【발명의 명칭】

상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N-. S-. P- 함 유 생체외래물질 분해 촉진용 조성물

【기술분야】

본 발명은 상황버섯 species) 추출물 또는 베타글루칸 ( β -glucan) 을 유효성분으로 함유하는 N-. S-, P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진 용 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

버섯류는 세계적으로 약 20, 000여 종이 알려져 있으며 그 중 식용으로 개발 가능한 것은 약 2, 000여 종이다. 국내 분포하는 버섯류는 약 992종이 기톡되어 있고 이중 식용 버섯이 100여 종, 독버섯이 50여 종이며, 특히 맹독성을 가진 버섯이 20여 종으로 확인되어있다. 약 20여 종 이상의 버섯이 국내에서 재배가능하며 항암, 콜레스테를 저하, 혈당강하 등이 입증된 바 있다. 전 세계적으로 상황버섯은 약 280여 종류가 존재한다. 대부분의 상황버섯은 노란색을 띠며 나이테 무늬를 형성하며 성장하는데. 현재 가장 널리 인공 재배되는 버섯 품종 중의 하나이다. 버섯은 유용한 생리 활성 대사 산물의 생산 및 의약품으로의 많은 재료로 큰 잠재력을 가지고 있음이 알려져있다. 상황버섯 ( ¾e////?"s species) 중 대표적인 것은 목질진흙버섯으로 Phellinus li eus라는 학명으로 알려져 있다. 그러나 한국의 경우 대표적인 재배종은 상황버섯 바우미 (/¾e////?7s baumin — 전체 상황 배재 농가의 98% 이상을 차지하고 있다. 특이하게 상황버섯 바우미가 식용으로 허용되고 건강증진 식품으로 활용되는 곳은 한국이 유일한 것으로 알려져 있으며 . 현재까지 상황버섯으로부터 다양한 생리활성물질들의 분리 연구가 지속적으로 진행되고 있으며. 추출방법에 따른 상황버섯 추출물의 효능변화 및 평가가 검토되고 있다. 자실체 이외에 균사체에서도. 상황버섯 자실체와 유사한 혈액 항웅고 활성, 항산화 효과, 항암작용， 위궤양 완화효과 및 항염증작용, 알츠하이머 (Alzheimer) 질환 치료를 위한 베타 시크리타제 (β-secretase) 저해활성 등의 다양한 생리활성이 보고되면서 상황버섯의 균사체 배양에 많은 연구가 집증되고 있으나, 상황버섯 또는 이로부터 분리된 물질의 니코틴 또는 농약 등의 생체외래물질 (xenobiotics)의 분해 촉진 효과는 알려진 바 없다. 베타글루칸 (β-glucan)은 세균， 버섯. 효모 및 곡물 소스로부터 얻어지는 면역 조절자 (immune modulators)로 알려져있고. 다당류를 발생시키고. 이러한 글루코스 (glucose) 중합체 (polymers)는 특정 병원성 세균 및 균류 (fungi) 세포벽의 성분이다. 베타글루칸은 베타 -1,6—연계된 결사슬 (side chain)에 상관없이 베타- 1.3-연계된 베타 -D-글루코피래노실 (glucopyranosyl) 유니트 (units)로 이루어져있고, 균류 세포벽 성분을 보존하고. 주요 PAMPs 중 하나로 인식되는 것으로 알려져있다 (Brown, 2006).

오래전부터 담자균류의 고등균류는 일반적인 의약품으로 사용되었다. 버섯의 면역 강화작용 및 항종양 활성과 같은 의약적 효과는 베타글루칸에 의한 것이라고 본다. 왜냐하면 _. 알파글루칸은 진핵 영양분 요소이고, 포유류의 효소에 쉽게 분해되고, 면역자극 활성이 없으나, 베타글루칸은 다양한 균류에서 유래되고, 경구 투여하였을 때 인간 효소에 의해 분해되지않으나, 대신 소장에서 점막 및 전신 면역을 자극하여 흡수된다 (Vos et al. , 2007). 흡수된 베타글루칸은 항종양 활성뿐만 아니라. 동물과 인간에 균류 및 세균에 의한 감염이 있을 때 숙주를 보호하는 능력을 활발하게 한다. 베타글루칸은 높은 분자량임에도 불구하고, 경구투여시 장에서 흡수되고. 선천적 및 후천적 면역력을 활성화시킨다.

베타글루칸은 글루코스 중합체이고, 백본 (backbone)으로 선형 베타 (1，3)- 연계된 D-글루코스 분자와 다양한 크기의 베타 (1.6)-연계된 결사슬이 백본과 다른 간격으로 존재한다. 다양한 베타 (1,3), 베타 (1.4) 및 베타 (1,6) 베타글루칸—연계 가운데 오직 베타 (1,3)만 면역력을 활발하게 하고, 항종양 활성을 보인다. 처음 알려진 베타글루칸의 기능은 항종양 활성 (Chihara et al.. 1970)이고, 그 이후 항균 (antifungal), 항감염 (ant i-infect ionKOnderdonk et al . , 1992), 방사선방호 (radioprotective)(Gu et al. , 2005), 콜레스테를 감소 (cholesterol reduct ion)(Wolever et al . , 2011) 및 식후 당 대사 활성 (postprandial glucose metabolic act ivi t ies)(Batt i lana et al.. 2001)을 포함하는 다른 많은 생물학적 활성이 보고되었다. 베타글루칸은 동물에서의 아스페르길루스 (AspergillusKTorosantucci et al., 2005) 및 칸디다성 질염 (Candida vaginal )(Pietrel la et al.. 2010) 감염 및 바다 물고기에서의 비브리오 (Vibrio) 감염 (Zhu et al. , 2006)에서 면역강화 활성의 백신 또는 보조제 후보로 예방을 위해 사용되어졌다. 오트 및 보리와 같은 식물의 베타글루칸은 주로 베타 (1,4) 연계된 것이고, 버섯 및 균류의 베타글루칸은 베타 (1,3) 백본에 짧은 베타 (1.6)—연계된 사이드체인으로 가지가 있다 (Yan et al.. 2005) . 이러한 글루칸의 구조， 형태 및 소스의 차이는 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있음이 알려져있다 (Brown and Gordon, 2001).

FMCKFlavin一 containing monooxygenase)는 보조인자 (cofactor ) 폴라빈 (flavin)을 통해 주로 친핵체로써 기질의 산화를 촉진시키는 효소의 그룹이다. 사이토크롬 (cytochrome) P450 효소와는 대조적으로 FM0는 일반적으로 생체외래물질 (xenobiotic substance)에 의해 유도되거나 억제되지않는다. 인간 FM0는 조직 특성을 보이는데, FM01은 인간 태아 간 및 성인 신장에 존재하고, FM02는 폐에 존재하며 , FM03은 성인 간에 존재한다.

