【발명의 명칭】

나프토퀴논계 화합물을 유효성분으로 포함하는 췌장염 예방 및 치료용 조성 물

【기술분야】

본 발명은 나프토퀴논계 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 . 이의 프 로드럭 (prodrug). 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분으로 함유하는 췌 장염 (pancreatitis) 예방 및 치료용 약학적 조성물, 또는 건강기능식품에 관한 것 이다.

【배경기술】

췌장은 길쭉하고 편평한 모양을 하는 장기로서 그 길이가 13cm, 중량은 100g 내외이다. 췌장은 배꼽 위쪽의 뱃속 깊이 위치하는데 위장 아래쪽의 후복강 내에 있다. 췌장의 증요한 역할은 두 가지인데 음식물의 소화와 흡수에 필요한 소 화효소를 분비하는 외분비 기능과 당을 조절하는 인슐린과 같이 체내 대사를 조절 하는 호르몬 분비의 내분비 기능이다.

췌장염 (pancreatitis)은 췌장 (pancreas)에 염증이 발생하여 생기는 질병으 로 급성 췌장염 (acute pancreatitis) 및 만성 췌장염 (chronic pancreatitis)이 있 다. 이자액 (pancreatic juice)은 아밀라아제 (amylase, 탄수화물을 가수분해함). 트립신 (trypsin, 단백질 가수분해에 작용)， 라파아제 (lipase, 지방 가수분해에 작 용)와 같은 소화 효소를 포함한다. 췌장염은 과음 (alcohol abuse). 담석 (gallstones) 등에 의해서 이자액이 원활하게 흐르지 않아 상기 효소들이 췌장의 자가분해를 유발하여 발생한다. 췌장염은 크게 두 가지 유형으로 나누어 볼 수 있 는데. 간질성 부종 (interstitial edema)과 췌장주변의 지방성 괴사 (per ipancreat ic fat necrosis)가 발견되는 경증 (mi Id type)의 췌장염 , 췌장주변 (peripancreat ic) 및 췌장 내부 (intrapancreatic)의 광범위한 지방성 괴사, 췌장의 유조직 궤사 (pancreatic parenchymal necrosis) , 줄혈을 동반하는 중증 (severe type)의 췌장염 이 있다 (Bank PA. , Am. J. gastroenterol . , 89， ppl51-152, 1994.； Bradley EL. , Arch. Surg. , 128. pp586-590, 1993.； 김창덕 . 대한소화기학회지 . 46, pp321-332. 2005). 췌장염은 알코올 및 담석 생성 등에 기인된 담도 질환뿐만 아니라, 대사 장 애, 약물， 복부 손상 등의 다양한 원인 등에 의해서도 발생한다. 췌장염은 췌장선 세포의 손상, 광범위한 간질성 부종, 출혈 및 손상 부위로의 호증구성 과립구의 이 동을 유발하는 췌장의 염증성 질환이다. 췌장염 환자의 약 20% 정도는 췌장 조직 의 괴사 및 손상 등이 다발성 장기부전과 전신적인 합병증을 수반하는 중증의 임상 경과를 밟게 되며 이 경우 약 30%의 높은 사망를이 보고되고 있다. 췌장염은 아직 정확한 병태 생리기전이 알려져 있지 않으나 대표적인 증상으로 나타나는 것은 단 백분해효소 전구물이 췌장 내에서 조기 활성화됨으로써 일어나는 자가소화의 과정 이다. 즉, 췌장샘 과리세포 (pancreas acinar cell)내에서 소화효소가 비정상적으 로 조기활성화되면, 췌장의 세엽자신을 소화해 버리고 이어서 염증이 발생하여 조 직의 탈락, 괴사가 발생한다. 최근에는 췌장 선방세포의 손상 후 췌장 내로 유입 되는 활성화된 대식세포가 조직손상에 대한 반응으로 전염증성 사이토카인 인터루 킨(^^^16^^1)-113( -13)를 분비해 염증세포의 순환. 췌장 부종 및 췌장 실질 파괴에 증요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 급성 췌장염의 진행은 3단계로, 국소적 염증반웅, 일개 혹은 다발성 장기부 전을 초래하는 전신적 염증반응, 그리고 최종적으로 장내 세균의 췌장 내로 이동에 의한 감염에 의한 것이다. 췌장염의 초기 병태생리에 대해서는 정확히 밝혀지지 않았으나, 최근에는 췌장 선방세포의 손상 후 대식세포가 유입되어 조직 손상에 대 한 반응으로 사이토카인 (IL-1( inter leukin—1), IL-6, TNF-α (tumor necrosis factorᅳ α λ)을 분비하는 것으로 밝혀져 있다. 이들 사이토카인은 염증세포의 순환, 췌장부종 및 췌장실질파괴에 중요한 역할을 한다. 급성 췌장염 환자의 혈청에서 사이토카인의 증가가 보이며, 이러한 증가는 췌장염이 경한 경우보다는 췌장괴사, 전신적 염증반웅, 다발성 장기부전 등과 같은 합병증이 동반되는 경우에 현저하게 높다.

