【발명의 명칭】

cFLIP s iRNA를 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 또는 감작용 조성물 【기술분야】

본 발명은 cFLIP siRNA를 포함하는 인터페론 베타 저항성 암질환 치료용또 는 감작용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 (a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상 보적으로 결합하는 s iRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신 -트레오닌—발린 서 열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치 환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물과 cFLIP siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포 감작용조성물에 대한 것이다.

【배경기술】

본 출원은 2016년 7월 29일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0097516 호를 우선권으로주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 인터페론 ( IFN)은 사이토카인의 일종으로서 항바이러스 활성을 나타내고， 세 포 증식을 억제하며, 자연 면역 반웅을 조절하는 기능을 갖는데， 이 중 타입 -1 인 터페론에 속하는 인터페론 -베타 ( interferon beta, 또는 IFN-β )는 5개의 알 파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서， 크기는 22kDa이며 당쇄를 제거하면 18kDa이 된다 (Arduini et al .， Protein Science, 8 : 1867-1877， 1999) . 인터페론 베타의 임상 적용에 관한 연구는 다양하고 활발하게 진행 증에 있 다. 다발성 경화증， 항바이러스 활성， 세포 성장 억제 또는 항성장 활성， 림프구 세포 독성 증대 활성， 면역 조절 활성， 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성， 대 식세포의 활성화 활성， 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증 가 활성， 자연 살해 세포 (natural ki l l ing cel l )의 증가 활성 등의 다양한 면역학 작 활성으로 암, 자가 면역 장애 및 바이러스 감염， HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다는 보고가 있다 (Pi U ing et al . , European Journal of Immunology, 29： 1041-1050 , 1999； Young et al . , Neurology 51 : 682-689 , 1998； Cirel l i et al , Clin Iimunother 3 : 27-87 , 1995) . 특히 타입 -1 인터페론의 항암 활성에 대하여 1988년도에 미국 식약처에서 만 성 골수 백혈병， 흑색종， 신세포암 같은 다양한 암종에 치료제로 허가를 받았으나 부작용과 무반웅 ( _non -response) , 내성 발생 등의 이유로 최근에는 항암제로써 사용 은 줄어든 상태이다. 최근까지도 인터페론 베타는 많은 연구를 통해 항암 효과가 검증되고 있으며， 인터페론 알파에 비하여 우수한 항암 효능을 나타내는 것이 확인 된 바 있다. 하지만 아직까지 항암 치료제로서 허가를 받지는 못하고 있다. 따라 서， 기존의 인터페론 베타의 부작용을 극복하고, 무엇보다도 인터페론 베타의 항암 효과를 최대한 활용할 수 있도록 인터페론 저항성 암의 항암 치료에 대한 민감성을 높이는 감작제의 개발이 시급한상황이다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

이에 본 발명자들은 암세포에서 cFLIP의 발현 수준을 억제함으로싸 암세포를 감작시키고 인터페론 베타의 항암 효과를 제고할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완 성하였다. 따라서 본 발명의 목적은

(a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 s iRNA; 및

(b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산서열에서 C-말단에 글라이신—아스파라진-이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조 성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은

인터페론 베타 저항성 암 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 (a) cFLIP유 전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 s iRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C—말단에 글라이신-아스파라진—이소류신- 트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은

(a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1 로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신- 아스파라진—이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성 분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징 으로 하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료 방법올 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은

cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른목적은，

인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 제제의 제조를 위한 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은，

cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인터페 론 베타 저항성 암세포의 감작 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기와같은목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

(a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및

(b) 서열번호 1로표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신—트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조 성물을 제공한다.

또한 (a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체로 구성되는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한 다.

또한 (a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및

(b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체로 필수적으로 구성되는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성 물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

인터페론 베타 저항성 암 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 (a) cFLIP유 전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신- 트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

(a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1 로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신- 아스파라진—이소류신-트레오닌—발린 서열 (GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성 분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징 으로 하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료 방법을 제공한다.

또한 (a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 s iRNA; 및 (b) 서열번 호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이 신-아스파라진-이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기 닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체로 구 성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료 방법을 제공한다. 또한 (a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번 호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이 신-아스파라진-이소류신—트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기 닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체로 필 수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것올 특 징으로 하는 인터페론 베타저항성 암 질환 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은

cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용조성물을 제공한다.

또한 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA로 구성되는 인터페 론 베타 저항성 암세포의 감작용조성물을 제공한다.

또한. cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA로 필수적으로 구성 되는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 제제의 제조를 위한 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인터페 론 베타 저항성 암세포의 감작 방법을 제공한다.

또한 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA로 구성되는 조성물 의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작 방법을 제공한다.

또한 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA로 필수적으로 구성 되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인 터페론 베타 저항성 암세포의 감작 방법을 제공한다. 이하본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은

(a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로결합하는 siRNA; 및

(b) 서열번호 1로표시되는 인간의 천연형 인터페론베타아미노산서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-아소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터폐론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조 성물을제공한다. 본 발명자들은 인터페론 베타 ( interferon , IFN13 또는 IFN- β )에 반응하 여 세포사멸이 일어나는 암세포와 그렇지 않은 저항성 암세포에 변이 체인 카비페론 (carbi feron)을 처리하고 세포사멸과 death receptor 신호전달에 관 련된 단백질 발현 양상을 비교한 결과, IFN13 저항성 암세포에서 ΙΡΝβ의 처리에 의하여 cFLIP의 발현율이 상승하는 것을 발견하였다. 나아가 IFNp 저항성 암세포 에서 siRNA를 이용하여 cFLIP의 발현을 억제하면， carbi feron에 반웅하여 저 항성 암세포에서 세포사멸에 증요한 caspase-8 등이 활성화되고 세포 생존률이 크 게 감소하는 등， carbi feron의 암세포 사멸 효과가 발휘되는 것을 확인하였다. 이 에 본 발명자들은 cFLIP siRNA를 유효성분으로 포함하는 IFNP 저항성 암세포를 에. 반웅하여 세포사멸이 일어나도록 하는 감작용 조성물을 제공한다. 더불어 IFNP 또는 그 변이체와 cFLIP siRNA를 병용 투여하여 저항성 암 질환에 치 료 효과를 갖는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 폴리뉴클레오티드 (polynucleot ide) 또는 핵산은 단일 또는 이증 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산 (deoxyr ibonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산 (r ibonuclei c acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한， 자연적으로 생성되는 뉴 클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌 (adenine , A) , 구아닌 (guanine, G) , 시토신 (cytosine, C) , 티민 (thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA 는 티민 대신 우라실 (Uraci l , U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 상보적 (complementary) '이라고 한다. 상기 'mRNA messenger RNA또는 전령 RNA) '는 단백질 합성 과정에서 특정 유 전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜 (ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성 ( 단백질 번역， translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형 (template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사 (transcription) 과정을 통하여 합성 된다. 또한 단백질은 폴리펩타이드 (polypeptide) 또는 펩타이드 (peptide)와 호환성 있게 사용되몌 예컨대， 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자 (삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테 인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라 이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피를라이신; P(Pro): 프를린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg)： 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀 레노시스테인; V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신. 본 명세서에 표기되는 (아미노산 일문자) (아미노산 위치) (아미노산 일문자) 는 천연형 단백질 (wild-type protein, 본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 인간 의 천연형 인터페론 베타 단백질)의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산 이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면， R27T은 정상 형 단백질의 27번에 해당하는 아르기닌이 트레오닌으로 치환된다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 발현 (expression)이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생 성되는 것을 의미한다. 상기 'cFLIP(cellular FLICE-like inhibitory protein)'은 CASH, FLIP, MRIT, CLARP, FLAME, Casper , FLAMEl, FLAME-1, I-FLICE, CASP8AP1 등의 명칭으로 도 알려져 있는 유전자로， 공식 명칭은 'CASP8 and FADD like apoptosis regulator(CFLAR)'이다. cFLIP은 caspase— 8과 구조적으로 유사하지만 단백질 분해 활성은 없으며， 전형적인 death receptor에 의한 세포사멸과 pattern recognition receptor에 의한세포사멸을조절한다. 본 발명에서의 cFLIP 유전자는 인간에서 유래한 것으로서， 염색체 상 2q33- 34에 위치한다. 인간의 cFLIP 유전자에는 다양한 아형 ( isoform) 단백질을 암호화하 는 전사 변이체 (transcr ipt var iant)가 존재하며, 아형으로는 대표적으로 cFLIP _L , cFLIP _R , CFLIP _s 등 세 가지가존재한다. 본 발명에서의 cFLIP은 바람직하게는 cFLIP _L 과 cFLIP _s 을 의미한다. CFLIP _L 은 N-말단에 2개의 DED 도메인 (death ef fector domain)과 C-말단에 caspase 유사 도메인 (caspase-Hke domain)이 있는 약 55kDa의 단백질이고， cFLIPs는 caspase 유사 도메인 없이 두 개의 DED 도메인만 있는 약

