| WO/2021/130728 | LIQUID COMPOSITIONS COMPRISING TERPENES AND CANNABINOIDS |
| JP2021521277 | Hemp extract for the treatment of pain in animals |
| JPH0912451 | ANTI-HELICOBACTER PYROLII AGENT |
LEE YI KUEN (CN)
ZHANG LI WENDY (CN)
ZHENG YUZHONG (CN)
DING XIANTING (US)
TSIM KARL WAH-KEUNG (CN)
HO CHIH-MING (US)
UNIV CALIFORNIA (US)
| CN101780069A | 2010-07-21 | |||
| CN1690056A | 2005-11-02 |
北京天昊联合知识产权代理有限公司 (CN)
| 权利要求书 1. -种川干促进红细胞生成的组合物， 其含 两种以上的作为 活性成分的类黄酮化合物； 其中所述的类黄酮化合物山下式 I所示： 其中， ！^为 12为 H或羟 ； 并 J .在制备所述的组合物时，所述的类黄酮化合物足以纯化的形 式使川的。 2. 根据权利耍求 1 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异 酮以及选〔I刺芒柄花素、芒柄花 ΐί·和毛蕊异黄酮 1'ί:中的个：少 - 种。 3. 根据权利要求 2 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷。 4. 极据权利要求 3 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和 毛蕊异黄酮 Γ的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。 5. 报据权利要求 4 所述的组合物， 中， 所述的毛蕊异货酮和 毛蕊异 酮^的摩尔比为 1:1。 6. 根据权利要求 2 所述的组合物， ¾中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮和芒柄花苷。 7. 根据权利要求 6 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和 芒柄花 ΐ'ί·的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。 8. 报据权利要求 7 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和 芒柄花苷的摩尔比为 1:1。 9. 根据权利要求 2 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷。 10. 根据权利要求 9所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷的摩尔比为 (4-6) ： (0.5-1.5) ： (20-30) 。 11. 根据权利要求 10所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺 柄花尜和芒柄花苷的摩尔比为 5:1:25。 12. 根据权利要求 2所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮 :。 13. 根据权利要求 12所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺 t柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为（4-6)： (0.5-1.5)： (0.5-1.5) ： (0.5-1.5) 。 14. 根据权利要求 13所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花 ^和毛蕊异黄酮 的摩尔比为 5:1:1:1ο 15. 根据权利要求 1-14中任意一项所述的组合物， 其中， 所述的 ϊ\ \合物 ¾药物组合物或膳食补充用纽合物， 并包含药川辅料。 16. 根据权利要求 15 所述的组合物， 其中， 所述的组合物的剂 動 U服液。 17. 根据权利要求 1 - 16 中任意一项所述的组合物在制备用于促 进红细胞生成的药物或膳食补充剂中的用途。 18. 报据权利要求 17 所述的川途， 其中， 所述的药物或膳食补 充剂川 "J '-预防和 /或治疗缺氧症和 /或贫血。 |
201210369803.5的优先权。 技术领域
本发明属于制药领域，具体而言，涉及一种用 于促进红细胞生成、 以及预防和治疗贫血和 /或缺氧症的药物组合物或膳食补充用组合物 及 JL:川途。 背景技术
红细胞主耍在人体的骨髓 （bone marrow ) (特别是红骨髓） 内 生成， fj'髓中的千细胞先分化为红细胞原祖细胞， 在促红细胞生成素
( erythropoietin， 也称为红细胞生成索 )的作用 K形成成熟的红细胞。 人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌 的 -种激素样物质。
贫血 ϋ指人体外周血中红细胞容积的减少，低于正 范围下限的 -种常见的临床症状。 贫血包括化疗诱导性贫血 （CIA ) 和 ^性贫血 等。 中， 在化疗诱导性贫血中， 化疗药物在杀灭大量癌细胞的同吋， 也杀伤了 :ι [ ·:常组织细胞而引起不同程度的 -†髓抑制作用， 因此化疗药 物足通过抑制骨髓造血细胞而引起贫血。超过 60%的癌症病人接受化 疗后都忠有贫血， 严重地降低了病人的机体功能和生活质量。 大多数 化疗药物会引起胃部不适， 造成病人呕吐和恶心， 严重影响食欲并导 致病人体: :减轻， 原困之一就是化疗诱导性贫血 (CIA)。 贤性贫血足 指各种闪素造成肾脏促红细胞生成素产 不足或尿^症血浆中 匕 尜物质 I：扰红细胞的生成和代谢而导致的贫血， 足慢性 ^功能不个 发^到终末期常见的并发症。 病人体内红细胞生成减少、 红细胞 命 缩短以及红细胞丢失增加， 影响病人的血液代谢循环。 通常治疗化疗 诱导性贫血和肾性贫血的方法为输血和透析， ii〖是输血可能会带来严 ： 的临床或亚临床副作用， 病人在接受治疗的过程中也会遭受极大的 痛苦。