현재까지 췌장염의 중증도를 경감시키고 다양한 장기의 합병증 발생을 억제 할 수 있는 여러 실험적 치료법이 제시되고 있으나 실험적 치료법을 정작 사람에게 적용할 경우 매우 미약한 효과를 보여 아직까지 췌장염의 예방 및 치료와 관련하여 승인된 약물은 없는 실정이다. 한편 , 나프토퀴논계 화합물은 일부 약학적 조성물의 유효성분으로 알려져 있다. 그 증 베타-라파촌 (β— lapachone)은 남미에서 자생하는 라파초 ( laphacho) 나무 (Tabebuia avel lanedae)에서, 듀니온 (dunnione)과 알파-듀니온(31 3-(：1^^0예 은 남미에서 자생하는 스트렙토카르푸스 듀니 (Streptocarpus dunnii)의 잎에서 얻 어진다. 이와 같은 천연의 삼환성 (tricyclic) 나프토퀴논 (naphthoquinone ) 유도체 들은 남미 지역에서는 오래전부터 항암제를 비롯하여 남미 지역의 대표적인 풍토병 인 사가스병 (Chagas disease)을 치료하기 위한 약으로 널리 사용되었고, 그 효과 또한 뛰어난 것으로 알려져 있다. 특히. 이들의 항암제로서의 약리 작용이 서방세 계에 알려지기 시작하면서 사람들의 주목을 받기 시작했고, 미국특허 제 5, 969.163 호에 개시된 바와 같이 이들 삼환성 나프토퀴논 유도체들은 실제로 다양한 연구 집 단에 의해서 각종 항암제로 개발되고 있다. 그러나, 이러한 나프토퀴논계 화합물 들이 췌장염에 효과가 있다는 사실은 보고된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 췌장염의 예방 및 치료에 효과가 있는 물질을 찾기 위 해 연구한 결과, 나프토퀴논계 화합물인 베타-라파촌 (β-lapachone) 및 듀니온 (dunnione)은 췌장염에 의해 증가된 췌장 중량 /체증 비율을 감소시키고, 증가된 소 화 효소 (아밀라아제 (amylase) 및 리파아제 ( lapase) )의 활성 및 사이토카인 (IL— 1β (인터루킨 (interleiikin)-113 ) 및 MCP-1)의 발현을 감소시키며 , 췌장 조직의 염증, 부종, 세포괴사를 감소 또는 억제하고. 췌장염에 의한 폐손상을 억제하는 것을 확 인함으로써， 상기 나프토퀴논계 화합물， 이의 약학적으로 허용되는 염, 프로드럭， 용매화물 또는 이성질체를 췌장염 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있 음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 나프토퀴논계 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염. 이의 프로드릭 (prodrug), 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분으로 함유 하는 췌장염 (pancreatitis) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 2로 표 시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 프로드럭 (prodrug), 이의 용 매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분으로 함유하는 췌장염 (pancreatitis) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

또한. 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물. 이의 약학적으 로 허용가능한 염 . 이의 프로드럭 , 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분 으로 함유하는 췌장염으로 기인한 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 이의 약학적으 로 허용가능한 염 , 이의 프로드릭 , 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분 으로 함유하는 췌장염 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 이의 약학적으 로 허용가능한 염 , 이의 프로드럭 . 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분 으로 함유하는 췌장염으로 기인한 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자돌은 마우스에 세롤레인 (caeru lein) (50 / g/kg)을 1시간 간격으로 6회 복강 투여하여 췌장염을 유발하였고„ 베타-라파촌 ( β— lapachone , β - p)과 듀니온 (Dimnione)을 세를레인 투여 하루 전 경구 투여하여 췌장염 동물 모델을 준비하였고, 이를 가지고 체증에 대한 췌장 중 량을 측정한 결과, 세를레인군은 정상군에 비해 췌장 중량 /체중 비율이 현저하게 증가하는 반면 , 베타 -라파촌군과 듀니온군은 농도 의존적으로 췌장 중량 /체중 비율 이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 1 참조) .

또한, 본 발명자들은 췌장 세포에서 합성 , 분비되는 소화효소인 아밀라아제

(amylase) 및 리파아제 ( lypase)의 활성을 확인한 결과, 혈청 내 아밀라아제 및 리 파아제 활성 모두 정상군에 비해 세롤레인군에서 높게 측정된 반면. 베타-라파촌군 과 듀니온군에서는 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였고 (도 2 참 조) , 췌장염과 관련된 사이토카인인 IL-Ι β 및 MCP-1의 발현을 확인한 결과. 정상 군에 비하여 세롤레인군에서 혈청 IL-Ι β 농도, IL-Ι β 발현량 및 MCP-1 발현량 모 두 높게 측정된 반면, 베타 -라파촌군과 듀니온군에서는 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며 (도 3 내지 도 4 참조) , 췌장 조직의 형태학적 변화를 확인한 결 과. 세를레인군은 췌장 조직의 부종, 염증, 세포괴사 현상이 나타났으나, 베타-라 파촌군과 듀니온군에서는 농도 의존적으로 이러한 현상을 정상군과 비슷하게 억제 하는 것을 확인하였다 (도 5 참조) .

또한, 본 발명자들은 이러한 베타 -라파촌의 췌장염에 대한 보호 효과가 NQ01 효소의 경로에 의한 것인지 확인하기 위해 NQ01 낙아웃 (knock out , 0) 마우 스에서 췌장 조직의 형태학적 변화, 체중에 대한 췌장의 중량, 혈청 아밀라아제 및 리파아제 활성 및 혈청 IL— 1 β 농도를 확인한 결과. 세를레인군과 베타-라파촌군 간의 유의성 있는 차이를 확인할 수 없었고 (도 6 내지 도 7 참조)， 세를레인 최종 투여 6시간 후 베타-라파촌을 정맥 주사함으로써 세를레인에 의해 유도된 췌장염에 대한 베타-라파촌의 치료 효과를 확인한 결과, 세를레인군은 췌장 조직의 부종, 염 증, 세포괴사 현상이 나타났으나, 베타-라파촌군에서는 이러한 현상들이 억제되는 것을 확인하였다 (도 8 참조) .

또한, 본 발명자들은 나프토퀴논계 화합물인 베타-라파촌과 듀니온의 췌장 염에 의한 폐손상에 대한 보호 효과를 확인한 결과， C57/BL6 마우스에서는 베타-라 파촌의 병용처리시 농도 의존적으로 세를레인에 의한 폐손상이 억제된 반면, NQ01 낙아웃 마우스의 경우에는 베타-라파촌을 함께 처리해도 폐손상이 보호되지 않음을 확인하였으며 (도 9 참조) , C57/BL6 마우스에서 듀니온의 병용처리시 세를레인에 의 한 폐손상이 현저히 억제됨을 확인하였다 (도 10 참조) . 상기 결과들을 토대로 NQ0-1을 통해 다양한 염증반응을 조절하여 세를레인에 의한 췌장염 및 췌장염 연관 폐손상을 보호하는데 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

