CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a promotores de expressão de genes específicos em plantas.

Nomeadamente, a presente invenção proporciona sequências de nucleotídeos capazes de expressar genes de interesse em tecido floral em diversas espécies de plantas, para produção de indivíduos geneticamente modificados que sejam capazes de resistir ao ataque de pragas.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona sequências de nucleotídeos para a expressão de genes de interesse em tecido floral de Gossypium hirsutum para produção de plantas geneticamente modificadas que sejam capazes de resistir ao ataque de pragas, tal como bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis).

Desta maneira, a presente invenção descreve construções de DNA que contenham os promotores dos genes de interesse, para criação de plantas geneticamente modificadas, bem como um método para modificação da expressão gênica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O melhoramento genético tem sido utilizado há milhares de anos mediante o cruzamento de espécies para obtenção de características de interesse que demonstrem alguma vantagem sobre as espécies originais para fins agroindustriais. Assim, as modificações transgênicas permitem o aceleramento na melhoria destes processos.

Há que se destacar que o algodão é a principal fonte de fibra têxtil e a segunda cultura mais importante de semente oleaginosa do mundo (KHAN et al, 2000). Segundo o Departamento de Agricultura Norte-Americano (USDA) 35% da fibra utilizada mundialmente provêm da cultura algodoeira (http://www.ers.usda.gov/Briefing/Cotton/, em 01/05/201 1 ). Essas características tornam a cultura do algodão economicamente importante tanto para indústria têxtil quanto para a agroindústria em geral, principalmente no que diz respeito à extração de óleo para biodiesel. Sabidamente, a espécie Gossypium hirsutum é responsável por mais de 95% da produção mundial da fibra (GUO et al, 2008).

No Brasil, a cotonicultura vem crescendo nos últimos anos e ganhando importância no agronegócio. Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Desenvolvimento, as lavouras brasileiras alcançaram o índice de produtividade 60% superior ao dos Estados Unidos, sendo que Mato Grosso e Bahia são os estados responsáveis por cerca de 82% da produção nacional, com destaque para os investimentos na área (http://www.agricultura.gov.br/vegetal/culturas/algodao, em 01/05/201 1).

Apesar da grande importância do algodão, as pragas ainda são um fator limitante da produção e utilização.

Originário do México e registrado no Brasil pela primeira vez em 1983, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) se tornou a praga de maior incidência no cerrado brasileiro e com maior potencial de dano (DEGRANDE, 1998). As fêmeas deste coleoptero ovipositam nos botões florais e maçãs do algodão e as larvas, quando eclodem, se alimentam dos mesmos promovendo sua queda. O hábito endofítico do bicudo-do-algodoeiro diminui a qualidade da fibra, dificulta o controle químico e, por consequência, causa danos económicos consideráveis. Segundo RIBEIRO 2007 o bicudo-do-algodoeiro pode atacar cerca de 50% de botões florais e maçãs de uma plantação de algodão, causando sua inviabilidade na maioria das vezes.

A bactéria B. thuringiensis, proveniente do solo, forma esporos durante sua fase estacionária de crescimento. Esses esporos contêm cristais formados pro proteínas Cry de um ou mais tipos que possuem uma potente e específica atividade inseticida. A toxina Bt é ingerida pelo inseto na forma de pro- toxina que, em contato com o pH alcalino do aparelho digestivo do animal é clivada na sua forma ativa. Uma vez ativada, a toxina se liga a parede do intestino promovendo a abertura de poros. O movimento de solutos através da membrana do tecido epitelial é desbalanceado, causando a morte do inseto (SANAHUJA et al., 201 1 ). Dentre as proteínas Cry, a maioria do tipo-Cryl l quando expressa em um sistema homólogo (por exemplo Bacíllus) ou em sistema heterólogo (por exemplo E. colí e planta transgênica) exibe atividade principalmente contra o grupo de insetos Lepidóptera e raramente contra o grupo Coleóptera, o qual pertence o bicudo. No entanto, a descoberta e caracterização de um novo gene, o gene cry1 la12, proveniente da cepa S81 1 de B. thurigiensis tornou-se um potencial agente biotecnológico para o controle da praga (SANAHUJA et al, 201 1). A proteína recombínante deste gene, Cry1 la12 , expressa em Escherichia coli demonstrou atividade contra larvas de A. grandis, demonstrando o potencial deste gene para o uso em transgenia, visando o controle deste importante inseto-praga (GROSSI-DE-SÁ et al., 2007). Muitas culturas já foram geneticamente manipuladas para expressarem proteínas Cry no combate a pragas, inclusive algodão (HOFFMANN et al. 1992). Os genes codificantes dessas proteínas foram majoritariamente expressos sob o controle do promotor constitutivo CaMV35S, originalmente isolado do vírus do mosaico da couve-flor.

A linhagem de algodão portando o gene Bt (US7345229) é resistente ao ataque de Heliothis zea, Pectinophora gossypiella, Heliothis virescens e Trichoplusia ni. Apesar de abrangente, tal linhagem não confere resistência ao A. grandis, a principal praga de algodão, destacadamente no Brasil.

Dessa forma, se faz necessária a construção de uma nova linhagem de algodão resistente ao ataque do bicudo-do-algodoeiro, um dos objetivos da presente invenção.

O promotor é o principal responsável pelo mecanismo de regulação da expressão de um gene, pois possui sítios de ligação para fatores transcricionais (TF) e para a própria RNA polimerase, responsável pela transcrição do gene.

Assim, a região promotora, ou promotor do gene, atua como uma notável ferramenta biotecnológica, pois permite o direcionamento da expressão do gene de interesse em uma linhagem transgênica.

Diversas regiões de promotores, denominadas elementos eis, foram caracterizadas como sítio de ligação de diferentes TFs, dentre elas a mais bem caracterizada é o elemento TATA-box. A pluralidade desses elementos permite a modulação temporal e espacial da expressão de um gene.

Um exemplo dessa aplicabilidade da região promotora seria o uso do promotor com expressão específica em fruto de tomate (W01991001324) para direcionar a expressão de genes capazes de melhorar a composição protéica e o valor nutricional, bem como facilitar a estocagem, manuseamento, cozimento e aspecto do fruto.

Promotores constitutivos como o CaMV35S são capazes de conduzir a expressão de um transgene em todos os tecidos da planta. Entretanto, o seu nível de expressão não é necessariamente semelhante em todas as células vegetais (SUNIKUMAR et al., 2002), há alterações na expressão da proteína ao longo do desenvolvimento da planta Esse efeito tem sido relacionado ao processo de metilação do promotor durante o desenvolvimento da planta já que este permanece ativo desde o início do desenvolvimento. Referido resultado tem sido relatado especialmente quando se inicia a fase reprodutiva, quando ocorre o ataque do A. grandis (CHEN et al., 2000). Além disso, níveis variáveis de expressão são observados em diferentes tecidos apesar de o promotor ser considerado constitutivo. Por exemplo, expressão de CrylA em ovários de algodão está entre os menores encontrados nos diferentes tecidos do algodoeiro. Isso pode ser especialmente crítico para insetos que atacam esse tecido durante o desenvolvimento como foi observado para o Hefiothis zea e que também pode ocorre para o A. grandis (KRANTHI et al., 2005). E, finalmente, impactos negativos em insetos não alvo podem ser minimizados pela diminuição material vegetal expressando Bt, apesar de que até o momento não existe um prova conclusiva de que o algodão Bt pode ter impacto em insetos não alvo (DALE et al., 2002).

Além disso, a expressão constitutiva de uma proteína heteróloga em uma variedade transgênica demanda um alto custo energético para a planta. Outros promotores constitutivos também foram caracterizados em algodão (EP1953231 ), em café (US6441273), em A. thaliana (US200201 15850) e em milho (US6670467).

Dessa forma, o método mais promissor em termos de custo e sustentabilidade para o controle do bicudo-do-algodoeiro é o desenvolvimento de linhagens de algodão geneticamente resistentes que possam suprimir o desenvolvimento larval do inseto.

Com o advento da biotecnologia e da engenharia genética tornou-se possível a manipulação de características de uma cultura economicamente importante como o algodão através da inserção de transgenes. Diversos genes proveninentes do Bacillus thuringiensis (Bt) já foram utilizados para a produção de plantas transgênicas resistentes a uma série de insetos.

Linhagens de plantas geneticamente modificadas para controle de pragas vem sendo amplamente comercializadas no Brasil, contudo, nenhuma das variedades atualmente disponíveis demonstra a capacidade de controlar esse importante inseto-praga, que é considerado um problema, pronunciadamente no Brasil.

