COMPOSITION ET PROCEDE D 'AROMATIS ATION DE PRODUITS LAITIERS. SOUCHE DE BACTERIE LACTIQUE, UTILISATION DESDITES COMPOSITION OU SOUCHE

La présente invention concerne l'industrie laitière, en particulier la fabrication de produits laitiers, et plus particulièrement la fabrication de fromages, notamment la fabrication de fromage à pâte pressée non cuite.

La fabrication des produits laitiers nécessite l'utilisation de différents microorganismes ayant des rôles spécifiques en technologie alimentaire. Notamment, les bactéries lactiques sont utilisées dans l'acidification du lait ce qui provoque la fermentation du lait en caillé. Les bactéries lactiques sont introduites dans le lait à fermenter sous formes de ferments, appelés également ferments d'acidification, cultures starter ou starters.

D'autres microorganismes sont quant à eux utilisés pour l'affinage des fromages. Dans ce cas, l'on parle de flore d'affinage, ou agents d'affinage ou encore de non-starters. Ces microorganismes permettent de transformer le caillé de lait en un produit partiellement lipolysé, protéolysé, enrichi en composé en composés aromatiques. Les composés aromatiques sont les composés développant la flaveur du fromage. Ils sont constitués par exemple d'acides aminés, d'acides gras, de peptides aromatiques ou de composés volatiles tels que des esters, des dérivés volatiles cétoniques ou soufrés etc.. L'on entend par flaveur dans le présent document, l'ensemble des sensations olfactives, gustatives et trigéminales perçues au cours de la dégustation.

Les agents d'affinage couramment utilisés sont des bactéries par exemple les bactéries du genre Arthrobacter, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Staphylococcus et Streptococcus. Ils peuvent également être des levures ou des moisissures comme par exemple les microorganismes du genre Candida, Debariomyces, Geotrichum, Kluyveromyces, Rhodotorula, Saccharomyces ou Penicilium. L'affinage est d'une grande importance pour donner de la flaveur au produit laitier.

Or l'addition d'agents d'affinage traditionnels aux ferments d'acidification est insuffisante dans certains cas pour développer la flaveur souhaitée dans le produit laitier. En effet, les agents d'affinage traditionnels ne permettent pas d'aromatiser le produit laitier suffisamment, notamment lorsque la durée d'affinage est courte ou réduite. Dans ce cas, le profil aromatique recherché n'est pas obtenu et d'autres fiaveurs indésirables comme par exemple l'amertume, peuvent apparaître.

Afin de répondre aux exigences des consommateurs et des industriels, il est devenu indispensable de trouver de nouveaux microorganismes susceptibles d'affiner et d'aromatiser les produits laitiers.

Par ailleurs, l'utilisation de microorganismes du genre Lactobacillus de type non lytique est connue.

En outre, on connaît l'utilisation agents d'affinage du genre Brevibacterium pour l'aromatisation de fromage.

Cependant, l'utilisation combinée de ces deux souches ne permet d'obtenir un affinage et une aromatisation des produits laitiers pouvant répondre aux exigences susmentionnées.

L'invention a pour but de proposer un nouveau moyen pour aromatiser des produits laitiers qui présente de nombreuses qualités et qui permet de développer la flaveur souhaitée aux produits laitiers et cela de manière significative, rapide et permanente. A cet effet, l'invention a pour objet une composition d' aromatisation de produits laitiers, notamment de fromages, comprenant au moins une combinaison de microorganismes, ladite combinaison comprenant au moins microorganisme de type lytique et au moins un agent d'affinage.

L'on entend par microorganisme de type lytique, toute bactérie d'acidification ou d'affinage présentant des propriétés enzymatiques élevées. En particulier, dans le cas présent, ce sont des microorganisme qui libèrent, par autolyse, au bout d'une durée classique d'affinage, 40 % ou plus de leurs enzymes protéolytiques intracellulaires dans leur milieu environnant en condition classique d'utilisation (c'est-à-dire dans des conditions de contraintes physiques, de salinité et de pH semblables à celle présentes dans un produit laitier).

Typiquement pour mesurer le % d'enzymes protéolytiques intracellulaires libérées dans le milieu environnant par autolyse, l'homme du métier pourra comparer l'activité intracellulaire de la dipeptidase PepD d'une quantité déterminée de microorganismes et la comparer à l'activité enzymatique de la dipeptidase PepD libérée par la même quantité de microorganismes dans le milieu environnant au bout de 24 heures à 40 ⁰ C dans un milieu tamponné à un pH de 5,8 par tampon phosphate de potassium à 0,1 M.