27kDa의 단백질이다. 본 발명에 따른 cFLIP 유전자의 mRNA는 보다 구체적으로는 cFLIP _L 또는 cFLIPs를 암호화하는 것으로서, 이에 제한되지 않으나서열번호 7 또는 서열번호 8 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열올포함하는 것일 수 있다. 상기 siRNA(smal l interfer ing RNA 또는 short interfering RNA 또는 si lencing RNA) '는 세포 안에 인위적으로 도입되어 특정 유전자의 mRNA의 분해를 유도하여 단백질 번역 (translat ion)이 나지 않도록 하여 유전자 발현을 억제하는 RNA 간섭 (RNA interference) 현상을 일으키는 짧은 이증가닥의 RNA로, 표적 mRNA의 특정 부위에 상보적인 20 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 세포 내에서 siRNA의 이중 가닥 중 표적 mRNA에 상보적인 가닥 (ant i sense strand)이 RISCCR A- induced si lencing complex) 단백질 복합체와 결합하여 표적 mRNA에 결합하고， RISC 복합체 안의 argonaute 단백질이 표적 mRNA를 절단하여 분해시키거나， 단백질 번역에 중요한 단백질과 리보솜이 mRNA와 결합하는 것을 억제하는 등의 기작으로 특정 유전자의 발현을 억제한다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 cFLIP siRNA는 cFLIP 유전자 의 mRNA상의 특정한 염기서열과 서로 상보적으로 결합하여 결과적으로 cFLIP mRNA 를 분해시킴으로써 cFLIP 유전자의 발현 수준을 낮출 수 있는 20 내지 25bp의 짧은 RNA를 의미하는 것이다. 상기 cFLIP siRNA는 구체적으로는 서열번호 9 내지 서열번 호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으며, 가장 바람 직하게는 서열번호 11 또는 서열번호 12로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명에 따른 cFLIP siRNA의 cFLIP mRNA 상의 표적 부위는 도 5에 도시된 바와 같다. 본 발명의 약학적 조성물에서 CFLIP _s iRNA는 인터페론 베타 저항성 암세포에서 세포사멸 또는 death receptor 관련 신호전달계를 활성화하여 항암제， 가장 바람직하게는 인터페 론 베타 또는 그 변이체의 항암 작용에 민감하게 반웅할 수 있는 감작제 (sensit i zer)로 작용하게 된다. 본 발명에 따른 siRNA는 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상， 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반웅 감소를 위한 다양한 변형 (modi f icat ion)을 가한 것일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이 상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 ^' 탄소 위치에서 0H기가 -CH ₃ (메틸) ,

-0CH ₃ (methoxy) , -NH ₂ , -F, -0-2-메록시에틸， -0-프로필 (propyl )， -0-2-메틸티오에 틸 (methyl thioethyl ) , -0-3-아미노프로필, -으3-디메틸아미노프로필， 0— N-메틸아 세트아미도 또는 -0"디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 (sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포 로티오에이트 (phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트 (boranophosphate)， 메틸포 스포네이트 (methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(pept ide nucleic acid) , LNA( locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nuclei c acid) 형태로의 변형도사용이 가능하다. 본 발명의 약학적 조성물의 다른 유효성분은 항암 활성을 갖는 인간의 인터 페론 베타 변이체로서， 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미 노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV) 을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 (R27T) 또는 세린 (R27S)으로 치환된 변이체이다. 상기 인간의 인터페론 베타 변이체는 인간의 천연형 인터페론 베타에 하나 이상의 Ν-연결형 당쇄가추가되도록 한 것으로서，

천연형 인터페론 베타 폴리펩티드 (서열번호 1)의 C-말단에 GNITV서열이 부 가되어 그 위치의 아스파라진에 Ν-연결형 당쇄화가 일어나도록 하거나;

천연형 인터페론 베타 폴리펩티드 (서열번호 1)에 R27T또는 R27S의 아미노산 치환을 도입하여 해당 부위의 아미노산 서열인 25 내지 28번째 아미노산 서열이 아 스파라진-글라이신-트레오닌 /세린 -류신 (NG(T/S)L)으로 변경됨으로써 그 위치의 아 스파라진에 N-연결형 당쇄화가 일어나도록 한 것이다.

