Изобретение относится к медицине, ветеринарии, конкретно к фармакологии, и касается применения композиции на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- {[ 6-бром- 1- метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в качестве средств с направленной доставкой для лечения гриппа и ОРВИ.

Вирусные инфекции широко распространены в человеческой популяции и способны поражать практически все органы и системы организма хозяина, вызывая латентную, острую, хроническую и медленную формы инфекции. Высокая заболеваемость и смертность от вирусных инфекций диктует необходимость создания этиотропных лекарственных препаратов. Значительная часть регистрируемых заболеваний вирусной этиологии приходится на грипп и ОРВИ.

Грипп является инфекционным заболеванием, наносящим вред здоровью людей и приводящий к значительным экономическим потерям. В дополнении к вакцинации Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) рекомендовано применение противогриппозных этиотропных химиопрепаратов, оказывающих непосредственное воздействие на репродукцию вируса и направленных на определенную вирусспецифическую мишень в ее цикле [1 . Hayden F. WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antivirals during Influenza. - Annex 5-Considerations for the Use of Antivirals during an Influenza pandemic, Geneva, 2-4 October, 2002. 2. European Medical Agency. Antivirals . http : //www . emea . europa . eu/influenza . 3.CDC Interim Antiviral Guidance for 2010- 2011. http/ /www . cdc . gov/ flu/reccommendation . htm. 4. Emergence of novel swine -origin influenza A ( H1N1) virus in human. Novel swine- origin influenza A (H1N1) virus investigation team. The New England Journal of Medicine 2009; 10:1-10]. Количество таких препаратов в медицине чрезвычайно ограничено. Существуют препараты первого поколения адамантанового ряда - амантадин и ремантадин, блокирующие протоновый канал, так называемые «М2-белки ингибиторы», эффективные в отношении вируса гриппа А, а также препараты второго поколения - ингибиторы нейраминидазы - занамивир (реленца) и осельтамивир (тамифлю) . Последние препараты по сравнению с препаратами адамантанового ряда имеют лучшие показатели безопасности. Главными причинами ограниченного применения противовирусных препаратов является возникновение резистентности вирусов к уже известным препаратам. Исследования клинических изолятов показали, что процент штаммов вируса гриппа А, резистентных как адамантанам, так и ингибитору нейраминидазы осельтамивиру чрезвычайно возрос в мире. По данным Центра контроля заболеваний (Атланта, США) в эпидемический сезон 2008-2009 гг. практически все циркулирующие в этот период штаммы вируса гриппа A H3N2 были резистентны к амантадину/ремантадину, а 98-100 % штаммов сезонного гриппа H1N1 были резистентны к ингибитору нейраминидазы - осельтамивиру. Существенным недостатком указанных лекарственных средств является и то, что их применение часто сопряжено с возникновением побочных эффектов в виде раздражения носоглотки, что ограничивает использование его у людей с астмой и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) , которые относятся к группе риска по

1

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) заболеваемости гриппом, а необходимость распылительного устройства осложняет его применение у пожилых людей и детей [Relenza: Highlights of Prescribing Information. http//www . cdc . gov/hlnl flu/eua/pdf//relenza] . При применении осельтамивира наблюдаются побочные эффекты в виде тошноты и рвоты [Roche. Tamiflu (Oseltamivir Phospate) capsules and Tamiflu for oral suspension, http/ /www . rocheusa . com] . Одним из путей повышения эффективности лечения гриппа и ОРВИ является разработка этиотропных препаратов с новой химической структурой, отличным механизмом действия и новой лекарственной формой, обеспечивающей направленную доставку.

Одной из актуальных проблем современной фармакологии является создание лекарственных форм, которые не только эффективно действуют на пораженные заболеванием органы и клетки, но и способны при введении в организм максимально полно и количественно достигать патологического очага, преодолевая множество естественных барьеров.

Разработка новых лекарственных форм препаратов с различными системами доставки, позволяющими повысить концентрацию поступающего лекарственного средства к пораженному органу и снизить выраженность побочных действий, является эффективным способом улучшения качества терапии .

Известны соединения, обладающие противовирусной активностью, способ их получения /Патент РФ ДО 2387642, C07D401/06, 31.10.2007/.

Известно интерферониндуцирующее средство для лечения острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) /Патент РФ 2470634, 05.10.2010/ .

Известно средство против вируса гриппа В /Патент РФ ДО 2435582, 05.10.2010/ .

В качестве средств для лечения гриппа и ОРВИ предложено использовать клатратные комплексы бета-циклодекстрина с производным индола, обладающего противовирусной активностью /Патент РФ ДО! 2448120, C07D413/06/ 01.11.2010/.

Вышеприведенные средства для лечения гриппа и ОРВИ не позволяют повысить концентрацию поступающего препарата к пораженному органу и снизить выраженность побочных действий и не обеспечивают улучшения качества терапии, в этом заключается решаемая техническая проблема.