FM0는 폭넓고 중복된 특이도 (specificity)를 가진 미세소체 (microsomal ) 산화 (oxidative) 효소의 두번째 군이다. FM0의 주요 반웅은 해테로 원자 (hetero- atom)의 유형이 각각 N-옥시드 (oxide), S-옥시드 또는 P-옥시드인 질소 (ni trogen) , 황 (sulfur) 또는 인 (phosphorus) 해테로 원자 화합물의 친핵성을 촉진시킨다. 사이토크롬 P450과 기능적인 부분이 중복되지만, 작용기전은 다르다. FM0는 효소에 기질이 결합하기 전에 분자 산소에 결합하고, 활성화한다. 또한, 보조인자로 플라빈 아데노신 디뉴클레오티드 (flavin adenosine dinucleot ide, FAD)를 필요로 한다. 사이토크롬 P450 효소와는 달리 FM0는 열에 민감하고, 신진대사를 연구하는 연구자들이 효소 시스템을 구별하는데 유용하게 사용할 수 있다.

FM03는 체내에서 N-, S- 및 P-를 함유하는 다양한 생체외래물질 (xenobiotics)를 대사시켜 분해함이 알려져있고, 이러한 생체외래물질로는 니코틴， 농약 및 비스테로이드계 항염증제 등이 있다.

구체적으로, 흡연자에 있어서 니코틴 (Nicotine)은 흡수된 뒤에 뇌 (투여 5분 후 투여량의 8%까지 축적), 신장 (투여량의 14% 이상 축적), 위점막, 부신수질， 코 점막 및 침샘에 농축된다. 또한, 체내에 축적된 니코틴은 암 질환， 고혈압. 구강질환 초래， 위산과다분비 촉진에 따른 각종 위장질환과 동맥경화증을 비롯한 각종 순환계 질환을 일으킬 수 있으며, 노화촉진 등에 중요한 요인으로 작용하여 심하면 발작, 경련 및 호흡마비, 근육경련 및 불필요한 혈압상승 등을 유발한다. 이러한 니코틴은 FM03에 의해 니코틴 -1-N-옥사이드 (Nicotine-1— N— oxide)로 분해되며， 이것의 대부분은 그대로 소변으로 배출된다고 알려져있다. 또한, 농약은 농작물에 해로운 벌레， 병균. 잡초 따위를 없애거나 농작물이 잘 자라게하는 약품으로, 살층제， 살균제， 발아제 및 생장 촉진제 등이 있다. 농작물에 뿌린 농약은 그 농작물을 섭취한 사람 또는 동물에 흡수되어 체내 축적되기 쉽다. 농약은 아트라진, 알라클로, 카벤다짐 외에 수많은 종류가 있다. 아트라진 (Atrazine)은 하기 화학식 1의 구조를 가진 s—트리아진계의 이행형 비호르몬성 제초제로 이 물질이 힐반웅을 저해한다는 점에서 주요한 제초작용기구는 광합성의 저해작용이라 보고 있으며 일반적으로 토양 처리용으로 사용한다. 아트라진에 내성이 있는 옥수수에서는 아트라진 2위의 염소를 S- 글루타티은 (glutathione)으로 치환하여 불활성화하는 기구가 알려져 있다. 또한 내성을 획득한 식물 혹은 내성변이체의 대부분은 아트라진의 표적단백질인 엽록체의 D-1 단백질이 변이되어 있어. 이러한 변이형 유전자를 도입하여 아트라진 내성의 식물을 만들어내고 있다.

【화학식 11

알라클로 (Al achlor )는 하기 화학식 2의 구조로 옥수수, 콩， 감자 등의 경작에 사용되는 제초제로서 토양에 방출되면 광분해와 미생물에 의한 분해가 빨리 진행되나, 인체에 축적될 경우 염색체 이상 및 위장, 갑상선, 비장 등에서 암을 유발한다고 알려져있다.

2】

카벤다짐 (Carbendazini)은 이의 잔류에 관해 1973년에 평가되었고 다시 1994년 (잔류 (res idues) ) 및 1995년 (독성학 및 환경)에 평가되었다. CCPR (잔류농약분과)은 위험성 평가가 요구되고, UK에 의해 규정된 정보에 기초하여 잔류의 정의를 재고할 것을 권장하였다 (ALIN0RM 97/24. para 51) . UK는 카벤다짐으로 발현되는 티오파네이트 -메틸 ( thiophanate-methyl ) , 베노밀 (benomyl ) 및 카벤다짐의 합을 잔류 정의로 표현했다. 최대 잔류 한계 (MRLs , maximum residue l imi ts)는 직접적인 사용 또는 대사 산물로 발생되는 카벤다짐 잔류를 포함한다. 데이터는 주요 제조업체 및 네덜란드 정부에 의해 제공되었다. 카벤다짐은 하기 화학식 1의 구조를 갖고, ISO에서는 카벤다짐으로 부르고, 화학적으로 IUPAC는 Methyl benzimidazol— 2-ylcarbamate로 부르며, CA는 Methyl ΙΗ-benz i πι idazol-2-yl carbamate로 부르고, CAS 등톡번호는 10605-21-7이다.

【화학식 3】

비스테로이드성 소염진통제 ( non-s teroi dal ant i-inf l ammatorydrugs , NSAIDs)는 소염, 진통 및 해열효과를 가진 비마약성. 비스테로이성 제제이다. 쉽고 간편하게 이용하는 이러한 비스테로이드성 소염진통제의 투약 및 축적에 의한 부작용으로 간, 신장, 청력 등에 손상을 준다고 많이 알려지고있다.

벤지다민 (Benzydaniine)은 하기 화학식 4의 구조로 국소적으로 작용하는 비스테로이드성 소염진통제로， 입과 목구멍에서 국소 마취, 통증 경감을 위한 진통제 및 염증상태에서 항염증 치료에 사용할 수 있다.

【화학식 4]

상기 벤지다민과 비슷한 비스테로이드성 소염진통제로 하기 화학식 5의 메틸 p—토릴 설파이드 (methyl p-tolyl sulfide, MTS) 및 하기 화학식 6의 수린닥 설파이드 (sulindac sulfide) 등이 있다.

【화학식 5】 이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 연구한 결과. FM03 유전자 발현이 증가하면 체내 니코틴 또는 농약과 같은 N-. S-. P-를 함유하는 생체외래물질의 분해가 촉진됨을 확인하였고 상황버섯 추출물 및 상황버섯에서 분리한 베타글루칸을 동물 모델에 경구투여할 경우, 간에서 FM03의 발현이 현저히 증가하며， 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상황버섯 추출물 및 베타글루칸을 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 상황버섯 ( ¾e//// s species) 추출물 또는 베타글루칸 (β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상황버섯 (/¾e////"s species) 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상황버섯 (/¾e////7"s species) 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여. 본 발명은 상황버섯 (/ e//// s species) 추출물을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상황버섯 (/¾e////7i/s species) 추출물을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진제를 제공한다. 또한. 본 발명은 상황버섯 ( ¾e////2"s species) 추출물을 유효성분으로 함유하는 N-, S-. P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진용 건강기능식품을 제공한다. 또한, 본 발명은 상황버섯 (/¾e////?i/s species) 추출물을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상황버섯 (/¾e/// s species) 추출물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 N-, S -， P- 함유 생체외래물질 분해 촉진에 사용하기 위한 상황버섯 (/¾e///;i/s species) 추출물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

또한. 본 발명은 베타글루칸 (β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-, S-,

P- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 베타글루칸 (β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N— , S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진제를 제공한다.