상기 인터페론 변이체는 천연형과 비교하여 항바이러스 활성, 세포 성장 억 제 활성， 면역 조절 기능， 생체 내 반감기 및 안정성 둥이 향상된 것으로， 대한민 국 등록특허 10-0781666호와 PCT 출원 PCT/KR2016/002129호에 보다 상세하게 기재 되어 있다. 구체적으로， 상기 인간 인터페론 베타 변이체의 아미노산서열은서열번호 2 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함 하는 것일 수 있다. 또한 본 발명의 인터페론 베타 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 6 증 어 느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함 한다. 상기 기능적 동둥물이란 상기 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성 ( 즉， 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면， 70%， 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%， 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로， 상기 서열번호의 아미 노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리 펩티드를 말한다. 여기서 실질적으로 동질의 생리 활성이란 서열번호 2 내지 서열 번호 6 증 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 N-연결형 당쇄 (N-linked glycosylation)를 보유함으로써 야생형 (wild type, WT) 인 간 인터페론 베타와 비교하여 동등하거나그 이상의 활성을 가지는 것을 의미한다. 인간 인터페론 베타의 활성으로서는 다발성경화증에 대한 경감, 완화 또는 치료 활성， 항바이러스 활성， 세포 성장 억제 활성， 항성장 활성， 항증식 활성， 림 프구 세포독성 증대 활성， 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활 성, 사이토카인 생성의 증가 활성， 세포독성 T세포의 효과 증가 활성， 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포 (natural killing cell)의 증가 활성， 암 예방 또 는 치료 활성ᅳ 자가 면역 장애 예방또는 치료 활성， 바이러스감염 예방또는 치료 활성, HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활성， C형 간염 예방 또는 치료 활성， 류마티스성 관절염 예방또는 치료 활성 등 매우 다양한 예시를 들 수 있다. 본 발 명의 목적상 인간 인터페론 베타의 활성이란 특히 암세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는항암활성을 의미한다. 인터페론 베타는 다양한 기작으로 암세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유 도하여 항암 활성을 갖는다. 인터페론 베타는 종양 세포의 혈관신생 작용에 대한 저해작용을 함으로써 종양세포의 성장을 억제하거나， 인터페론-베타는 종양이 존재 하는 부위의 주변 환경에서 선천성 또는 후천성 면역반응을 유도함으로써 종양세포 의 사멸을 유도해 항암 효과를 나타낼 수 있다. 나아가 인터페론 베타는 암세포에 직접 작용하여 세포 외부 자극에 반웅하는 외재적 사멸 수용체 신호전달계

(extrinsic death receptor pathway)와 내재적 미토콘드리아 신호전달계 (intrinsinc mitochondrial pathway) 둥 주요 세포사멸 관련 신호 전달을 조절한다 (Parker B et al. , Nat. Rev. Cancer. , 16:131-144， 2016) . 상기 기능적 동둥물은서열번호 2 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 중 일부가부가， 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기 에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산 의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산 (Gly, Ala, Pro), 소수성 아 미노산 (lie, Leu, Val), 방향족 아미노산 (Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gin, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 인터페론 베타 변이체 폴리펩티드의 아미 노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리 활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 상기 서 열번호로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 생리 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물 의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하 면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성， 저장성, 휘발성 또는 용해도둥을 변경시키 기 위한구조 변경이 이에 포함된다. 또한본 발명에 따른 인간 인터페론 베타 변이체는 항체 또는항체의 단편과 결합된 융합 단백질인 것일 수 있다. 인터페론 베타는 다양한 조직과 세포에서 발 현되므로， 인터페론 베타의 항증식 활성과 세포사멸 활성이 암세포에 집중될 수 있 도록 암세포 특이적으로 발현되는 단백질 또는 고분자 물질， 즉 종양성 항원을 특 이적으로 인식하는 항체와 결합한 인터페론 베타 변이체는 암 표적 치료제로서 부 작용은 낮추고 더욱 우수한 치료 효과를 기대할 수 있다. 구체적으로는 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함 하는 것일 수 있다. 상기 종양성 항원은 면역 반웅， 특히 T-세포 매개된 면역 반웅을 이끌어내는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 종양 항원은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고， 예를 들면， 글리오마-관련된 항원， 암배아 항원 (CEA) , β -인간 융모성 생식 샘자극호르몬, 알파태아단백질 (AFP) , 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린， RAGE-1, 丽- CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1 , RU2(AS) , 장 카르복실 에스테라제， mut hsp70-2 , M-CSF, 프로스타제， 전립선-특이적 항원 (PSA) , PAP, NY-ESO-1 , LAGE-la, p53 , 프로스테인， PSMA, Her2/neu, 서바이빈 (survivin) 및 텔로머라제, 전립선-암 종 종양 항원 -l(PCTA-l) , MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타계， 에프린 B2 , CD22 , 인슐 린 성장 인자 ( IGF)-I , IGF-I I , IGF-I 수용체 및 메소텔린을포함한다. 본 발명에서 지칭된 종양성 항원의 유형은 또한종양-특이적 항원 (TSA) 또는 종양-관련된 항원 (TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 대해 고유하고 신체의 다른 세포 상에서 발생하지 않는다. TAA 관련된 항원은 종양 세포에 대해 고유하지 않고 대신에 또한항원에 대한 면역원성 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포 상에서 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 대해 반 응하게 하는 조건 하에서 발생할 수 있다. T 는 면역 시스템이 비성숙하고 반웅할 수 없는 경우 태아 발달 동안 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나 정상 세포 상에서 매우 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포 상에서 훨씬 높 은수준으로 발현되는항원일 수 있다.