따라서 , 본 발명의 나프토퀴논계 화합물인 베타-라파촌 및 듀니온은 췌장염 에 의해 증가된 췌장 증량 /체증 비율을 감소시키고, 증가된 소화 효소의 활성 및 사이토카인의 발현을 감소시키며, 췌장 조직의 염증, 부종, 세포괴사를 감소 또는 억제하고 , 췌장염에 의한 폐손상을 억제하는 것을 확인함으로써 , 본 발명의 나프토 퀴논계 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염. 이의 프로드력, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체는 췌장염 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 나프토퀴논계 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사 용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 ( f ree ac i d)에 의해 형성 된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산， 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요 드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레 이트. 페닐-치환된 알카노에이트 , 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트， 방 향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이 러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페미트, 설파이 트, 바이설파이트, 니트레이트， 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드 로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이 오다이드 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트， 카프릴레이 트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피' 올레이트, 옥살레이트, 말로네이트. 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레 이트, 말리에이트, 부린 1 , 4-디오에이트， 핵산 -1 , 6—디오에이트 . 벤조에이트， 클로 로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메특 시벤조에이트， 프탈레이트， 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 틀루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트. 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트. 시트레이트. 락테이트, β -하이드록시부티레이트， 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌 -1-설포네이트, 나프탈렌 -2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법ᅳ 예를 들면. 나프토퀴논계 화합물 을 과량의 산 수용액 증에 용해시키고, 이 염을 수흔화성 유기 용매 , 예를 들면 메 탄올 , 에탄을 , 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 나프토퀴논계 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼 합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있 다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수 산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여 과하고. 여액올 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨. 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대웅하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

또한 , 본 발명의 나프토퀴논계 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니 라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함 한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 나 프토퀴논계 화합물을 수흔화성 유기용매 , 예를 들면 아세톤, 메탄을 , 에탄올 , 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 흔합물에서 용매나 과 량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시 켜 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우， 나프토퀴논계 화합물ᅵ 이의 약학적으로 허용되는 염. 이의 프로드력， 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유 효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여시에 다양 하기의 경구 또는 비경 구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 돌면 정제, 환제, 경 /연질 갑셀제. 액제, 현 탁제， 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이 외에 회석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니를， 솔비를, 셀를로즈 및 / 또 는 글리신) . 활택제 (예: 실리카, 탈크， 스테아르산 및 이의 마그네슴 또는 칼슘염 및 /또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실 리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴. 메틸셀를로즈. 나트륨 카복시메틸셀를로즈 및 / 또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한 천, 알긴산 또는 이의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 흔합물 및 /또는 흡수제， 착색제. 향미제. 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 발명의 나프토퀴논계 화합물， 이의 약학적으로 허용되는 염 . 이의 프로 드릭, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또 는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제 화하기 위하여 나프토퀴논계 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염， 이의 프로드릭, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 안정 제 또는 완충제와 함께 물에 흔합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고 /되거나 방 부제 , 안정화제 , 수화제 또는 유화 촉진제 , 삼투압 조절을 위한 염 및 /또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며. 통상적인 방법 인 흔합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성 별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며 . 몸무게가 60 kg인 성인 환차를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 - 1 , 000 nig/일이며, 바람직하게는 0.01 - 500 mg/일이며. 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 상기 나프 토퀴논계 화합물을 약 0.01 내지 100 중량 %로 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 이의 약학적으 로 허용가능한 염 , 이의 프로드력 , 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분 으로 함유하는 췌장염으로 기인한 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 췌장염으로 기인한 질환은 폐손상. 패혈증, 신부전, 늑막 삼출액. 다 발성 장기 부전 및 다발성 장기손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 나프토퀴논계 화합물인 베타-라파촌 및: 듀니온은 췌장염에 의해 증가된 췌장 증량 /체중 비율을 감소시키고, 증가된 소화 효소의 활성 및 사이토카 인의 발현을 감소시키며, 췌장 조직의 염증. 부종， 세포괴사를 감소 또는 억제하고. 췌장염에 의한 폐손상을 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 나프토퀴논계 화 합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이의 프로드릭, 이의 용매화물 또는 이의 이 성질체는 췌장염으로 기인한 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 이의 약학적으 로 허용가능한 염. 이의 프로드릭, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분 으로 함유하는 췌장염 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 췌장염은 만성 췌장염 또는 급성 췌장염인 것이 바람직하다.

상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 나프토퀴논계 화합물인 베타-라파촌 및 듀니온은 췌장염에 의해 증가된 췌장 중량 /체중 비율을 감소시키고 , 증가된 소화 효소의 활성 및 사이토카 인의 발현을 감소시키며 , 췌장 조직의 염증 부종, 세포괴사를 감소 또는 억제하고, 췌장염에 의한 폐손상을 억제하는 것을 확인함으로써 , 본 발명의 나프토퀴논계 화 합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 프로드릭, 용매화물 또는 이성질체는 췌장염 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 나프토퀴논계 화합물 , 이의 약학적으로 허용되는 염 , 이의 두로 드럭, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체가 상기와 같은 췌장염 예방 및 개선을 위 해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게 는 음료. 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.

본 발명의 건강 기능 식품은 , 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학 적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 나프토퀴논계 화합물 , 이의 약학적으로 허용되는 염 , 이의 프로드릭, 이 의 용매화물 또는 이의 이성질체 이외에 구연산. 액상과당, 설탕, 포도당, 초산. 사과산. 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명에 따른 건강 기능 식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 췌장 염 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령, 성별. 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적 절히 선택될 수 있으며 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포 함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강 기능 식품을 섭취함으로써 췌장염 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다.

상기 건강기능식품의 제조에 있어서 상기 나프토퀴논계 화합물, 이의 약학 적으로 허용되는 염, 이의 프로드럭, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체의 함량은 건강기능식품의 형태에 따라 다르지만, 약 0.01 내지 100 증량%의 농도이다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 이의 약학적으 로 허용가능한 염, 이의 프로드릭, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분 으로 함유하는 췌장염으로 기인한 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 췌장염으로 기인한 질환은 폐손상, 패혈증, 신부전 . 늑막 삼출액， 다 발성 장기 부전 및 다발성 장기손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 나프토퀴논계 화합물인 베타-라파촌 및 듀니은은 췌장염에 의해 증가된 췌장 증량 /체증 비율을 감소시키고. 증가된 소화 효소의 활성 및 사이토카 인의 발현을 감소시키며, 췌장 조직의 염증, 부종, 세포괴사를 감소 또는 억제하고, 췌장염에 의한 폐손상을 억제하는 것을 확인함으로써. 본 발명의 나프토퀴논계 화 합물 , 이의 약학적으로 허용되는 염 , 이의 프로드력 , 이의 용매화물 또는 이의 이 성질체는 췌장염으로 기인한 질환 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유 용하게 사용될 수 있다. 【유리한 효과】