Традиционные пути введения и лекарственные формы фармакологических препаратов не всегда могут создавать необходимую терапевтическую концентрацию в очаге поражения и обеспечивать достаточную продолжительность действия, вызывая при этом системные побочные эффекты. В связи с этим одним из приоритетных направлений современной фармакологии и связанных с ней дисциплин является изыскание новых способов и средств доставки существующих и разрабатываемых лекарственных средств. Современные транспортные системы способны изменять фармакокинетику переносимых ими лекарственных веществ, оптимизируя процессы абсорбции, распределения в тканях (преодоление гистогематических барьеров, включая гематоэнцефалический), метаболизма и элиминации [Козлов И. Г., Кукушкин Г. В., Юров Д.Е., Томаев У.М. /Новые подходы к созданию направленного транспорта лекарственных веществ в лимфатическую систему/ /Журнал «Здравоохранение Чувашии», 2013, выпуск ДО! 4] .

Одним из способов целенаправленной доставки лекарственного препарата к очагу поражения является его транспорт посредством лимфатической системы. При этом удается не только создавать и поддерживать адекватные концентрации лекарственных средств в тканях-

2

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) мишенях, но и воздействовать на патогенные агенты непосредственно в лимфе .

В настоящее время практическое применение находят разнообразные системы доставки, обладающие различными физическими и биохимическими свойствами. Большое внимание уделяется лекарственным формам, содержащим липиды - твердые липидные наночастицы (SLN, solid lipid nanoparticles), наноструктурные липидные носители (NLC, nanostructured lipid carriers), липидные наноэмульсии, конъюгаты липид-лекарство (LDC, lipid drug conjugates) . Липидные лекарственные формы могут повышать биодоступность липофильного лекарства путем улучшения его солюбилизации в просвете кишечника (за счет образования везикул, смешанных везикул и мицелл) , а также влияя на транспортные и метаболические процессы в энтероцитах [Ипатова О.М., Торховская Т.И., Медведева Н.В., Прозоровский В.Н., Иванова Н.Д., Широнин А. В., Баранова В. С., Арчаков А. И . /Биодоступность пероральных лекарственных форм и способы ее повышения// Биомедицинская химия, 2010, том 56, вып . 1, с. 101-119] .

Лекарственные формы, содержащие липиды, твёрдые липидные наночастицы, представляют собой однородные частицы, сформированные из липидов, находящихся в одинаковых агрегатных состояниях, при этом моле-кулы лекарственного вещества диспергированы в пространстве между боковыми цепями жирных кислот.

Основными материалами для синтеза твердых липидных наночастиц являются триглицериды и воски. Размеры наноносителей данного типа колеблются от 50 до 1000 нм. Лекарственное вещество в них, как правило, высоколипофильное, растворено в ядре или диспергировано по всей матрице. Твердые липидные наночастицы хорошо абсорбируются в лимфатические сосуды кишечника и через грудной проток поступают в большой круг кровообращения, не подвергаясь пресистемному метаболизму. Они хорошо зарекомендовали себя в качестве средств целенаправленной доставки в экспериментальном исследовании, оценивавшем проницаемость гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) для антиретровирусных препаратов: стадивудина, делавирдина и саквинавира [Козлов И. Г., Кукушкин Г. В., Юров Д.Е., Томаев У.М. /Новые подходы к созданию направленного транспорта лекарственных веществ в лимфатическую систему/ /Журнал «Здравоохранение Чувашии», 2013, выпуск W 4] . В случае с применением противогриппозных препаратов за счет целенаправленной доставки и увеличения их концентрации в верхних дыхательных путях обеспечивается подавление репродукции вируса в этих органах, что в конечном итоге позволяет снизить выраженность побочных действий и повысить эффективность лечения гриппа и ОРВИ.

Таким образом, техническая проблема, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в том, что существующие средства для лечения гриппа и ОРВИ не обеспечивают улучшения качества терапии, низкоэффективны. Технический результат - это обеспечение направленной доставки и увеличение концентрации лекарственного средства в верхних дыхательных путях при снижении применяемых доз лекарственного средства.

Для решения обозначенной технической проблемы и достижения технического результата в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтио метил-1-Н-индол-

3

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 3-ил] карбонил} -4 бензилпиперазина, обладающая свойством направленной доставки для лечения гриппа и ОРВИ, при следующем соотношении компонентов, масс %:

Вариант 1 :

Гидрохлорид 1- { [ 6-бром- 1- метил-5- метокси-2 -фенилтиометил- 1 -Н-индол- 3 2,0 - 14, 0 ил] карбонил }- 4 бензилпиперазин

Глицерид длинноцепочечных жирных

64, 0 - 86,0 кислот

Масло растительное 10, 0 - 20,0

Эмульгатор 2, 0

Фармацевтическая композиция дополнительно может содержать триглицерид среднецепочечный при следующем соотношении компонентов, масс %:

Вариант 2 :

Гидрохлорид 1- { [ б-бром-1- метил-5- 2,0 - 14,0 метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индол- 3

ил] карбонил } -4 бензилпиперазин

Глицерид длинноцепочечных жирных 50 - 70,0

кислот

Масло растительное 10, 0 - 30,0

Триглицерид среднецепочечный 4,0 - 16,0

Эмульгатор 2, 0

Глицерид длинноцепочечных жирных кислот может быть выбран из группы, например, глицерилтристеарата, глицерилдистеарата, глицерилмоностеарата , глицерилпальмитата, глицерилдибегената, глицерилтрибегената, глицерилмоноолеата, белого воска или воска цетиловых эфиров.