TSA또는 TAA항원의 포괄적인 예시는 다음과 같다: MART-l/MelanA(MART-I ) , gplOOCPmel 17)， 티로시나제， TRP-l , TRP-2와 같은 분화 항원 및 MAGE-1， MAGE-3， BAGE, GAGE-1 , GAGE-2 , pl5와 같은 종양—특이적 다증계통 항원; CEA와 같은 과발현 된 배아 항원; 과발현된 종양유전자 및 p53 , Ras , HER-2/neu와 같은돌연변이된 종 양 -억제 유전자; 염색체 전위로부터 초래된 고유 종양 항원; 예를 들면 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원， 예를 들면 엡스타인 바 바 이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰， 단백질 -기반 항원에는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met , nra-23Hl, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, - ras, 베타-카테닌， CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단 백질， 베타 -HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 \CA 27.29\BCAA, CA 195， CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO— 029， FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, M0V18, NB/70K, Y-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 결 합성 단백질 \사이클로필린 C—관련된 단백질， TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS. 상기 종양성 항원을 특이적으로 인식하는 항체로는 예를 들어， HuM195 (예를 들어 , Kossman et al. , Clin. Cancer Res., 5:2748-2755, 1999) , CMA-676 (예를 들 어， Sievers et al. , Blood, 93:3678-3684, 1999) , AT13/5 (예를 들어， Ellis et al., J. Immunol. 155:925-937, 1995)， HB7, 트라스투주맙 (예를 들어, HERCEPTIN; Fornier et al., Oncology(Huntingt) , 13:647-58， 1999)， TAB-250(Rosenblum et al. , Clin. Cancer Res. , 5:865-874， 1999) , BACH-250, TAKMaier et al. , Cancer Res., 51:5361-5369, 1991) 및 미국 특허 제 5, 772,997호; 게 5, 770,195호에 기술된 mAb(mAb 4D5; ATCC CRL10463)； 및 미국 특허 게 5， 677,1기호에 기술된 mAb, Mc5(예 를 들어， Peterson et al. , Cancer Res. , 57:1103-1108， 1997； Ozzello et al . , Breast Cancer Res. Treat. , 25:265-276， 1993) , hCTMOl (예를 들어， Van YM et al. , Cancer Res., 56:5179-5185， 1996) CC49(예를 들어， Pavlinkova et al. , Clin. Cancer Res., 5:2613-2619, 1999)， B72.3(예를 들어， Divgi et al., Nucl. Med. Biol. , 21:9-15, 1994) , 마우스 모노클로날 항 -HM1.24 IgG2a/ κ , 인간화된 항 -HM1.24 IgGl/κ항체 (예를 들어， 0no et al. , Mol . Imwuno. , 36:387-395， 1999) , 리툭시맙 (rituximab), 이브리투모맙티욱세탄 (ibritumomabtiuxetan) 및 토시투모맙 (tositumomab), AME-133v(Appl ied Molecular Evolution), 오크렐리주맙 (0creli2uraab; Roche) , 오파투무맙 (Ofatumumab; Genmab) , TRU-015(Trubion) 및 IMMU-106(Immunomedics) 등이 포함되나， 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 항체는 인간항체， 키메라항체 및 /또는 인간화 항체일 수 있 으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 키메라 항체는 뮤린 면역글로불린의 가변 영역 과 인간 면역글로불린의 보존 영역으로 구성되는 항체를 의미한다. 이러한 변형은 단순히 인간 항체의 보존 영역을 뮤린 보존 영역으로 치환시키는 것으로 구성되며, 이에 따라 약학적 용도에 대해 허용가능하도록 충분히 낮은 면역원성을 가질 수 있 는 인간 /뮤린 키메라를 생성한다. 상기 인간화 항체란 비 -인간 상보성결정영역 (CDR)을 갖는 항체의 서열을 변 형시킴으로써 인간 항체 생식세포 (germl ine)로부터 유래된 아미노산 서열로 (부분 적으로 또는 전체적으로) 구성된 항체를 의미한다. 항체의 가변영역 및 CDR의 인간 화는 당업계에 잘 알려져 있는 기법에 의해 수행된다. 이러한 항체는 Fc 의존적 이 펙터 기능을 위해 필요하지만 항체에 대한 면역 반웅을 훨씬 덜 유발시킬 것 같은 인간 보존 영역을 보유한다. 일례로서， 가변 영역의 프레임워크 영역은， 비 -인간 CDR을 실질적으로 온전하게 남겨놓거나 또는 심지어 CDR을 인간 게놈으로부터 유래 된 서열로 대체한 상응 인간 프레임워크 영역에 의해 치환된다 (예컨대， 특허출원 US 2006/25885 참조) . 전체 ( ful ly) 인간 항체는 인간 면역 시스템에 상응하도록 면 역 시스템이 변형된 유전개질 마우스에서 생산된다. 인간화 항체는 또한 인간 프레 임워크, 비 -인간 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하고， 존재하는 임의의 보존 영역 이 인간 면역글로불린 보존 영역과 실질적으로 동일한， 즉 약 85% 또는 90% 이상이 동일한, 바람직하게는 95% 이상이 동일한， 항체를 나타낸다. 따라서, 인간화 항체 의 모든 부분 (아마도 CDR은 제외하고)은 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열 의 상웅하는 부분과 실질적으로 동일하다. 본 발명에서의 항체 단편은 항체 대웅물 (counter part )과 동일한 항원과 반웅 할 수 있는 항체 단편을 나타낸다. 이러한 단편은 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정될 수 있으며, 여기에는 일례로서 Fab 단편 (예컨대, 파파인 소화에 의한 단편 )， Fab' 단편 (예컨대， 펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편)， F(ab' )2 단편 (예컨 대， 펩신 소화에 의한 단편)， Facb (예컨대， 플라스민 소화에 의한 단편)， Fd (예컨 대， 펩신 소화， 부분적 환원 및 재웅집에 의한 단편)， 및 scFv (단쇄 FV; 예컨대， 분자생물학 기법에 의한 단편) 단편이 포함된다. 상기 단편은 당업계에 알려져 있 거나 및 /또는 본원에 개시되어 있는 바와 같이， 효소 분할， 합성 또는 재조합 기법 에 의해 생산될 수 있다. 본 명세서에서 '치료 '는 질환의 발생 또는 재발 억제， 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소， 질병 진행 속도의 감소， 질병 상태의 개선， 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 치료 대상인 질환은 인터페론 베타 저항성 암 질환이다. 상기 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물은 인터페론의 항 암 작용에 반웅하지 않는 암 질환이라면 그 종류에 제한되지 않으나， 구체적으로는 유방암, 위암， 난소암， 폐암， 결장암， 항문암， 성상세포종, 백혈병， 림프종， 두경 부암， 간암， 고환암， 자궁경부암, 육종， 혈관종， 식도암， 안암， 후두암， 경구암， 중피종， 골수종， 구강암， 직장암, 인후암， 방광암， 자궁암, 전립선암， 대장암, 췌 장암， 신장암, 피부암， 기저세포암， 혹색종， 편평세포암종, 구강편평세포암종， 대 장직장암， 교모세포종， 자궁내막암 및 악성뇌교종으로 이루어진 군에서 선택된 어 느 한 암 질환일 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 항암또는 암세포 감작을 위해, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형 화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매， 분산매질， 수중유또는 유중수 에 멀견， 수성 조성물， 리포좀， 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양， 즉 인터페론 베타 저항성 암을 감작시키고， 인간 인터페론 베타 또는 그 변이체와 병용 투여되 었을 때 항암 효과를 나타내기에 층분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들 어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 1000mg/kg의 범위로 투여될 수 있으며 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조 성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로， 투여 대상， 연령， 성별 체 중， 개인차 및 질병 상태에 따라통상의 기술자가 적절하게 선택할수 있다. 투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여 방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내， 근육 내， 동맥 내, 골수 내, 경막 내 ， 심장 내， 경피， 피하， 복강 내， 비강 내， 장관， 국소 설하 또는 직장 내 투여일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우， 적합한 경구투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립 정제， 환제， 당의정제, 캡슐제， 액 제, 겔제, 시럽제， 현탁액， 웨이퍼 등의 형태로 제형화할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈， 텍스트로즈， 수크로즈， 솔비틀， 만니틀， 자일리틀 에리스리틀 및 말티틀 둥을 포함하는 당류와 옥수수 전분， 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 둥을 포함하는 전분류， 셀를로즈， 메틸 셀를로즈， 나트륨 카르복시메틸셀를로오즈 및 하 이드록시프로필메틸셀를로즈 둥을 포함하는 샐를로즈류， 젤라틴， 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피를리 돈， 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가， 상기 약학적 조성물은 항웅집제, 윤활제， 습윤제， 향료， 유화제 및 방부제 등을 추 가로포함할수 있다. 또한, 비경구적으로 투여하는 경우， 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경 구용 담체와 함께 주사제， 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나， 물， 에탄올， 폴리올 (예를 들어， 글 리세를, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) , 이들의 흔합물 및 /또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는， 적합한 담 체로는 행크스 용액， 링거 용액， 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buf fered sal ine) 또는 주사용 멸균수， 10% 에탄올， 40%프로필렌 글리콜 및 5% 텍 스트로즈와 같은 둥장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로 부터 보호하기 위해서는 파라벤， 클로로부탄올， 페놀, 소르빈산， 티메로살 등과 같 은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 ^' 있다. 또한， 상기 주사제는 대 부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 둥장화제를 추가로 포함할 수 있 다. 경피투여제의 경우， 연고제， 크림제， 로션제, 겔제, 외용액제， 파스타제 리 니멘트제, 에어를제 둥의 형태가 포함된다. 상기에서 경피투여는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대， 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으 로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (pr ick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Remington' s Pharmaceut ical Science, 15th Edit ion, 1975， Mack Publ ishing Company, East on, Pennsylvania)에 기술되어 있 다. 흡입투여제의 경우， 본 발명에 따라사용되는 화합물은 적합한추진제， 예를 들면, 디클로로플루오로메탄， 트리클로로플루오로메탄， 디클로로테트라플루오로에 탄， 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여， 가압 팩 또는 연무기로부터 에 어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에아로졸의 경우， 투약 단 위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 ¾라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분 과 같은 적합한분말 기제의 분말흔합물을 함유하도록 제형화할수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington' s Pharmaceut ical Sciences , 19th ed. , Mack Publ ishing Company , East on, PA, 1995) . 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완층제 (예를 들어， 식염수 또 는 PBS) , 카보하이트레이트 (예를 들어， 글루코스， 만노즈， 슈크로즈 또는 텍스트 란)， 항산화제, 정균제， 킬레이트화제 (예를 들어， EDTA 또는 글루타치은)ᅳ 아쥬반 트 (예를 들어， 알루미늄 하이드록사이드)， 현탁제， 농후제 및 /또는 보존제를 추가 로포함할수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할수 있도록 당업계에 공지된 방법을사용하여 제형 화될 수 있다. 또한， 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나ᅤ 항암또는 인터페론 베타 저항성 암의 감작 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할수 있다. 또한본발명은 cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로결합하는 siRNA를유효성 분으로포함하는 인터페론베타저항성 암세포의 감작용조성물을제공한다. 상기. 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 조성물이란, 인터페론 베타의 자극에 반웅하지 않는 암세포의 세포사멸에 대한 민감성 (sensit ivity)을 증가시켜， 인터페론 베타 또는 그 변이체의 항암 치료 효과가 나타날 수 있도록 하는 조성물 을 의미한다. 본 발명자들이 발현한 cFLIP 유전자의 발현을 억제하는 siRNA가 인터 페론 베타 저항성 암세포에 대하여 감작 작용을 하는 기작은 전술한바와같다. 상기 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 인간의 cFLIP 유 전자의 발현을 효과적으로 억제하여 다양한 cFLIP의 아형 단백질 ( isoform)이 모두 발현되지 않도록 하기 위한 것이다. 구체적으로는 서열번호 9 내지 서열번호 13으 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열을포함하는 것일 수 있다. 또한 본 발명에 따른 감작용 조성물은 항암제와 동시에 투여될 수도 있고， 순차적으로 투여될 수도 있다. 즉, 본 발명에 따른 감작용 조성물은 항암제와 시간 차를 두고 별도로 항암제보다 먼저 또는 나중에 투여될 수 있다. 투여 방법과 투여 경로에 대하여서는본 발명의 약학적 조성물에서 설명한 바와같다. 본 발명의 목적상， 상기 항암제란 인간 인터페론 베타 또는 그 변이체를 의 미하는 것으로서， 가장 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 6으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터페론 베타 변이체이 다. 또한 상기 인간 인터페론 베타 변이체는 암 환자에 주입되었을 때 체내에서 암 세포 조직에 선택적으로 집증될 수 있도록 암세포 특이적 마커에 결합하는 항체 또 는 그 단편과 융합된 형태의 단백질일 수도 있다. 항체 또는 그 단편과 결합한 융 합 단백질 형태의 인터페론 베타 변이체는 구체적으로는 서열번호 18 내지 서열번 호 21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 감작용 조성물은 인터페론 저항성 암세포의 감작 효과에 최 적화된 제형으로 제조되며， 인간 인터페론 베타 변이체와 동일한 제형일 수도 있 고， 경우에 따라 다른 제형으로 제조될 수도 있다. 본 발명의 감작용조성물을 적용할수 있는 암 질환은 인터페론 베타 저항성 암 질환이라면 그 종류에 제한되지 않으며, 구체적인 암 질환의 종류는 본 발명의 약학적 조성물에서 설명한바와 같다. 또한 본 발명은, 인터페론 베타 저항성 암 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 (a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신 -아스 파라진-이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27번째 아르기닌 아미 노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체의 용도를 제 공한다. 또한본 발명은, (a) cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말 단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌 -발린 서열 (GNITV)을 포함하거나， 27 번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여 하는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타 저항성 암 질환치료 방법을 제공한다. 또한본 발명은， 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 제제의 제조를 위한 cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA의 용도를 제공한다. 또한 본 발명은, cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효 성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특 징으로하는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 모발 성장 촉진 및 염증의 개선， 치료， 예방 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 '개체' 란 동물， 바 람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat ient) 일 수 있다. 본 발명의 상기 '제제 또는 조성물' 은 식품 조성물， 화장료 조성물， 약학적 조성물 등의 형태일 수 있고， 본 발명에서는 바람직하게 약학적 조성물을 의미하는 것일 수 있으며 이는 전술한바와 같다. 본 발명의 용어 ᅳ-을 포함하는 (compr ising)' 이란 '함유하는' 또는 '특징 으로 하는' 과 동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서， 언급되지 않은 추 가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '-로 구성되는 (consisting of)' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소 단계 또는 성분 등을 제외하는 정을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essentially consisting of) ' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.

