Domaine de l'invention

La présente invention concerne des compositions et des méthodes pour la destruction de protéines prion infectieuses associées avec l'encéphalite spongiforme affectant les espèces animales, notamment bovines et ovines. Plus spécifiquement, l'invention concerne l'utilisation de bactéries pour la destruction de protéines prion infectieuses contenues dans les tissus animaux.

Art antérieur

Les protéines prion sont des protéines anormalement conformées qui sont associées à des maladies neuro-dégénératives infectieuses. Les maladies liées aux prions dans les espèces de mammifères non humaines incluent la scrapie chez le mouton, certaines encéphalopathies comme l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB), l'encéphalopathie spongiforme féline, l'encéphalopathie spongiforme simienne. La protéine prion pathogène catalyse la transformation de la protéine normale, physiologique en une forme amyloïde insoluble. Les protéines prion des mammifères comprennent un haut degré d'homologie (85 à 97%). Ces protéines sont donc capables, après introduction dans un autre organisme, de provoquer la transformation des protéines prions normales endogènes (Prusiner 1998). L'infection des bovins a ainsi été associée à la présence, dans la nourriture de ces derniers, de farines de viandes et d'os d'animaux, désignées ci-après sous le terme générique de « farines animales », provenant d'animaux contaminés par une protéine prion pathogène. L'existence de farines animales provenant d'animaux contaminés par l'ESB, du fait de l'accumulation de la forme amyloïde insoluble de la protéine prion, présente de nombreux problèmes d'ordres économique, technique et environnemental. En effet, la forme amyloïde insoluble de la protéine prion (PrPsc), qui est la forme infectieuse et pathogène de la protéine, est très stable. Cette protéine est riche en feuillets β, résistante à la chaleur et aux enzymes protéolytiques les plus actives, comme par exemple la protéinase K (Prusiner, 1998). Par conséquent, aujourd'hui dans beaucoup de pays, les produits d'origine animale qui pourraient servir de base comme supplément nutritionnel pour les animaux, tels que les farines animales, sont incinérés. Puis, les résidus de cendres sont détruits de manière à éviter une transmission de la protéine prion infectieuse à d'autres animaux. En Europe, l'utilisation des farines animales et de leurs sous- produits en tant que nourriture a été interdite. Aux Etats-Unis, plusieurs cas d'encéphalite spongiforme bovine ont été rapportés, et les industriels ont été contraints à des réglementations plus sévères de manière à prévenir le développement des maladies liées au prion. Une grande variété de tests pour déterminer la présence de protéines prion infectieuses dans les tissus animaux a été développée, incluant des tests de type Western blot, des tests d'immunodétection de type sandwich, des tests ELISA, des tests fluoroimmunologiques, des tests d'électrophorèse capillaire, et des tests de liaison aux plasminogènes. Cependant peu de méthodes applicables industriellement pour détruire la protéine prion infectieuse ont été développées. Les protéines prion infectieuses sont résistantes aux méthodes de destruction conventionnelles qui permettent de dénaturer les protéines, incluant par exemple l'autoclavage, la congélation, et l'exposition à des réactifs fortement délétères pour les bactéries, comme le formaldéhyde, l'acide carboxylique et le chloroforme. A titre illustratif, la protéine prion infectieuse résiste à des températures de l'ordre de 2000C. Actuellement seuls l'incinération ou encore le traitement avec des agents de blanchiment sont utilisés en pratique pour détruire l'isoforme pathogène de la protéine prion. Une autre méthode de destruction de la protéine prion est décrite dans la demande de brevet WO 02/083082. Cette méthode consiste à utiliser des enzymes, notamment des kératinases provenant d'une bactérie Bacilus licheniformis pour réduire la quantité de protéine prion infectieuse. Néanmoins, cette méthode comprend des inconvénients d'ordres technique et économique. En effet, la mise en œuvre de cette méthode implique des étapes nombreuses telles que la culture des bactéries, l'extraction des enzymes protéolytiques ou encore le stockage de ces dernières, opérations qui peuvent s'avérer onéreuses à un niveau industriel. Il existe donc dans l'état de la technique, un besoin pour de nouvelles compositions et de nouvelles méthodes pour détruire la protéine prion infectieuse qui sont applicables au traitement de matériaux biologiques, comme les tissus animaux, comprenant une protéine prion infectieuse. Ce besoin est d'autant plus important que plus de 180.000 cas d'ESB et 100 cas de maladie de Creutzfeldt-Jakob ont été rapportés en Europe depuis 1992, et les cas dans l'espèce humaine devraient augmenter de manière significative. L'expansion de ces maladies est difficile à contenir puisque de telles maladies ne bénéficient aujourd'hui d'aucun traitement thérapeutique. Notamment, la protéine prion pathogène n'est pas immunogène. Des efforts importants ont été réalisés pour étudier l'ESB, ainsi que le processus de contamination de la nourriture humaine par la protéine prion. Dans l'espèce humaine, les maladies neuro-dégénératives associées aux protéines prion incluent la maladie de Creutzfeldt- Jakob, le syndrome Gerstmann-Stràussler-Scheinker, l'insomnie fatale, le kuru, et les variants de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Ces pathologies humaines sont associées à la consommation d'une nourriture carnée (bœuf infecté par l'ESB, agent causal du nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob), à l'utilisation de l'hormone de croissance humaine contaminée par les prions infectieux (provoquant la maladie de Creutzfeldt-Jakob) et au cannibalisme rituel (qui entraîne la maladie de Kuru). La recherche de nouvelles compositions et de nouvelles méthodes pour détruire la protéine prion infectieuse est donc d'importance, tant dans le domaine agronomique que dans le domaine de la santé humaine. Avantageusement, ces nouvelles techniques devront de préférence être moins consommatrices d'énergie, techniquement plus simples, et plus économiques que les techniques connues. De plus, ces nouvelles techniques devraient ne pas entraîner la destruction totale de la matière à décontaminer comme cela peut- être le cas avec l'incinération.