또한, 본 발명은 베타글루칸 (β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N— , S-. P- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 건강기능식품을 제공한다.

또한. 본 발명은 베타글루칸 (β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 베타글루칸 (β— glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-. S -， P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법을 제공한다.

아울러 , 본 발명은 N-, S-. P- 함유 생체외래물질 분해 촉진에 사용하기 위한 베타글루칸 (β-glucan) 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

【유리한 효과】

본 발명의 상황버섯 (/¾e////77s species) 추출물 또는 베타글루칸 (β- glucan)은 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 N-, S-, P—를 함유하는 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 la는 상황버섯 spec ies) 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 히스토그램 (hi stogram)으로 나타낸 도이다. 도 lb는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상자그림 (box plot )으로 나타낸 도이다.

도 lc는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 MA plot으로 나타낸 도이다.

도 Id는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상관분석 산점도 (correlat ion scat ter plot )로 나타낸 도이다.

도 2a는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 계층적 클러스터링 결과를 나타낸 도이다.

도 2b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 유전자 발현 패턴을 나타낸 도이다.

도 3a는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 히스토그램으로 나타낸 도이다.

도 3b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상자그림으로 나타낸 도이다.

도 3c는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다증투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 MA plot으로 나타낸 도이다.

도 3d는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다증투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상관분석 산점도로 나타낸 도이다.

도 4a는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 계층적 클러스터링 결과를 나타낸 도이다.

도 4b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 유전자 발현 패턴을 나타낸 도이다.

도 5는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 투여군에서의 RNA 품질 (qual i ty)를 확인한 도이다:

Cont : 대조군; 및 PBE: 상황버섯 열수추출물 처리군.

도 6은 미"우스 조직에 따른 FM0( F 1 av i n-cont a i n i ng monooxygenase) 유전자의 발현을 확인한 도이다:

Tissues: 조직 종류；

Liver: 간 조직；

Lung: 폐 조직； 및

Kidney; 신장 조직 .

도 7은 마우스 조직별 추출물 처리에 따른 FM0 유전자의 발현 변화를 확인한 도이다: .

Tissues: 조직 종류;

Liver： 간 조직；

Lung: 폐 조직；

Kidney; 신장 조직；

Cont: 대조군;

PBE: 상황버섯 열수추출물 처리군:

PBW: 상황버섯 수층분획물 처리군;

PBG: 상황버섯 베타글루칸 처리군;

20： 20 mg/kg; 및

100： 100 mg/kg.

도 8a 내지 도 8b는 카벤다짐 1 mg/iiii을 경구 투여한 후 고속액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC) 분석한 결과를 나타낸 도이며， (A)는 카벤다짐의 기준을 나타낸 결과이고, (B)는 경구투여 30분 후 결과이며. (C)는 경구투여 1시간 후 결과이고, (D)는 경구투여 1.5시간 후 결과이며, (E)는 경구투여 2시간 후 결과이고, (F)는 경구투여 6시간 후 결과이며, (G)는 경구투여 12시간 후 결과이다.

도 9a 내지 도 9b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 20 mg/kg을 하루에 한번 7일 동안 투여한 후, 카벤다짐 500 mg/kg을 경구 투여한 후 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도이며, (A)는 카벤다짐 경구투여 30분 후 결과이고, (B)는 카벤다짐 경구투여 1시간 후 결과이며, (C)는 카벤다짐 경구투여 1.5시간 후 결과이고, (D)는 카벤다짐 경구투여 2시간 후 결과이며， (E)는 카벤다짐 경구투여 6시간 후 결과이고, (F)는 카벤다짐 경구투여 12시간 후 결과이다.

도 10a 내지 도 10b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 100 nig/kg을 하루에 한번 7일 동안 투여한 후, 카벤다짐 500 mg/kg을 경구 투여한 후 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도이며, (A)는 카벤다짐 경구투여 30분 후 결과이고, (B)는 카벤다짐 경구투여 1시간 후 결과이며. (C)는 카벤다짐 경구투여 1.5시간 후 결과이고， (D)는 카벤다짐 경구투여 2시간 후 결과이며, (E)는 카벤다짐 경구투여 6시간 후 결과이고, (F)는 카벤다짐 경구투여 12시간 후 결과이다.

도 11은 HPLC로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.

도 12는 SD 랫트에서 각종 베타글루칸의 경구투여에 의한 FM03의 발현증가를 나타낸 도이다. 랫트 (n = 3)에 PBG(25 mg/kg) , Zymosan(25 mg/kg) , Barley(25 mg/kg)를 하루 1회ᅳ 7일간 경구투여한 후에 간을 적출하여 FM03의 발현을 real time PCR로 분석하였다:

FM03: flavin containing monooxygenase 3；

Con: control；

PBG: Phellinus baumii β-D-glucan; 및

Zymosan: β -D-glucan from yeast； Barley: ^' .β _D—glucan(pur i ty: ≥95%) from bar ley. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 상황버섯 species) 추출물 또는 베타글루칸 (β- glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-. S-, P- 함유 생체외래물질 (xenobiotics) 분해 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 상황버섯 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

1) 상황버섯에 추출용매를 가하여 추출하는 단계；

2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및 3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계. 상기 방법에 있어서, 단계 1 )의 추출용매는 물, Ci 내지 C ₂ 저급 알코을 또는 이들의 흔합물을 용매로 하여 추출하는 것이 바람직하며 , 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출용매는 건조된 상황버섯에 10 내지 100배로 하는 것이 바람직하고, 20 내지 50배 첨가하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출온도는 70 내지 140 ^° C인 것이 바람직하고, 85 내지 110 °C인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출시간은 1 내지 36시간인 것이 바람직하고， 9 내지 24시간인 것이 바람직하나. 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비둥건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 상황버섯은 상황버섯 바우미 (/¾e/// /s bau ii) 또는 상황버섯 린테우스 (/¾e/// s linteus) ⁰ A 것이 바람직하고, 상황버섯 바우미인 것이 더욱 바람직하다.

상기 베타글루칸은 담자균류 식물 및 진균류로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리된 것이 바람직하고, 상황버섯, 영지버섯 ( Ganoder lucidum) . 동충하초 (Cordyceps )와 같은 담자균류 , 보리와 같은 식물 및 효모를 비롯한 진균류로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리된 것이 보다 바람직하며 , 상황버섯, 보리 또는 효모로부터 분리된 것이 더욱 바람직하다.

상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 FM03(Fl avin-cont a i n i ng monooxygenase3) 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 N- , S- , P- 함유 생체외래물질은 체내에 축적되는 니코틴, 농약 및 의약품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고 니코틴 또는 농약인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한， 상기 의약품은 비스테로이드계 항염증제일 수 있다.