【발명의 효과】

따라서 본 발명은 cFLIP유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA와 인터 페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물과 cFLIP siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세 포 감작용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 인터페론 베타에 저항성 또는 내성을 나타내어 인터페론 베타에 반웅하지 않는 암세포에서 cFLIP의 발현 수준을 낮춤으로써 암세포의 세포사멸을촉진하는 효과가 있다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 반웅성 암세포인 0VCAR-3 세포주에서 카비페론 (carbiferon)의 효과를 확인한실험 결과를 보여준다.

도 1의 A는 carbiferon의 농도와 처리 시간에 따른 세포생존률 (cell viability; 상단의 바 그래프)과 현미경 세포 사진 (하단 패널)을 나타낸다. 도 1의 B는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영 향을 확인하는 qPCR 결과이다. 도 1의 C는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다 도 2는 IFNp 무반응성 암세포인 HeLa 세포주에서 carbiferon의 효과를 확인 한실험 결과를보여준다.

도 2의 A는 carbiferon의 농도와 처리 시간에 따른 세포생존률 (cell viability; 상단의 바 그래프)과 현미경 세포 사진 (하단 패널)을 나타낸다. 도 2의 B는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영 향을 확인하는 qPCR 결과이다. 도 2의 C는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다 도 3은 Π β 반응성 또는 무반웅성 암세포에서의 carbi feron(100ng/ml )에 의한 cFLIP의 발현 수준의 변화를 확인하는 실험 결과를 보여준다.