Масло растительное выбирают из группы, например, масла оливкового, арахисового, кунжутного, льняного, рапсового, соевого, хлопкового, лимонного, апельсинового.

В качестве триглицерида среднецепочечного может быть выбрано масло кокосовое или пальмовое или пальмоядровое.

В качестве эмульгатора выбирают лецитин или желатин^

Заявляемые композиции на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтио метил-1-Н-индол- 3-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в качестве средств с направленной доставкой для лечения гриппа и ОРВИ получали следующим образом.

Твердые липидные частицы, содержащие гидрохлорида 1- { [ б-бром-1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-� �-индол-3-ил] карбонил } -4

бензилпиперазин, получали способами, описанными в работе [Meghavi Patel , Development, Characterization and Evaluation of Solid Lipid Nanoparticles as a Potential Anticancer Drug Delivery System, University of Toledo, 2012], с модификациями. Метод 1: метод горячей гомогенизации. В стакане на 100 мл при нагревании 50-60 °С смешивали 25 г липидов, далее вводили раствор гидрохлорида 1- { [ 6-бром-1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-� �-индол-3-ил] карбонил } -4

бензилпиперазина в спирте. Смесь выдерживали при нагревании в течение 30 мин при постоянном перемешивании для удаления спирта и равномерного распределения гидрохлорида 1- { [ б-бром-1- метил-5- метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индол- 3-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина по всему объему липидов. К полученному раствору добавляли раствор

4

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) лецитина в воде с концентрацией 2 мг/мл при t=50 °С, тщательно перемешивали до получения однородной эмульсии. Конечную эмульсию переливали в 2 л деионизированной воды комнатной температуры при постоянном перемешивании, далее суспензию обрабатывали ультразвуковым щупом (14 Вт) в течение 1 мин для измельчения частиц. Твердые липидные частицы отфильтровывали на воронке Бюхнера, высушивали на воздухе. В результате получали частицы со средним диаметром 1000 нм. Метод 2: обращено-фазовый метод. В круглодонной колбе растворяли 25 г липидов, вводили навеску гидрохлорида 1— { [ 6— бром- 1 - метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1 -Н-индол-3-ил ] карбонил } -4 бензилпиперазина в 5 мл спирта. Далее добавляли 500 мл деионизированной воды, эмульгировали смесь с помощью ультразвукового щупа (14 Вт) и выпаривали спирт на роторном испарителе при температуре 50 °С. При этом следует не допускать вспенивания смеси. Конечную полученную композицию остужали до комнатной температуры. Размер полученных частиц составлял 500-1000 нм. Метод 3: через получение основания. 1- { [ б-бром- 1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазин предварительно растворяли в спирте и проводили титрование 0,1 М раствором гидроксида натрия для получения основания. Далее повторяли процедуру, описанную в методе 1 или методе 2.

Частицы были охарактеризованы следующими физико-химическими методами: размер частиц определяли с помощью микроскопа PZO Worszava и методом динамического светорассеяния (Malvern Zetasizer) . Содержание 1-{ [б-бром-1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-� �-индол- 3-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в композициях на основе твердых липидных частиц определяли методом ВЭЖХ (Ultimate Dionex 3000, детектор диодно-матричный на аналитических колонках Waters Acquity ВЕН Cl 8 (100x2,1 мм, 1,7 мкм) .

С помощью описанных методов были получены композиции на основе твердых липидных частиц гидрохлорид 1- {[ б-бром-1- метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина. Их составы представлены в таблицах 1 - 6.

Таблица 1 - Состав заявляемой композиции ДО 1.1

Таблица 2 - Состав заявляемой композиции ДО 1.2

5

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Таблица 3 - Состав заявляемой композиции ДО 1.3

Таблица 4 - Состав заявляемой композиции ДО 2.1

Таблица 5 - Состав заявляемой композиции ДО 2.2

6

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Таблица б - Состав заявляемой композиции ДО 2.3

Указанные фармацевтические композиции могут применяться в форме таблеток, желатиновых капсул, при следующем соотношении компонентов:

Гидрохлорид 1- { [ б-бром-1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1- Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазин от 2 до 14%;

- наполнитель (и) или носитель (и) остальное.

Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения и рисунками.

На Рисунке 1 представлен коэффициент тканевой доступности для легких и трахеитбронхов крыс при внутрижелудочном однократном введении заявляемой композиции 1.1, гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил- 5-метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индо� �-3-ил] карбонил } -4

бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином.