缺氧 （hypoxia , 或称为缺氧症） 是指因组织的氧气供应不足或 川氧障码， 而导致组织的代谢、 功能和形态结构发生异常变化的病理 过程。 缺氧症 -般表现为： 头暈、 头痛、 耳鸣、 眼花、 四肢软弱无力； 或者产生恶心、 呕吐、 心慌、 气短、 呼吸急促、 心跳快速无力。 红细 胞是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主耍 的媒介， 因此增加机体 内红细胞的: ¾可以有效改善缺氧状态 （参见参考文献： "促红素治疗 新^儿缺氧缺血性脑病疗效分析， 郭志梅等， 临床军医杂志， 2008 , 5 " 及 " EPO对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 NSE表达的影响， 刘青，
¾志等， 暨南大学学报： 自然科学与医学版， 201 1， 6 " ) 。
前临床治疗化疗诱导性贫血和肾性贫血以及缺 氧症最有效的 药物为红细胞生成刺激物（ESAs ) ， 主要为人工重组促红细胞生成素 ( recombinant EPO, rHuEPO ) ， 促红细胞生成素 （ EPO ) 足哺乳动物 调节红细胞生成的 要调控因子， 要由肾脏和肝脏产生， 在缺氧状 态下如果无法提升血液中的 EPO含：默将会导致贫血的发生。 EPO 的 合成表达 ：耍受缺氧诱导因子 ( HIF ) 的调控， HIF对于红细胞 4·:成、 Jin. \ 生、细胞代谢等多种过程都具有调节作川。在 缺氧环境下， HIF 选择性地结合到 EPO基因的低氧响应元件（ HRE )― 1：， 进而 'j I发 EPO ¾因的转 · ¾达。 有关可参见参考文献： " Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- l a, Ken Y.Z. Zheng et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1 , 59, 1697- 1704 " 。
ESAs治疗化疗诱导性贫血和肾性贫血: 要通过皮下注射 ΕΡΟ来 增力 11病人的红细胞水平， 可以有效减少病人的输血次数。 许多临床试 验农明皮下注射剂量为 5000 IU/天的人工 组促红细胞牛-成索 j以有 效的增加红细胞水平并减少病人的输血次数。 「I前 I 1J面― h冇多种基 f i:PO的药物， 美国 Amgen公司（位于美闺加州 Thousand Oaks市）拥有 多项关于 EPO的专利，其产品之 Epogen ® (epoetin alfa)是 1 前被最 广泛使川的 EPO药物。 但是 EPO的应用而临着费用^昂以及严: 副 作川的 题， 如心脏疾病、 血块形成、 高血压、 过敏反应等。 美闺食 药品监 符理局（FDA)多次发布关； 控制 ESAs 剂: 使用的报告来 提^ EASs使用的安全性。 因此幵发一种价格低廉、 毒副作用小的药 物， 对 减轻癌症病人和肾病病人的痛苦具有非常 : 要的 义。
中药应用在贫血治疗上有悠久的历史， 作为纯天然植物药物， 中 药补血配方通常无毒副作用， 可以长期服用。 在用于贫血治疗的中药 补血配方， 经常使用黄芪作为主要成分进行配制。 黄芪的药川迄今已 2000多年的历史， 具有补气生血的功效。 黄芪含皂甙、 蔗糖、 多 糖、 多种氨基酸、 叶酸及硒、 锌、 铜等多种微量元素， 具 许多生物 学和 学功效， 如保肝、 生血、 抗氧化、 抗卨血压、 增强免疫等。 ί ^山于中药的成分复杂， 通常有几十种甚 上 种的化合物组成， 难 以对 进行药理学研究和优化。 中药的药材质量控制也足尤其重要， 产地、 候、 年份等因素都能影响中药材的质量， 从而影响药物的 W 效性和稳定性。 尽管在国内市面上有许多治疗贫血的中药药品 ， 但是 π治疗效果也足良莠不齐， 因此对中药进行优化， 解决质: ¾：控制等难 题对 f中药的幵发和推广具有重要的意义。
近的研究表明，黄芪中的类黄酮成分能够有效 刺激肾细胞中促 红细胞 1 成素的表达， 从而提高血液中的红细胞水平来改善和治疗贫 血。 中^要的四种具有促进促红细胞生成素农达的 黄酮化合物为 刺 柄花素、 芒柄花苷、 毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮 ΐΐ : 。 ¾近的研究 明， 儿种从黄芪中分离的类黄酮化合物在单独使川 时 I ij以增强细胞低 親反 /、V:兀件 ( HRE ) 的转录活性， 从 lilj促进促红细胞生成素的农达来 提 血液中的红细胞水平 （参见参考文献： " Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- l a. Ken Y.Z. Zheng et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1 , 59. 1697- 1704 " ) 。 似是「 前的各类黄酮化合物在单独使用时 #在药 效 限— H.使 Π]剂 M较大的缺陷。 发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提 供了一种川于促进 红细胞 4·:成的组合物及其用途。
具体而宫， 本发明提供：
(1) -种川于促进红细胞生成的组合物， 其含有两种以上的作为活 性成分的类黄酮化合物； 其中所述的类黄酮化合物由下式 I所示：
Jt:中， ！^为
R 2 为 H或羟基；
并上1.在制备所述的组合物吋，所述的类黄酮 合物是以纯化的形 式使川的。
(2) 根据 （1) 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮 以及选 ΙΊ刺芒柄花索、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷中的至少一种。
(3) 报据 （2) 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮 和毛蕊异货酮苷。