상기 농약은 살충제, 살균제 및 제초제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 상기 FM03 유전자는 서열번호: 13(GenBank 등록번호: NM— 008030)으로 나타내는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서. 본 발명자들은 상황버섯 열수추출물. 상황버섯 수층분획물 및 상황버섯 베타글루칸을 제조하였고, 이를 단일투여 (24시간)와 다중투여 (7일)로 나눠 각각 하루에 한번 경구투여한 후. 단일투여군과 다중투여군에서의 간 유전자의 발현 변화를 확인하였고 (도 la 내지 도 4b 참조), 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 투여한 마우스에서의 FM0 유전자의 발현 변화를 확인한 결과, 단일투여와 다중투여 모두에서 FM03 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 (표 4 참조)， 조직에서의 R A 품질 (quality)를 시각화하여 확인하였다 (도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 마우스 조직에 따라 FM0 유전자의 발현을 확인한 결과. 같은 FM0 유전자군 (gene family)이더라도 조직에 따라 발현량의 차이가 나는 것을 확인하였고 (도 6 참조), 상황버섯 열수추출물 (PBE), 상황버섯 수층분획물 (PBW) 및 상황버섯 베타글루칸 (PBG)을 처리함에 따라 조직에서의 FM0 유전자의 발현 변화를 확인한 결과， 간에서의 FM03와 신장에서의 FM04에서 처리 농도에 의존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7 참조).

또한 본 발명자들은 고속액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC) 분석을 통해 상황버섯 열수추출물을 전투여한 후, 카벤다짐을 투여하여 농약의 분해를 확인한 결과, 상황버섯 열수추출물을 투여하지 않았을 때보다, 상황버섯 열수추출물을 투여했을 때 마우스 체내 남아있는 카벤다짐의 양이 투여한 상황버섯 열수추출물 농도에 비례하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 8a 내지 도 11 참조).

또한, 본 발명자들은 Zymosan (효모 베타글루칸), Barley (보리 베타글루칸)을 7일간 경구투여후 랫트의 간에 발현된 FM03을 real time PCR로 분석하였다. 그 결과, 상황버섯 베타글루칸에서는 2.4배 (2.43 土 0.34)ᅳ 효모 베타글루칸에서는 2.9배 (2.94 ±0.19), 보리 베타글루칸에서는 2.2배 (2.15 土 0.31)) 가량 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 12 참조).

결론적으로 베타글루칸에 의한 FM03의 증가는 상황버섯의 베타글루칸에 국한된 것이 아니라 효모와 식물유래의 보리 베타글루칸에 의해서도 나타나는 것으로 확인되었다. 즉. 고가의 상황버섯을 이용하기 보다는 저가의 효모 또는 보리 유래의 베타글루칸을 사용하여도 FM03의 발현이 증가되므로. 잔류농약과 니코틴 등 체내에 흡수된 각종 N- , S- 및 P-를 함유하는 다양한 생체외래물질 ( xenob i ot i cs )의 배출은 증가된 FM03에 의하여 효과적으로 달성할 수 있다.

따라서. 본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써. 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을, N- ,ᅳ S- , P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한. 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N- . S- , P- 함유 생체외래물질 분해 촉진제를 제공한다.

본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키고， 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써 , 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을. N- , S- . P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한. 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N- , S- , P- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키고. 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써. 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을, N- , S- . P-를 함유하는 생체외래물질 분해 분해 촉진용 천연물의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

N- , S- , P-를 함유하는 생체외래물질 분해 분해 촉진 효과를 가지는 본 발명의 조성물은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 단독으로 포함하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 . 부형제 또는 희석제를 추가로 포함함으로써 통상적인 방법에 의해 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애 현기 증과 같은 알레르기 반웅 또는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 또한, 상기와 같이 제형화 된 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 투여 경로를 통해 N— , S- . P-를 함유하는 생체외래물질 분해를 촉진 하기 위한 목적으로 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로가 포함 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제제화 할 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제, 증량제, 결합제, 습윤제. 붕해 제. 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산 제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분, 칼슘카보에이트 (Cal c i um carbonate) , 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose)： 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파 라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제로서는 피부 외용제가 포함된다.

본 발명의 N- , S- , P-를 함유하는 생체외래물질 분해 분해 촉진 효능을 제공하는 조성물을 피부 외용제로 하는 경우, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 로션, 연고. 겔, 크림. 패취 또는 분무제의 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 있어서 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 약학적 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 90 중량 %로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고 _, 환자의 상태. 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서. 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸의 바람직한 투여 량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하 게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.001 mg/kg 내지 10 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수희 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예상되는 투여의 모든 방식이 가능하며, 예를 들면, 경구, 피부 도포, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하. 자궁내 경막 또 는 뇌혈관내 ( Int racerebrovent r i cu l ar ) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 N- , S- , P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진을 위하여 단독으로, 또는 수술， 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 S- , P- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 유효성분인 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸이 첨가될 사료에 대해 0.01 내지 10 중량부로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 사료 첨가제 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 성분 이외에 추가로 구연산， 후말산 아디픽산， 젖산 등의 유기산이나 인산칼륨， 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테친 토코페롤, 비타민 C , 녹차 추출물ᅳ 키토산. 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1 성분 이상을 흔합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제， 완충액. 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액ᅳ 현탁액 유탁액 등과 같은 주사용 제형 _, 캡슐 _, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제 조성물 및 이를 포함하는 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류 . 비타민 , 항산화 항곰광이 , 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료. 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제. 성장 촉진제 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.

상기 동물 사료용 사료 첨가제는 동물의 사료에 직접 흔합하거나 사료와 별도로 단독으로 경구 제형, 주사 또는 경피로 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여 할 수 있다. 투여량은 동물의 체중， 건강상태, 식이, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 당 업계에서 잘 알려진 바와 같이 일일 투여량은 약 0. 1~10nig/g, 바람직하게는 0.05~1 nig/g이며， 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 사료 첨가제는 악취 저감을 목적으로 사료에 첨가될 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제를 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 첨가제를 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고ᅳ 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 첨가제의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조 할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스와 콩 플레이트 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체의 경우에는 정제. 산제, 토로키제로 사용될 수 있으며 액체형 담체의 경우 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀견제, 용액제 투여 형태일 수 있다. 또한 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유 할 수도 있다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 상업용으로 중요한 돼지. 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 증요한 가금류에는 닭. 오리, 거위 등이 포함되며 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물을 포함하는 동물용 사료 배합 방법은 사료 첨가제 조성물을 동물사료에 건조 중량 기준으로 1kg 당 약 10g 내지 500g , 바람직하기로는 10g 내지 100g의 양으로 혼합하는 것이다. 또한 사료 흔합물을 완전히 혼합한 후, 매쉬로 공급하거나. 추가가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. _{Λ Q}

lo 또한. 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 N- . S- , P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법을 제공한다.

상기 인간을 제외한 개체는 인간만을 제외한 말. 양， 돼지， 염소, 낙타, 영양. 소, 닭. 오리, 개. 고양이 등의 동물을 의미한다.

상기 N-ᅳ S- , P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법은 비록 인간을 제외한 동물을 대상으로 하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한， 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 N- , S- , P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법에 의해 생체외래물질 분해 촉진에 충분히 사용될 수 있다.

본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FM0 유전자군 증에서 특히 FM03의 발현을 증가시키고， 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 N- , S- . P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진 방법으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 통계처리

실험결과는 평균土표준편차로 표기하였고, 모든 측정은 최소 3번씩 수행하였다. 평균값의 집단 간 비교는 InStat 3.06(GraphPad sof tware Inc . , 미국)을 이용하여 AN0VA 단방향 분석으로 수행하였다. 유의성 있는 ρ값은 ≤0.05로 표기하였다.