На Рисунке 2 представлен коэффициент тканевой доступности для легких и трахеитбронхов крыс при внутрижелудочном однократном введении заявляемой композиции 1.2, гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил- 5-метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индо� �-3-ил] арбонил } -4

бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином.

На Рисунке 3 представлен коэффициент тканевой доступности для легких и трахеитбронхов крыс при внутрижелудочном однократном введении заявляемой композиции 1.3, гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил- 5-метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индо� �-3-ил] карбонил } -4

бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином.

На Рисунке 4 представлен коэффициент тканевой доступности для легких и трахеитбронхов крыс при внутрижелудочном однократном

7

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) введении заявляемой композиции 2.1, гидрохлорида 1-{[б-бром-1-метил-

5-метокси-2-фенилтиометил-1-Н-инд ол-3-ил] карбонил } -4

бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином.

На Рисунке 5 представлен коэффициент тканевой доступности для легких и трахеитбронхов крыс при внутрижелудочном однократном введении заявляемой композиции 2.2, гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил- 5-метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индо� �-3-ил] арбонил } -4

бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином.

На Рисунке 6 представлен коэффициент тканевой доступности для легких и трахеитбронхов крыс при внутрижелудочном однократном введении заявляемой композиции 2.3, гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил- 5-метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индо� �-3-ил] карбонил } -4

бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином.

Пример 1. Определение тканевой доступности композиции на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ 6-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в рамках исследования фармакокинетики распределения в органах и тканях крыс линии Wistar.

Проведено исследование сравнительной фармакокинетики распределения 1- { [ 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтио� �етил-1-Н- индол-3-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в крови, органах и тканях при внутрижелудочном однократном введении крысам заявляемых композиций, гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином в дозе 50 мг/кг.

Для проведения эксперимента были сформированы следующие группы крыс по 40 шт . :

1-я - гидрохлорид 1- { [ 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтио� �етил- 1-Н-индол-З-ил] карбонил} -4 бензилпиперазин;

2-я - клатратный комплекс бета-циклодекстрина с гидрохлорид 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтио метил-1-Н-индол-3-ил] карбонил} - 4 бензилпиперазином;

3-я - заявляемая композиция 1.1;

4-я - заявляемая композиция 1.2;

5-я - заявляемая композиция 1.3;

6-я - заявляемая композиция 2.1;

7-я - заявляемая композиция 2.2;

8-я - заявляемая композиция 2.3.

Образцы крови брали после декапитации животных. Кровь отбирали от каждого животного в пробирки, содержащие 100 мкл 5% аг-ЭДТА, через следующие временные интервалы: 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 30 и 48 часов после внутрижелудочного введения заявляемых композиций, гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтио метил-1-Н-индол- 3-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина и его клатратного комплекса с бета-циклодекстрином. На каждую временную точку были взяты по 5 крыс. Плазму крови отделяли центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 15 мин. Пробы плазмы крови заморозили и хранили до анализа при минус 70 °С. Для изучения распределения у животных после их декапитации забирали и замораживали фрагменты следующих органов и тканей: легкие, трахеи+бронхи .

Содержание 1-{ [б-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилти� �метил-1-Н- индол-3-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в плазме крови, органах и тканях анализировали методом ВЭЖХ-МС-МС (ВЭЖХ-системы Thermo Ultimate-3000 с тандемным масс-спектрометрическим детектором Thermo

8

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) TSQ Exactive Plus) с источником нагреваемой электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов на аналитических колонках Waters Acquity ВЕН С18 (50x2.1 мм, 1,7 мкм) .

Пробоподготовку образцов проводили путем осаждения белков и экстракции ацетонитрилом плазмы крови и водных гомогенатов органов. Предел количественного определения 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] арбонил } -4 бензилпиперазина в различных тканях составил й 10 нг/мл.

На основании полученных данных по концентрациям 1- { [ 6-бром-1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-� �-индол-3-ил] карбонил } -4

бензилпиперазина в плазме крови (нг/мл) и трахеи и бронхах (нг/г ткани) были рассчитаны площади под фармакокинетическими кривыми от момента введения до конкретной временной точки (AUCo- _t) · По полученным данным рассчитывали коэффициент тканевой доступности по следующей формуле :

Коэффициент тканевой доступности = AUC _0-t (ткани) / AUC _0-t (плазмы крови) .

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что при введении крысам заявляемых композиции 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 по сравнению с гидрохлоридом 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина и его клатратным комплексом с бета-циклодекстрином отмечено от 2- до 6- кратное повь ение коэффициента тканевой доступности для легких и трахеи+бронхов (Рис. 1 - 6) . Как видно из представленных рисунков внутрижелудочное введение крысам предлагаемых композиций на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил} -4 бензилпиперазина обеспечивает максимальное его проникновение в верхние дыхательные пути и подавление репродукции вируса в этих органах, что очень важно при лечении гриппа и ОРВИ.