As linhagens geneticamente modificadas comercializadas no Brasil fazem uso de proteínas tóxicas com atividade inseticida sob controle do promotor constitutivo CaMV35S. Essa região regulatória é capaz de conduzir a expressão de um transgene em todos os tecidos da planta. Entretanto, o seu nível de expressão não é necessariamente semelhante em todas as células vegetais, variando ao longo do desenvolvimento da planta e nos diferentes tecidos apesar de o promotor ser considerado constitutivo. Também podemos citar possíveis impactos negativos em insetos não-alvo e, por fim, a expressão constitutiva de uma proteína heteróloga em uma variedade transgênica demanda um alto custo energético para a planta. Adicionalmente, a utilização de muitos promotores para expressão ectópica, já contemplados no estado da técnica, determina a expressão do produto gênico em vários os órgãos da planta, sem especificidade alguma, o que nem sempre é desejável, porque a esses promotores normalmente se tem associado genes utilizados para seleção de transformantes (tais como os que conferem resistência a antibióticos) sendo expressos em vários tecidos da planta. Tal característica, desnecessária e indesejável em plantas geneticamente modificadas destinadas, por exemplo, à alimentação humana ou animal tende a diminuir a aceitação do produto final, ou de seus derivados, pelos consumidores. Portanto, promotores tecido- específicos seriam de grande importância nestes casos, como é enfoque deste pedido de patentes que visa à proteção de sequências regulatórias específicas de flores e frutos em plantas.

Portanto, de acordo com o estado da técnica da presente invenção, verifica-se que sequências regulatórias de dois genes tecido-específicos, particularmente tecido floral de espécies de plantas, principalmente em algodão (Gossypium hirsutum), capazes de iniciar e acionar a transcrição de polinucleotídeos, bem como o uso destas sequências promotoras na modificação da transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos na produção de polipeptídeos de interesse, como proteínas tóxicas a pragas, ainda não possui uma descrição ou ensinamentos prévios.

Consequentemente, pelos motivos já apresentados nesta descrição, persiste a necessidade de linhagens geneticamente modificadas de algodão que possam ser resistentes ao ataque do bicudo do algodoeiro.

Figura, portanto, como um objetivo da presente invenção a criação de plantas geneticamente modificadas com construções em tecidos florais que sejam capazes de resistir ao ataque de pragas.

Assim para suprir a falta de promotores, disponíveis no mercado atualmente, eficientes em direcionar expressão em flores de plantas, mais especificamente em algodão, é que este pedido de patente está sendo direcionado.

Desta forma, o presente invento pretende apresentar construções de DNA que contenham promotores de genes específicos, que desempenhem função características no tecido floral de diversas espécies de plantas para criação de variedades geneticamente modificadas, preferencialmente sobre o tecido floral do algodão para resistência ao ataque do bicudo do algodoeiro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção compreende a descrição de sequências regulatórias de nucleotídeos promotoras da expressão de genes específicos, tal como genes estruturais, em plantas, incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas.

Mais especificamente a invenção refere-se a sequências regulatórias de polinucleotídeos isoladas de plantas de algodoeiro que são capazes de acionar a transcrição de polinucleotídeos, e ao uso destas sequências regulatórias na modificação de transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos e produção de polipeptídeos.

Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos.

A Invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos.

Em um primeiro momento são descritas construções de DNA que contenham o promotor de cada um dos genes específicos, GhPGFSI e GhPGFS2, em tecidos florais de plantas, operacionalmente ligados a um gene heterólogo e/ou endógeno.

Assim, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão para geração de novas linhagens de plantas transgênicas, células vegetais e protoplastos com a capacidade de direcionar a expressão do gene de interesse somente em alguns tecidos da planta como tecidos florais.

Além de poder ser utilizado para a promoção da geração de novas linhagens de algodão geneticamente modificados, resistente ao ataque do bicudo do algodoeiro, foi vantajosamente verificado que estas sequências também podem ser utilizadas para demais espécies dotadas de tecido floral, pois, mediante a codificação de proteínas tóxicas que impedem o ataque por pragas. Como exemplo temos a inibição do ataque da lagarta rosada da maçã (Pectinophora gossypiella).

O ataque desta praga promove a queda de botões, o que culmina na perda total das maçãs pequenas e dano parcial em maçãs mais velhas

Esta sequência também pode ser eficiente na inibição indireta das lagartas da maçã (Heliothis virescens). Estes insetos de hábito noturno ovipositam seus ovos preferencialmente nos ponteiros de folhas novas ou nas brácteas dos botões florais. Assim, com a modificação da expressão dos genes de tecidos florais é possível ter o controle eficiente e direcionado destes parasitas. As regiões regulatórias são utilizadas como um importante instrumento para direcionar a expressão de genes de interesse, como os que codificam proteínas tóxicas do tipo Cry para a geração de novas linhagens de algodão geneticamente modificado (GM) resistente ao ataque do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis), o principal inseto-praga da cotonicultura nacional.

Este inseto utiliza as estruturas florais de algodão para a alimentação ovoposição.

Vantajosamente a presente invenção engloba a capacidade de direcionar a expressão de genes em tecidos reprodutivos, distinto do que é atualmente descrito pelo estado da técnica que abordam tão somente a expressão em determinados tecidos vegetativos.

Isso de deve ao fato de que vários insetos e pragas atacam as culturas no momento do florescimento e frutificação e recentemente visando o controle desses insetos pragas está se utilizando plantas geneticamente modificadas expressando proteínas entomotóxicas. Para a obtenção de plantas transgênicas com níveis adequados de proteínas que confiram resistência a insetos nas plantas, a escolha e utilização de promotores que direcionam a expressão nos locais específicos de ataque é extremamente rentável

Neste sentido a invenção ora proposta provê o uso de regiões promotoras tecido-específicas de órgãos florais que ao serem fusionadas a genes codificantes, principalmente os codificantes de proteínas tóxicas, que podem ser utilizados na geração de plantas transgênicas resistentes a pragas que atacam culturas durante o florescimento. As proteínas tóxicas mais bem caracterizadas e utilizadas em larga escala no controle de pragas em lavouras são as proteínas do tipo Cry. A bactéria do solo, Bacillus thuringiensis, é capaz de formar esporos que contêm cristais compostos predominantemente de tais proteínas que possuem atividade inseticida eficiente. Diversas proteínas do tipo Cry já foram descritas, apresentando toxicidade seletiva para grupos específicos de insetos.

Em um outro aspecto a presente invenção engloba os genes GhPGFSI e GhPGFS2 que apresentam alta expressão em tecidos florais de diversas espécies de plantas.

Análise por qPCR mostra que ambos os genes são altamente expressos em botões florais de G. hirsutum a partir do estágio de 6mm. Dentre os tecidos florais, foi observada elevada expressão em estame, carpelo, pétala e sépala para os dois genes.

A sequência promotora, tanto de GhPGFSI quanto de GhPGFS2, apresentam motivos eis que justificam o padrão de expressão espacial e temporal desses genes. Dentre eles podemos destacar os elementos específicos de pólen G10, LAT52 e ZM13, além do domínio CArG de ligação a MADS. A análise da expressão através do gene repórter GUS em Arabidopsis thaliana mostra que GhPGFSI e GhPGFS2 foram expressos principalmente em estame e estigma, o que indica que tais fragmentos de promotor já contêm elementos capazes de direcionar de maneira específica a expressão desses genes. Tais resultados foram corroborados ainda com o padrão de expressão específico em estames e pólen que pode ser visualizado no experimento de expressão transiente em botões florais de G. hirsutum através de experimentos de biobalística.

Assim a presente invenção adicionalmente compreende a descrição de novas sequências regulatórias, capazes de melhorar a expressão de uma sequência de nucleotídeo, tal como genes estruturais em plantas, utilizada para a produção de plantas transgênicas, células vegetais e protoplastos pertencentes a diferentes espécies de interesse comercial. Cabe ainda ressaltar que a utilização de promotores da própria espécie na produção de plantas transgênicas constitui uma vantagem do ponto de vista tecnológico, já que permitirá um controle da expressão do transgene de forma mais forte e específica.

Dessa forma o presente desenvolvimento é eficiente contendo sequências promotoras dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 de expressão especifica em tecido floral, especificadamente de Gossypium hirsutum, eficiente em minimizar os efeitos deletérios observados nos cultivares atualmente comercializados, sem que isso agregue custos adicionais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Gráfico adaptado de Genevestigator. Cada ponto retangular exibe o valor do potencial de expressão (EP) de experimentos de microarranjo representado por uma variação de azul. EP é definido como o valor médio absoluto de 1 % dos maiores valores de todos os microarranjos do banco de dados do Genevestigator

À direita o total de experimentos de microarranjo que possuem o gene indicado na parte superior da figura. Os genes submetidos a esta análise foram selecionados devido a sua alta expressão no banco de dados do PAVE. Os dois genes mostrados foram selecionados para análise de seu padrão de expressão devido à observada expressão em tecidos florais.