Les microorganismes de type lytique sont par exemple les bactéries lactiques lyriques d'acidification ou d'affinage, par exemple du genre Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus et Leuconostoc de type lytique.

Les agents d'affinage sont par exemple des bactéries et notamment les bactéries du genre Arthrobacter, Coiγnebacterium, Lactobacillus, Lactococcus,

Leuconostoc, Micrococcus, Pediococcus, Propionibacteriwn, Staphylococcus et Streptococcus. Ils peuvent également être des levures ou des moisissures comme par exemple les microorganismes du genre Candida, Debariomyces, Geotrichum, Khiyveromyces, Rhodotorula, Saccharomyces ou Penicilium. En effet, l'utilisation de microorganismes de type lytique en combinaison avec au moins un agent d'affinage pour l'affinage de produits laitiers permet d'une part de potentialiser, c'est-à-dire, d'augmenter voire de renforcer, le développement de la flaveur par rapport à une utilisation de microorganismes de flore d'affinage classique. Typiquement, le rapport en nombre microorganismes de type lytique sur agents d'affinage pourra être compris entre 30/70 et 70/30, preférentiellement le rapport pourra être compris entre 40/60 et 60/40.

Cette synergie se manifeste non seulement par l'obtention d'une quantité significativement plus élevée de composés d'aromatisation classiques dans le fromage tels que ceux du type diacétyle, 2-butanone, acétoïne, DMDS (disulfure de diméthyl), l-octén-3-ol, DMTS (trisulfure de diméthyl) et acide butyrique.

L'action de microorganismes de type lytique en combinaison avec un agent d'affinage permet en outre, par synergie avec ledit agent d'affinage, de promouvoir le développement de la flaveur par ledit agent d'affinage. Il permet notamment à Brevibacterium linens de produire davantage de composés soufrés.

De plus, l'utilisation de microorganismes de type lytique pour l'affinage de produits laitiers permet de diminuer la proportion de composés responsables de la flaveur de type amère.

Enfin, l'utilisation de microorganismes de type lytique en combinaison avec un agent d'affinage permet la production de peptides de petite taille (inférieure à IkDa), hydrophiles, qui ne sont pas produits lorsque les différentes souches sont cultivées indépendamment. Cette synergie permet donc la production de peptides différents qui confèrent des nouveaux goûts (par exemple du type bouillon de viande, umami, savoureux) au produit laitier fini. Un autre avantage de la présente invention est que le microorganisme de type lytique peut être utilisé conjointement avec des bactéries utilisées pour l'acidification de produits laitiers, c'est-à-dire avec les ferments d'acidification (par exemple du type Lactococcus lactis et/ou Streptococcus thermophilus).

Avantageusement, le microorganisme de type lytique est du genre Lactococcus ou du genre Lactobacillus, en particulier de l'espèce Lactobacillus helveticus ou Lactobacillus casei.

Avantageusement, ledit agent d'affinage est un microorganisme du genre Arthrobacter ou Brevibacterium, en particulier du genre Brevibacterium linens.

L'utilisation de la combinaison de microorganismes du genre Lactobacillus helveticus de type lytique et de microorganisme du genre Brevibacterium permet de renforcer le développement de flaveur par les microorganismes du genre Brevibacterium.

Dans un mode de réalisation préféré, ledit microorganisme de type lytique est la souche Lactobacillus helveticus LbH 210 déposée au nom de Danisco France SAS, 20 rue de Brunel, 75017 Paris, à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes) le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3554.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, ledit agent d'affinage est la souche Brevibacterium 3306 déposée au nom de Danisco France SAS, 20 rue de Brunel, 75017 Paris, à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3556.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, ledit agent d'affinage est la souche Brevibacterium 3383 déposée au nom de Danisco France SAS, 20 rue de Brunel, 75017 Paris, à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3555.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits microorganismes de type lytique et lesdits agents d'affinage sont en mélange ou en forme séparée.

Avantageusement, lesdits microorganismes de type lytique et lesdits agents d'affinage sont sous forme d'un mélange de souches lyophilisé ou congelé, ou sous forme de souches conditionnées de manière séparée.