(4) 根据 （3) 所述的组合物， 其巾， 所述的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄 酮 I 的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。
(5) 根据 （4) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄 酮 ί::的摩尔比为 1:1。
(6) 根据 （2) 所述的组合物， 其巾， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮 和芒柄花^。
(7) 根 ; (6) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异 j¾酮和芒柄花苷 的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。 (8) 报据 (7) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和芒柄花 Ί 的摩尔比为 1:1。
(9)根据 （2)所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷。
(10) 根据 （9) 所述的组合物， 其巾， 所述的毛蕊异货酮、 刺芒柄 花尜和芒柄花甘 -的摩尔比为 (4-6) ： (0.5-1.5) ： (20-30) 。
(11) 根据 （10) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄 花尜和芒柄花 Π:的摩尔比为 5:1:25。
(12) 根据 （2) 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄 »i、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷。
(13) 根据 （12) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒枘 花素、芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为（ 4-6):( 0.5-1.5 ):(0.5-1.5):
(0.5-1.5) 。
(14) 根据 （13) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄 花尜、 柄花苷和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为 5:1:1:1。
( 15) 根¾ (1) - (14) 中任意 -项所述的组合物， 其中， 所述的组 合物为药物组合物或膳食补充用组合物， 并包含药用辅料。
(16) 匪 (15) 所述的组合物， :中， 所述的组合物的剂 为 1」服 液。
(17) 根据 （1) - (16) 中任意一项所述的组合物在制备用于促进红 细胞 ^- -.成的药物或膳食补充剂中的用途。
(18) 根据 （17) 所述的用途， 其中， 所述的药物或膳食补充剂用于 预防 Ι I /或治疗缺氧症和 /或贫血。 本发明的组合物与现有技术相比具有以― F优点和积极效 ¾： 木发明的组合物对增强 HRE的转 > 活性、 从而促进红细胞 '\ -成、 以及预防和治疗贫血和 /或缺氧症具有良好的协同效果， 并 显著地 降低了 ^ 性组分的川量， 价格低廉且^副作川小。 例如， 在本发 liJ 的 ·个优选的组合物中， 甚至能增加约 3倍的 HRE转 活性。 HRE转 ¾活性的增强能够直接刺激 EPO的表达， 从而达到促进红细胞生成、 以及预防并治疗贫血和缺氧症的 的。相比各活性组分单独作用和黄 芪水提液的作用效果， 本发明的组合物能够提升其 2倍的药效， 并且 所耑剂 i可低至约 0.6μΜ， 不到先前的 1/10。
附图说明
阁 1 为比较例 1 中的黄芪水提液成分作用于 pHRE- Luc 转染的 Ηΐ;Κ 293Τ 细胞时， 对 HRE转录活性的影响的 意图；
2为比较例 2 中的 4种化合物单独作用于 pHRE-Luc转染的 HEK 293T肾细胞时， 对 HRE转录活性的影响的示意图；
阁 3为试验例 1中的 pHRE-Luc载体的图谱示意图。 具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本 发明作进一歩说 明， 似这并非是对本发明的限制， 本领域技术人员根据本发明的基本 思 ， I >j'以做出各种修改或改进，但是只要不脱离 本发明的基本思想， 均在本发明的范围之内。
本文中所述的治疗是指为使有 4:.命的人体或者动物体恢复或获 得健康或减少痛苦， 进行阻断、 缓解 （或改稗） 或者消除病因或病灶 的过程。
本文中所述的毛蕊异黄酮的英文名称为 Calycosin 或 7,3'-dihydroxy-4'-methoxyisoflavone ; 分子式为 C 16 H 12 O 5 ; 分 为 284.26348； 毛蕊异黄酮 ^ :
化学式 II
I I前毛蕊异黄酮已知的药理作用如下： （1 )提, 免疫功能； ( 2 ) 增强抗氧化、 抗辐射和抗癌作用； （3 ) 保护心脑血管、 肝脏、 肾脏 和肺脏作用； （4 ) 保护脑细胞、 提高记忆力； （5 ) 抗菌及抑制病毐 作川； （6 ) 降血脂、 降血糖、 减少糖尿病并发症等。 本文中所述的刺芒柄花素也称为 7-羟基 -4' - 氧基 ^黄酮、 芒柄 花 J¾ 素 ； 英 文 名 称 为 Formononetin 、 7-Hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)chromone 、 7-Hydroxy-4'- methoxyisoflavone. 或 Dadein 4'-methyl ether-, CAS ¾ "j 485-72-3； 分 f式为 C 16 H 12 O 4 ; 分子量为 268.26 ; 刺芒柄花素的化学式如下化学 式 III所示：
H.