Figura 2. Análise de expressão relativa dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 em tecidos vegetativos de algodão. No eixo y está representada a expressão relativa dos prováveis genes específicos de flor em relação à expressão dos genes de referência GhPP2A 1 e GhUBQ14 em diferentes tecidos de algodão (eixo x). Estes valores de expressão relativa foram gerados pelo programa qBase que emprega o modelo de quantificação relativa delta-CT através da fórmula Q =EACT, onde E é a eficiência do gene e ACT é a amostra com menor valor de expressão menos o valor de expressão em questão.

Figura 3. Análise de expressão relativa dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 em botões florias de algodão. No eixo y está representada a expressão relativa dos genes selecionados em relação à expressão dos genes de referência GhACT4 e GhUBQ14 em estágios de desenvolvimento dos botões florais de 2- 12 mm (eixo x).

Figura 4. Análise de expressão relativa dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 em órgãos florais de algodão No eixo y está representada a expressão relativa dos genes GhPGFSI, GhPGFS2, em relação à expressão dos genes de referência GhACT4 e GhFBX6 em diferentes órgãos florais de algodão (eixo x).

Figura 5. Eletroforese em gel de agarose 1 ,2% contendo os fragmentos resultantes da reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos GhPGSF1_GSP1/GSP2_GW1 e GhPGSF2_GSP1/GSP2_GW1 na técnica de RACER para definição do Sítio de Início de Transcrição dos gene GhPGFSI e GhPGFS2. Para o gene GhPGFSI obteve-se um fragmento de 300 pb e o gene GhPGFS2 um fragmento de 400 pb.

Figura 6. Coloração histoquímica de GUS da construção p300_GhPGFS1 \G\ S (contendo 300 pb da região promotora) em botões florais e plântulas de Arabidopsis. A expressão órgão específica do promotor p300_GhPGFS1 foi examinada durante o desenvolvimento dos botões florais e pode ser visualizada nos estames (D) e essa coloração permanece forte e específica nos estames até botões no estágio tardio de desenvolvimento como pode ser observado no estágio F. Forte coloração GUS é observada na porção apical do estigma (G) e na borda da folha (H, I) e na raiz principal (J) de plântulas.

Figura 7. Coloração histoquímica de GUS da construção p760_GhPGFS1 GUS (contendo 760 pb da região promotora) em botões florais e plântulas de Arabidopsis. A expressão órgão específica do promotor p760_GhPGFS1 foi examinada durante o desenvolvimento dos botões florais e pode ser visualizada no tecido conectivo e estilete em estames (E, F, G e H) e essa coloração permanece forte e específica nessas estruturas até botões no estágio tardio de desenvolvimento como pode ser observado no estágio H. Forte coloração GUS é observada na porção apical do estigma (D, E, F, G e H) e nas sépalas (D, E e F), nas pétalas (F, G e H) e no pedicelo (F).

Figura 8. Análise histoquímica do promotor do gene GhPGFS2 em plantas da Arabidopsis transformadas com a construção pGhPGFS2::GUS. Forte coloração GUS pode ser observada em estames (F, G, H, I, J, L) desde estágios iniciais até estágios tardios do desenvolvimento de botões florais. No estigma de flores abertas (L) e no pecíolo da folha em plântulas (M, N).

Figura 9. Expressão transiente dos dois fragmentos de promotor de GhPGFSI por biobalística em botões florais de G. hirsutum. Padrão de expressão similar para os dois fragmentos de promotor, observado através do gene repórter GUS em estames e grãos de pólen. A. p300_GhPGFS1 ::GUS (promotor de 300 pb); B. p760_GhPGFS1::GUS (promotor de 760 pb).

Figura 10. Expressão transiente dos três fragmentos de promotor de GhPGFS2 por biobalística em botões florais de G. hirsutum. Padrão de expressão similar para os três fragmentos de promotor, observado através do gene repórter GUS em estames e grãos de pólen. A. p351_GhPGFS2::GUS (promotor de 351 pb); B. p858_GhPGFS2::GUS (promotor de 858 pb); C. p1408_GhPGFS2::GUS (promotor de 1408pb).

Figura 1 . Resultado do BLASTn indicando a família gênica a qual o gene GhPGFSI pertence

Figura 12. Resultado do BLASTn indicando a família gênica a qual o gene GhPGFS2 pertence

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A obtenção de plantas transgênicas com níveis adequados de proteínas heterólogas, necessita de sequências nucleotídicas regulatórias (promotores) que direcionem altos níveis de expressão em tecidos específicos ou alvo. A busca por estes promotores é baseada na identificação de genes que são expressos em um determinado tecido ou condição fisiológica.

Assim, foram identificados genes de expressão predominantemente em tecido floral, mediante a combinação da informação derivada do PAVE com a do Cotton Genome Database.

Os genes GhPGFSI e GhPGFS2 foram selecionados na biblioteca de flores inteiras de devido a sua alta expressão (seis ou mais etiquetas de expressão no PAVE) e foram comparados com a sequência dos genes de G. hirsutum do Cotton Genome Database usando o programa tBLASTN (GhPGFS, Gossypium hirsutum putative gene flower specific). Com a sequência destes dois genes foi realizado um BLASTn no Banco de Dados de Arabidopsis com objetivo de encontrar os possíveis ortólogos, os quais foram então analisados na plataforma Genevestigator (Figura 1).

Tabela 1 : Resultado da comparação entre os 2 Contigs de G. raimondii identificados no banco de dados PAVE como específicos de flor com o banco de dados do Cotton Genome Database para genes expressos em G. hirsutum. Similaridade entre os genes está descrita em número de nucleotídeos.

A análise nesta plataforma nos possibilitou visualizar uma elevada expressão potencial em tecidos florais em Arabidopsis e estes genes tiveram seu padrão de expressão avaliado de forma detalhada através de reações de PCR em tempo real (qPCR) em plantas de algodão da espécie Gossypium hirsutum da variedade "BRS Cedro" de três meses de idade.

As plantas foram cultivadas sob temperatura controlada (21 ± 4 °C) e sob fotoperíodo natural. Os possíveis genes específicos de flor tiveram seu perfil de expressão gênica avaliado em três condições diferentes: entre diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos (1 ), entre diferentes estágios do desenvolvimento de botões florais (2) e entre os diferentes órgãos florais de botões de G. hirsutum (3). Duas replicatas biológicas para cada amostra foram usadas para análise por Real-Time PCR e três replicatas técnicas foram analisadas para cada replicata biológica. Todas as replicatas biológicas apresentaram uma reprodutibilidade adequada. A normalização dos dados obtidos com a análise por qPCR^ requer genes que apresentem transcritos com expressão uniforme na maioria das células do organismo ou entre as espécies que estão sendo analisadas, assim como durante várias fases do desenvolvimento e sob diferentes condições ambientais. Estes genes são usualmente denominados genes constitutivos ou "Housekeeping Genes". Por isso foi analisado os perfis de expressão gênica de nove genes candidatos a genes de referência em algodão por qPCR em um conjunto de 22 diferentes amostras de tecidos de algodão, agrupados em 5 diferentes conjuntos experimentais, com o intuito de identificar os melhores genes para a normalização dos dados de expressão gênica durante o desenvolvimento floral de algodão (Artico et al, 2010).

A primeira análise de expressão dos possíveis genes específicos de flor foi feita entre diferentes órgãos de algodão, incluindo órgãos vegetativos como folha, caule, raiz e ramo e órgãos reprodutivos como coletânea de flor (botões florais de 2, 4, 6, 8 e 10 mm de diâmetro) e coletânea de maçã- maça é a denominação usual para os frutos de algodão (maçãs de 10-15, 16-20, 21-30 e >30 mm de diâmetro).

Ultrapassada esta etapa, foi observado que os genes GhPGFSI e GhPGFS2 tiveram uma expressão relativa em botões florai, mais alta que nos demais tecidos, o que indica um acúmulo de transcritos desses genes em tecidos de flor, enquanto sua expressão é menor ou em níveis quase indetectáveis nos outros tecidos analisados, tais como raiz, folha, caule, ramo e maçã. Esta evidência demonstra que esses genes apresentam uma expressão específica em tecidos florais (Figura 2). Esses resultados foram comprovados com replicatas biológicas para cada tecido.

Em seguida, foi analisado a expressão de ambos os genes, GhPGFSI e GhPGFS2, durante o estágio de desenvolvimento dos botões florais de 2, 6, 7, 8, 10 e 12 mm de diâmetro, o que comprovou que tais genes são altamente expressos no botão de 6 mm, sendo que esse nível de expressão se mantém elevado também nos botões de 7, 8, 10 e 12 mm (Figura 3).

Os resultados foram confirmados com replicatas biológicas para cada botão floral analisado.

Em uma última análise foi verificado a expressão dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 nos diferentes órgãos florais do botão de algodão. Os dois genes tiveram uma expressão relativa bastante elevada em estames e também em carpelo, sépala e pétala. Esse resultado foi similar nas replicatas biológicas de cada órgão floral analisado (Figura 4).