Таким образом, заявляемые композиции на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ б-бром-1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1- Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в качестве противогриппозных препаратов за счет целенаправленной доставки и увеличения его концентрации в верхних дыхательных путях обеспечат подавление репродукции вируса в этих органах, что в конечном итоге позволит снизить выраженность побочных действий и повысить эффективность лечения гриппа и ОРВИ.

Пример 2. Изучение эффективности заявляемых композиций на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ 6-бром-1-метил-5- метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индол- 3-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина на модели экспериментальной гриппозной пневмонии мышей.

Исследования по противогриппозной активности заявляемых композиций на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1— { [ 6— бром- 1 -метил- 5-метокси-2 -фенилтиометил- 1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина in vivo проведены в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. И. И. Мечникова) .

Целью исследования являлось изучение эффективности заявляемых композиций на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1— { [ 6— бром- 1 -метил- 5-метокси-2 -фенилтиометил- 1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина в двух дозах на модели вирусной гриппозной

9

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) пневмонии мышей. В качестве препарата сравнения использовали противогриппозное лекарственное средство умифеновир.

Материал и методы

Препараты, приготовление растворов для экспериментов

В экспериментах использовали композиции на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина, их составы приведены в таблицах 1-6, фармацевтическую субстанцию умифеновир. Для лечения животных заявляемые композиции и умифеновир готовили в виде суспензии в 1 % растворе крахмала. Вводимые дозы исследуемых препаратов указаны из расчета содержания фармацевтической субстанции в лекарственной форме . Образцы исследуемых препаратов готовили непосредственно перед проведением эксперимента, животным вводили по 200 мкл приготовленных препаратов внутрижелудочно . Вещества взвешивали с точностью до 0,1 мг на аналитических весах. Дозы препаратов рассчитывали в относительных массовых единицах - мг/кг массы тела животных в сутки.

Вирус

Для моделирования гриппозной пневмонии был использован штамм вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндмН1141 2009), предоставленный ВОЗ, в лиофилизированном состоянии, хранившийся при плюс 4 °С и адаптированный к мышам. Для адаптации и подготовки инфицирующего материала мышей заражали интраназально разведенным вирусом, после проявления признаков болезни их гуманно умерщвляли и вскрывали. В стерильных условиях получали гомогенат легочной ткани. Полученный гомогенат легочной ткани использовали для заражения 10-дневных куриных эмбрионов, из которых получали аллантоисный вирус и после титрования на его мышах (определения МЛД ₅₀ (мышиная летальная доза 50) дозы вируса, вызывающая 50 % гибели зараженных мышей) проводили инфицирование животных. В опытах использовали один пул вируса, который не замораживали и хранили при температуре 4 °С. Этот же пул вируса использовали в 2-х экспериментах.

Типирование используемого вируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

Для типирования вируса в РТГА применили специфические сыворотки к эталонным штаммам вирусов гриппа - А/Калифорния /04/2009 (H1N1) и сезонный вирус А/Брисбен/59/2007 (H1N1), полученные из ВОЗ. Для постановки РТГА использовали 96-луночные микропланшеты с V-образными лунками. Сыворотки в двукратно снижающихся концентрациях разводили в изотоническом растворе натрия хлорида и разливали по лункам. К каждому их разведению добавляли равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем являлась взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживали в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляли взвесь эритроцитов. Результаты реакции учитывали через 30 минут. Выводы о результатах типирования вируса делали на основании выявленного взаимодействия тестируемого вируса с одной из позитивных референс-сывороток . Вирус относили к тому или иному типу (субтипу) вируса при условии его взаимодействия с соответствующей референс-сывороткой не менее 1/4 гомологичного титра.

Животные

Беспородных мышей, самок с массой тела 12-14 г. получали из питомника «Андреевка» (Московская обл.) и содержали на стандартном рационе. Животных содержали в регламентированных условиях вивария при естественном световом режиме на стандартном пищевом рационе и

10

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) свободном доступе к воде и пище. Кормили животных брикетированными кормами в соответствии с утвержденными нормами. Содержание животных соответствовало правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) . Маркировка животных по группам производилась с помощью окраски красителями поверхности тела.

Животных взвешивали на весах Ohaus Scout SPX222 (НПВ 220г, дискретность 0,01 г) каждый раз в определенное время (12.00 часов дня) .

Описание и схемы применения препаратов на модели гриппозной пневмонии мьшей

Препарат сравнения умифеновир

В качестве препарата сравнения использовали умифеновир. Целесообразность выбора умифеновира определялась тем, что он является единственным лицензированным противогриппозным препаратом, относящимся к классу индолов, доказавшим свою эффективность и безопасность в доклинических и клинических испытаниях, . Гидрохлорид 1- { [ 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтио� �етил-1-Н-индол-3- ил] карбонил } -4 бензилпиперазин входящий в состав композиции также относится к этому классу. Умифеновир вводили за 24 часа и 1 час до инфицирования, далее в течение 5 суток 1 раз в сутки после инфицирования. Для внутрижелудочного введения использовали одноразовый инсулиновый шприц со специальной иглой (лаваж) .