본 발명은 나프토퀴논계 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 프 로드릭 (prodrug) , 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 유효성분으로 함유하는 췌 장염 (pancreat i t i s ) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로. 구체적으로 상기 나프 토퀴논계 화합물인 베타-라파촌 ( β - l apachone) 및 듀니은 (dunni one)은 췌장염에 의 해 증가된 췌장 증량 /체중 비율을 감소시키고, 증가된 소화 효소 (아밀라아제 (amylase) 및 리파아제 ( lapase))의 활성 및 사이토카인 (IL-Ιβ (인터루킨 ( inter leukin)-ip ) 및 MCP-1)의 발현을 감소시키며 , 췌장 조직의 염증, 부종, 세 포괴사를 감소 또는 억제하고， 췌장염에 의한 폐손상을 억제하는 것을 확인함으로 써, 상기 나프토퀴논계 화합물， 이의 약학적으로 허용가능한 염. 이의 프로드럭, 이의 용매화물 또는 이의 이성질체를 췌장염 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사 용할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 체중에 대한 췌장의 중량을 측정한 결과를 나타낸 도이다:

p<0.05: 정상군과 세롤레인 (caerulein)군을 비교; 및

'ρ<0.05: 세를레인군과 베타-라파촌 (β-lapachone)군 또는 세를레인군과 듀 니은 (dunnione)군을 비교.

도 2는 혈청 내 아밀라아제 (amylase) 및 리파아제 (lapase) 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다:

#ρ<0.0δ: 정상군과 세를레인군을 비교; 및

V0.05: 세를레인군과 베타-라파촌군 또는 세를레인군과 듀니온군을 비교. 도 3은 혈청 내 -1{3(인터루킨^1 ^16^^)-13) 농도 및 췌장 내 IL-1 β 발현을 측정한 결과를 나타낸 도이다:

"ρ<0.05: 정상군과 세를레인군을 비교: 및

V0.05: 세를레인군과 베타-라파촌군 또는 세를레인군과 듀니온군을 비교. 도 4는 췌장 내 MCP-1 발현을 측정한 과를 나타낸 도이다:

ρ<0.05: 정상군과 세를레인군을 비교; 및

V0.05: 세롤레인군과 베타-라파촌군 또는 세를레인군과 듀니온군을 비교. 도 5는 C57/BL6 마우스에서 췌장조직의 형태학적 변화를 확인한 사진 및 이를 조직학적 점수로 나타낸 그래프이다: Cont： 정상군 :

CAE: 세를레인군;

β-Lap: 베타-라파촌만 처리한 군;

CAE+ β -Lap 10： 세를레인과 베타-라파촌 10 mg/kg을 병용처리한 군;

ΟΑΕ+β-Lap 20： 세를레인과 베타-라파촌 20 mg/kg을 병용처리한 군;

CAE+ -Lap 40： 세를레인과 베타-라파촌 40 mg/kg을 병용처리한 군;

Dunn i one: 듀니온만 처리한 군;

CAE+Dunnione 10： 세를레인과 듀니온 10 nig/ kg을 병용처리한 군;

CAE+Dunnione 20: 세를레인과 듀니은 20 nig/kg을 병용처리한 군:

CAE+Dunnione 40： 세를레인과 듀니은 40 mg/kg을 병용처리한 군;

p<0.05: 정상군과 세를레인군을 비교; 및

V0.05: 세롤레인군과 베타-라파촌군 또는 세를레인군과 듀니은군을 비교. 도 6은 NQ01 낙아웃 (knock out, K0) 마우스에서 췌장조직의 형태학적 변화 를 확인한 사진 및 이를 조직학적 점수로 나타낸 그래프이다:

Cont: 정상군:

CAE: 세를레인군;

β-Lap 40： 베타-라파촌만 40 mg/kg 처리한 군;

CAE+p-Lap 40： 세를레인과 베타-라파촌 40 mg/kg을 병용처리한 군;

V0.05: 정상군과 세를레인군을 비교: 및

NS: Non-significant. 유의성 없음. 세를레인군과 베타 -라파촌군을 비교. 도 7은 NQ01 낙아웃 마우스에서 체중에 대한 췌장의 중량, 혈청 내 아밀라 아제 및 리파아제 활성 및 혈청 내 IL-Ιβ 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다:

#p<0.05: 정상군과 세를레인군을 비교; 및

NS: Non-significant, 유의성 없음, 세를레인군과 베타 -라파촌군올 비교. 도 8은 베타-라파촌의 췌장염 치료 효과를 췌장조직의 형태학적 변화를 확 인한 사진 및 이를 조직학적 점수로 나타낸 그래프이다:

Cont: 정상군;

CAE: 세롤레인군;

β-Lap 40： 베타-라파촌만 40 nig/kg 처리한 군;

CAE+p-Lap 10： 세를레인과 베타-라파촌 10 mg/kg을 병용처리한 군;

CAE+p-Lap 20： 세를레인과 베타-라파촌 20 nig/kg을 병용처리한 군;

CAE+ β -Lap 40： 세를레인과 베타-라파촌 40 mg/kg을 병용처리한 군 ;

V0.05: 정상군과 세를레인군을 비교: 및

*p<0.05: 세를레인군과 베타 -라파촌군을 비교.

도 9는 C57/BL6 마우스 및 NQ01 낙아웃 마우스에서 베타-라파촌에 의한 폐 조직의 형태학적 변화를 확인한 사진이다:

Cont： 정상군 ;

CAE: 세를레인군;

β-Lap: 베타-라파촌만 처리한 군;

CAE+ β -Lap 10： 세를레인과 베타-라파촌 10 mg/kg을 병용처리한 군;

ΟΑΕ+β-Lap 20: 세롤레인과 베타-라파촌 20 mg/kg을 병용처리한 군: 및

CAE+ β -Lap 40： 세를레인과 베타-라파촌 40 mg/kg을 병용처리한 군.

도 10은 C57/BL6 마우스에서 듀니온에 의한 폐 조직의 형태학적 변화를 확 인한 사진이다:

Cont: 정상군;

CAE: 세롤레인군;

Dunn i one: 듀니온만 처리한 군;

CAE+Dunnione 10: 세롤레인과 듀니은 10 ing/kg을 병용처리한 군;

CAE+Dunnione 20： 세롤레인과 듀니은 20 nig/kg을 병용처리한 군; 및 CAE+Dunnione 40： 세를레인과 듀니온 40 ing/kg을 병용처리한 군. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 이하, 본 발명올 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내 용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>베타-라파촌 (β-Lapachone)의 합성

베타-라파촌 (β-lapachone)은 라파초 (lapacho) 나무에서 비교적 적은 양으 로 얻어지나. 베타-라파촌 합성의 원료가 되는 라파출 (lapachol)은 라파초 나무에 서 상당히 많은 양으로 얻어지기 때문에 이미 오래전에 라파출을 사용하여 β-라파 촌을 합성하는 방법이 개발되었다. 즉, 라파출과 황산을 함께 흔합하여 상온에서 격렬하게 교반시키면 비교적 좋은 수율로 베타-라파촌이 얻어질 수 있다.