도 3의 A는 0VCAR-3 세포주， 도 3의 B는 HeLa 세포주에서의 웨스턴 블롯 결 과이다. 도 4는 HeLa 세포주에서 cFLIP 유전자 발현 억제가 carbiferon의 항암 효과 에 미치는 영향을 확인하는 실험 결과를보여준다.

도 4의 A는 4가지 염기 서열의 siRNA가흔합된 cFLIP siRNA (총 ΙΟηΜ)의 처리 가 세포생존률에 미치는 영향을 나타낸다. 도 4의 B는 상기 흔합 cFLIP siRNA가 caspase-8의 수준에 미치는 영향을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 5는 cFLIP유전자의 발현을 억제하기 위한 siRNA디자인을보여준다. 도 5의 A는 cFLIP long form(cFLIP _L )과 short form(cFLIP _s )의 발현을 모두 억제하기 위한 siRNA 표적 부위를 나타내는 모식도이다. 도 5의 B는 해당 siRNA의 염기 서열이다. 도 6은 HeLa 세포주에서 cFLIP siRNA의 발현 저해능을 확인하는 실험 결과를 보여준다.

도 6의 A는 각각의 siRNA(lOnM)로 48시간동안 처리한후 확인한 cFLIP단백 질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 6의 B는 각각의 siR A(20nM)로 48시 간 동안 처리한 후 cFLIP mRNA 수준을 확인하는 qPCR 결과이다. 파란색 점선으로 표시한 siRNA는 1차로 선별된 siRNA를 나타낸다. NC는 음성대조군 siRNA(negat ive control siRNA)를 의미한다. 도 7은 HeLa 세포주에서 1차 선별된 siRNA의 효과를 확인하는 실험 결과를 보여준다.

도 7의 A는 해당 siRNA(lOnM) 단독으로 처리한 경우의 세포생존률을 나타낸 다. 도 7의 B는 해당 siRNA(lOnM)와 carbi feron(100ng/ml )을 함께 처리한 경우의 세포생존률을 나타낸다. 파란색 점선으로 표시한 siRNA는 2차로 선별된 siRNA를 나 타낸다. NC는 음성대조군 siRNA(negat ive control siRNA)를 의미한다. 도 8은 다양한 암세포주에서 2차로 선별된 siRNA(lOnM) 단독 또는 항암제와 병용투여가세포생존률에 미치는 영향을 확인하는 실험 결과를 보여준다. 도 8의 A는 난소암세포인 SK-0V-3 세포주， 도 8의 B는 위암세포인 SNU-216 세포주， 도 8의 C는 위암세포인 NCI-N87 세포주에서,의 결과이다. NC는 음성대초군 siRNA( negative control siRNA)를 의미한다. ACFP는 항체 -사이토카인 융합 단백질 (ant ibody-cytoki e fusion protein)로서， 허셉틴 (hercept in)의 heavy chain 말단 에 carbiferon을융합시킨 융합단백질을의미한다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

암세호의 IFN3 저항성에 따른 carbiferon의 차별적 효과

에 반웅하는 암세포와 IFN13에 반웅하지 않는 저항성 암세포에서 카비 페론 (carbiferon, R27T등)의 항암 효과를 비교하였다 (도 1， 도 2).

Carbiferon의 세포독성을 확인하기 위하여 96- 611 1)1 6의 각 well에 IX

10 ⁴ 개의 OVCAR-3 세포 또는 5X10 ³ 개의 HeLa 세포를 분주한 뒤 24시간 동안 37.5°C,

5% C0 ₂ 환경에서 배양하였다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 carbiferon을

10~1000ng/ml 농도로 처리한 뒤 24시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 이 후 배양 액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤 WST 시약을 1:10으로 회석하여 각 well당 100 μΐ씩 처리한 뒤 2시간 동안 37.5 ^° C, 5% C0 ₂ 환경에서 방치한 뒤 430nra파장에서 흡 광도를 측정하였다.

【표 1】

qPddl斗§ 라이머

유전자 발현의 측정을 위하여 0VCAR-3 또는 HeLa 세포에 carbiferon을 100ng/m! 농도로 처리한 뒤 뒤, 24시간 내지 72시간 동안 배양하였다 ·. 이 후 배양 액을 게거하고 PBS 워시를 3회 진행한 뒤 세포를 수거한 뒤 Trizol을 활용하여 R A 를 추출한 뒤 이를 기반으로 cDNA를 합성하였으며 합성된 cDNA를 templat로 하여 Taqman probe를 활용한 qPCR을 진행하였다. 실험에 사용된 프라이머 염기서열은 표 1에 나타낸 바와 같다 _,

카비페론 처리에 의한 death receptor signaling molecule의 발현 양상을 검 증하기 위하여 0VCAR-3 또는 HeLa 세포주에 100ng/ml의 carbiferon을 처리한 뒤 상 기와 같은 방법으로 배양하고, 세포 배양액을 PBS로 3회 세척한 뒤, 프로티아제 저 해제와 포스파테이즈 저해제가 포함된 R1PA 버퍼 ΙΟΟμ Ι를 처리하여 30분 동안 ice 상에 두어 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 1.5ml 튜브에 담아 13000rpm, 4 ^° C 조 건으로 원심분리하여 상충액 (용해물)만 수거한 뒤 새로운 튜브에 모았다. BCA 정량 법을 이용하여 용해물의 단백질 농도를 정량한 뒤 30pg의 용해물을 채취하여 5X sample buffer와 섞고, 10( C에서 10분간 끓여주어 단백질이 충분히 변성되도록 유 도하였다. 준비된 샘플을 마커 (Marker)와 함께 10% SDS-PAGE 겔에 loading하고 70 V tage로 30분, 120 voltage로 1시간 동안 내려주었다. 이후 겔을 조심스럽게 분 리하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDF(polyvmylidene dif luoride) 막을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 IX transfer 버퍼에 담가 100 voltage로 90분간 단백질 transfer를 진행하였다. 5%의 BSA가 포함된 Tris-buf fered sal ine-Tween 20(TBS-T. 0.1% Tween20)에 막을 1시간 30분 동안 블락 ¾ 한 뒤 각 항체를 TBS-T에 1:1000으 로 희석하여 준비하였다. 막을 항체 회석물에 담가 상은에서 2시간 동안 흔들어주 며 반웅시켰다. 이 과정이 끝나면 10분 동안 3번씩 TBS-T로 닦아주고 상온에서 호 스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase: HRP)가 결합된 이차 항체를 첨가 하여 1시간 동안 반웅하였다. 다시 한번 세척 과정을 수행한 후， 밴드를 ECL 시약 (enhanced chemi luminescence reagent , Intron)을 처리한 뒤. 필름에 현상하였다. 도 1의 C， 도 2의 C，그리고도 3에서 레인 1은 콘트를 레인 2는 24시간， 레인 3은 48시간， 레인 4는 72시간의 carbi feron lOOng/ral 처리군이다. 에 반웅하는 암세포인 0VCAR-3 세포주에 의 변이체인 carbi feron 을 1 10 100 , 또는 lOOOng/ml의 농도로 처리하고 24 내지 72시간동안 배양한 뒤 세포생존률을 확인한 결과， 0VCAR-3 세포는 carbi feron 농도의존적으로， 그리고 배 양시간이 길수록 세포생존률이 크게 감소하는 것으로 관찰되었다 (도 1의 A) . 또한 세포사멸에 중요한 death receptor 신호 전달에 관여하는 DR4, DR5 , FASL, FAS, TNF- α , TRAIL의 발현 수준을 qPCR (도 1의 B)과 웨스턴 블롯 (도 1의 C)으로 확인한 결과， 그수준이 크게 증가하였다. 이와 대조적으로， IFNP에 반웅하지 않는 저항성 암세포인 HeLa세포주에서 동일한 방법으로 배양하여 carbi feron의 효과를 확인한 결과， 가장 높은 농도에서 도 세포생존률은 크게 변함이 없었으나 (도 2의 A) , death receptor 신호 전달 관련 유전자들은 HeLa 세포주에서도 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 2의 B, 도 2의 C) . 한편， 반응성 0VCAR-3와 무반응성 HeLa 세포주에서 세포사멸을 억제하는 단백질인 cFLIP의 발현을 확인한 결과, carbi feron(100ng/ml )으로 자극한 HeLa 세포주에서만 cFLIP 단백질이 증가하는 것으로 나타났다 (도 3) . 이는 cFLIP 단백질 발휜을 억제하는 것이 무반웅성 암 질환을 치료하기 위한 감작제로 이용될 수 있는 가능성을 제시하는 것이다.