Metodologia

Através da ferramenta BLASTn pode-se identificar regiões de similaridade entre sequências e inferir relações funcionais entre elas, podendo inclusive, identificar membros de famílias gênicas.

Desta maneira, utilizando a sequência codificante dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 e comparando-as contra a base de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) foi possível deduzir a que família gênica cada gene pertence e sua possível função biológica.

O primeiro gene GhPGFSI foi identificado como codificante de uma proteína que demetilesterefica pectinas da parede celular vegetal (Pectin Methylesterase - PME).

As PMEs são enzimas que pertencem a classe 8 de carboidrato esterases (CAZY:http://www.afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/ e Coutinho et al., 2003). Elas estão envolvidas na demetilesterificação de pectinas, que representam aproximadamente 35% do total de peso seco em parede celular de dicotiledôneas, gerando grupos carboxil que desempenham um papel na complexação de íons de cálcio aumentando a firmeza da parece celular (WILLATS et al., 2001 ). Além disso, a ação de PMEs é necessária antes da ação de poligalacturonases (PG) que estão envolvidas na degradação de matriz péctica durante o amadurecimento de frutos (WAKABAYASHI et al., 2003).

Assim, PMEs contribuem tanto para a firmeza quanto para o amolecimento da parece celular (LOUVET et al., 2006). A regulação temporal e espacial da atividade de PMEs durante o desenvolvimento da planta varia em cada uma das isoformas desta grande família (MICHELI et al., 1998; LI et al., 2002).

No genoma de Arabidopsis, Louvet e colaboradores analisaram o perfil de expressão de 66 genes da família de PMEs e foi visto que a expressão é fortemente regulada de maneira tecido específica, sendo que 19 genes são altamente ou unicamente expressos em botões florais (LOUVET et al., 2006). Diversos estudos têm identificado PMEs específicas de tubo polínico, indicando que PMEs de plantas podem estar envolvidas no processo de desenvolvimento do tubo polínico e em suas interações com o tecido femininos da flor (JIAN et al., 2005).

A região codificante do segundo gene, o GhPGFS2, apresentou alta homologia com o gene SKU14 de A. thaliana, que possui atividade de oxidorredutase e de ligação ao íon cobre, codificando uma proteína altamente similar a proteína específica de pólen Bp10 de Brassica napus e Ntp303 de Nicotiana tobacum. SKU1 pertence a uma família de 19 membros altamente similares em Arabidopsis (HONYS e TWELL, 2003). Por exemplo, os membros SKU5 e SKU6 dessa família também são altamente similares a proteína específica de pólen Bp10 de B. napus, embora eles sejam expressos em outras partes da planta (JACOBS e ROE, 2005).

Recentemente, uma análise do transcriptoma de pólen em Arabidopsis identificou apenas dois membros da família, SKU14 (At1g55560) e SKU12 (At1g55570) como abundantes e especificamente expressos em pólen, e em nenhum outro órgão. Provavelmente a expressão dos vários membros dessa família é regulada diferencialmente durante o desenvolvimento e nos diferentes órgãos da planta (TWELL e HONYS, 2003).

Estes dados indicam que algumas oxidorredutases têm padrão de expressão conservado e específico para flor, entre diferentes espécies vegetais.

Após ter sido realizada a confirmação da especificidade da expressão gênica em tecidos florais de algodão via qPCR, iniciou-se o isolamento da região posicionada a montante (5') da sequência de EST destes genes (região promotora) empregando o kit Universal Genome Walker (GW) (Clontech) que permite "andar" pelo genoma identificando regiões desconhecidas.

Uma região promotora de 1450 pb foi obtida para o gene GhPGFSI enquanto para o gene GhPGFS2 obteve-se uma região de 2557 pb. Os fragmentos em questão foram purificados, clonados em vetor pGEM®-T Easy (Promega) e inseridos em E. coli cepa D H 5a para posterior sequenciamento. Após a identificação das regiões promotoras através do sequenciamento foram realizadas buscas por elementos regulatórios nas sequências amplificadas por GW utilizando-se o banco de dados PLACE (http:///www.dna. affrc.go.jp/htdocs/PLACE/) (HIGO et al., 1999) para identificação de possíveis sítios de ligação a fatores de transcrição já caracterizados em plantas.

O fragmento promotor do gene GhPGFSI tem um tamanho total de 1450 nucleotídeos. O ponto de início de tradução foi determinado pelo alinhamento com outros genes de espécies vegetais relacionadas. O sítio de início de transcrição foi determinado utilizando o GeneRacerTM Kit e identificado na posição - 144 pb (Figura 5). A busca por elementos cis-regulatórios presentes na região promotora desse gene, utilizando-se de informações disponíveis no banco de dados do PLACE, revelou a presença de inúmeros motivos comumente encontrados em regiões promotoras de plantas. Como por exemplo, foi observada a presença de motivos típicos de regiões promotoras de eucariotos, como o TATA-box, normalmente presente a 30 pb do ponto de início da transcrição (+1 ), localizado em nossa sequencia na posição -15 pb, e elementos proximais como CAAT-box, nas posições - 276,-245, -197 pb (STEPHEN e JAMES, 2003). Outros elementos chaves foram encontrados, especialmente aqueles relacionados com a expressão específica em pólen. Um desses elementos regulatórios corresponde à sequência GTGA (posição - 205, -251 e -485-9), que pertence ao motivo GTGANTG10 altamente conservado em plantas como tabaco e tomate, e, é capaz de direcionar a expressão em grãos-de- pólen (ROGERS et al., 2001 ). Outro elemento eis responsável por direcionar e regular a expressão durante o desenvolvimento do pólen é o POLLEN1 LELAT52, representado pela sequencia AGAAA, que é encontrado nas posições -43, -52, -482, - 779, -821 , -974, -1607 pb na região promotora isolada do gene GhPGFSI (BATE e TWELL, 1998). Um outro elemento encontrado na região amplificada foi o motivo MYB.ph3 composto pela sequência do tipo AAACAAATA, que é o domínio de ligação do fator transcricional MYB específico de epiderme de pétala em Petunia hybrida (Solano et al., 1995). Nas posições -741 , -875, -1203, -1237, -1365 e -1489 pb, encontram-se sequências de AP1 -CArG boxes presentes em promotor de genes responsáveis pela identidade dos órgãos florais, como APETALA3. E na posição -736 e -765, encontra-se motivos CArG (CwvvwwwwwwG, onde w é A/T repetido x vezes) de ligação para domínios de proteínas MADS como AGL15 responsável pela expressão em embriões.

Tabela 2: Possíveis elementos eis relevantes encontrados na região promotora do gene GhPGFSI envolvidos em várias respostas, principalmente na expressão específica em pólen e anteras.

O fragmento de 2557pb do GhPGFS2 teve seu sítio de início de transcrição identificado na posição -80pb a montante do ATG inicial. Dentre os elementos regulatórios identificados no PLACE podemos ressaltar a presença daqueles característicos de região promotora denominados CAAT-box (CAAT), TATA- box (TATTAAT) e GATA-box (GATA), responsável por alta e específica atividade do promotor (LAM et al. 1989). Dentre os elementos específicos de tecido floral pode-se destacar dois específicos de pólen GTGANG10 (GTGA) e POLLE 1 LELAT52 (AGAAA) e três elementos de ligação de MADS: AP1 (TTTTTRG) de especificidade floral mediado por APETAL3 nas posições -295, -516, -824 e -945 (TILLY et al.1998), Agamous (CCVWWWVNNRGH), cuja sequência apresenta sítio de ligação de AGAMOUS em A. thaliana na posição -557 (HUANG et al. 1993) e CARGCW8GAT (CWWWWWWWWG) nas posições -989 e -1389, também encontrado na região promotora de GhPGFSL Nas posições -71 , -504 e -1042 foi encontrado o elemento específico de epiderme de pétala denominado MYB.ph3 (WAACNRWYW). E por fim, foi localizado na posição -1085 o elemento específico de fruto, responsivo a etileno ERELEE4 (AWTTCAAA) (ITZHAKI et al.1994).

Tabela 3: Possíveis elementos eis relevantes encontrados na região promotora do gene GhPGFS2 envolvidos em várias respostas, principalmente na expressão específica em pólen e anteras.

No intuito de avaliar a funcionalidade e especificidade das regiões promotoras isoladas no presente invento, a análise da atividade órgão- específica do promotor destes genes foi realizada através de experimentos histoquímicos de coloração GUS. Para isso fragmentos de 300 pb e 760 pb para o gene GhPGFSI e 350 pb para o gene GhPGFS2 foram clonados no vetor Gateway, pKGWFS7, contendo o gene repórter uidA (GUS) ou GFP (KARIMI et al,. 2007). Plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana foram transformadas através do sistema de infiltração da inflorescência mediado por Agrobacterium tumefaciens (floral-dip) (DESFEUX et al., 2000). Três linhagens independentes de plantas transgênicas contendo os promotores dos genes GhPGFSI e do gene GhPGFS2, segregando 3: 1 foram selecionadas em meio de cultura contendo o antibiótico Canamicina (50μg/mL).