化学式 III
刺芒柄花素易溶于甲醇、 乙酸乙酷、 乙醚、 稀碱溶液， 难溶于水。 可以从植物中提取刺芒柄花素， 也可通过化学方法合成。 例如， 合成 方法可参见参考文献： " J.Agric.Food Chem.. EN;9.1994,42, 1869- 1871 " 。 I I前刺 柄花素已知的药理作用如下： （1 ) 抗癌作用： 可 防治乳腺癌、 前列腺癌以及结肠癌； ( 2 ) 雌激尜作川： 能增加小 动物了'ώ'的: Φ: ， 但雌激素作用是很弱的， 作用不及同类的异黄酮 染料木尜（金雀异黄素）、 大豆黄素； （3 ) 对 Triton WR- 1339引起的 雄性 1Ί化病大鼠高血脂有降血脂作用； （ 4 ) 临床用作利尿剂。
本文中所述的芒柄花苷也称为刺芒柄花尜 -7-葡 糖甙； 英文名 称为 Ononin、 或 Formononetin-7-O-beta-D-glucopyranoside ; CAS - '' 为 486-62- 4 ; 分子式为 C 22 H 22 O 9 ; 分子量为 430.40 ; 芒柄花 :ίΐ的化学 式如下化学式 IV所示：
化学式 IV
本文中所述的毛蕊异黄酮卄也称为毛蕊异黄酮 葡 ¾ί糖 、 毛蕊 酮 -7-O-p-D 葡萄糖苷； 英文名为 Calycosin-7-glucoside、 Calycosin-7-O-P-D-glucoside、 3',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavone-7- beta-D-glucopyranoside、 Calycosin 7-O-beta-D-glucoside、 Calycosin 7-beta-D-glucopyranoside、 或 Calycosin-7- O-beta-D-glucopyranoside ; 分 M为 446.40 ; CAS号为 20633-67-4， 毛蕊异黄酮 : ί 的化学式如 下化学式 V所示：
化学式 V
本发明的 Η的在于提供一种含有类黄酮化合物的组合物 其用 途。
本发明人通过实验发现： 当将毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 柄花 i I· il I毛蕊异黄酮苷中的两种或多种进行组合吋， 所得到的组合物的各 ^分 ¾ 出了出人意料的协同作用， 所得到的组合物在提高血液中的 红细胞水平方面的效果优子各组分单独使用的 效果。在此发现的 础 上， 本发明人进 -步得到了本发明的技术方案。
体而言， 本发明提供了- -种用于促进红细胞生成的组合物， 其 含冇两种以上的作为活性成分的类黄酮化合物 ； 其中所述的类黄酮化 合物山下式 I所小- :
其中， 1^为
R 2 为 H或羟 ¾ ; 并且在制备所述的组合物时，所述的类黄酮化 合物是以纯化的形 式使川的。
所述的类黄酮化合物的纯化) - 式可商购得 ¾ iJ (例如可得 四川维 克奇生物技术有限公司），也可使用本领域巳 知的纯化方法进行制备。
巾， 特别说明的是， 式 I中， ¾ R,为羟基， 1 2 为 11吋， 所述 的类黄酮化合物为刺芒柄花素；
式 I 中， ^ 为羟基， R 2 为羟基时， 所述的类黄酮化合物为毛 蕊 黄酮；
式 I中， 当！^为 ， R 2 为 Η时， 所述的类黄酮化 物为芒柄花苷；
式
I屮， ^！^为 ， R 2 为羟基时， 所述的类黄酮 化合物为毛蕊异黄酮苷。
在本发明的组合物中， 毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛 蕊异 嗣 ff的使用浓度可以分别为 0.016-10μΜ。
优选的是， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮、 以及选 f:1刺芒枘花 ϊ、'. : 柄花 'f和毛蕊异黄酮苷中的至少一种。
优选的是， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮 苷。 更 优选的是， 所述的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为 （0.016-2)： (0.016-2) ， 31优选为 1:1。
优选的是， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮和芒柄花卄。 更优选 的 ，所述的毛蕊异黄酮和芒柄花苷的摩尔比为（ 0.016-2 )： ( 0.016-2 )， W优选为 1:1。