<실시예 2>

cFLIP발현 억제가 carbiferon의 효과에 더치는 영향

암세포에서 cFLIP 단백질의 발현 억제가 carbi feron의 항암 효과에 미치는 영향을 cFLIP siRNA를 이용하여 확인하였다 (도 4) . cFLIP 저해에 의한 carbi feron의 세포 독성능 향상을 검증하기 위하여 HeLa 세포를 24-wel l plate에 1 X 10개씩 분주한 뒤 24 시간 동안 37.5 ^° C , 5% C0 ₂ 환경에 서 배양하였다. 24시간 경과 후 세포 배양액을 제거하고， ΙΟηΜ의 cFLIP siRNACDharmacon, cat# LU-003772-00-0002)를 Dharmafect transfection reagent와 섞어 상온에서 15분간 incubation한 뒤 세포에 처리하였다. 24시간 처리 후 배양액 을 제거하고， carbiferon을 lOOng/ml농도로 처리한 뒤 48시간 동안 추가 배양하였 다ᅳ 이 후 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤， 세포생존률을 측정하거나 (도 4 의 A) 단백질 발현을 확인하였다 (도 4의 B).

세포생존률을 측정하기 위하여 WST 시약을 1:10으로 배양액에 섞어 각 well 에 처리하고 두 시간동안 37.5 ^° C, 5% C0 ₂ 환경에서 반웅시킨 뒤 430nm파장에서 흡 광도를측정하였다.

단백질 발현올 확인하는 웨스턴 블롯을 위하여 프로티아제 저해제와 포스파 테이즈 저해제가 포함된 RIPA버퍼 100 μΐ를 처리하여 30분 동안 ice 상에 두어 세 포를 용해시찼다. 용해된 세포를 1.5ml 튜브에 담아 13000rpm, 4 ^° C 조건으로 원심 분리하여 상층액 (용해물)만 수거한 뒤 새로운 류브에 모았다. BCA 정량법을 이용하 여 용해물의 단백질 농도를 정량한 뒤 30yg의 용해물을 채취하여 5Xsample buffer와 섞고， 100 ^° C에서 10분간 끓여주어 단백질이 충분히 변성되도록 유도하였 다. 준비된 샘플을 마커 (marker)와 함께 10% SDS— PAGE 겔에 loading하고 70 voltage로 30분, 120 voltage로 1시간 동안 전기영동하였다. 이후 겔을 조심스럽게 분리하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDF(polyvinylidene di fluoride) 막을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 lxtransfer 버퍼에 담가 100 voltage로 90분간 단 백질 transfer를 진행하였다. 5¾)의 BSA가 포함된 Tr is-buffered saline-Tween 20(TBS-T, 0.1% Tween20)에 막을 1시간 30분 동안 블락킹한 뒤， 각항체를 TBS-T에 1:1000으로 회석하여 준비하였다. 막을 항체 희석물에 담가 상온에서 2시간 동안 흔들어주며 반웅시켰다. 이 과정이 끝나면 10분 동안 3번씩 TBS-T로 닦아주고 상은 에서 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 이차 항체 를 첨가하여 1시간 동안 반웅하였다. 다시 한 번 세척 과정을 수행한 후， 밴드를 ECL 시약 (enhanced chemi luminescence reagent , Intron을 ᄎ리한 뒤 필름에 현상하 였다. 도 4의 B에서 레인 1은 콘트를, 레인 2는 carbiferon 단독처리， 레인 3은 siR A단독처리， 레인 4는 carbiferon, cFLIP siRNA의 병행처리군이다.

ΙΡΝβ의 돌연변이체인 carbiferon은 암세포에서 death receptor 신호전달계 를 활성화시켜서 최종적으로 caspase-3에 의한 세포사멸을 일으킨다. cFLIP 단백질 발현을 억제하기 위하여 시판 증인 4종류의 cFLIP siRNACDharmacon, cat# LU- 003772-00-0002)를 흔합하여 HeLa 세포에 처리하고， carbi feron 존재 또는 부존재 하에서 세포생존률을 측정하였다 (도 4의 A) . cFLIP siRNA에 의하여 cFLIP의 long form과 short form이 모두 발현이 거의 완전하게 억제된 것은 western blot으로 확 인하였다 (도 4의 B, cFLIP L, cFLIP S) . 그 결과， carbi feron(100ng/ml ) 또는 cFLIP siRNA(lOnM)만을 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포생존률의 차이가 거의 없었으나， carbi feron과 cFLIP siRNA를 동시에 처리한 경우에는 세포생존률이 약 50% 정도 감소하였다. 또한 carbi feron과 cFLIP siRNA를 동시에 처리한 경우에 만 western blot으로 세포사멸에 증요한 활성화된 cleaved caspase-8의 존재가 확 인되었다. 이상의 결과는 무반응성 세포에서 cFLIP siRNA을 이용하여 cFLIP 의 발현을 억제함으로써 carbi feron에 의한 세포사멸을 효과적으로 촉진할 수 있음 을 보여주는 것이다.