A seleção das plantas transgênicas até a terceira geração foi realizado somente através dos ensaios de segregação em meio com antibiótico. Sementes e plantas pertencentes às linhagens T3, produzidas pelas plantas T2 homozigotas, foram então utilizadas em ensaios histoquímicos de coloração GUS para análise do padrão de expressão órgão-específico dos promotores isolados. Nesses testes foram utilizadas plântulas com 15 dias de idade e inflorescência de plantas com 60 dias.

A análise histoquímica em plântulas de Arabidopsis contendo o promotor do gene GhPGFSI, p300_GhPGFS1 ::GUS, demonstrou uma fraca expressão na borda da folha e na raiz principal. Já a expressão de GUS detectada em flores foi forte e específica em estames no botão floral jovem em Arabidopsis, que representa o estágio 1 1 de desenvolvimento, quando as papilas estigmáticas estão formadas, e essa coloração continua intensa nos estames em estágios posteriores do desenvolvimento do botão floral, assim como também é possível observar coloração no estigma em flores em um estágio tardio de desenvolvimento (Figura 6). Já a observação da coloração GUS a partir da expressão do fragmento de 760 pb do promotor do gene GhPGFSI , p760_GhPGFS1 ::GUS, demonstrou forte coloração em estames, principalmente no tecido conectivo e estilete, em botões florais desde estágio iniciais do desenvolvimento floral até botões de estágios tardios, em flores abertas. Esse fragmento também direcionou expressão em sépalas, pétalas, pedicelo e no estigma de flores de vários estágios de desenvolvimento (Figura 7).

De maneira semelhante, a análise de coloração GUS da construção p351_GhPGFS2::GUS demonstrou que esse fragmento de promotor direciona uma expressão contínua e crescente em estames desde o estágio 1 1 de desenvolvimento em Arabidopsis até flores tardias. A marcação por GUS também se faz presente no estigma de flores abertas e no pecíolo da folha em plântulas (Figura 8).

Com o objetivo de avaliar o padrão tecidual de expressão em G. hirsutum através da fusão do gene repórter uidA, regulado por tais regiões promotoras foi realizado o ensaio de expressão transiente por biobalística de acordo com o descrito por RECH et al. (2008). Botões florais de G. hirsutum de 5 a 8mm foram submetidos ao bombardeamento utilizando-se as duas construções contendo fragmentos de promotor do gene GhPGFSI (300 e 760 pb) e as três construções dos promotores dos genes GhPGFS2 (351 , 827 e 1250pb). Os promotores de ambos os genes GhPGFSI e GhPGFS2 apresentaram um padrão de expressão semelhante e específico em estames e pólen de algodão (Figura 9 e 10).

EXEMPLO 1 - SELECÁO IN SILICO DE ESTS COM PADRÃO DE EXPRESSÃO ÓRGÃO/TECIDO ESPECÍFICO EM FLOR DE ALGODÃO

Para identificação dos genes de algodão dois banco de dados distintos foram usados, o PAVE (http://www.agcol.arizona.edu/cgi- bin/pave/Cotton/index.cgi) e o Cotton Genome Database (U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service CottonDB http://cottondb.org/cdbhome.html). Assim selecionamos genes que apresentaram alta expressão (seis ou mais etiquetas de expressão no PAVE) exclusiva ao desenvolvimento floral de G. raimondii e comparamos a sequência destes genes com aqueles genes de G. hirsutum do Cotton Genome Database usando o programa tBLASTN (ALTSCHUL et al., 1997) e o parâmetro matriz BLOSUM62. Esta matriz é construída a partir do alinhamento local de sequências com similaridade igual ou maior que 62%. Com a sequência desses genes também foi realizado BLASTn no Banco de Dados de Arabidopsis com objetivo de encontrar seus possíveis ortólogos, os quais foram então analisados na plataforma Genevestigator que permite avaliar o padrão de expressão a partir de centenas de experimentos de microarranjo (Figura 1). Genevestigator (https://www.genevestigator.ethz.ch) é uma ferramenta Web, porém com aplicativo JavaScript instalado no computador (ZIMMERMANN et al., 2004). A plataforma de A. thaliana com microarranjos Affymetrix ATH1 22K foi selecionada nesta análise. Nossos resultados foram obtidos pela visualização dos gráficos de Anatomia (Anatomy) com visualização no mapa de intensidade (heat map) em escala logarítmica. Apenas sequências que apresentaram elevada expressão em tecidos florais foram selecionadas para o desenho dos iniciadores.

EXEMPLO 2- ANÁLISE DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DOS GENES GhPGFSI E GhPGFS2 POR qPCR

a) Material Vegetal

Em todos os experimentos descritos no presente trabalho foram utilizadas plantas da espécie Gossypium hirsutum de três meses de idade da variedade "BRS Cedro". As plantas foram cultivadas sob temperatura controlada (21 ± 4 °C) e sob fotoperíodo natural na Embrapa CENARGEM em Brasília (DF, Brasil). Os órgãos utilizados foram botões florais, frutos, folhas, caules, ramos e raízes. Também foram incluídos sete estágios de desenvolvimento floral (botões florais com os seguintes diâmetros: 2, 4, 6, 7, 8, 10 e 12 mm) e quatro estágios de desenvolvimento de frutos (frutos com os seguintes diâmetros: 10-15, 16-20, 21-30 e maior que 30 mm) (GREENBERG et al., 2004). Além disso, órgãos florais (sépala, pétala, estame, carpelo e pedicelo) foram dissecados a partir do botão de 6 mm e armazenados. O material foi isolado a partir de, pelo menos, cinco diferentes plantas de algodão para a obtenção de um pool para cada tecido. O procedimento foi repetido com outras cinco plantas a fim de se obter um segundo pool que representasse a replicata biológica. Todas as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogénio líquido e armazenadas à -80°C até serem utilizadas para a extração do RNA.

b) Desenho dos iniciadores

Os iniciadores para as análises da PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foram desenhados utilizando-se a ferramenta Primer3 (ROZEN e SKALETSKY, 2000) e avaliados usando o programa NetPrimer (Premier Biosoft International). Foram selecionados apenas aqueles resultantes em amplicons entre 80 pb e 200 pb e com temperaturas médias de hibridização em torno de 60 ^° C. Todos os iniciadores (Tabela 1) foram inicialmente testados via qPCR por visualização em gel de agarose e a especificidade da amplificação foi verificada pela análise das curvas de dissociação geradas pelo programa Opticon Monitor 3 (DNA Engine Opticon Real- Time PCR Detection System, Bio-Rad). A normalização dos dados relativos de expressão foi realizada utilizando o conjunto dos melhores genes constitutivos definidos por Artico et al., 2010.

Tabela 4. Relação de sequências de iniciadores, gerada pelo programa Primer3, para os supostos genes específicos de flores e para os genes constitutivos de G. hirsutum.

Nome Lócus homólogo Processo biológico Iniciador Direto/Reverso descrito em descrito em A.thaliana

A.thaliana

GhPGFSI AT5G449180 Pectina metilesterase GAGAAGAGCCTTGCGTCATC/

AAGCGCCTCTCTGTTGTTGT

GhPGFS2 AT3G 13400 Oxirreductase CCTTGATGAGCCATTCCTTG/

GGGGGATAGGACAGTTGGTT

GhPP2A1 At1 g59830 Subunidade catalítica de GATCCTTGTGGAGGAGTGGA/ proteína fosfatase 2A GCGAAACAGTTCGACGAGAT

GhUBQ14 At4g02890 Poli-ubiquitina CAACGCTCCATCTTGTCCT/

TGATCGTCTTTCCCGTAAGC

GhACT4 At5g09810 Membro da família TTGCAGACCGTATGAGCAAG/ gênica da Actina ATCCTCCGATCCAGACACTG

GhFBX6 At5g15710 Membro da família TGCCTGCAGTAAATCTGTGC/ protéica F-box GGGTGAAAGGGTTTCCAAAT c) Extração de RNA e síntese de cDNA

As amostras de RNA total foram preparadas a partir dos tecidos de algodão (G. hirsutum, variedade Cedro). Os tecidos utilizados de órgãos vegetativos da planta foram: folha, caule, ramo, raiz, coletânea de flor (botões de 2, 4, 6, 8 e 10 mm) e coletânea de maçã (10-15, 16-20, 21 -30 e >30 mm de diâmetro); de órgãos reprodutivos foram: botão floral de 2, 4, 6, 7, 8, 10 e 12 mm e sépala, pétala, estame, carpelo, pedicelo isolados do botão floral de algodão de 6 mm. Todos os tecidos foram coletados de diferentes indivíduos. Cada tecido foi dividido em dois pools a fim de obtermos replicatas biológicas. Os tecidos foram mantidos congelados à -80 ^° C e macerados em nitrogénio líquido para a extração de RNA.