<실시예 1>상황버섯 (/¾e////H/s baimii) 추출물의 제조

<1-1>상황버섯 열수추출물 (/¾e/// 7i/s baimii extract , ΡΒΕ)의 제조

본 발명자들은 상황버섯 추출물을 제조함에 있어서, 추출 수율은 온도, 정제수의 양, PH . 추출시간 및 상황버섯 조각 등의 추출 상태에 따라 달라지게 되는 것을 확인하였다. 보통 추출 온도는 85 ^° C , 90 ^° C . 95 ^° C . 100 ^° C , 105 ^° C 및 110 ^° C이고, 추출 시간은 9시간, 18시간 및 24시간이다. 이에, 상황버섯을 건조시켜 조각을 낸 후, 상황버섯 조각 4 g 또는 10 g에 정제수 200 (20배 또는 50배)를 넣고, 현탁액을 여과한 후, 추출 수율을 측정하였다.

또한, 상기 방법을 이용하여 추출물을 대량생산 하였다. 200 ί 추출기에 잘게 썬 상황버섯 조각과 20 ί 정제수를 넣고, 24시간 동안 1 C에서 20번 추출하였고. 여과장치로 여과한 후. 여과액을 농축하였다. 이를 각각 감압하에 동결건조하였다. 추출 수율은 하기 표 1에 나타내었다.

【표 11

본 연구에서 상황버섯 열수추출물은 국내에서 재배한 상황버섯 자실체를 구입하여 제조하였다.

구체적으로, 상황버섯 자실체 loo g을 2000 의 증류수를 넣고 ioo°c의 중탕으로 24시간 추출하였다. 추출액을 여과하여 보관한 후 잔사에 다시 2000 m의 증류수를 넣고 100 ^° C의 중탕으로 24시간 추출하여 총 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 100 ι 로 감압농축한 후에 동결건조시켜 상황버섯 열수추출물 (/¾e////?"s bauwii ext ract , PBE)을 얻었다.

<1-2> 상황버섯 수충분획물 (/¾e////M/s bauwii water fract ion, PB ) 및 상황버섯 베타글루칸 (/¾e/// K s baumii β-Glucan, PBG)의 제조

국내에서 재배한 상황버섯 자실체를 구입하여 공지된 방법을 이용하여 베타글루칸을 정제하였다.

구체적으로. 상황버섯 자실체 100 g을 2000 me의 증류수를 넣고 100 ^° C의 중탕으로 24시간 추출하였다. 추출액을 여과하여 보관한 후 잔사에 다시 2000 의 증류수를 넣고 100 ^° C의 중탕으로 24시간 추출하여 총 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 100 ιιι(!로 감압농축한 후에 4 ^° C로 만든 다음 감압농축액에 -20 ^° C로 빙냉시킨 300 inC 에탄을 (약 3배)을 넣고 4시간 동안 4 ^° C에 두었다. 4시간 후, 침전물이 베타글루칸이고, 상기 분리한 베타글루칸을 Bet a-gl ucan assay kit(Megazyme.co)를 이용하여 확인하였으며. 이를 동결 건조하여 상황버섯 베타글루칸 baumii β-Glucan, PBG)이라 칭하였다. 한편, 상황버섯 열수추출물 중에서 에탄을에 침전하지 않는 상등액은 여과지로 여과한 후에 농축한 후에 동결건조하여 상황버섯 수층분획물 (/¾e///y?i/s baumii water fraction. PBW)이라 칭하였다.

<실시예 2>세포 배양 및 동물 모델 디자인

<2-1>세포 배양

마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포 (ATCC, Rockville, MD)를 페니실린 (penici llin)(10,000 units/mO-스트랩토마이신 (streptoinycin)(10,000 Linits/ni 및 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco-BRL, 미국)을 첨가한 DMEM 배지로 계대배양하였고, 37°C, 5% C0 ₂ 인큐베이터에서 배양하였다. T-25 플라스크 (flask)에 배양하여, 계대배양 할 때는 10X 트립신 (Trypsin)-EDTA 용액을 DMEM을 이용하여 10배 희석하여 사용하였다. 조직배양 플라스크에 배양된 Raw 264.7 세포에 IX 트립신 -EDTA 용액을 넣고 37 ^° C에 10분간 흔합시킨 후, 트립신 반웅에 의해 단일세포로 만들어주고, 이러한 반웅을 종결하기위해 1 FBS가 함유된 DMEM 배지를 첨가한 후, 2번 세척하였다. 이 후 낮은 은도에서 원심분리한 후 계대배양 하였다. <2-2>동물 모델 디자인

체중 25 내지 30 g의 5주령 수컷 MPF(murine pathogen free, outbred-mouse) ICR 마우스를 샘타코 (Samtako Bio Korea)에서 구입하여 경구투여 실험동물로 사용하였다. 마우스는 물과 식이는 자유롭게 먹을 수 있도록 하였고ᅳ 조명 사이클을 12시간은 밝게， 12시간은 어둡게 설정하였다. 방은 22.5°C 온도에, 42.5% 습도로 유지하였다.

상황버섯 열수추출물은 동결건조시킨 분말을 사용하여, 증류수에 용해시켜 경구투여하였다. 실험 그룹은 대조군 (control. n=2), 100 nig/kg의 수용성 상황버섯 열수추출물 처리군 (PBE-100, n=2)으로 나누었고, 단일투여 (24시간)와 다중투여 (7일)로 나눠 하루에 한번 경구 투여하였다. 또한. 상황버섯 열수추출물 (PBE), 상황버섯 수층분획물 (PBW) 및 상황버섯 베타글루칸 (PBG)은 동결건조시킨 분말을 사용하여, 증류수에 용해시켜 경구투여하였으며. 실험 그룹은 대조군 (control , n=3), 20 mg/kg의 상황버섯 열수추출물 처리군 (PBE-20, n=3), 100 mg/kg의 상황버섯 열수추출물 처리군 (PBE- 100. n=3). 20 nig/kg의 상황버섯 수층분획물 처리군 (PBW-20, n=3). 100 nig/kg의 상황버섯 수층분획물 처리군 (PBWᅳ 100, n=3), 20 nig/kg의 상황버섯 베타글루칸 처리군 (PBG-20, n=3) 및 100 mg/kg의 상황버섯 베타글루칸 처리군 (PBG-100, n=3)으로 나누었고, 7일간 하루에 한번 경구 투여하였다. <2-3>농약 (pesticide) 경구투여 동물 모델

상황버섯 추출물 (PBE) 또는 베타글루칸 20 및 100 nig/kg을 7일간 하루에 한번 경구 투여한 후, 을리브오일에 현탁한 (suspended) 카벤다짐 (carbendazim)(Methyl benzimidazol—2yl carbamate BCM, Methyl 2benzimidazolecarbamate C9H9N302, FW 191.19) (Sigma Aldrich Chemical) 500 mg/kg을 투여하였고, 대조군으로 단일 위관 영양법 (gavage)을 투여한 마우스에 카벤다짐 500 uig/kg을 투여하였다.