Исследуемые композиции

В первом эксперименте при изучении эффективности заявляемых композиций на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1-{ [6- бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиом� �тил- 1-Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазина, так же как и в случае умифеновира, была применена следующая схема лечения: за 24 часа и 1 час до инфицирования, далее в течение 5 суток 1 раз в сутки после инфицирования. Во втором эксперименте при лечении заявляемыми композициями на основе твердых липидных частиц гидрохлорида 1- { [ б-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-З-ил] карбонил} -4 бензилпиперазина использовали 2 дозы и 2 схемы введения. Первую дозу равную 3,7 мг/кг/ сутки вводили за 1 сутки до инфицирования 2 раза в день; за 4 до и 4 часа после инфицирования в день заражения; далее 2 раза в сутки в течение 7 суток. Вторую дозу 15 мг/кг/сутки применили за 24 и 1 час до инфицирования; далее 1 раз в сутки в течение 7 суток.

Группы животных

Для проведения эксперимента были сформированы следующие группы мьшей :

1-я умифеновир доза 40 мг/кг;

2-я умифеновир доза 60 мг/кг;

3-я заявляемая композиция 1.1 доза 3,7 мг/кг;

4-я заявляемая композиция 1.1 доза 15 мг/кг;

5-я заявляемая композиция 1.2 доза 3,7 мг/кг;

6-я заявляемая композиция 1.2 доза 15 мг/кг;

7-я заявляемая композиция 1.3 доза 3,7 мг/кг;

8-я заявляемая композиция 1.3 доза 15 мг/кг;

9-я заявляемая композиция 2.1 доза 3,7 мг/кг;

10-я заявляемая композиция 2.1 доза 15 мг/кг;

11-я заявляемая композиция 2.2 доза 3, 7 мг/кг

12-я заявляемая композиция 2.2 доза 15 мг/кг;

13-я заявляемая композиция 2.3 доза 3, 7 мг/кг

14-я заявляемая композиция 2.3 доза 15 мг/кг;

11

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 15-я - вирусный контроль.

В группах было от 8 до 15 животных. В некоторых группах при манипуляциях, связанных с заражением или лечением погибали 1 или 2 мыши. Далее эти группы рассматривались как содержащие на одну мышь меньше. Предварительно взвешенные мь и в этот же день инфицировались интраназально под легким наркозом вирусом гриппа

А/Калифорния/04/2009 (пндмН11\11 2009) в дозе 10 МЛД _БО - Лечение проводили по описанным схемам. Животные контрольной группы были инфицированы вирусом гриппа и не получали никакого лечения, им внутрижелудочно зондом вводили суспензию 1 % крахмального геля в объеме 200 мкл по схеме применения заявляемых композиций.

За леченными и животными контрольной группы вели ежедневное наблюдение. В первые 5 суток после инфицирования вирусом гриппа мышей взвешивали ежедневно, в последующий период раз в 1-2 сутки.

Химиотерапевтическую активность исследуемых препаратов на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по следующим критериям:

• повышение показателя защиты от смертности;

• титр вируса в легких;

• увеличение средней продолжительности жизни мышей по сравнению с контрольными животными, не получавшими лечения.

Среднюю продолжительность жизни мышей рассчитывали по следующей формуле :

где: f - количество мышей умерших на день d,

выжившие мыши также включены B i n d, в этом случае равно 16, п - количество мышей в группе.

Уменьшение или увеличение массы тела рассчитывали отдельно для каждой мыши и выражали в процентах, при этом за 100% принимали массу тела животного перед инфицированием. Для всех мышей одной группы определяли среднее значение процента потери или увеличения массы тела животных.

Получение легких мышей

На 4 сутки после инфицирования вирусом гриппа из каждой группы гуманно умерщвляли и вскрывали по 3 мыши и в стерильных условиях извлекали легкие. После вскрытия проводилась визуальная оценка легких. При методе оценки степени поражения легких использовали 4-х бальную систему. Полное поражение всего легкого (увеличены в размерах, красные, плотные) оценивалось четырьмя крестами, Н поражения - тремя крестами, половина - двумя крестами, Ч - одним крестом.

После визуальной оценки легких их трехкратно промывали в растворе 0,01 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ), далее гомогенизировали и ресуспендировали в 1 мл холодного стерильного раствора ФСБ. Суспензию осветляли от клеточного дебриса центрифугированием при 2000 g в течение 10 мин и супернатант использовали для определения инфекционного титра вируса в культуре клеток MDCK.