Sommaire de l'invention

L'invention concerne un procédé de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière sous forme liquide, sous forme de particules ou sous forme de fibres, contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant : - une étape (a) consistant à mettre en contact et mélanger ladite matière contaminée avec au moins une bactérie, qui sécrète une ou plusieurs enzymes hydrolytiques, y compris protéolytiques, vis-à-vis de ladite protéine prion infectieuse et, - une étape (b) d'incubation de la ou des bactéries avec ladite matière contaminée pendant une période de temps suffisante à l'obtention d'un pourcentage de réduction désiré de la concentration en protéine prion infectieuse dans ladite matière contaminée. L'invention concerne également des procédés tels que définis ci-dessus, pour lesquels l'étape (a) est précédée d'une étape de chauffage de la matière contaminée à une température et pendant une période de temps suffisantes pour augmenter la sensibilité de la protéine prion infectieuse à la protéolyse. L'invention a également pour objet une composition nettoyante pour réduire la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant au moins une bactérie telle que définie dans le procédé ci-dessus.

Description des figures

Figure 1 Zymogrammes des surnageants provenant des bactéries thermophiles et S290 SDS-PAGE 10%, piste 1 : surnageants de souche AT1243 (incubation à 800C), piste 2 : surnageants de souche AT1222 (incubation à 800C). piste 3 : surnageants de souche S290.

Figure 2 Hydrolyse de la protéine prion recombinante par les surnageants de bactéries thermophiles. (a) Pistes 1 à-6: protéine prion native, protéine prion hydrolysée par les surnageants des souches S290 (600C), AT1243 (80°C), AT1222 (80°C), AT1243 (600C), et AT1222 (6O0C) pendant cinq heures, respectivement. (b) Pistes 1 à 6: protéine prion dénaturée thermiquement (PrPden), PrPden hydrolysée par les surnageants des souches S290 (600C), AT1243 (8O0C), AT1222 (80°C), AT1243 (6O0C), et AT1222 (6O0C) pendant cinq heures, respectivement. (c) Pistes 1 à 6: protéine prion native en présence de Cu2+ (PrPCu), PrPCu hydrolysée par les surnageants des souches S290 (600C), AT1243 (800C), AT1222 (800C), AT1243 (600C), et AT1222 (6O0C) pendant cinq heures, respectivement.