본 실시예에서는 합성방법으로 라파출을 얻기위해 2-Hydroxy— 1,4- naphthoquinone (17.4 g, 0.10M)을 DMS0( 120 m£)에 녹이고, LiH(0.88 g, 0.11M)을 천천히 가하였다. 이때, 수소가 발생하므로 주의하고, 반응용액을 교반하면서 더 이상 수소가 발생하지 않는 것을 확인한 상태에서, 30분 동안 더 교반시킨 다음, 프레닐 브름화물 (Prenyl br oni i de ) ( 1-Br omo-3-nie t hy 1 -2-but ene )(15.9 g. 0.10M)과 Li 1(3.35 g, 0.025M)을 천천히 가하였다. 그 후, 반웅용액을 45°C까지 가열한 상 태에서 12시간 세차게 교반시켰고 , 반응용액을 10 ^° C 이하로 넁각시킨 상태에서 먼 저 얼음 (76 g)을 가하고 이어서 물 (250 mC)을 가한 다음, 진한 염산 (25 m«을 천천 히 가함으로써 용액을 pH 1의 산성으로 유지하였다. 반웅 흔합물로 EtOAc(200 me) 을 가한 상태에서 세차게 교반시키면 EtOAc에 녹지 않는 하얀색 고체가 생성되는데, 이들 고체는 여과하여 걸러낸 다음, EtOAc 층을 분리하였다. 물 층은 Et0Ac(100 ιιιθ을 사용하여 한 번 더 추출하예 앞서 추출한 유기층과 혼합하였고, 유기층은 5% NaHC0 ₃ (150 ιη.( 로 씻은 다음. 농축하였으며, 농축물을 CH ₂ C1 ₂ (200 ι )에 녹이고 2N NaOH 수용액 (70 me)로 세차게 흔들어서 분리하였다. CH ₂ C1 ₂ 층을 2N NaOH 수용액 (70 me 2)으로 처리하여 두 번 더 분리하였다. 분리한 수용액을 합친 다음, 진 한 염산을 사용하여 pH 2 이상의 산성으로 조정하면 고체가 생성되며, 이를 여과하 여 분리함으로써 라파출 (lapachol)을 수득하였다. 그런 다음. 상기 라파출은 75% EtOH을 사용하여 재결정하였고, 황산 (80 m.0과 흔합한 상태에서 상온에서 10분간 세차게 교반한 다음ᅳ 얼음 (200 g)을 가함으로써 반웅을 종결하였다.

상기 과정을 보다 일반적인 구조식으로 표현하면 아래와 같다. 【화학식 11

다음으로, 반웅물로 CH ₂ C1 ₂ (60 m«)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH ₂ C1 ₂ 층을 분리하여 5% NaHC0 ₃ 로 씻어 주었다. 물 층은 CH ₂ C1 ₂ (30 m )를 사용하 여 한번 더 추출하여 5¾> NaHC0 ₃ 로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 흔합하였고, 유기층을 MgS0 ₄ 를 사용하여 말린 다음, 농축함으로써 불순한 상태의 베타-라파촌을 얻었다. 이를 다시 이소프로판올을 사용하여 재결정함으로써 순수한 상태의 베타- 라파촌 (8.37 g)을 수득하였다.

1H-NMR (CDC13, δ )： 8.05 (1H, dd, J=l, 8Hz), 7.82 (1H, dd, J=l, 8 Hz), 7.64 (1H, dt, J=lᅳ 8 Hz), 7.50 (1H, dt , J=l, 8 Hz), 2.57 (2H, t , J-6.5 Hz). 1.86 (2H, t, J =6.5 Hz) 1.47 (6H, s).

<실시예 2>듀니은 (Dunnione)의 합성 상기 <실시예 1>에서 라파출을 얻는 과정에서 EtOAc에서 녹지 않고 분리된 고체는 C-Alylation 물질인 라파출과는 달리 OAkylation 된 2— Prenyloxy— 1 ,4 - maphthoquinone이다. 이를 먼저 EtOAc를 사용하여 한번 더 재결정함으로써 깨끗이 정제한 후, 정제된 고체 (3.65 g, 0.015M)를 를루엔에 녹이고 5시간 동안 환류시킴 으로써 클라이젠 자리옮김 (Claisen Rearrangement)을 유도하였다. 그런 다음, 틀 루엔을 감압 증류하여 농축시키고, 이를 더 이상의 정제 과정 없이 황산 (15 m 와 흔합한 상태에서 상온에서 10분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (100 g)을 가함으로써 반웅을 종결하였다. 반웅물로 CH ₂ C1 ₂ (50 me)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH ₂ C1 ₂ 층을 분리하여 5% NaHC0 ₃ 로 씻어 주었다. 물 층은 CH ₂ C1 ₂ (20 mO를 사용하 여 한번 더 추출하여 5% NaHC0 ₃ 로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 그 후, 유기층은 MgS0 ₄ 를 사용하여 건조하여 농축한 다음, 이를 실리카겔을 사용하 여 크로마토그래피함으로써 순순한 상태의 듀니온 (2.32 g)을 수득하였다.

1H-NMR (CDC13, δ )： 8.05 (1H, d, J=8Hz), 7.64 (2H, d, J=8Hz), 7.56 (1H, m), 4.67 (1H. q, J=7Hz), 1.47 (3H, d, J=7Hz), 1.45(3H, s) 1.27 (3H, s).

<실시예 3> 알파듀니온 ( α-Dunnione)의 합성

상기 <실시예 2>에서 정제한 2-Prenyloxy-l,4-maphthoquinone(4.8 g, 0.020M)을 자일렌 (Xylene)에 녹이고 15시간 동안 자일렌을 환류시킴으로써 상기 < 실시예 1> 보다 고은 및 장시간 반웅 조건에서 클라이젠 자리옮김을 유도하였다. 이 과정에서 클라이젠 자리옮김은 물론 두 개의 메틸 (Methyl) 기 중에서 한 개가 이동한 라파출 유도체와 함께 고리화 반응까지 진행된 상태의 알파 듀니은 ( α- Dunnione)이 얻어진다. 그런 다음, 자일렌을 감압 증류함으로써 농축한 다음 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피하여 순순한 상태의 알파 듀니온 (1.65 g)을 수득하였다.