Определение титра вируса в легких мышей

Для определения инфекционного титра вируса гриппа клетки MDCK (перевиваемые клетки почки собаки, масса 50-60) рассеивали в 96- луночных планшетах фирмы "Costar" со средней плотностью 30000-35000 клеток на лунку и выращивали в минимальной среде Игла (МЕМ) в присутствии 5 % фетальной сыворотки телят, 10 мМ глутамина и антибиотиков (пенициллин 100 МЕ/мл и стрептомицин 100 мкг/мл) до полного монослоя. Перед заражением вирусом гриппа клетки 2 раза

12

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) промывали средой MEM без сыворотки. Готовили 10-кратные разведения каждой пробы вируса из легких (цельный до 10 ⁸ ) на среде с добавлением ТРСК-трипсина (2 мкг/мл) . Полученными разведениями заражали монослой 4-х лунок 96-луночного планшета. После инкубации при 37 °С в атмосфере 5 % ССД в течение 72 часов клетки промывали трижды ФСБ и фиксировали 10 % раствором формальдегида при температуре 18 - 23 °С в течение 5 мин. После удаления раствора формальдегида в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл 1 % раствора кристаллического фиолетового и выдерживали при температуре 18 - 23 °С в течение 5 мин. После промывания водой и высушивания планшета в лунки добавляли по 0, 1 мл 96 % спирта, инкубировали при покачивании при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм. Лунки считали положительными, если оптическая плотность в них была меньше оптической плотности в клеточном контроле на 20 %. Инфекционный титр вируса определяли по 4 повторностям каждой пробы по методу Рида и Менча и выражали в loglO ТЦИД ₅ о/0,1 мл (тканевой цитопатической инфекционной дозы 50 - доза вируса, вызывающая гибель 50 % зараженных клеток) . Далее рассчитывали среднее значение титра для трех одинаковых проб.

Результаты

Наработка и характеристика пула вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1), адаптированного к мышам

При типировании образца вируса, используемого для заражения, в РТГА применили специфические сыворотки к эталонным штаммам вирусов гриппа - А/Калифорния/04/2009 (H1N1) и сезонный вирус А/Брисбен/59/2007 (H1N1), полученные из ВОЗ. Титрование в РТГА показало, что титр используемого для заражения и адаптированного к мышам вируса составлял 1:640 при взаимодействии с референс- сывороткой А/Калифорния /4/2009 (H1N1) и менее, чем 1:10 - с референс-сывороткой А/Брисбен/59/2007 (H1N1), в то время как при взаимодействии этих же сывороток с референс-вирусами титры составляли 1:1280. Представленные данные свидетельствуют, что используемый вирус являлся вирусом гриппа А/Калифорния/ 04/2009 (H1N1) (Таблица 7) .

Таблица 7 - Характеристика использованного в исследованиях пула вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1), адаптированного к мышам

13

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Для определения дозы вируса, содержащей 10 МЛД50 _/ группы, состоящие из 4-6 мышей, заражали полученным цельным аллантоисным вирусом и последовательными 10-кратными его разведениями (от 10 ^-1 до 10 ⁵ ) . Пример данных по наблюдению за животными в течение 16 суток приведены в Таблице 8. Из этих данных видно, что 50 % гибели животных вызывает заражение вирусом 10 ³ , следовательно, 50 мкл разведения 10 ² будет содержать примерно 10 МЛД50 (Таблица 8) .

Таблица 8 - Определение МЛД ₅₀ адаптированного к мышам вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1) на модели гриппозной пневмонии мышей

Эффективность заявляемых композиций и препарата сравнения умифеновира на модели гриппозной пневмонии мышей

У животных контрольной группы, зараженных вирусом гриппа в дозе 10 МЛД50 и не получавшей никакого лечения, в соответствии с вышеприведенной дозой заражения наблюдали полную гибель животных. Средняя продолжительность жизни мышей в первом и втором эксперименте в группах вирусного контроля была 7,5 и 8,25 сутки соответственно. При этом максимальная потеря составила примерно 10 % на 7 сутки в первом опыте и 30 % на 9 сутки во втором опыте. В первом эксперименте лечение заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 в дозе 3,7 мг/кг/сутки защищало от гибели 33-45 % животных, увеличивало среднюю продолжительность их жизни. Изменение схемы лечения и увеличение ее продолжительности до 7 суток не привело к значительному усилению эффективности, которая была практически такой же, как и в первом эксперименте. Увеличение дозы заявляемых композиции 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 до 15 мг/кг/сутки привело к повышению эффективности лечения. Лечение заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 в дозе 15 мг/кг/сутки по результатам обоих опытов защищало от гибели 50-64 % животных, увеличивая продолжительность их жизни примерно в 1,5-1, 6 раза. Лечение заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 в дозе 15 мг/кг/сутки по оцениваемым параметрам в некоторой степени сопоставимо с препаратом сравнения умифеновиром в дозе 60 мг/кг/сутки (Таблицы 9 и 10) .