La présente invention a également pour objet une souche Lactobacillus helveticus LbH 210 déposée au nom de Danisco France SAS, 20 rue de Brunel, 75017 Paris, à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le n° CNCM 1-3554. Cette souche permet de potentialiser la flaveur développée par les agents d'affinage d'un produit laitier.

La présente invention a en outre pour objet un procédé d'aromatisation d'un produit laitier, notamment d'un fromage à pâte pressée non cuite, comprenant l'addition d'une composition d'aromatisation dans du lait. L'addition d'une composition d'aromatisation dans du lait confère au procédé d'aromatisation d'un produit laitier un gain de temps car elle permet de réduire le temps d'affinage. En outre, elle permet de diminuer l'obtention de composés responsables de flaveurs amères indésirables ce qui limite les risques de retrait de la vente de produits laitiers ne répondant pas aux exigences des consommateurs. Dans un mode de réalisation avantageux, la concentration en microorganismes de type lytique et en agents d'affinage est comprise entre 10 ⁴ et 10 ⁸ UFC/g de produit laitier, préférentiellement d'environ 10 ⁶ UFC/g de produit laitier.

Typiquement, le rapport en nombre microorganismes de type lytique sur agents d'affinage pourra être compris entre 30/70 et 70/30, préférentiellement le rapport pourra être compris entre 40/60 et 60/40.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé, on ajoute les microorganismes de type lytique et les agents d'affinage à raison delO ⁶ à 10 ⁹ UFC par litre de lait, préférentiellement d'environ 10 ⁸ UFC par litre de lait. Préférentiellement, le lait est d'origine animale.

Enfin, l'invention a pour objet l'utilisation d'une composition comprenant une combinaison de microorganismes, ladite combinaison comprenant au moins un microorganisme de type lytique et au moins un agent d'affinage pour l'aromatisation de produits laitiers, notamment de fromages.

L'utilisation d'une telle composition pour l'aromatisation de produits laitiers permet d'obtenir un produit laitier affiné de manière significative, c'est-à-dire significativement affiné par rapport à un procédé d'aromatisation classique. En outre, cette utilisation permet d'obtenir un produit laitier affiné ne présentant pas de mauvais goûts ou de mauvaises odeurs.

Dans un mode de réalisation avantageux, ledit au moins un microorganisme de type lytique utilisé est préférentiellement du genre Lactobacillus helveticus de type lytique, et ledit agent d'affinage utilisé est préférentiellement du genre Brevibacterium.

Avantageusement, le produit laitier est choisi parmi les fromages à pâte molle, à pâte pressée non cuite, à pâte cuite, à pâte fraîche, à pâte persillée, les fromages fondus et « analogue cheese » (à base poudre de caséine et/ou de protéines sériques), des fromage modifiés par voie enzymatique ou « enzyme modified cheese », le Cottage cheese, ainsi que le yaourt, la crème maturée, les boissons lactées, un lait fermenté, un rétentat de produit laitier, un hydrolysat de protéines végétales, par exemple de soja, ou un lait infantile.

Encore plus avantageusement, le produit laitier est de type fromage à pâte pressée non cuite, et préférentiellement de type Gouda ou Cheddar. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative détaillée qui va suivre, de plusieurs modes de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs, en référence aux figures 1 et 2 annexées. La figure 1 représente la comparaison de l'effet sur la production de produits aromatiques de l'utilisation d'une composition d'aromatisation selon l'invention et d'une composition d'aromatisation classique.

La figure 2 représente les chromatogrammes obtenus par HPLC des échantillons de fromage fabriqués et traités avec les souches Brevibacterium 3306, Brevibacterium 3383, et la souche Lactobacillus helveticus LBH 210.

L'invention concerne une composition d'aromatisation de produits laitiers, notamment de fromages, comprenant au moins une combinaison de microorganismes, ladite combinaison comprenant au moins microorganisme de type lytique et au moins un agent d'affinage.

Les microorganismes de type lytique sont par exemple les bactéries lactiques lytiques d'acidification ou d'affinage, par exemple du genre Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus et Leuconostoc de type lytique.

Avantageusement, le microorganisme de type lytique est du genre Lactobacillus et préférentiellement Lactobacillus helveticus. Le genre Lactobacillus helveticus appartient à la famille bactéries lactiques. Les bactéries appartenant à ce genre sont des bactéries gram positive, et généralement catalase négative, homofermentaires ou hétérofermentaires et produisant du lactate D ou L à partir d'hydrates de carbone.