<실시예 3>단일투여군에서의 간 유전자의 발현 변화 분석

^' 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델을 가지고 간에서 샘플을 얻어 마이크로어레이 (niicroarray) 방법을 통해 간 유전자의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 <2— 2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델 중 단일투여군 마우스를 디클로로메탄 (dichloromethan, CH ₂ C1 ₂ )으로 안락사시킨 후, 2 mi 튜브에 150 nig 조직을 얻고, RNA를 얻기 위해 -20°C 이하로 샘플을 보관하였다. Mouse Gene 1.0 ST array(Af fymetr ix Inc)를 사용하여 마이크로어레이를 수행하여 , 0D 260/280 비로 확인하였다. 이렇게 확인한 결과를 히스토그램 (histogram), 상자그림 (box plot), MA plot 및 상관분석 산점도 (correlation scatter plot)을 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 la 내지 도 Id에 나타내 바와 같이, 간 유전자 발현 양상을 확인하였다 (도 la 내지 Id) .

또한, 상기 결과를 토대로 주요 유전자를 분석하여 대조군과 비교하여 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 100 mg/kg의 농도로 단회 경구투여한 실험군에서의 발현양상 변화를 하기 표 2에 나타내었다.

【표 2】

또한, 상기 <표 2>를 바탕으로 cutof f 2.0으로 설정하여, 계층적 클러스터링 (c l uster ing)을 이용하여 특정 유전자 클러스터링을 수행하였다.

그 결과 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이， 대조군과 상황버섯 열수추출물 처리군의 계층적 클러스터링 결과를 확인하였고. 이의 유전자 발현 패턴을 확인하였다 (도 2a 및 도 2b) .

<실시예 4>다중투여군에서의 간 유전자의 발현 변화 분석

상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델을 가지고 간에서 샘플을 얻어 마이크로어레이 (mi croarray) 방법을 통해 간 유전자의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-2〉와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델 중 다중투여군 마우스를 가지고, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과 도 3a 내지 도 3d에 나타내 바와 같이. 간 유전자 발현 양상을 확인하였다 (도 3a 내지 3d) .

또한 , 상기 결과를 토대로 주요 유전자를 분석하여 대조군과 비교하여 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 100 mg/kg의 농도로 7일간 다중 경구투여한 실험군에서의 발현양상 변화를 하기 표 3에 나타내었다.

【표 3】 또한, 상기 <표 3>를 바탕으로 cutof f 2.0으로 설정하여, 계층적 클러스터링 (c luster ing)을 이용하여 특정 유전자 클러스터링을 수행하였다.

그 결과 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 상황버섯 열수추출물 처리군의 계층적 클러스터링 결과를 확인하였고, 이의 유전자 발현 패턴을 확인하였다 (도 4a 및 도 4b) .

<실시예 5> FMKFlavin-containing monooxygenase) 유전자의 발현 변화 확인

상기 <실시예 3>과 동일한 방법을 사용하여 얻은 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 경구투여한 ICR 마우스의 간조직 ( l iver t i ssue)에서의 FM0 유전자의 발현 변화를 확인하였다.

【표 4】

상기 표 4에 나타낸 바와 같이. 단일투여의 경우에는 FM03 유전자만 5.13배 증가하였고, 다중투여의 경우에는 FM02는 3.8배. FM03는 17.6배 및 FM04는 3.14배 증가하는 것을 확인하였다 (표 4).

<실시예 6> RNA품질 (quality) 확인

상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 얻은 조직에서 RNA를 얻어 겔 전기영동 (gel electrophoresis)을 이용하여 18S 리보솜 RNA(rRNA) 및 28S rRNA를 시각화하여 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 단일투여의 경우 rRNA의 integrity가 1.6 및 1.7로 나타났고 다중투여의 경우 rRNA의 integrity가 2.4 및 2.4로 나타남을 확인하였다 (도 5).

<실시예 1>마우스 조직에 따른 FM0유전자의 발현 확인

마우스 간， 폐 및 신장 조직에서의 FM0 유전자 발현을 확인하였다.

구체적으로, 마우스를 디클로로메탄 (dichloromethan, CH ₂ C1 ₂ )으로 안락사시킨 후, 간, 폐 및 신장 조직을 얻고, 실험 전 얼려서 보관해둔다. 냉동된 조직을 절단하고, 트리졸 (Trizol) 시약 1 ι 을 넣어서 균질화 (homogenized)한 후, 샘플을 5분 동안 실온에 보관한다. 이에 0.2 niC 클로로포름 (chloroform)을 넣고, 튜브를 15초 동안 강하게 볼텍스 (vortex)하고. 2 내지 3분 동안 보관한다. 이 후, 샘플을 4 ^° C에서 15분 동안 12000 rpm으로 원심분리하면 흔합물은 빨간색으로 보이는 아래쪽에 페놀 (phenol)-클로로포름 층과 색이 없는 위쪽의 물층으로 나뉜다. 물층을 새로운 튜브로 옮기고, 이소프로필 알코을 (isopropyl alcohol) 0.5 을 넣고, 균질화한 후, 실온에서 10분간 보관한 후, 4°C에서 15분 동안 12000 rpm으로 원심분리한다. 상층액을 제거하고, 침전된 RNA 펠렛 (pel let)을 75% 에탄올 (ethanol lO EtOH 35 ni^+DEPC water 15 ηι 1 ^로 한 번 세척한 후, 샘플을 볼텍스로 섞어주고, 4 ^° C에서 5분 동안 7500 rpm으로 원심분리하였다. RNA 펠렛은 건조시킨 후, 50 ill RNase-free water를 첨가하고, 56 ^° C에서 10분간 보관하였다. 이렇게 얻은 RNA의 농도는 NanoDrop 2000 UV 분광광도계 (spectrophotometer)로 측정하였다. 얻은 RNA를 M-MLV 역전사효소 (Moloney Murine Leukemia Virus reverse Transcriptase) (Promega, 미국)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. A/프라이머 흔합물은 멸균된 PCR 류브에 5 RNA , 올리고 ( dT) (0.5 !ig/ id ) 1 μΐ , DEPC 처리한 물을 10 ^까지 넣어주고, 70°C에서 10분 동안 반웅시킨 후， 얼음에 최소 5분간 놓아둔다. 반웅 흔합물은 5 X 반웅 완충용액 4 i , 10 rnM dNTP 흔합물 2 βί , 증류수 2. 4 μΐ , RNase 억제제 ( i nhi b i tor ) 0. 1 ^로 흔합하여 각 RNA/프라이머 혼합물과 부드럽게 섞어주고, 간단히 원심분리하여 모아준다. 이를 42 ^° C에 3분간 놓아둔 후, 1 βί Μ- MLV 역전사효소를 넣고, 섞어준 후 42 ^° C에 60분 동안 놓아둔다. 반웅 종결은 70°C에 5분간 놓아두고, 얼음에 놓아 식혀준 후, 간단히 원심분리하여 반웅물을 얻는다. 이렇게 얻은 반웅물은 바로 PCR 하거나, 실험 전까지 -20 ^° C에 보관한다.