As extrações de RNA total foram realizadas a partir de 100 mg de cada tecido vegetal macerado em nitrogénio líquido, utilizando o Invisorb Spin Plant RNA Mini kit (Invitek), de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras foram dosadas no NanoDrop ND-1000 (Thermo Ficher Scientific), com as leituras das absorbâncias na faixa 230-280 nm e utilizadas na síntese de cDNAs. A integridade do RNA foi avaliada também em eletroforese em gel de agarose 1 % com coloração em brometo de etídio. A presença de produtos espúrios de amplificação causados pelo DNA genômico foi também continuamente verificado pelo perfil de dissociação da qPCR. Ambos os testes mostraram que o Invisorb Spin Plant RNA Mini kit remove eficientemente DNA contaminante das amostras de RNA em algodão.

A primeira fita de cDNA de cada amostra foi sintetizada a partir de 1 g de RNA total, ao qual adicionou-se 50 μΜ de oligonucleotídeos (dT24V) e 10 mM de cada deoxirribonucleosídeo 5'-trifosfato (dNTPs). Essas reações foram incubadas a 65 ^° C por 5 minutos e resfriadas no gelo. Em seguida foram adicionados 20 mM de ditiotreitol (DTT), 200 unidades de Superscript III (Invitrogen) e o respectivo tampão First-Strand totalizando o volume de 20μΙ_. Esta reação foi incubada a 50 ^° C durante 1 h, segundo instruções do fabricante. A inativação da transcriptase reversa foi feita por incubação da reação a 70 ^° C por 15 minutos.

d) PCR quantitativa em tempo real (qPCR)

Para os experimentos de qPCR os cDNAs utilizados foram diluídos 50 vezes em água MilliQ® estéril ultrapura e as mesmas alíquotas foram utilizadas em todos os experimentos. Cada reação foi realizada em triplicata para cada par de iniciador. As qPCRs foram efetuadas no sistema de detecção Chromo 4 (Bio- Rad), e os resultados visualizados pelo software Opticon Monitor 3 (DNA Engine Opticon Real-Time PCR Detection System , Bio-Rad). As reações de amplificação dos cDNAs foram realizadas em um volume final de 20 μΙ_ contendo 2,00 μ[_ do detector SYBR Green I (1X) (Molecular Probes), 10 μΙ_ do cDNA diluído (1 :50), 0,80 μΐ_ dos iniciadores direto e reverso (10 μΜ cada), 0,05 μί_ de dNTP (10 mM), 2,00 μΙ_ de tampão PCR sem magnésio (10x), 1 ,20 μΐ_ de cloreto de magnésio (50 mM), 0,05 μΙ_ de Platinum® Taq DNA Polymerase (5 υ/μ__) e 3,90 μί, de água. Na reação controle negativa, o volume do cDNA foi substituído por água MilliQ® estéril. Para a análise dos genes nos tecidos vegetativos juntamente com a coletânea de flor e a coletânea de maçã, o volume final de cada reação foi aumentado para 40 μΙ_ a fim de melhorar os resultados.

Os parâmetros da reação da PCR foram 94°C por 5 minutos para a ativação da enzima polimerase, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 94°C por 15 segundos, anelamento dos iniciadores específicos para cada gene a 60°C por 10 segundos e polimerização a 72°C por 15 segundos.

As medidas dos produtos de amplificação foram realizadas pela incorporação do marcador fluorescente SYBR Green na dupla fita de DNA. Para avaliação da eficiência do iniciador utilizamos o programa online Real-time PCR Miner (ZHAO e FERNALD, 2005). Este programa utiliza os pontos iniciais e finais da fase exponencial da PCR juntamente com os dados brutos de fluorescência de cada iniciador em cada ciclo e estima para cada gene os valores de eficiência das amplificações e o ciclo de corte CT (Cycles threshold) sem a necessidade de uma curva padrão a partir de um algoritmo de regressão não linear. Estes valores de CT gerados pelo Miner foram utilizados no programa qBase, versão v 1.3.5 (HELLEMANS et al., 2007) que emprega o modelo de quantificação relativa delta-CT para transformar o valor de expressão em valores relativos não-normalizados, que serão corrigidos pela eficiência da PCR através da fórmula Q =EACT , onde E é a eficiência do gene e ACT é a amostra com menor valor de expressão menos o valor de expressão em questão.

Os resultados foram submetidos a dois diferentes programa que classificam os melhores genes constitutivos, o geNorm (VANDESOMPELE, et al. 2002) e NormFinder (ANDERSEN, et al. 2004). Estes programas se baseiam em algoritmos diferentes que utilizam como informação a análise do ciclo limite (Cycles threshold) dos genes nos diferentes tecidos em duas replicatas biológicas e a eficiência do iniciador em cada amostra biológica. Com esta análise identificamos os genes que apresentam a menor variação quanto ao número de transcritos em cada tecido.

Para a avaliação da expressão dos possíveis genes específicos de flor, os valores de eficiência das amplificações de cada iniciador e o ponto de corte CT (Cycles threshold) dos genes nos diferentes tecido foram determinados pelo programa online Real-time PCR Miner, utilizados no programa qBase versão 1.3.5 e normalizados com os genes de referência indicados pelo programa NormFinder.

EXEMPLO 3 - ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DAS REGIÕES PROMOTORAS DOS GENES GhPGFSI E GhPGFS2

A região do DNA localizada a montante (5') dos ESTs validados por qPCR, correspondente portanto a região regulatória dos genes em análise, foi amplificada empregando a técnica de Genome Walkertm (GW) (Clontech) a partir do DNA genômico de Gossypium hirsutum. Bibliotecas foram construídas a partir de quatro pools de fragmentos oriundos da digestão de DNA genômico com diferentes enzimas de restrição de corte abrupto (Dral, EcoRV, Pvull e Stul). Esses fragmentos foram então ligados a adaptadores fornecidos pelo kit.

A técnica "genome walking" permite amplificar, através de PCR, regiões localizadas à montante de uma sequência conhecida (DEVIC et al., 1997) empregando-se oligonucleotídeos complementares aos adaptadores e à sequência conhecida (no nosso caso do EST validado). A primeira etapa do procedimento de Genome Walker consiste de um PCR primário empregando oligonucleotídeos mais externos relacionados ao adaptador (AP1 ) e à sequência do EST validado. Uma alíquota desse PCR primário é então usada como molde para a realização do PCR secundário que utiliza oligonucleotídeos mais internos (AP2 e GSP2) à região amplificada. Para tal foram realizados os seguintes procedimentos como descrito a seguir.

a) Isolamento de DNA total de folha de algodão A extração de DNA genômico foi realizada a partir de folhas de G. hirsutum segundo o kit Genomic DNA from Plant (Macherey-Nagel). As amostras de DNA foram quantificadas em NanoDrop ND-1000 (Thermo Ficher Scientific) com as leituras das absorbâncias na faixa 230-280 nm, analisadas em gel de agarose 1 % corado com brometo de etídio e acondicionadas em freezer à -20°C.

b) Desenho dos oligonucleotídeos gene-específicos (GSPs)

Oligonucleotídeos complementares à porção 5' terminal da sequência do EST representativo de cada gene validado foram desenhados com o intuito de amplificar produtos a montante da referida região. Os critérios adotados foram os seguintes: tamanho do oligonucleotídeo (mínimo: 25 bases; ótimo: 26 bases; máximo: 28 bases); temperatura de anelamento (mínimo: 66°C; ótimo: 67°C; máximo 68°C) e conteúdo em GC (mínimo: 40%; máximo: 60%) (Tabela 2).

Tabela 2. Pares de Iniciadores Utilizados para o isolamento da região promotora dos genes. GhPGFSI e GhPGFS2 através da técnica de Genome Walker.