优选的足， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮、 剌芒柄花索和 >'.：柄 花 l 。 更优选的是， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷的摩 尔比为 (4-6) ： (0.5-1.5) ： (20-30) ， 更优选为 5:1:25。
优选的足， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄 花 Π : 和毛蕊异黄酮 : 。 更优选的是， 所述的毛蕊异黄酮、刺 ^柄花尜、 芒柄花 : Π : 和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为 ( 4-6 ) ： ( 0.5- 1.5 ) ： ( 0.5- 1.5 ) ： ( 0.5- 1 .5 ) ， 更优选为 5: 1 : 1 : 1。
优选的是， 本发明的组合物中还可包含其它活性成分， 如， 维生 尜
优选的是， 本发明的组合物为药物组合物或膳食补充用组 合物， 并包含药川辅料。
本领域技术人员可以根据需要对药用辅料的种 类和用量进行选 择， 以制成所需的药物或膳食补充剂。 本发明的组合物中可采用本领 域公知的药用辅料， 包括但不限于 （例如） 参考文献： " 《药剂学》 (第四版） ， 毕殿洲主编， 人民卫生出版社 2001 年出版" 中所披露 的药川辅料。
所述的药用辅料包括本领域已知的可药用载体 ， 例如聚乙二醇 类、 聚维酮类、 表面活性剂类 （如泊洛沙姆 188 ) 、 ^机酸类 （如酒 石酸、 琥珀酸等） 、 糖类 （如右旋糖、 半乳糖、 蔗糖等） 与醇类 （廿 露醇、 山梨醇、 木糖醇等） 、 纤维素 （如乙基纤维素、 羧甲乙纤维素 等） 、 聚 W烯酸树脂类等。
本发明的组合物可以口服或者非口服的形式施 用。本领域技术人 W能够理解的是， 施用量根据年龄、 体重、 症状、 治疗效果、 施用方 法、 处理时问等而不同。 口服施用时可采用固体、 液体等形式， 非口 服施川时 I J采用注射剂等形式。
川于 U服的固体形式可包括片剂、 丸剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒剂 等， 木领域技术人员可以根据需要选择采川下述辅 料进行制备： 填充 剂 （如淀粉、 糊精、 乳糖、 甘露醇、 微晶纤维素等） 、 吸收剂 （如硫 酸^、 磷酸氢钙等） 、 湿润剂 （如水、 乙醇等） 、 粘合剂 （如羟甲¾ 纤维索、 聚维酮、 淀粉浆等） 、 崩解剂 （如交联羧甲 ¾纤维素钠、 交 联聚维酮等）、润滑剂（如硬脂酸、滑石粉、 聚乙 ：醇、微粉硅胶等）、 矫味剂 （如甜味剂 （如蔗糖、 甜菊甙、 阿斯帕坦等） 、 芳香剂 （如香 料和香精等） 等） 、 着色剂 （如甜菜红、 焦糖、 柠檬黄等） 等。
川」 」服的液体形式 （口服液） 包括溶液剂、 乳剂、 混悬剂、 糖 浆剂等， 本领域技术人员可以根据需要选择采用下述辅 料进行制备： 溶剂 （如水、 I†汕、 二甲基亚砜 （DMSO ) 、 乙醇、 闪 醇、 聚乙 ： 醇、 脂肪油、 液体石蜡、 醋酸乙酯等） 、 矫味剂 （如甜味剂 （如蔗糖、 甜菊 、 阿斯帕坦等） 、 芳香剂 （如香料和香精） 等） 、 ^色剂 （如 甜菜红、 腿、 柠檬黄等） 、 防腐剂 （尼泊金类、 苯 酸'；苯 η'酸钠、 山梨酸等） 、 润湿剂 （如聚山梨酯类、 聚氧乙烯脂肪醇醚类等） 、 助
^；剂 （如廿油、 胶树类、 纤维素类、 硅藻土等） 、 乳化剂 （如表而活 性剂类等） 等。
优选的足， 本发明的组合物的剂型为口服液。
木发明还提供了上述任意 - -项所述的组合物在制备川丁-促进红 细胞 ^成的药物或膪食补充剂中的用途。 优选的足， 所述的药物或膳 补充剂川 "J '-改 和 /或治疗缺氧症和 /或贫血 （更优选为化疗诱导性 贫血和 1 ίί性贫血） 。 以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明 内 ， in这些例 /·不、V:被现解为对木发明保护范围的限制。
在以下例 中， 毛蕊异黄酮、 刺芒柄花索、 芒柄花^、 毛蕊异黄 i'f均可购 1'|四川维克奇生物技术有限公 π 。 试验例 1 : 构建 ΕΡΟ表达调控的离体硏究模型