RT-PCR은 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR 류브에 주행 RNA 1 ； 와 역방향 프라이머를 섞어주고, 5분간 70 ^° C에서 반웅시킨 후 얼음에 놓아둔다. 이에 정방향 프라이머를 넣어주고. 반웅 볼륨이 20 ^가 되도록 DEPC 물로 채워준다. 이를 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 PCR 조건으로 수행하였다. PCR 결과물은 1 .0% 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동으로 확인하였고, 이미지는 LAS-3000으로 확인하였다.

【표 5】

프라이머

유전자 이름 서열 방향 사용된 조직 서열번호

FM01_F CAT TCC AAC TAC AAG GAC TCG 정방향 서열번호: 1

FM01 신장

FM01_R TGT CTC TGG ACA GTG GGA AGT 역방향 서열번호: 2

FM02_F CCG GGT CH TAA GGG ITT CAG G 정방향 서열번호: 3

FM02 폐

FM02_R AGG CTC CAT CTT CCC AAC CGT A 역방향 서열번호: 4

FM03_F CAG CAT TTA CCA ATC GGT CTT C 정방향 서열번호: 5

FM03 간

FM03_R ΉG CTG TGA TGC ATG AAG TTG 역방향 서열번호: 6

FM04_F TCC TGA GCC CAC ATT TAC CTC ο ο ο 서열번호: 7

FM04 신장

FM04ᅳ R CCA GTG TTT CCA AGA CCA ACC 역방향 서열번호: 8

FM05_F GCT TGC CTA CAC GGT TCA AG 정방향 서열번호: 9

FM05 간

FM05_R ATC ACA CGG ATG CTC ACC TG 역방향 서열번호: 10

GAPDH_F AGC CTC GTC CCG TAG ACA AA 정방향 서열번호: 11

GAPDH

GAPDH_R CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC 역방향 서열번호: 12 【표 6]

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 같은 FM0 유전자군 (gene fami ly) 이더라도 조직에 따라 발현량의 차이가 나타나는 것을 확인하였다 (도 6) . <실시예 8>마우스 장기별 추출물 처리에 따른 FM0유전자의 발현 변화 확인

마우스 간, 폐 및 신장 장기에서의 추출물 처리에 따른 FM0 유전자 발현변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 추출물을 경구투여한 동물 모델을 가지고, 상기 <실시예 7>과 동일한 실험 방법으로 RT-PCR을 통해 확인하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 5>와 비슷한 결과로 간에서의 FM03 및 신장에서의 FM04에서 상황버섯 열수추출물 (PBE) , 상황버섯 수층분획물 (PBW) 및 상황버섯 베타글루칸 (PBG)을 처리한 군에서 처리하지않았을 때보다 농도 의존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인하였고， 상황버섯 열수추출물이나 상황버섯 수층분획물보다 상황버섯 베타글루칸을 처리한 군에서의 FM03의 발현 변화가 더욱 확실하게 나타남을 확인하였다 (도 7) .

<실시예 9>마우스 조직에서 FM03유전자의 발현 분석 확인

상기 <실시예 8>에서와 같이 상황버섯의 베타글루칸 ( β -D-glucan)이 마우스의 간에서 FM03의 발현을 촉진하는 것을 확인하였으나 상황버섯은 매우 고가이므로 이보다 가격이 저렴한 효모 또는 식물에서 추출한 베타글루칸도 FM03의 발현을 촉진하는 지 규명하기 위하여 각종 베타글루칸 을 7일간 경구투여후 랫트의 간에 발현된 FM03을 real t ime PCR로 분석하였다.

구체적으로, SD rat를 일주일간 사육장에 적응시킨 후에 4 그룹 (n = 4)으로 나누어 식염수 (Control). 상황버섯 (PBG), 효모 (Zymosan, Sigma-Aldr ich Co.. USA), 보리 (Barley, Sigma-Aldr ich Co., USA)의 베타-글루칸을 25 mg/kg의 농도로 하루 1회, 총 7일간 경구 투여 후 간을 적출하였다. 적출한 장기에서 RNA 분리를 수행하기 위해 각 조직에 1 m£ TRIzol reagent를 처라한 후 homogenizer를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 250 ≠ chloroform을 넣고 잘 섞은 후 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 550 ≠ isopropanol을 이용하여 RNA를 침전시킨 후 75% ethan 로 세척하고 자연 건조시켰다. RNase free water로 RNA를 녹인 후 R A 농도 측정 후 -80 ^° C에서 저장하였다.

추출한 RNA에 역전사로 cDNA를 합성하기 위해 oligo d(T)15-mer(EBT-1523, Elpis Biotech. Korea), reaction buffer (50 niM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgC12, 10 mM DTT, pH 8.3), 10 mM dNTP과 200 unit M-MLV-RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Pr omega, USA)를 분리한 RNA에 처리하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 real time PCR을 수행하였다. Real time PCR용 plate(multiplate PCR plates 96-well clear. # LL9601, Bio-rad, United Kingdom)에 2X Amp i gene qPCR Green Mix Lo-Rox(Enzo, #ENZ-NUC103) 10 f , forward primer 1 μί, reverse primer 1 i , template DNA 2 ! , distilled H20 6 / 를 넣어준 뒤 Optical Adhesive covers (Applied Biosystems, USA)를 덮어주었다. 1500 rpm에서 5분간 centrifuge하여 spin down하여 real time PCR 기기 (CFX- Connect , Bio— rad)를 이용하여 real time PCR을 polymerase activation 2 min, 95 °C , 1 cycle, denaturat ion 5 sec , 95 ^° C , anneal ing/extension 30 sec , 65 ^° C , 40 cycles 수행하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 랫트에 7일간 생리식염수 (대조군), PBG (상황버섯 베타글루칸), Zymosan (효모 베타글루칸), Barley (보리 베타글루칸)을 각각 25 mg/kg의 농도로 경구투여한 후에 간을 적출하여 FM03의 발현을 real time PCR로 분석한 결과 상황버섯 베타글루칸에서는 2.4배 (2.43 士 0.34), 효모 베타글루칸에서는 2.9배 (2.94 ±0.19), 보리 베타글루칸에서는 2.2배 (2.15 土 0.31)) 가량 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 12).

결론적으로 베타글루칸에 의한 FM03의 증가는 상황버섯의 베타글루칸에 국한된 것이 아니라 효모와 식물유래의 보리 베타글루칸에 의해서도 나타나는 것으로 확인되었다. 따라서 고가의 상황버섯을 이용하기 보다는 저가의 효모 또는 보리 유래의 베타글루칸을 사용하여도 FM03의 발현이 증가된다. 따라서 잔류농약과 니코틴 등 체내에 흡수된 각종 N-, S- 및 P-를 함유하는 다양한 생체외래물질 (xenobiotics)의 배출은 증가된 FM03에 의하여 효과적으로 달성할 수 있다.

<실시예 10> 고속액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)를 이용한농약 분해 확인

<10-1> HPLC를 위한준비

상기 실시예 <2— 3>과 동일한 방법으로 농약 경구투여한 동물 모델을 가지고 상황버섯 추출물의 농약 분해를 HPIX 방법을 이용하여 확인하기 위해 샘플 준비를 하였다.