Gene Pares de Iniciadores (direto/reverso)

GhPGSFI. .GSP1/GSP2. _GW1 ACCTTAAGCGCCTCTCTGTTGTTGTC/

GACACACCCACCACTGCCACTAC

GhPGSFI. _GSP1/GSP2. _GW2 GTCGACACGCGTGCCTATAGTAATCA/

ACTAGTGAATTCGCGTCTGTGTGCAG

GhPGSFI. .GSP1/GSP2. _GW3 G G C AAAC AATC C AAGTG GTG C AAGTT/

GGCTATTTATTGTTTGGTCCTTGAACC

GhPGSF2. _GSP1/GSP2_ _GW1 GTAGCTGCCAATCTGATCCTTCACCT/

GCTGCCAATCTGATCCTTCACCT

GhPGSF2_ _GSP1/GSP2_ _GW2 CGCTCGTC C ATTC ATTTATTTC CTTG/

TCCACTGTGCTGATGGCTAACCTTTT

c) Construção das bibliotecas de GW e realização da PCR

Para a construção das bibliotecas foram utilizadas alíquotas de

DNA genômico de algodão (2,5 yg) digeridas durante 16 horas a 37 °C com as enzimas de restrição Dral, EcoRV, Pvull e Stul separadamente. Em seguida o DNA digerido foi purificado via extração clorofórmio/fenol e ligado aos adaptadores. Tanto a purificação quanto a ligação dos adaptadores foram processadas seguindo as instruções do fabricante do kit. Após a ligação dos adaptadores, as amplificações das sequências promotoras foram realizadas segundo os parâmetros da reação de PCR: 7 ciclos de 94°C por 25 segundos para a ativação da enzima polimerase e 72°C para anelamento dos iniciadores específicos e polimerização e 32 ciclos de 94°C por 25 segundos e 67°C por 3 minutos, condições utilizadas tanto na PCR primária quanto na secundária. Para o gene GhPGFSI o primeiro conjunto de oligonucleotídeos desenhado (GhPGSF1_GSP1/GSP2_GW1 ) permitiu isolar um fragmento de 300 pb de região promotora. Então um novo conjunto de oligonucleotídeos foi sintetizado, GhPGSF1_GSP1/GSP2_GW2, e agora uma região promotora de 780 pb foi obtida. Como queríamos um promotor maior para o gene um terceiro par de oligonucleotídeos, GhPGSF1_GSP1/GSP2_GW3, foi desenhado e com ele obtivemos um promotor de 1450 pb do gene GhPGFSI (Tabela 2). Do mesmo modo para isolar a região promotora do gene GhPGFS2, foram necessários dois conjuntos de primers, GhPGSF2_GSP1/GSP2_GW1 e GhPGSF2_GSP1/GSP2_GW2, que permitiram isolar fragmentos de 370 pb e 2557 pb respectivamente.

d) Isolamento, purificação e clonagem das regiões promotoras

Os fragmentos únicos amplificados em cada etapa de GW foram purificados e concentrados utilizando-se o Kit DNA Clean & Concentrator (Zymo Research) de acordo com especificações fornecidas pelo fabricante.

Os produtos de amplificação purificados foram em seguida inseridos no vetor pGEM® -T Easy (Promega). Alíquotas de aproximadamente 50 ng de DNA foram dispostas em microtubo de 1 ml juntamente com 50% de Tampão de Ligação 2X, 20 ng de vetor e 1 ,2 u de T4 DNA ligase. A reação de ligação permaneceu por 1 horas à temperatura ambiente e o/n a 4°C. Após esse período, uma alíquota do produto de ligação foi utilizada para transformar Escherichia coli cepa DH5a por choque térmico.

e) Minipreparação de DNA plasmidial e sequenciamento dos insertos

Foram selecionados 5 clones de cada evento de transformação para validação quanto à presença do plasmídeo recombinante. Foi realizado uma PCR utilizando os primers M13 direto (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') e M13 reverso (5 - GTAAAACGACGGCCAG-3') para identificação das colónias recombinantes. As que foram identificadas como positivas por conter um fragmento do tamanho esperado para cada gene foram repicadas em 4 ml de meio LB líquido acrescido de ampicilina 100 mg/l e mantidas sob agitação constante de 300 rpm a 37°C durante 16 horas. Após o período de incubação as amostras foram centrifugadas e sucessivas minipreparações de DNA plasmidial foram realizadas utilizando-se o GeneJetTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Os plasmídeos foram digeridos com a enzima EcoRI para a confirmação da presença do inserto, e o DNA plasmidial (200 ng) foi submetido a uma reação de sequenciamento com os oligonucleotídeos 13 senso e antisenso empregando o MegaBace 1000 DNA Analysis Systems (GE Healthcare). Foram sequenciados 2 clones de cada evento. As sequências foram analisadas utilizando-se o programa DNA Baser e um consenso a partir dos clones sequenciados foi obtido.

f) Análise das sequências e busca de domínios regulatórios

As sequências obtidas foram submetidas a análises comparativas com sequências depositadas no banco de dados do NCBI usando Blastn. Ao mesmo tempo foram realizadas buscas por motivos regulatórios normalmente presentes em regiões promotoras de genes de plantas utilizando o banco do PLACE database (http:///www.dna. affrc.go.jp/htdocs/PLACE/) (HIGO et al., 1999).

EXEMPLO 4 - IDENTIFICAÇÃO DO SÍTIO DE INÍCIO DE

TRANSCRIÇÃO

A identificação do sítio de início de transcrição (SIT) foi feita através do kit GeneRacerTM (Invitrogen). Os procedimentos foram feitos seguindo as instruções do fabricante utilizando RNA total extraído de botões florais de algodão de 6 mm de diâmetro. Primeiramente, foi utilizada a enzima CIP (calf intestinal phosphatase), que remove os grupamentos fosfato da extremidade 5' de mRNA truncados e outras moléculas de RNA não-mensageiros. Após purificação, restam somente mRNAs completos e a enzima TAP (tobacco acid pyrophosphatase) retira a estrutura CAP5', deixando livre uma extremidade fosfato na qual se ligará o adaptador fornecido pelo kit. Após a ligação do adaptador foi feita a transcrição reversa utilizando oligonucleotídeos do tipo Random Primer (fornecido pelo kit). Para obter a extremidade 5' do cDNA, isto é, o primeiro nucleotídeo a ser transcrito foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos específicos a cada um dos genes em duas rodadas de amplificação (oligonucleotídeos utilizados GhPGSF1_GSP1/GSP2_GW1 e GhPGSF2_GSP1/GSP2_GW1 , Tabela 2). No PCR primário se utilizou oligonucleotídeos mais externos relacionados ao adaptador (GeneRacer 5' primer) e ao cDNA (GSP1 ). O resultado da amplificação deste PCR primário é utilizado como molde para um PCR secundário que utiliza primers mais internos em relação ao adaptador (GeneRacer 5' Nested primer) e ao cDNA (GSP2). O fragmento resultante deste PCR secundário foi clonado, sequenciado e analisado de acordo com as orientações do fabricante. EXEMPLO 5 - ANÁLISE FUNCIONAL DAS REGIÕES PROMOTORAS DOS GENES GhPGFSl E GhPGFS2

a) Clonagem e subclonagem do promotor dos genes GhPGFSl e GhPGFS2 em vetores bacterianos e de expressão em plantas

Dois promotores de promotor do gene GhPGFSl (300 e 760 pb) e três fragmentos do promotor do gene GhPGFS2 (351 , 858 e 1250pb) foram clonados através da amplificação por PCR a partir do DNA genômico extraído a partir de folhas de G. hirsutum. Os pares de iniciadores descritos na Tabela 3, foram utilizados para a amplificação das regiões promotoras dos genes GhPGFSl e GhPGFS2, respectivamente. As reações de PCR foram realizadas em um total de 50μί, contendo 1 μΙ_ de DNA (200 ng/μΐ.), MgCI 1 mM, 0,4mM de cada dNTP, 0,1 μΜ de cada iniciador, 10μί do tampão de PCR Pfu 10X concentrado, e 1 ,25 U da enzima Pfu DNA Polimerase (Fermentas).

Tabela 3. Pares de Iniciadores Utilizados para a reação de PCR para o isolamento da região promotora dos genes GhPGFSl e GhPGFS2 para clonagem no vetor de entrada pENTR-D-TOPO.

As reações de PCR foram purificadas utilizando-se do kit DNA

Clean & ConcentratorTM (Zymo Research), de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos dos promotores foram então primeiramente clonados no vetor de entrada pENTR-D-TOPO (Invitrogen), para posterior recombinação em vetores de expressão do sistema Gateway® (Invitrogen). As reações de ligação foram realizadas contendo 4μί da reação de PCR purificada, 1 μί de solução salina (1 ,2M NaCI, 0,06M MgCI2) diluída 1 :4, e 1 μί do vetor TOPO®, em um volume final de 6μί. Após 30 minutos à temperatura ambiente (22-23°C), 2μί da reação de ligação foi utilizado para transformar células de Escherichia coli TOP10 eletrocompetentes. As bactérias transformantes foram selecionadas em meio de cultura LB sólido (peptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCI 5g/L, ágar 15g/L, pH7,0) contendo o antibiótico canamicina na concentração final de 50 pg/mL. Em seguida, a confirmação dos clones positivos para pGhPGFSI e pGhPGFS2 foi realizada através de PCR a partir do plasmídeo isolado das colónias positivas, utilizando-se dos mesmos pares de iniciadores utilizados na reação de isolamento do fragmento do promotor.