木试验例釆川的^转染了 pHRE- Luc载体的 HEK293T细胞作为 liPO 达调控的离体研究模型。 转染了 pHRE-Luc载体的 HEK293T 细胞的构建过程可参见参考文献： " Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- l a. Ken Y.Z. Zheng ct al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1， 59,
1697- 1704 " ， 具体如下：
从荧 M标准生物品收藏中心 （American Type Culture Collection ( ATCC ) ， 位于美 维 尼亚州 Manassas 市） 获得人胚贤细胞 (HHK)293T细胞系， 将― I：述细胞加入 Φ:细胞培养液 (含 ϋ 10% ( v/v ) 的胎牛血.淸 ( FBS ) 、 100 U/ml的 1Ϊ霧尜以及 100 U/ml的链 素的
I 1 DMIiM培养基） 中， 放入 37 °C恒温培养箱， 控制二氧化碳浓度在 5% ( v/v ) ， 培养 24小吋。
人类促红细胞生成素 （EPO ) 基因中获取的缺氧反应元件 (HRE) (5' -TCG AGG CCC TAC GTG CTG TCT CAC ACA GCC TGT CTG ACG-3' )含冇高度保守的缺氧诱导因子- 1 ( HIF- 1 ) 结合靶点 （5' -TAC
GTG-3' ) 。 将 6个 HRE序列合成并从头到尾串联克隆到 pBI-GL载体 (可得 (：]位于美国 San Jose市的 BD Biosciences Clontech公 ) 中 ( Ά 体 歩 骤 nj' 参 照 以 下 文 献 ： " Generation of bidirectional hypoxia/HIF-responsive expression vectors to target gene expression to hypoxic cells. Post, D.E., and Van-Meir, E.G., 2001 . Gene Therapy 8,
1801 - 1807 " )，从而得到 pHRE-Luc载体（参见图 3 )，其中所述的 pBI-GL 载体本身具有 个报告基因： 萤火虫荧光素酶基因 （firefly luciferase gene ) 。 通过磷酸钙细胞转染技术， 将该 pHRE-Luc转染到培养的 HHK293T细胞中 （具体步骤可参照以下文献： " Regulation of a transcript encoding the proline-rich membrane anchor of globular muscle acetylcholinesterase: the suppressive roles of myogenesis and innervating nerves. Xie, H.Q., et al.， 2007. Journal of Biological Chemistry, 282, 1 1765- 1 1775. " ) ， 转染效率「 80%。 实施例 1
将毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷分别 ffl DMSO溶解， 配制成各 |¾的 DMSO母液 （每种 DMSO母液可分别为 3种 浓度： 50μΜ、 500μΜ、 5mM， 用来配制不同的终浓度， 以提高实验 精度） 。 针对农 1所示的每种本发明组合物， 按照其纽分及终浓度， 计 并: 取所需体积的 DMSO母液， 合并、 并用试验例 1所述的细胞 培 液稀释至 300微升， 用于下述 3次平行实验。 将所得的组合物溶液 作川 试验例 1构建的转染后的 HEK293T细胞上后， 测量所引起的荧 光索酶活性变化， 具体步骤如下：
将转染 的 HEK293T细胞种于 24孔培养板， 毎个孔巾细胞数为 3 万个， 细胞培养液体积为 500微升， 于一天后吸走原^的细胞培养液， 力 11入 400微升新鲜的细胞培养液， 3小时后再加入上述含有本发明组合 物的细胞培养液 100微升， 从而每孔总体积为 500微升， 并且每种组合 物中的各组分在该 500微升细胞培养液巾的浓度为表 1所示的终浓度。 ^种组合物重复 3次。 施加本发明组合物两天后， 将细胞裂解， 每个 孔巾加入 300微升的裂解试剂 （裂解试剂是含有 0.2%Triton X- 100和