Les bactéries Lactobacillus helveticus de type lytique sont naturellement présentes dans le lait et largement utilisées dans l'industrie agroalimentaire, et notamment dans l'industrie du fromage. De préférence, ledit microorganisme de type lytique est la souche

Lactobacillus helveticus LbH 210 déposée à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3554.

Les agents d'affinage sont par exemple des bactéries et notamment les bactéries du genre Arthrobacter, Corynebacteήum, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Staphylococcus et Streptococcus. Ils peuvent également être des levures ou des moisissures du genre Candida ou Debariomyces, Geotrichum, Kluyveromyces, Rhodotorula, Saccharomyces ou Penicilium.

Avantageusement, ladite composition comprend en outre au moins un microorganisme du genre Arthrobacter, Brevibacterium, et avantageusement Brevibacterium linens.

Le genre Brevibacterium appartient à la famille Coryneformes. Les bactéries appartenant à ce genre sont des bactéries gram +, hétérofermentaires.

Dans un mode de réalisation avantageux, ledit agent d'affinage est la souche Brevibacterium 3306 déposée à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3556.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, ledit agent d'affinage est la souche Brevibacterium 3383 déposée à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3555.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits microorganismes de type lytique et lesdits agents d'affinage sont en mélange ou en forme séparée.

Avantageusement, lesdits microorganismes de type lytique et lesdits agents d'affinage sont sous forme d'un mélange de souches lyophilisé ou congelé, ou sous forme de souches conditionnées de manière séparée.

La souche Lactobacillus helveticus LbH 210 déposée à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3554 peut également être ajoutée séparément de l'agent d'affinage.

L'utilisation d'une composition d'aromatisation de produits laitiers selon l'invention se fait de manière classique pour l'homme du métier. Dans le cas de la fabrication d'un produit laitier, celle-ci sera réalisée de manière habituelle dans ce domaine, et notamment par fermentation d'un produit laitier par incorporation d'un ferment.

Notamment, il est possible de mélanger, préalablement à l'ensemencement du milieu à fermenter, qui est en l'occurrence du lait, la combinaison comprenant au moins un microorganisme de type lytique et au moins un agent d'affinage directement avec le ferment d'acidification lactique ou grand levain.

Il est cependant possible d'incorporer séparément ou simultanément dans le milieu à fermenter, la composition d'aromatisation comprenant au moins un microorganisme de type lytique et au moins un agent d'affinage et le ferment lactique. Les microorganismes de type lytique et les agents d'affinage peuvent être incorporés, de manière simultanée ou séparée, sous forme sèche, lyophilisée ou congelée.

La présente invention a en outre pour objet un procédé d'aromatisation d'un produit laitier, notamment d'un fromage à pâte pressée non cuite, obtenu par un procédé comprenant l'addition d'une composition d'aromatisation dans du lait. Le produit laitier comporte du lait d'origine animale et/ou végétale. A titre de lait d'origine animale, on peut citer le lait de vache, de chèvre, de brebis, de chamelle, de bufflesse ou leur combinaison.

A titre de lait d'origine végétale, on peut citer toute substance fermentescible d'origine végétale qui peut être utilisée selon l'invention notamment provenant des graines de soja, de riz, de coco ou de malt.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé, qu'on ajoute les microorganismes de type lytique et les agents d'affinage à raison de 10 à 10 ⁹ UFC par litre de lait, préférentiellement d'environ 10 ⁸ UFC par litre de lait. Typiquement la proportion de microorganismes de type lytique sera comprise entre 30 et 70% par rapport à la quantité totale d'agents d'affinage sera comprise entre Ainsi dans le produit laitier fini, la concentration des microorganismes de type lytique et des agents d'affinage est comprise entre 10 ⁴ et 10 ⁸ UFC/g de produit laitier, préférentiellement d'environ 10 ⁶ UFC/g de produit laitier.

Avantageusement, le produit laitier est choisi parmi les fromages à pâte molle, à pâte pressée non cuite, à pâte cuite, à pâte fraîche, à pâte persillée, les fromages fondus et « analogue cheese » (à base poudre de caséine et/ou de protéines sériques), des fromage modifiés par voie enzymatique ou « enzyme modified cheese », le Cottage cheese, ainsi que le yaourt, la crème maturée, les boissons lactées, un lait fermenté, un rétentat de produit laitier, un hydrolysat de protéines végétales, par exemple de soja, ou un lait infantile.