1H-NMR (CDC13, δ )： 8.06 (1H, d, J=8Hz), 7.64 (2H, ni), 7.57 (1H, m), 3.21 (1H, q, J=7Hz), 1.53 (3H, s) , 1.5K3H, s) 1.28 (3H, d, J=7Hz). <실험예 1>췌장염 동물 모델의 준비

본 발명에서는 체증 22±2 g 내외의 C57BL/6 쥐를 사용하였다. 실험에 사 용한 모든 생쥐들은 항은 (22~26 ^° C). 항습 (55~60%)이 되는 무균 동물실에서 사육하 였으며, 일반 고형사료 (샘타코 (주) , 한국)와 물을 충분히 공급하면서 1주 동안 적응 시킨 후 실험하였다. 모든 실험은 원광대학교 임상시험 관리위원회의 실험실 동물 관리 및 윤리 규정에 따라 임상시험 관리위원회의 승인을 받은 후 시행하였다. 동 물 실험을 위한 췌장염 유발 방법 중에서 최근 세를레인 (caerulein) 유도 췌장염 모델은 재현성이 뛰어나고 경제적인 이유로 가장 널리 사용되는 실험동물 모델로 그동안 많은 연구에 의하여 발생기전에 관하여 비교적 잘 연구된 동물 모델이다. 정상군을 제외한 모든 실험동물은 약 16시간 전부터 사료 공급을 증단한 다음 세를 레인 (50 / g/kg)을 1시간 간격으로 6회 복강 투여하여 췌장염을 유발하였다. 또한, 세를레인을 처리하기 하루 전에 베타-라파촌 (β-lapachone, β— Lap)과 듀니온 (Diinnione)을 경구투여하여 세를레인에 의해 유도되는 췌장염에 대한 베타-라파촌 과 듀니온의 예방효과를 확인하였으며, 세를레인 (50 /ig/kg)을 1시간 간격으로 6회 복강 투여하여 췌장염을 유발한 후 세를레인 최종 투여 6시간 뒤에 베타-라파촌을 정맥주사하여 세를레인에 의해 유도되는 췌장염에 대한 베타-라파촌의 치료효과를 확인하였다.

<실험예 2>베타-라파촌 및 듀니은의 췌장중량 감소 효과확인

췌장염 발생시 부종으로 인해 췌장의 무게가 증가한다고 알려져 있다. 이 에. 실험이 끝난 모든 동물 모델을 채혈한 후, 체중에 대한 췌장의 중량을 측정하 였다.

구체적으로， 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델을 베타 ᅳ라파촌 및 듀니온을 농도별로 (0, 10. 20. 40 nig/ kg) 처리한 후, 세롤레인 (50 igl kg)을 투여하여 췌장염을 유발한 후, 채혈을 한 다음 췌장을 절취하여 Grady의 방 법에 의해 췌장 증량 ( _we t pancreas weight )/체중 (wet body weight) 계산식을 통하 여 체중에 대한 췌장의 중량을 측정하였다.

그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 세를레인을 처리한 군은 정상군에 비해 현저하게 췌장 증량 /체증 비율이 증가하는 반면, 베타-라파촌 또는 듀니온을 같이 처리한 군에서는 처리한 베타-라파촌 및 듀니온의 농도 의존적으로 췌장 중량 /체증 비율이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 1). <실험예 3>베타-라파촌 및 듀니은의 혈청 소화효소 활성 억제 효과 확인 췌장은 인체에서 그 어느 장기보다 왕성하게 단백질을 합성하는 장기로. 하루에 약 6-20 gm의 소화 단백을 합성하여 분비한다. 이들 소화 효소는 강력한 단백 분해능을 갖고있기 때문에 췌장샘 과리세포에서는 여러 가지 안전장치를 통해 췌장의 자가소화를 방지하고 있다. 췌장염은 이렇게 불활성 전구체로 정상적으로 췌장세포에서 합성 , 분비되는 소화효소가 췌장 안에서 조기 활성화되어 췌장의 자 가 소화에 의해 발생한다고 알려져 있기에 혈청 아밀라아제 (amylase) 및 리파아제 (lipase)의 활성을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델을 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 베타-라파촌 또는 듀니온, 및 세를레인올 투여한 후, 혈청을 얻어 아밀라아제 활성 분석 키트 (DAMY-100; BioAssay Systems, 미국)와 리 파아제 활성 분석 키트 (DLPS-100; BioAssay Systems. 미국)를 사용하여 595 nm와 412 nm에서 흡광도를 측정하여 혈청 내 아밀라아제 및 리파아제의 활성을 분석하였 다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 아밀라아제의 활성은 정상군 (1168土 215.0 U/L)에 비하여 세롤레인군 (1700±106.4 U/L)에서 현저히 높게 측정되었고. 리파아제의 활성도 정상군에 비하여 세를레인군에서 약 30%정도 높게 측정된 반면, 베타-라파촌 또는 듀니온을 같이 처리한 군에서는 농도 의존적으로 아밀라아제 및 리파아제의 활성이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 2). <실험예 4 베타-라파촌 및 듀니온의 염증 매개 물질 발현 억제 효과 확인