A clonagem dos promotores dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 no vetor binário Gateway® pKGWFS7 (Karimi et al., 2002) foi realizada através de recombinação. Nesse vetor, o promotor dos genes foram clonados a frente da sequência codificante do gene gus, que codifica a enzima β-glucuronidase (GUS), através da recombinação entre as regiões attl_1/attR1 e attl_2/attR2 dos vetores de entrada e de destinação, pENTR-D-TOPO/pKGWFS7, respectivamente.

As reações de recombinação foram realizadas nas seguintes condições: 1 μΙ_ da enzima LR Clonase™ II (Invitrogen), 150ng do vetor de entrada pENTR-D-TOPO (contendo o promotor dos gene GhPGFS4 e GhPGFS8), 150ng do vetor de destinação pKGWFS7 e tampão TE (10mM Tris-HCI, 1 mM EDTA) em um volume final de 5μί. Essa mistura foi incubada por 1 hora a 25°C. Em seguida, 1 μί de uma solução de proteinase K 2Mg^L foi adicionado à cada reação anterior e uma nova incubação por 10 minutos a 37°C foi realizada. 2 iL de reação foram então utilizados para a transformação de células de E.coli TOP10 eletrocompetentes, e os clones positivos foram desta vez selecionados em meio LB sólido contendo o antibiótico espectinomicina na concentração final de 50μg/μL. Os clones positivos foram em seguida confirmados através de reações de PCR de colónia, utilizando os mesmos pares de iniciadores descritos anteriormente neste item. O DNA plasmidial destes clones foi extraído e purificado com o kit GeneJetTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) segundo instruções do fabricante, e 1 μί de DNA (1 μg/μL) foi utilizado para a transformação de células de Agrobaterium tumefaciens GV3101 eletrocompetentes. A seleção dos clones positivos foi realizada em meio LB sólido, contendo 100μg/mL dos antibióticos rifampicina e espectinomicina. Após a confirmação através de reações de PCR de colónia, um clone contendo cada um dos promotores dos genes de algodão foi selecionado para a transformação de plantas de A. thaliana.

b) Obtenção de plantas da espécie Arabidopsis thaliana expressando os promotores dos genes GhPGFSI e GhPGFS2

A obtenção de plantas expressando os promotores dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 foi realizada através do sistema de infiltração da inflorescência mediado por Agrobacterium tumefaciens (floral-dip) (DESFEUX et al., 2000). Para isso, uma colónia isolada de A. tumefasciens, contendo cada clone obtido nos item A desta seção, foi crescida por 48 horas a 28°C sob agitação de aproximadamente 200 rpm, em 2mL de meio LB líquido (peptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCI 5g/L, pH7,0), contendo 100 g/mL do antibiótico rifampicina e 100pg/mL do antibiótico espectinomicina. Essa cultura foi utilizada para inocular 200mL de meio LB líquido, contendo os mesmo antibióticos presentes na cultura anterior. Após 16 horas de crescimento a 28 °C sob agitação, a cultura foi centrifugada por 15minutos a 4000rpm. O sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas em 200mL de uma solução contendo 5% de sacarose e 0,01 % do surfactante Silwet L-77. As flores de plantas adultas da espécie A. thaliana ecotipo Erecta (LER) foram imersas nessa solução agitando-se levemente. Após 1 minuto, as plantas foram colocadas na posição horizontal em uma bandeja, e cobertas por um filme plástico com o objetivo de manter a umidade. No dia seguinte, o filme plástico foi retirado, e as plantas foram colocadas na posição vertical novamente. Cerca de 10 plantas foram transformadas para cada construção.

As sementes produzidas pelas plantas transformadas foram esterilizadas em uma solução de EtOH 70% e TWEEN 20 0,05% por 10 minutos, e semeadas em meio MS sólido (sais MS 4,6g/L, sacarose 20g/L, glicina 2mg/L; ácido nicotínico 5mg/L, piridoxina- HCI 0,5 mg/L, tiamina-HCI 0, 1 mg/L, ágar 8g/L, pH5,8) (Murashige & Skoog, 1962) contendo o o antibiótico canamicina na concentração final de 50 g/mL. As linhagens transgênicas resistentes foram transferidas para potes contendo o substrato comercial Plantmax® em uma proporção de 2: 1 :0,5 (substrato:vermiculita:perlita) e dessa forma cultivadas sob condições de luz (fotoperíodo de 18 horas de luz/6 horas de escuro) e temperatura (22°C, ± 2°C) controlada. Em seguida as sementes da geração TO de plantas contendo o promotor dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 no vetor pKGWFS7 foram submetidas novamente à seleção com canamicina, com o objetivo de identificar aquelas linhagens apresentando uma segregação de 3:1 entre plantas resistentes e sensíveis, indicando a presença de apenas uma inserção de T-DNA. 10-15 plantas resistentes da geração T1 de cada linhagem independente previamente selecionada foram transferidas para potes contendo substrato, e um novo teste de segregação foi realizado com as sementes produzidas por essas plantas, com o objetivo de identificar as linhagens T2 heterozigotas e homozigotas. As plantas T2 cultivadas em placas apresentando aproximadamente 100% de resistência ao herbicida ou antibiótico utilizado foram transferidas para potes contendo substrato, segundo as condições mencionadas anteriormente, e as sementes T3 produzidas foram então utilizadas para os testes de análise da atividade promotora dos genes isolados através de ensaio histoquímico da coloração GUS.

c) Transformação transiente através da Técnica de

Biobalística

A transformação transiente por biobalística (modificado de RECH et al, 2008) foi realizada no Laboratório de Interação Molecular Planta-Praga na Embrapa Cenargen - DF. A preparação do DNA para bombardeamento foi feita utilizando 50μΙ de tungsténio, 50μΙ de cloreto de cálcio 2,5M e 5μΙ das construções contendo os promotores a serem testados dos genes GhPGFSI e GhPGFS2 inseridos no vetor pKGWFS7 (^/μΙ). Após agitação foram adicionados 20μΙ de espermidina 2,5M, retornando a agitação em velocidade baixa por 10 minutos a fim de precipitar as partículas.

As amostras foram centrifugadas a velocidade máxima por 15 segundos, o sobrenadante foi descartado e uma séria de três lavagens com 150μΙ de etanol absoluto foi iniciada, seguida de agitação e nova centrifugação nas mesmas condições anteriores. Após as três lavagens foram adicionados 24μΙ de etanol absoluto. As amostras foram então submetidas a sonicação por 3 segundos, agitadas e 3,2μΙ foram depositados na membrana carreadora e dispostas em câmara de sílica por 15 minutos para secar.

Botões florais de G. hirsutum de 5-8mm foram seccionados longitudinalmente e dispostos de maneira circular num raio de cerca de 5cm a partir do centro da placa por duas horas em meio osmótico de bombardeamento: meio MS (Aldrich-Sigma Chemical Co. Ltd.), 9g de sacarose e 2,4g de Fitagel em pH5,7.

O bombardeamento foi feito no equipamento PDS-1000/He system (Bio-Rad) sob pressão de gás hélio 1200psi e vácuo de 25polHg. Cada construção foi bombardeada em duplicata. Após o bombardeamento o material biológico foi deixado por duas horas no meio osmótico para posterior ensaio histoquímico de coloração de GUS.

d) Ensaio histoquímico de Coloração GUS

O ensaio histoquímico para detecção de atividade GUS foi realizado em inflorescências, plântulas e em botões florias submetidos à técnica de bombardeamento segundo Jefferson (Jefferson et al., 1987). As inflorescências e plântulas foram inicialmente imersos em acetona 90% e deixadas a -20°C por 30 minutos para tirar clorofila e descolorir o material. Em seguida, o material foi lavado 2x com tampão fosfato 0, 1 M pH7.0. Após a lavagem, o material foi incubado em uma solução contendo 400μί de tampão fosfato 0,1 M pH7.2; 4μ!_ do substrato ácido 5- bromo-4-cloro-3-indolil- -D-glicuronídeo (X-Gluc) 200mM; 1 μΙ_ de K4Fe(CN)6 0,5 mM e 4μΙ_ de K3Fe(CN)6 0,05 mM para uma solução. O material foi deixado por 16h-24h em uma estufa a 37°C para o desenvolvimento da coloração. A atividade da enzima foi interrompida retirando a solução de reação e adicionando etanol 70%. O material foi deixado no etanol por no mínimo 72hs para clareamento. Após esse tempo, as inflorescências foram analisadas e fotografadas em lupa e microscópio ótico.

Os exemplos e realizações aqui apresentados possuem caráter meramente ilustrativo, não sendo, portanto, limitativos à invenção, restando evidente para os especialistas na matéria que outras concentrações poderão ser empregadas, sem fugir ao escopo da invenção.