Encore plus avantageusement, le produit laitier et de type fromage à pâte pressée non cuite, et préférentiellement de type Gouda ou Cheddar.

Parmi les fromages, on peut citer entre autres le Banon, le Bleu d'Auvergne, le Brie, le Boulette d'Avesne, le Carphilly, le Camembert, le Cantal, le Carré de l'Est, le Chanco, le Charource, le Cheddar, le Chesire, le Cotija, le Coulommiers, le

Danbo, le Dauphin, le double Gloucester, l'Edam, l'Emmenthal, l'Epoisse, la Fêta, le

Gorgonzola, le Gouda, le Jarisberg, le Limberger, le Livarot, la Mimolette, le

Manchego, la Maroilles, le Monterey Jack, la Mozzarella, le Munster, le type

Parmesan, le Pelardon, le Pont-1'Evêque, la Raclette, le Red Leicester, le Roquefort, le Saint-Félicien, le Saint-Marcellin, le Saint-Nectaire, le Saint-Paulin, le Stilton, le

Tilsit, la Tomme de Savoie, le Vacherin Mont-d'Or et le Vieux-Lille.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.

Préparation du fromage du type Cheddar :

Un lait est reconstitué à partir de lait en poudre écrémé incorporé à 930 g pour 8.36 L d'eau. Ensuite une solution aqueuse chlorure de calcium (Calciol® de Marshall à 500 g/L d'eau) est ajoutée à une concentration de 0, 35mL/L de lait reconstitué.

Le milieu de fermentation ainsi préparé est prêt à être inoculé par des ferments d'acidification (Choozit RA073® de Danisco) et soit une composition

d'aromatisation selon l'invention (comportant une souche de Lactobadllus helveticus de type lytique LBH 210 associé à deux souches de genre Brevibacteήum 3383 et 3306) ou soit une composition d'aromatisation classique (comportant une souche de Lactobadllus de type non lytique LB 67 associé à deux souche de genre Brevibacteήum 3383 et 3306).

Deux cuves de 10L de type Pierre Guerrin® sont ainsi utilisées. Puis une quantité de crème est ajoutée (1000g par cuve) afin d'obtenir 33 grammes de matières grasses par litre de lait. La température est maintenue à 32°C et la vitesse d'agitation à 5 (selon la cuve de 10L de type Pierre Guerrin®). Dans la première cuve, sont ajoutés simultanément : la souche lytique LBH

210 à raison de 1><1O ⁸ UFC/L de milieu de fermentation, les souches 3383 et 3306 à raison de 1><1O ⁸ UFC/L de milieu de fermentation et un ferment d'acidification classique (Choozit RA073® de Danisco) à raison de 2xlO ⁹ UFC/L de milieu de fermentation. Dans la seconde cuve, sont ajoutés simultanément : la souche non lytique

LB67 (déposée à la CNCM le 20 janvier 2006 sous le numéro CNCM 1-3553), à raison de 2xlO ⁸ UFC/L de milieu de fermentation, les souches 3383 et 3306 à raison de l ^χ l0 ⁸ UFC/L de milieu de fermentation et un ferment d'acidification classique (Choozit RA073® de Danisco) à raison de 2 ^χ lO ⁹ UFC/L de milieu de fermentation. Puis dans chacune des cuves, le mélange est ensuite soumis à maturation pendant 45 minutes sous agitation (vitesse 5).

De la présure, ayant une concentration de 520 mg de chymosine par litre de présure, est ajoutée dans le mélange après maturation à raison de 25mL par 100 litre de lait. Le pH est enregistré au cours de la fabrication à l'aide d'un pH-mètre. La coagulation se déroule pendant 20 à 30 minutes.

Après coagulation, le caillé obtenu est laissé au repos 20 minutes et est ensuite découpé. Le découpage se fait longitudinalement et transversalement. L'ensemble formé du caillé et du sérum, est chauffé de 32°C à 42°C et soumis à une agitation de vitesse 5 pendant 120 minutes. Le sérum qui se forme est soutiré de manière continue.

Le caillé de chacune des cuves est placé dans deux moules de 14 cm de diamètre.