<4-1>베타-라파촌 및 듀니은의 IL-Ιβ 발현 억제 효과 확인

췌장염의 발생이 췌장샘 꽈리세포 내에서 소화효소의 자가 활성화에 따른 췌장세포의 손상으로 유발되지만 여러 가지 면역세포 등이 활성화되어 염증 반웅을 야기함으로써 췌장의 손상을 확대시키며 이들 면역세포로부터 생산되는 다양한 염 증성 사이토카인 (cytokines)들을 포함하는 체액성 인자 등이 전신적인 다장기 손상 의 유발에 관여하는 것으로 밝혀지고 있다. 췌장염에서 염증반웅을 유도하는 면역 세포의 활성화에는 대표적으로 TNF-α , 인터루킨 (interleukin)— IP UL-Ιβ ). 인터 루킨 -6이 관여하는 것으로 알려져 있다. 그 중 췌장염에서 혈청 IL-Ιβ , TNF-a의 농도가 증가되어 있으며 , 췌장염의 증증도와 비례관계가 있음이 보고되어있고, 인 터루킨 1 유전자 결손 마우스를 이용한 실험과 인터루킨 1 수용체 길항제 처치시 췌장염의 발생이 억제됨이 보고되어있어 , IL-Ιβ가 췌장염을 일으키는 주요인자로 생각되고 있다. 이에 , IL— 1β의 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로. 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델을 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 베타-라파촌 또는 듀니은. 및 세롤레인을 투여한 후, 혈청을 얻어 마우스 IL-Ιβ ELISA 키트 (BD, 미국)를 사용하여 혈청 증의 IL-Ιβ 농 도를 측정하였다. 먼저 마우스 IL-Ιβ의 특정 항체 (specific antibody)가 코팅된 96 웰 (well) 소판에 비세척액 또는 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 실온에서 반웅 시킨 후 세척하였다. 이후 biotin conjugate를 넣고 다시 실온에서 1시간 동안 반 웅시키고 세척시킨 후 streptavidin-HRP working 용액을 넣고 반응시켰다. 이후 다시 세척한 후 stabilized chromogen을 넣고 반응시킨 후 450 ηηι에서 흡광도를 측 정하였다. 또한, 각각의 췌장 조직에서 실시간 중합효소 연쇄반웅 (Rea卜 time PCR) 으로 췌장 내 IL-Ιβ의 발현 양상을 확인하였다. Total RNA를 추출하기 위해 각각 의 췌장 조직 20 mg에 TRIzoK Invi trogen, 미국) 1 mL을 첨가하고 얼음 위에서 5분 을 방치하여 세포를 용해시키고 클로로포름 (chloroform) 200 _U L을 첨가하여 14,000 i-pni에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 취하여 새로운 튜브에 옮기 고 같은 양의 이소프로판올 (isopropanol)을 첨가한 후 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 분리하였다. 99% 에탄을 (ethanol)로 2,000 rpm에서 원심분리 하여 세척한 후 1회 더 세척하고 공기 중에서 건조시킨 후 디에틸피로카르본산 (diethylpyrocarbonate, DEPC) 물에 녹였다. Nanodrop 2000(Thermo, USA)을 이용 하여 RNA를 정량하였고. 전체 RNA 2 을 DEPC와 함께 70 ^° C에서 5분 동안 가열 시킨 루 을리고 (dT)를 포함한 Reverse Transcription Premix( Invi trogen, 미국)에 넣고 최종 부피가 20 가 되도록 하였다. 42 ^° C에서 55분, 70 ^° C에서 15분 동안 반웅시켜 cDNA를 합성하여 중합효소 연쇄 반웅 (polymerase chain reaction, PCR)에 사용하였다. 얻어진 cDNA로부터 IL-Ιβ, GAPDH를 증폭시키기 위해 DEPC water로 5 배 희석시킨 cDNA 2 를 프라이머 0,5 _t iL, DEPC water 7 _y L, SYBR green Master Mix( Invitrogen Life Technology, USA) 10 μᄂ와 함께 StepOne Plus Real- Time PCR system (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 반웅 조건은 50°C 2분, 95°C 10분에서 반웅 후 95°C 10초와 60°C 1분을 40회 반복하여 증폭시켰다. 증폭하고자 하는 유전자들의 프라이머 염기서열은 하기 표 1과 같다.

【표 1】

유전자 프라이 염기 서열 방ᄋ함 서열번호

머 이름

IL-Ιβ IL-lb_F TCT TTG AAG TTG ACG GAC CC ¾ o방ᄋ향ᄋ 서열번호:

1 IL-lb_R TGA GTG ATA CTG CCT GCC TG 역방향 서열번호:

2

GAPDH GAPDH_F TCC CAC TCT TCC ACC TTC GA 정방향 서열번호:

3

GAPDH_R AGT TGG GAT AGG GCC TCT CTT G 역방향 서열번호:

4 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 , 정상군에 비하여 세를레인군에서 현저하 게 높은 혈청 IL-Ι β의 양이 측정된 반면 , 베타—라파촌 또는 듀니온을 같이 처리한 군에서는 농도 의존적으로 혈청 IL-Ι β의 양이 확연하게 감소하였고, IL-Ι β의 발 현 또한 정상군에 비하여 세를레인군에서 현저하게 높게 확인된 반면, 베타-라파촌 또는 듀니온을 같이 처리한 군에서는 췌장 내 IL-Ι β의 발현이 감소하는 것을 확인 하였다 (도 3) .

<4-2>베타-라파촌 및 듀니은의 MCP-1 발현 억제 효과확인

염증세포의 침윤에는 우선 염증세포의 활성화와 염증세포의 혈관으로부터 조직 안으로의 이동과 같은 일련의 과정이 필요하며, 케모카인 (chemokine)은 화학 운동성 (chemoki nes i s)와 주화성 (chemotaxi s)의 작용을 나타내어 염증세포가 조직 부위로 이동할 수 있도록 하는 사이토카인의 일종으로 특히 췌장염에서 MCP-1이 췌 장염의 발생 및 췌장염의 합병증인 폐손상의 발생에 관여하는 것으로 알려지고 있 기에 MCP-1의 발현양상을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델을 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 베타-라파촌 또는 듀니은, 및 세롤레인을 투여한 후, 각각의 췌장 조직에서 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하여 MCP-1의 발현 양상을 확인하였다. 증폭하고자 하는 유전자들의 프라이머 염기서열 은 하기 표 2와 같다.

【표 2]

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상군에 비하여 세를레인군에서 현저 하게 높은 MCP-1의 발현이 확인된 반면, 베타-라파촌 또는 듀니은을 같이 처리한 군에서는 농도 의존적으로 췌장 내 MCP-1의 발현이 감소됨을 확인하였다 (도 4).

<실험예 5>베타-라파촌 및 듀니은의 췌장조직의 형태학적 변화 확인 췌장염에서는 췌장 조직의 염증, 부종， 세포괴사가 일어나는 것으로 알려 져 있기에 이러한 췌장 조직의 형태학적 변화를 확인하였다.