Figure 3 Hydrolyse de farines animales par les surnageants de bactéries thermophiles et par la protéinase K. (a)Les pistes 1 à 16 représentent respectivement : des farines de laine/poils (1 ), des farines de laine/poils hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 à 8O0C (2), AT1222 à 8O0C (3), et S290 à 6O0C (4) des farines de viande (5), des farines de viande hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (6) et AT1222 (7), et S290 (8) des farines de sang (9), des farines de sang hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (10) et AT1222 (11 ), et S290 (12) des farines mixtes (13), des farines mixtes hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (14) et AT1222 (15) et S290 (16). Les temps d'incubation sont de 20 heures. (b)Les pistes 1 à 8 représentent respectivement : des farines de laine/poils (1 ), des farines de laine/poils hydrolysées par la protéinase K (1 μM, 370C) (2), des farines de viande (3), des farines de viande hydrolysées par la protéinase K 4, des farines de sang (5), des farines de sang hydrolysées par la protéinase K (6), des farines mixtes (7), des farines mixtes hydrolysées par la protéinase K (8). Les temps d'incubation sont de 20 heures. Description détaillée de l'invention

Partant du constat que les procédés disponibles dans l'état de la technique pour détruire la protéine prion sont assez complexes et présentent des inconvénients d'ordre technique ou économique, les inventeurs se sont attaché à rechercher des bactéries capables de se multiplier sur les substrats à décontaminer et de produire simultanément in situ des enzymes protéolytiques efficaces contre le prion. En premier lieu, la résolution du problème de réduction du caractère pathogène des farines animales à l'aide de microorganismes a requis, de la part des inventeurs, l'étude préalable de l'activité de protéases sécrétées par de tels micro- organismes sur des substrats modèles. Les kératines se sont avéré être un bon substrat modèle car elles présentent de nombreuses similarités structurelles avec la protéine prion infectieuse ce qui confère à ces enzymes une grande résistance à la protéolyse. On peut citer notamment l'insolubilité des kératines due à la présence de nombreux ponts disulfure intra et inter moléculaires, le contenu important en feuillets β, dans le cas des β kératines, et leur degré important d'agrégation (Arai et al., 1996 ; Goddard et Michaelis, 1934). De telles protéines peuvent être détruites seulement par des protéases hautement actives, telles que les subtilisines sécrétées par les bactéries appartenant au genre Bacillus. (Atalo et Gashe, 1993 ; Cheng et al., 1995 ; Lin et al., 1992 , Williams et al., 1990 ; Kristie et al., 2000) ou par des protéases actives en conditions dénaturantes qui déstabilisent les substrats résistant à la protéolyse (Han et Damodaran, 1997). Les inventeurs ont donc utilisé comme substrat modèle la kératine insoluble, formant des structures fibrillaires similaires à la PrPsc. En second lieu, la résolution du problème de réduction du caractère pathogène des farines animales à l'aide de micro¬ organismes a nécessité de sélectionner des micro-organismes produisant des enzymes protéolytiques détruisant la protéine prion infectieuse qui soient capables de se multiplier sans apport nutritif exogène, sur la matière substrat à décontaminer. Pour atteindre cet objectif, les inventeurs ont criblé des collections de micro-organismes capables de croître sur la kératine ou sur des farines animales et sécrétant des protéases capables de dégrader la PrPsc contenue dans les farines animales. Les inventeurs ont découvert, selon l'invention, grâce à cette méthode de criblage, des bactéries capables de dégrader la protéine prion infectieuse PrPsc et de croître sur un milieu composé de farines animales. La présente invention est basée sur l'utilisation de bactéries thermophiles et de bactéries appartenant au genre Streptomyces pour la dégradation de la protéine prion infectieuse contenue dans les tissus ou encore les farines animales Un premier objet de la présente invention concerne un procédé de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière organique sous forme liquide, sous forme de particules ou sous forme de fibres, contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant : - une étape (a) consistant à mettre en contact et mélanger ladite matière contaminée avec au moins une bactérie qui sécrète une ou plusieurs enzymes hydrolytiques, y compris protéolytiques, vis-à-vis de ladite protéine prion infectieuse et, - une étape (b) d'incubation de la ou des bactéries avec ladite matière contaminée pendant une période de temps suffisante à l'obtention d'un pourcentage de réduction désiré de la concentration en protéine prion infectieuse dans ladite matière contaminée. L'efficacité du procédé de l'invention pour dégrader la protéine prion infectieuse était inattendue puisque l'exposition à des températures élevées et à des enzymes comme la protéinase K, connue pour dégrader les structures amyloïdes ne suffit pas à dégrader la protéine prion. Il est donc très surprenant que l'incubation de bactéries avec la protéine prion infectieuse parvienne à détruire cette dernière, à des températures compatibles avec la survie des bactéries. Par « enzyme hydrolytique », on entend une enzyme habituellement désignée par le terme « hydrolase », appartenant à la classe E. C.3 selon la classification internationale des enzymes. De préférence, l'enzyme hydrolytique est une enzyme protéolytique ou protéase, appartenant à la classe E. C.3.4 selon la classification internationale des enzymes. Par les termes « mise en contact » et « mélange », l'homme du métier comprendra que les bactéries sont par exemple déposées sur la matière contaminée ou susceptible d'être contaminée par la PrPsc, puis mélangées à la matière contaminée, de manière à augmenter la surface de contact entre les bactéries et la matière contaminée, Par le terme « incubation », on doit comprendre que les bactéries sont placées dans des conditions permettant leur survie, de préférence des conditions proches de celles qui leurs sont habituelles dans leur milieu naturel. En particulier, la température à laquelle sont soumises les bactéries pendant leur incubation avec la matière contaminée ne sera pas inférieure à 2O0C. Le terme « matière organique sous forme de particules » englobe les matières organiques sous forme de poudre et de farine. Le terme « matière organique contaminée » englobe les tissus animaux, les farines animales, leurs dérivés, et les sols. Le pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse non protéolysée désigne la valeur V, exprimée en %, obtenue à l'aide de la formule suivante :