<실시예 3>

IFN 3 저항성 암세포를감작하기 위한 cFLIP siRNA선별

에 반웅하지 않는 암세포에서 또는 carbi feron의 세포사멸 효과 를 감작하기 위한최적의 siRNA를 디자인하고 선별하였다. cFLIP의 long form과 short form은 세포사멸 관련하여 동일한기능을수행하 기 때문에 두 형태의 cFLIP의 발현을 모두 억제할 수 있는 siRNA가 가장 바람직하 몌 이를 위하여 적절한 cFLIP의 표적 서열의 위치와서열을 결정하였다 (도 5) . 먼 저 siDirect version 2.0 program을 이용하여 7종의 siRNA를 선별하고, 추가적으로 시판중인 2종의 siRNA를 포함하였다 (Dharmacon) .

디자인한 cFLIP siRNA의 cFLIP저해능을 확인하기 위하여 HeLa세포를 분주 한 뒤 24시간 동안 37.5 ^° C , 5% C0 ₂ 환경에서 배양하였다. 24시간 이후 세포 배양액 을 제거하고 ΙΟηΜ의 siRNA를 Dharmafect transfect ion reagent와 섞어 상온에서 15 분간 incubat ion한 뒤 세포에 처리하였다. 48시간 처리 후 배양액을 제거하고 앞선 실시예에서와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 6의 A에서 레인 1은 Mock, 레인 2는 음성 컨트롤 siRN NC siRNA) , 레인 3부터 11까지는 디자인한 cFLIP siRNA의 처리군이다. 또한 20nM의 siRNA로 형질전환하여 같은 방법으로 배 양하고 수득한 세포에서 Tr iz 을 활용하여 RNA를 추출한 뒤 이를 기반으로 cDNA를 합성하였으며 합성된 cDNA를 template로 ^하여 Ta pan probe를 활용한 qPCR을 진행 하였다 (도 6의 B) . 선별한 siRNA는 IFNP 무반옹성 세포인 HeLa 세포주에 48시간 동안 처리한 후, cFLIP long form(cFLIP _L )과 short form(cFLIP _s ) 단백질의 수준을 western blot 으로 확인하였다 (도 6의 A) . 분석 대상인 9종의 siRNA을 각각 처리한 세포에서는 모두 cFLIP _L 과 cFLIPs 단백질이 감지되지 않았다. 또한 siRNA를 처리한 세포에서는 qPCR로 측정한 cFLIP mRNA 수준이 대조군과 비교하여 약 50% 이상 감소한 것으로 나타났다 (도 6의 B) . qPCR과 웨스턴 블롯 결과에 기반하여 cFLIP 발현 저해능이 우 수한 것으로 확인된 D-513, 211， 262, 404， 480 등 5종의 siRNA를 1차적으로 선별 하였다.

1차적으로 선별한 cFLIP siRNA는 HeLa 세포주를 이용하여 carbi feron의 세포 사멸 효과에 미치는 영향을 추가적으로 확인하였다. 먼저 각각의 siRNA이 세포사멸 에 미치는 영향을 알아보기 위하여 carbi feron 없이 siRNA 단독으로 처리하고 앞선 실시예에서와 같은 방법으로 세포생존률을 측정하였다 (도 ₇ 의 A) . HeLa cel l을 플 레이트에 접종하고 24시간 경과 후 siRNA (최종 농도 10nM)를 처리하고， 다시 24시 간이 경과한 후 WST assay를 실시한 결과, 세포생존률이 감소하는 것으로 나타나， siRNA단독으로도 세포독성 즉 세포사멸 유도 효과가 있었다. 다음으로， cFLIP siRNA와 carbi feron 병용 처리의 효과를 확인하였다 (도 7의 B) . HeLa 세포주는 접종 24시간 후 siRNA (최종 농도 10nM)를 처리하고， 다시 24시 간 경과 후 carbi feron(100ng/ml )을 처리하여 24시간 뒤의 세포생존률을 측정하였 다. siRNA만 단독으로 처리한 경우와 비교하여 carbi feron과 siRNA를 병용처리한 경우 HeLa 세포주의 세포생존률을 낮추는데 동반상승 (synergy) 효과가 있는 것으로 관찰되었다. carbi feron과의 병용 처리의 효과를 분석한 siRNA 중 효과가 가장 뛰 어난 404및 480 cFLIP siRNA를 2차로 선별하였다.

<실시예 >

다양한암세포주에서 cFLIP siRNA와 carbiferon병용처푀의 효과

최종적으로 선별된 404 및 408 cFLIP siRNA의 무반웅성 암세포에 대한 감작효과를 다양한 암세포주를 이용하여 확인하였다 (도 8) . 선별한 cFLIP siRNA와 카비페론 흑은 ACFP와의 병행처리에 의한 세포사멸능 을 검증하기 위하여 SK-OV-3, SNU-216, NCI-N87 세포를 24-well plate에 1X10개씩 분주한 뒤 24시간 동안 37.5 ^° C, 5% C0 ₂ 환경에서 배양하였다. ACFP는 허셉틴

(herceptin)의 heavy chain 말단에 carbiferon (R27T)을 융합시킨 융합 단백질이 다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 ΙΟηΜ의 siRNA를 Dharmafect transfection reagent와 섞어 상은에서 15분간 incubation한 뒤 세포에 처리하였다. 24시간 처리 후 배양액을 제거하고 Carbiferon, ACFP, 허셉틴을 100ng/ml농도로 처리한 뒤 48 시간 동안 추가 배양하였다. 이 후 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤 WST시 약을 1:10으로 배양액에 섞어 각 well에 처리한 뒤 2시간동안 37.5 ^° C, 5% C0 ₂ 환경 에서 반응시킨 뒤 430nra파장쎄서 흡광도를 측정하였다. 본 실시예에 사용된 세포주 들은 IFNp에 전혀 반웅하지 않거나 (SNU-216), 에 정상적으로 반웅하는 세포 보다 에 대한 민감성이 매우 낮은 것 (SK-OV-3, NCI-N87)으로 확인되었다 (데이 터 미도시). 난소암세포인 SK-0V-3 세포주 (도 8의 A), 위암세포인 SNU-216 세포주 (도 8의 B)와 NCI— N87 세포주에서 cFLIP siRNA (도 8의 C)의 효과를 세포생존률을 측정하여 알아보았다. siRNA를 처리하지 않은 경우 herceptin 단독 보다는， carbiferon 그리 고 herceptin과 결합한 융합 단백질 형태인 ACFP가 암세포 생존률을 감소시키는 데 더욱 효과적이었다. 나아가 cFLIP siRNA와 동시에 처리한 경우 ACFP와 carbiferon 의 세포사멸 효과는 더욱 증진되는 것으로 나타났다.

【산업상 이용가능성】

이상 살펴본 바와 같이， 본 발명의 조성물은 인터페론 베타에 저항성을 나타 내는 암 또는 인터페론 베타에 저항성을 갖게 된 암에서 cFLIP단백질의 발현 수준 을 낮춤으로써 효과적으로 감작시켜 치료하는 새로운 기작의 항암제 또는 항암 보 조제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.