1 mM -.硫苏糖醇和 1 OOmM磷酸钾的缓冲液 （ pH7.8 ) ) ， 振摇十分钟 /ι 收柒细胞溶解液， 溶解液用离心机离心 10分钟， 转速为 13,500rpm， 收¾.1:消液测量其荧光强度， 细胞裂解液中荧光素酶活性变化 ώ FLUOstar OPTIMA (可得自位于德 |玉 I Ortenberg市的 BMG Labtech公 ><\ ) 测定， 其荧光强度由蛋白含量进行内标， 蛋白含量由 Bradford方 法测得， 所用试剂盒可得 ΐ位于美国加利福尼亚州 Hercules市的 Bio-Rad Laboratories公司， 该测量数值可反映药物作川对 HRE的转 ¾ 活性的影响。 其中对照组为不添加任何药物的细胞响应， 釆用 ((¾验 ϊ\ \的荧光强度 -对照组的荧光强度 ) /对照组的荧光强度） X 100 %来评价 药物的作川效果。
Λ体结果参见表 1。
本发明组合物对 HRE的转录活性的影响
组合物中各组分的终浓度 (μΜ) pHRE-Luc 编 '
毛蕊异 ^酮 刺 t柄花素 芒柄花 t 毛蕊异货酮^ 活性位 (%)
1 2 2 0 0 63.1±4.34
2 0.4 0 0.4 0 41.6±1.02
3 2 0 2 0 91.1±8.45
4 0.08 0 0 0.08 26.4±11.29
5 0.4 0 0 0.4 56.2±17.46
6 2 0 0 2 129.4+15.14
7 0.4 0 0.016 10 243.9+55.52
8 0.4 0 0.08 2 100.2±31.49
9 10 0 0.016 0.016 104.8±18.71
10 0.08 0.4 0 0.4 74.4±1.87
11 0.4 0.08 0 0.08 77.1±8.16 0.4 0.08 0 10 262.9±49.33
0.08 0.016 0.4 0 214.8±40.05
0.4 10 0.08 0 121.1±28.36
2 0.016 0.4 0 189.6±34.98
0.4 0.08 0.08 0.08 333.4±20.03
0.08 0.08 0.08 0.016 126.2±50.24
10 10 0.08 0.4 236.2±37.68
2 0.08 2 10 141.4±44.82
0.4 10 0.08 2 132.2±61.10
0.4 0.016 10 0.4 141.1+63.32
10 0.016 0.4 0.08 196.0±50.63
0.4 0.4 0.08 2 174.9±50.46
0.4 0.08 0.08 10 232.8±38.28
0.08 0.016 2 0.4 38.9±10.48
0.4 0.016 0.08 0.4 40.4+18.15
0 0.08 0.4 2 146.6±14.52
2 0.08 0.4 0.016 143.2±30.45
0.4 10 0.016 0.016 192.9±14.14
0.08 0.08 0.4 0 74.7±11.49
0.016 0.016 0.4 0.08 103.1±4.56
10 10 10 0.4 108.1±10.28
0.016 0.4 0.08 10 92.4±53.66
2 0 2 0.08 86.9±31.50
10 0 0 10 216.2±46.98
0.08 10 0.08 2 266.2±83.82
0.4 0.08 0.016 0.016 69.9±10.68
0.4 0.016 0.08 2 153.7±4.95
0.4 0.016 0.016 0.016 79.6±15.55
0.4 2 0.08 0.4 1 I5.7±21.49 1 0.4 0.4 0.08 10 159.8±2.22
2 0.016 0.08 0.4 2 106.8±2.58
3 0.4 0.08 0.4 0.016 84.8±24.49
4 0.4 10 0.016 0.4 184.3+12.51
5 0.4 10 0.016 0.08 207.3±43.85
6 2 0.08 0.016 10 166.7±34.33
7 10 0.016 0.016 0.08 200.6±47.35
8 0.08 0.016 0.4 0.016 107.0±44.09
9 0.4 10 0.016 0.4 141.3±33.43
0 0.4 0.016 10 10 178.7±21.28
1 0.08 10 0.08 0.4 115.8±32.33
2 0.4 0.016 0.016 0.016 84.2±6.05
3 0.4 0.08 0.08 0.08 61.7+5.80