구체적으로. 심장 천자 (cardiac puncture)를 이용하여 혈액 샘플을 채취하였다. 마우스를 눕혀 놓고, 칼돌기연골 (xiphoid cartilage) 뒤쪽으로 중간에서 약간 왼쪽에 25 내지 30 게이지 (gauge) 바늘을 부착한 1 주사기를 삽입한다. 바늘이 심장에 들어가기 위해서는 흉골의 수평축에서 10 내지 30 ^° 로 삽입해야한다. 또한. 최대 심장 박동 시점에 즉시 심장 옆으로 접근하여 바늘이 1 cm 정도 들어갔을 때 주사기를 당겨 혈액을 채취한다. 샘플은 7일간 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 투여한 후, 카벤다짐을 투여하고나서 0.5， 1, 1.5, 2, 6 및 12시간 마다 채취하였다. 이렇게 얻은 샘플은 혈액의 2배 용량의 메탄올 (MeOH)을 넣고 30분 동안 흔들어 섞어준다 (shaking). 이 후, 1700 g에서 15분 동안 원심분리하고, 유기용제 (organic solvent) 충을 제거하고. HPLC 분석에 사용한다. <10-2> HPLC를 이용한농약 분해 확인

상기 실시예 <9-1>의 방법을 이용하여 얻은 샘플을 가지고 HPLC 분석을 통해 농약 분해를 확인하였다.

구체적으로, HPLC는 Dionex(독일)를 사용하였다. 칼럼은 reverse phase colunm(C18, 250X4.6. 5 μηι)을 이용하였다. 파장은 245 nm로 하였고, 샘플의 주입양은 20 yL로 하였다. 이동상으로는 메탄올：물 (50:50)을 사용하였고, 유량 (flow rate)은 1 /분으로 설정하였다.

그 결과 도 8a 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, 상황버섯 열수추출물 또는 베타글루칸을 투여하지않았을 때보다 상황버섯 열수추출불 또는 베타글루칸을 투여했을 때 마우스 체내 남아있는 카벤다짐의 양이 투여한 상황버섯 열수추출물 또는 베타글루칸 농도에 비례하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 8a 내지 도 11). 지금까지의 결과를 토대로 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 경구투여 함으로써 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 크게 증가시키고, 카벤다짐의 분 해를 촉진시키는 것을 확인함으로써. 본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸 을 이용하여 FM03의 발현을 증가시킴으로써 체내 니코틴 또는 농약과 같은 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질의 분해가 촉진됨을 확인함으로써 . 생체외래물질 분해 촉진용 조성물로 사용할 수 있다.

<제조예 1>건강기능성식품의 제조

<1-1>상황버섯 추출물 함유 건강기능성식품

상황버섯 추출물: 0.1 - 10% 중량부，

지방분해효소 (Lipase): 0.001 ~ 0.01% 중량부,

제 3 인산칼슴: 1 20% 증량부.

비타민 E: 0.01 ~ 0.1% 중량부,

효소 분말: 1 ~ 10% 중량부.

유산균: 0.1 - 10% 중량부,

바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 ~ 10% 중량부, 및

포도당: 20 ~ 90% 중량부. <1-2>효모추출물 함유 건강기능성식품

효모 추출물: 0.1 - 10% 중량부

지방분해효소 (Lipase): 0.001 ~ 0.01% 중량부,

제 3 인산칼슘: 1 20% 중량부,

비타민 E: 0.01 - 0.1% 중량부, 효소 분말: 1 ~ 10% 중량부，

유산균: 0.1 - 10% 중량부,

바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 - 10% 중량부, 및

포도당: 20 - 90% 중량부.

<1-3>보리추출물 함유 건강기능성식품

보리 추출물: 0.1 - 10% 중량부,

지방분해효소 (Lipase): 0.001 0.01% 중량부,

제 3 인산칼슘: 1 20% 중량부.

비타민 E: 0.01 ~ 0.1% 증량부,

효소 분말: 1 ~ 10% 중량부,

유산균: 0.1 ~ 10% 중량부,

바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 ~ 10% 중량부， 및

포도당: 20 - 90% 중량부.

<제조예 2>천연물의약품의 제조

<2-1>산제의 제조

실시예 1의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 흔합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<2-2>정제의 제조

실시예 1의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸 100 nig

옥수수전분 100 nig

유 당 100 nig

스테아린산 마그네슘 2 nig

상기의 성분을 흔합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제 를 제조하였다. <2"3> 캡슐제의 제조

실시예 1의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸 100 nig

옥수수전분 100 mg

유 당 100 nig

스테아린산 마그네슘 2 nig

상기의 성분을 흔합한 후, 통상의 캡술제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐 에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<2-4>주사액제의 제조

실시예 1의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸 10

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 Ιι

<제조예 3>사료 첨가제의 제조

<3-1>상황버섯 추출물을 함유하는사료 첨가제의 제조

본 발명자들을 상황버섯 추출물을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로 사료첨가제를 제조하였다. 상황버섯 추출물: 0. 1 - 10% 중량부.

지방분해효소 (Lipase ) : 0.001 - 0.01% 중량부,

제 3 인산칼슘: 1 - 20% 중량부 ,

비타민 E : 0.01 - 0. 1% 중량부，

효소 분말: 1 ~ 10% 중량부,

유산균: 0. 1 ~ 10% 중량부,

바실러스 (Bac i l his ) 배양액: 0.01 10% 중량부, 및

포도당: 20 ~ 90% 중량부.

<3-2> 베타글루칸을 함유하는 사료 첨가제의 제조

본 발명자들을 베타글루칸을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로 사료 첨가제를 제조하였다. 베타글루칸: 0.1 ~ 10% 중량부,

지방분해효소 (Lipase): 0.001 - 0.01% 중량부,

제 3 인산칼슘: 1 - 20% 중량부，

비타민 E: 0.01 ~ 0.1% 증량부.

효소분말: 1 ~ 10% 증량부,

유산균: 0.1 10% 중량부,

바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 ~ 10% 중량부. 및

포도당: 20 ~ 90% 중량부.

<제조예 4>사료의 제조

<4-1>상황버섯 추출물을함유하는사료의 제조

본 발명자들은 하기의 성분을 흔합하고 통상의 사료 제조 방법에 따라서 제 조하였다.

실시예 1의 상황버섯 추출물 50 g

버섯배지 200 g

소맥피 30 g

비트펄프 50 g

쌀주정박 220 g

옥수수후레이크 200 g

전지대두 40 g

전분박 100 g

콘싸일리지 200 g

옥수수속대 180 g

비지 400 g

라이그라스 323 g

지오라이트 14 g

타피오카 40 g <4-2>베타글루칸을함유하는사료의 제조

본 발명자들은 하기의 성분을 흔합하고 통상의 사료 제조 방법에 따라서 제 조하였다.

실시예 1의 베타글루칸 50 g

버섯배지 200 g

소맥피 30 g

비트펄프 50 g

쌀주정박 220 g

옥수수후레이크 200 g

전지대두 40 g

전분박 100 g

콘싸일리지 200 g

옥수수속대 180 g

비지 400 g

라이그라스 323 g

지오라이트 14 g

타피오카 40 g