Puis le caillé de chacun des moules est découpé en pièces égales (4 à 8) environ toutes les 15 minutes pour soutirer du sérum, puis retourné. A partir du moment où le pH de chaque caillé atteint 5,2, chaque caillé est découpé en petits morceaux (de moins d'un centimètre de diamètre) et 3% de NaCl en masse par rapport à la masse du caillé est ajouté. Puis chaque caillé est mélangé et

moulé dans un moule de 14 cm de diamètre et pressé successivement à différentes pressions. La pression exercée initialement est de 1,5 bars pendant 30 minutes puis cette pression est augmentée toutes les 30 minutes de 0,5 bar. Enfin, la pression de 3 bars est maintenue toute une nuit. 24 heures après l'inoculation, chaque caillé moulé est pesé et emballé en film sous vide, de manière imperméable.

Puis les fromages sont stockés à 4 ⁰ C pendant environ une semaine. Ensuite, des échantillons de fromage sont soumis à une procédure d'affinage accélérée par mise en suspension (« slurrying »), selon la méthode IBT standard method PM 4.0. Cette méthode est utilisée de façon à comprendre dans une échelle de temps réduite à semaine (au lieu de trois mois pour un affinage classique), les mécanismes biochimiques de l'affinage. Dans ces conditions les processus enzymatiques impliqués dans l'affinage sont accélérés.

Pour cela, un échantillon de 100g fromage (fabriqué avec une composition d'aromatisation selon l'invention ou une composition d'aromatisation classique) est broyé dans 5OmL d'eau en présence de Ig de citrate de trisodium et de 300mg d'acide ascorbique. Chaque mélange est ensuite mis sous vide pendant une semaine à

30°C de façon à obtenir une suspension dite finale.

Puis des essais ont été effectués sur la suspension finale obtenue. Le premier essai consiste en quantifier la présence d'acide aminés dans chacune des suspensions.

Les résultats sont donnés dans le tableau 1 suivant.

Tableau 1 : Com araison de la uantité d'acides aminés obtenue avec des

En présence de microorganismes lytiques, on obtient une plus grande quantité d'acides aminés et donc une plus grande flaveur, les acides aminés étant fortement impliqués dans le développement de la flaveur d'un produit laitier.

Ensuite, un échantillon de chacune des suspensions finales (obtenue avec une composition d'aromatisation selon l'invention ou avec une composition d'aromatisation classique) est analysé par chromatographie en phase gazeuse (CPG)

de façon à déterminer les composés volatiles impliqués dans le développement de la flaveur d'un produit laitier. Protocole de la CPG :

Dans un flacon à sertir de 10g sont introduits : 3 g chlorure de sodium Normapur à 99,5%, 5g d'échantillon à analyser (dans le cas présent 5g de suspension dite « finale », et 2 mL d'eau ultra pure.

L'extraction est réalisée par un dispositif de type Headspace HS40XL® de Perkin-Elmer. Le temps de chauffage appliquée est de 30 minutes, la température de l'échantillon de 6O ⁰ C, la température de l'aiguille de 8O ⁰ C et la température de transfert de 100 ⁰ C.

La séparation et le dosage est effectuée par un dispositif de type CPG Autosystème XL® de Perkin-Elmer. La colonne utilisée est de type CP-SIL5CB (Varian®), de type Wcot fused silice 30m ^χ 0,32mm (diamètre interne).

La phase stationnaire est constituée de 100% de diméthylpolysiloxane. L'épaisseur du film est de 0,5μm.

Le gaz vecteur est de l'hélium de débit égal à l,6mL/minute. Le cycle appliqué est le suivant : 4O ⁰ C pendant 2 minutes puis 10 ⁰ C jusqu'à 160 ⁰ C, puis 16O ⁰ C pendant 3 minutes.

Le détecteur est un détecteur de type à ionisation de flamme. La température maximale appliquée est de 250 ⁰ C.

Les résultats sont présentés par la figure 1.

La surface des pics de chromatographie obtenue est quantifiée selon des unités arbitraires qui sont représentées sur l'axe des ordonnées du graphique de la figure 1. L'ensemble des composés volatiles suivants : c'est-à-dire le diacétyle, le 2- butanone, l'acétoïne, le DMDS, le l-octén-3-ol, le DMTS et l'acide butyrique composé volatile sont présents en quantités significativement plus importantes lorsqu'une composition incorporant une souche de Lactobacillus helveticus LBH 210 (souche lytique) combinée à deux souches de Brevibacterium est utilisée que lorsqu'une composition incorporant une souche de Lactobacillus helveticus LB 67 (souche non lytique) combinée à deux souche de Brevibacterium est utilisée. Ces résultats sont d'autant plus significatifs qu'il a été incorporé une quantité deux fois plus importante de Lactobacillus helveticus non lytique que de Lactobacillus helveticus lytique comparativement dans les échantillons. Enfin, différents échantillons de fromage sont analysés par chromatographie en phase liquide en phase inverse de façon à déterminer les composés non volatiles impliqués dans le développement de la flaveur d'un produit laitier.