구체적으로. 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델을 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 베타—라파촌 또는 듀니은, 및 세를레인을 투여한 후， 췌장 조직을 분리하여. 10% 포르말린 (formalin)에 넣어 24시간 동안 4°C에서 고정 하고, 10% 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenedianiinetetra-acetic acid)(EDTA, H 7.4) 용액을 이용하여 탈회하고 수세 및 탈수 등의 과정을 거친 다음 파라핀에 포매하여 5 urn 두께로 절단하였다, 절단한 조직은 헤마록실린 (hematoxy l i n)-에오 신 ( eos i n) 염색을 한 후, 광학현미경을 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 정상군의 췌장샘 과리세포들은 촘촘한 구조로 배열되어 있는 반면, 세를레인군의 췌장샘 꽈리세포들은 부종으로 인하여 세포가 커지고 세포 간격이 확장되어 있으며, 염증세포의 침윤과 세포괴사 현상이 확인되었다. 하지만. 베타-라파촌 또는 듀니온의 처리에 의해 세를레인군의 현상 들은 정상군과 비슷하게 억제됨을 확인하였고, 이를 그래프로 도식화한 결과, 베타 一라파촌 또는 듀니은의 처리 농도에 의존적으로 세를레인에 의한 췌장 조직의 부종， 염증. 세포괴사 현상이 모두 억제되는 것을 확인하였다 (도 5) .

<실험예 6> NQ01낙아웃 (knock out , K0) 마우스에서 베타-라파촌에 의한 췌 장 보호 효과 경로 확인

<6-1> NQ01 낙아옷 마우스에서 췌장조직의 형태학적 변화 확인

베타-라파촌은 NQO-l(NAD(P)H : qu i none ox i doreduct ase-1)의 보조기질 (co_ subst rate )로 알려져 있기에 베타-라파촌의 췌장염 보호 효과가 NQ01 효소의 활성 경로를 경유하는지를 검증하기 위하여 , NQ01 낙아웃 마우스에서 췌장 조직의 형태 학적 변화를 확인하였다.

구체적으로, NQ01 낙아웃 마우스를 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 베 타-라파촌 또는 듀니온. 및 세를레인을 투여한 후, 상기 <실험예 5>와 동일한 방법 으로 해마록실린-에오신 염색을 한 후 , 광학현미경을 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 세를레인에 의한 췌장샘 과리세포들의 부종, 염증세포의 침윤 및 세포괴사 현상은 C57/BL6 마우스와 유사한 증가를 보였 지만, 베타-라파촌을 함께 처리한 군에서는 C57/BL6 마우스와는 다르게 췌장 조직 의 부종, 염증, 세포괴사 현상의 감소를 확인할 수 없었다 (도 6) . <6-2> NQ01낙아웃마우스에서 췌장염에 대한보호효과경로 확인

베타-라파촌의 췌장염 보호 효과가 NQ01 효소의 활성 경로를 경유하는지를 검증하기 위하여, NQ01 낙아웃 마우스에서 체중에 대한 췌장의 중량. 혈청 아밀라 아제 및 리파아제 활성 및 혈청 IL-Ι β 농도를 확인하였다.

구체적으로, NQ01 낙아웃 마우스를 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 베 타-라파촌 또는 듀니온, 및 세를레인을 투여한 후, 체중에 대한 췌장의 중량은 상 기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 췌장 중량 /체중 계산식을 통해 측정하였고, 혈청 아밀라아제 및 리파아제 활성은 상기 <실험예 3>과 동일한 방법으로 키트를 사용하 여 측정하였으며, 혈청 IL-Ι β 농도는 상기 실험예 <4-1>과 동일한 방법으로 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, NQ01 낙아웃 마우스에서는 췌장 증량 / 체중 비율 및 혈청 내 아밀라아제와 리파아제의 활성이 세롤레인군과 베타-라과촌 병용군 간의 유의성 있는 차이를 확인할 수 없었으며 , 혈청 내 IL-Ι β 농도도 두 그룹간의 별다른 차이가 없는 것을 확인하였다 (도 7) .

<실험예 7>베타-라파촌의 췌장염 치료 효과 확인

세를레인에 의해 유도된 췌장염에 대한 베타-라파촌의 치료 효과를 확인하 였다.

구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델에 세를 레인 (50 g/kg)을 1시간 간격으로 6회 복강 투여하여 췌장염을 유발한 후 세롤레인 최종 투여 6시간 뒤에 베타-라파촌을 정맥주사하고， 췌장을 절취하여 췌장조직의 형태학적 변화를 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 헤마록실린-에오신 염색을 통 해 확인하였다.

그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 세를레인군의 췌장샘 과리세포들은 부 종으로 인하여 세포가 커지고 세포 간격이 확장되어 있으며, 염증세포의 침윤과 세 포괴사 현상이 관찰된 반면, 베타-라파촌의 처리에 의해 이러한 현상들이 현저하게 억제되는 것을 확인하였고, 이를 그래프로 도식화한 결과, 세를레인에 의해 증가한 췌장 조직의 부종, 염증, 세포괴사 현상이 베타-라파촌의 처리에 의해 모두 감소하 는 것을 확인하였다 (도 8) .

<실험예 8>췌장염에 의한폐손상보호 효과 확인

<8-1>베타-라파촌의 폐손상보호 효과 확인

췌장염은 다양한 장기에 합병증 (특히 ᅳ 폐부전)을 유발하며 이 경우 약 20% 의 사망를을 보이는 위중한 질환이다. 이에， 췌장염에 의한 폐손상이 베타-라파촌 에 의해 보호되는지 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델인 C57/BL6 마우스와 NQ01 낙아웃 마우스를 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 베타- 라파촌 및 세롤레인을 투여한 후, 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 헤마특실린- 에오신 염색을 한 후， 광학현미경을 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이, C57/BL6 마우스에서는 베타-라파촌의 병용처리시 농도 의존적으로 세를레인에 의한 폐손상이 억제된 반면, NQ01 낙아웃 마우스의 경우에는 베타-라파촌을 함께 처리해도 폐손상이 보호되지 않음을 확인하 였다 (도 9) . <8-2>듀니온의 폐손상보호 효과확인

췌장염에 의한 폐손상이 듀니은에 의해 보호되는지 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 준비한 동물 모델인 C57/BL6 마우스를 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 듀니은 및 세를레인을 투여 한 후, 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 해마톡실린-에오신 염색을 한 후 광학 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이 . C57/BL6 ,마우스에서 듀니온의 병용처 리시 세를레인에 의한 폐손상이 현저히 억제됨을 확인하였다 (도 10) . 상기 결과들을 토대로 나프토퀴논계 화합물인 베타-라파촌과 듀니온은 NQ0-1을 통해 다양한 염증반응을 조절하여 세를레인에 의한 췌장염 및 췌장염 연관 폐손상을 보호하는데 우수한 효과가 있음을 확인하였다.