4 2 0.08 2 2 187.4±11.40
5 2 0.016 0.08 0.08 128.8±31.32
6 2 0.016 0.4 0.08 168.1±37.74
7 0.4 0.4 2 2 171.7±8.75
8 0 0.08 0.4 0.08 24.6±13.56
9 2 0.08 2 0.016 97.2±19.15
0 0.4 2 0.016 0.4 67.9±6.46
1 0.4 2 0.016 0.4 86.9+15.39
2 2 0.08 0.4 0.4 72.7+31.66
3 0.016 2 0.08 0.08 66.9±33.31
4 0.4 2 0.016 2 167.7±33.41
5 0.4 2 0.08 0.4 128.9±15.47
6 2 0.016 0.08 2 182.6±10.92 在上农中， 浓度为 0表示的是在该组合物中不含有相应的化合物 从农 1π」'以^出， 本发明组合物能够 效地提 ¾jHRE转: ¾活性。 ill进 ·^而^， 山毛蕊异黄酮以及刺芒柄花素、 芒柄花卄和毛蕊异黄 酮 ΐί-中的至少一种组成的组合物能够有效的提 HRE转朵活性。
中， 由毛蕊异黄酮和芒柄花苷组成的组合物 （摩尔比 1:1) ， 以及山毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷组成的组合 物 （摩尔比 1:1) ， M ^均能够提高约一倍的 HRE转录活性。
此外， 由毛蕊异黄酮以及刺芒柄花素、 芒柄花 ^和毛蕊异黄酮 中的两种组成的组合物最高均能够提高约两倍 的 HRE转录活性。 特别 !i， 山 0.08μΜ毛蕊异黄酮以及 0.016μΜ刺芒柄花素和 0.4μΜ芒柄花苷 成的组合物 （摩尔比为 5:1:25) ， 可以提高 215%的 HRE转： ¾活性， 并卜 1. .尔浓度总和仅为约 0.6μΜ。
此外， 山毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷组 成的组合物能够提高约 1~3倍的 HRE转录活性。特别是， 由 0.4μΜ毛蕊 Η黄酮、 0.08μΜ刺芒柄花素、 0.08μΜ芒柄花苷和 0.08μΜ毛蕊异黄酮 ί ϊ- ί\〖成的组合物（摩尔比为 5： 1： 1： 1 )，可以提高 333 %的 H RE转 活性， 并—11. .尔浓度总和仅为约 0.6μΜ。 比较例 1
制黄芪水提液的母液： 将黄芪与水按 量比 1:8进行混合， 煎 ¾两次， 每次煎煮 2小吋， 合并两次所得的水煎液， 将得到的水提液 — I "·燥得到粉末状固体， 使用时将该粉末按照相应浓度溶解于试验例 1 所述的细胞培养液中。 根据与实施例 1相同的方法测量所引起的荧光 尜酶活性变化。 其中终浓度分别为： 0.01、 0.1、 0.3、 0.5、 1、 1.5、 lO mg/mL Λ体结果参见图 1。 从图 17'J以看出， 为了取得较好的提高 HRI^^¾活性的效架， 所需采用的黄芪水提液成分的有效浓度偏高， ¾本为1~10 mg/mL (其中， 黄芪水提液成分的终浓度为 10mg/mL 吋， N」-测得其中含 W毛蕊异货酮约 6.9μΜ、 刺芒柄花尜约 5.6μΜ、 芒 枘花 if约 1.6μΜ和毛蕊异黄酮苷约 5.13μΜ， 总和为约 19μΜ) ， 并 Η. 在此 浓度下， 所提高的 HRE转录活性也有限， 高才能提髙约 80% 的 HRE转录活性。 比较例 2
配制毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷的 DMSO母液， 使用吋将所得母液按照相应浓度溶解于试验例 1所述的 细胞培养液中， 根据与实施例 1相同的方法测 m所'引起的荧光尜酶活 性变化。 其中终浓度分别为： 0.003、 0.01、 0.03、 0.1、 0.3、 1、 3、
10、 30μΜ。 Α体结果参见图 2。 从图 2可以看出， 各组分^独使用时， 为了取得较好的提高 HRE转录活性的效果， 所需采川的有效终浓度偏 基本为 1 ~30μΜ， 并且在此高浓度下， 所提^的 HRE转 活性也 ^限， ¾ ¾J才能提高约 80%的 HRE转录活性。 在低于 Ι μΜ的浓度下， 所提 的 HRE转录活性普遍偏低。 综上所述， 由上述实施例和比较例的结果可以看出， 本发明的组 合物对增强 HRE的转录活性、 从而促进红细胞生成、 以及预防禾 11治疗 贫 ιίιι.禾 11 /或缺氧症 n冇 好的协同效^：， 并且显著地降低了各 ί, ·性 n ι 分的川 。