Les différents échantillons de fromage sont issus de fromages fabriqués soit avec une composition d'aromatisation comportant Lactobacillus helveticus LBH 210 (souche lyrique) en présence de Brevibacterium 3383 et 3306, soit Lactobacillus helveticus LBH 210 (souche lytique) uniquement, soit Brevibacterium 3383 uniquement, ou soit Brevibacterium 3383 uniquement. Protocole de l'HPLC utilisée :

5 g de fromage de chaque échantillon préalablement pesé sont broyés au Valentin dans un tube de 50ml. Le fait de broyer chaque échantillon permet d'optimiser l'extraction et d'avoir un échantillon homogène. Puis 2OmL de tampon citrate pH3.0 est ajouté au fromage broyé.

L'échantillon est ensuite homogénéisé à l'Ultra-Turrax pendant 20 secondes. L'opération est renouvelée jusqu'à obtention d'un mélange homogène. Puis le tube est ensuite placé dans l'étuve à 4O ⁰ C pendant 1 heure. Après cette étape, la matière grasse se trouve en surface. Afin de mieux l'extraire, il est conseillé de placer les tubes dans la glace afin de figer la phase grasse.

Une fois la phase grasse extraite, l'échantillon est centrifugé à 3000rpm pendant 35 minutes.

Après centrifugation, les peptides se retrouvent dans le surnageant. Pour effectuer l'analyse par HPLC, il faut prélever ImI de surnageant, le placer dans un tube Eppendorf® de 1,5ml et centrifuger à 13000rpm (tour par minutes) pendant lOminutes.

Après centrifugation, ImI de surnageant est prélevé à l'aide d'une seringue à filtration et filtré à travers un filtre Acrodisc Nylon 13-0.45μm. Récupérer le filtrat dans un tube à HPLC et sertir. L'échantillon est alors prêt à être analysé par chromatographie haute performance en phase liquide inverse (reverse phase HPLC) par l'utilisation d'un gradient Eau/Acetonitrile sur une durée de 80 minutes avec l'utilisation d'une colonne Phenomenex Jupiter® lOμm C18 de 300à 250x4.6mm.

En outre, des échantillons de fromage fabriqués et traités de manière analogue que les échantillons évoqués précédemment, à l'exception près que les microorganismes inoculés simultanément avec ferment d'acidification sont soit des souches Brevibacterium 3306, soit des souches Brevibacterium 3383, ou encore soit des souches Lactobacillus helveticus LBH 210.

Les résultats sont présentés sur la figure 2 et le tableau 2 suivant.

Tableau 2 : Comparaison de la quantité de certains composés non volatiles impliqués dans la flaveur du fromage de type Cheddar dans différents échantillons :

II a été obtenu que, en comparaison avec l'utilisation des souches isolément, avec l'utilisation de la combinaison des souches Brevibacterhim 3306 + Brevihacterium 3383 + Lactobacillus helveticus LBH 210 :

• on obtient une forte diminution de peptides de grande taille hydrophobes (dont le temps d' elution est compris entre 45 et 51 minutes sur la figure 2). Ces peptides confèrent généralement de l'amertume au produit laitier et sont à éviter,

• on obtient une quantité significative de peptides de petite taille, hydrophiles, dont la nature est modifiée (on obtient un seul pic à environ 17 minutes dont l'aire est équivalente à la somme des aires deux pics obtenus lors de l'utilisation séparée des souches d'affinage, sur la figure 2). Ces peptides confèrent généralement des flaveurs appréciées dans les produits laitiers (tels que le goût de bouillon de viande ou des goûts savoureux par exemple) et

• on obtient l'apparition de peptides de petite taille hydrophiles non présents lors de l'utilisation des souches isolément (dont le temps d'élution est à environ 18 minutes sur la figure 2). Ces peptides appartiennent à la gamme des peptides qui confèrent généralement des flaveurs appréciées dans les produits laitiers et permettent de varier ou affiner encore la flaveur obtenue lors de l'affinage.

Bien que l'invention ait été décrite en relation avec plusieurs modes de réalisation particuliers, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.