Для оценки эффективности лечения, а также чтобы исключить проявление токсических эффектов, в эксперименте проводилась визуальная оценка состояния легких мышей. Оказалось, что все инфицированные мыши в контрольной группе погибли от пневмонии, о чем свидетельствовало состояние их легких, оцененное на 4 креста. Во всех изученных дозах состояние легких при лечении умифеновиром было

14

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) сходно с состоянием легких у животных, леченных заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3, патологические изменения наблюдались примерно в половине легких и были оценены на 2 креста.

Результаты вирусологического исследования легких животных подтвердили полученные при наблюдении за мышами данные и коррелировали с клиническими параметрами эффективности лечения со снижением размножения вируса в этом органе. У животных контрольной группы в первом и во втором эксперименте титры вируса были 4,8312,89 и 3,610,36 1д ТЦИД50 соответственно. В первом эксперименте титр вируса в легких животных при лечении умифеновиром и заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 зависел от вводимой дозы. При лечении умифеновиром в дозе 60 мг/кг/сутки и заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 в дозе 15 мг/кг/сутки титр вируса в легких животных составил 3,012,6 1д ТЦИД _БО И 2,3310,51 -2,8310,58 1д ТЦИД50 соответственно против 4,8312,89 1д ТЦИД50 в вирусном контроле (Таблица 9) . Во втором эксперименте при лечении заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 обе изученные дозы 3,7 и 15 мг/кг/сутки практически одинаково подавляли размножение вируса. Полученные результаты по заявляемым композициям 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 в изученных дозах 3,7 и 15 мг/кг/сутки в отношении ингибирования размножения вируса в легких животных были в некоторой степени сопоставимы с умифеновиром в дозах 40 и 60 мг/кг/сутки (Таблица 10) .

Лечение заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 в дозе 15 мг/кг/сутки на модели гриппозной пневмонии мышей является эффективным. На фоне приема заявляемых композиций 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 в дозе 15 мг/кг/сутки, отмечено снижение гибели животных, размножения вируса в легких и увеличение продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой нелеченных животных.

Результаты лечения эффективной дозой (15 мг/кг/сутки) заявляемыми композициями 1.1; 1.2; 1.3; 2.1; 2.2 и 2.3 сопоставимы по всем оцениваемым параметрам с терапией умифеновиром в дозе 60 мг/кг/сутки (следует отметить, что при схожих эффектах доза заявляемых композиций в 4 раза меньше дозы умифеновира) .

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что предлагаемые средства с направленной доставкой в верхние дыхательные пути в максимально низких дозах являются эффективными в отношении лечения гриппа и ОРВИ. Максимальный эффект заявляемые композиции оказывают в дозе 15 мг/кг, что в 4 раза меньше дозы умифеновира.

Примеры твердых лекарственных форм включают, например, таблетки, пилюли, желатиновые капсулы и др.

Пример твердой лекарственной формы включает желатиновые капсулы. Для желатиновых капсул обычно используются дополнительно красители и стабилизаторы. В качестве красителей применяются: тетразин, индиго; в качестве стабилизаторов могут быть представлены: натрия метабисульфит, натрия бензоат. Предлагаемые желатиновые капсулы содержат от 2 до 14 % активного ингредиента.

ПРИМЕР 3.

1 капсула 10 мг содержит:

Активное вещество:

15

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) гидрохлорид 1-{[б-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилт иометил-1- Н-индол-З-ил] карбонил } -4 бензилпиперазин 10 мг в пересчете на безводное вещество

Вспомогательные вещества:

глицерид длинноцепочечных жирных кислот, триглицерид среднецепочечный, масло растительное, эмульгатор, целлюлоза микрокристаллическая до массы содержимого 350 мг

Капсулы твердые желатиновые:

Желатин

Титана диоксид (Е171)

Активный ингредиент в свободной форме, такой, как порошок или гранулы, в количестве 100 г (количество вещества, необходимое для получения 10000 капсул) перемешивается с вспомогательными веществами (3400 г) .

Назначаемая для приема доза активного компонента гидрохлорид 1- { [6-бром-1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-� �-индол-3- ил] карбонил } -4 бензилпиперазин формулы 1 варьирует в зависимости от многих факторов, таких как возраст, пол, масса тела пациента, симптомы и тяжесть заболевания, конкретно назначаемое соединение, способ приема, форма препарата, в виде которой назначается активное соединение .

Обычно, общая назначаемая доза составляет от 1 до 50 мг в день. Общая доза может быть разделена на несколько доз, например, для приема от 1 до 4 раз в день . При оральном назначении интервал общих доз активного вещества составляет от 1 до 50 мг в день, предпочтительно, от 5 до 20 мг . Эффективная терапевтическая доза препарата может быть выбрана лечащим врачом.

16

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 9 - Эффективность исследуемых препаратов на модели гриппозной пневмонии мышей, индуцированной вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1) (ЭКСПЕРИМЕНТ 1)

17

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

18

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 10 - Эффективность исследуемых препаратов на модели гриппозной пневмонии мышей, индуцированной вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1) (ЭКСПЕРИМЕНТ 2)

Препарат

ы, дозы

19

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

20

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)