V=[(X-Y)/X]*100

Dans laquelle : X est une valeur représentative de la quantité de protéine prion non protéolysée dans la matière contaminée avant traitement par le procédé selon l'invention et, Y est une valeur représentative de la quantité de protéine prion non protéolysée dans la matière contaminée après traitement par le procédé selon l'invention. De préférence, la valeur V est d'au moins 80%, avantageusement d'au moins 90%, de préférence d'au moins 95%, de manière tout à fait préférée d'au moins 98%, et idéalement de 100%. La valeur V du pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse non protéolysée peut être mesurée aisément par l'homme du métier, par des techniques en soi communes. A titre illustratif l'homme du métier utilise la technique d'électrophorèse comprenant avantageusement les étapes suivantes : (i) déposer un échantillon de matière organique traitée par le procédé de réduction décrit ci-dessus à l'extrémité d'un gel d'électrophorèse, (ii) faire migrer les protéines présentes dans le dépôt de matière organique sur le gel d'électrophorèse, (iii) après migration des protéines, déterminer la quantité Y de protéine prion infectieuse non protéolysée, et (iv) calculer la valeur V à l'aide de la valeur X de quantité de protéine prion infectieuse non protéolysée dans la matière organique avant traitement. La quantité de protéine prion infectieuse non protéolysée peut être déterminée par exemple en mettant en contact la surface du gel d'électrophorèse avec une solution contenant des anticorps marqués, spécifiques de cette protéine, puis en quantifiant l'intensité du marquage dans la région du gel d'électrophorèse dans laquelle migrent les protéines ayant une masse moléculaire identique ou proche de celle de la protéine prion infectieuse non hydrolysée. Des anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine prion infectieuse seront décrits ci-après plus en détails. La valeur X peut être déterminée en appliquant les étapes (i) à (iii) du procédé ci-dessus à un échantillon de matière organique avant traitement par le procédé selon l'invention. De manière à pouvoir calculer le pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse, à l'issue du procédé, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire (c) consistant à mesurer la concentration en protéine prion infectieuse dans la matière contaminée, à l'issue de l'étape (b). De manière avantageuse, l'étape (c) du procédé selon l'invention comprend la réalisation d'un test choisi dans le groupe comprenant : un Western Blot, un test immunologique de type « sandwich », un test fluoroimmunologique, une immunoélectrophorèse, un test de liaison au plasminogène. -• En particulier, l'homme du métier pourra réaliser une immunoélectrophorèse pour détecter la protéine prion infectieuse selon la méthode décrite dans le brevet US 6,514,707. L'homme du métier pourra également mettre en œuvre les méthodes décrites ci- dessus en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine prion infectieuse issus des hybridomes enregistrés sous les références ATCC HB-12403 et ATCC HB-12696 décrits respectivement dans les brevets US 6,165,784 et US 6,261 ,790. L'homme du métier pourra également mesurer la quantité de protéine prion infectieuse dans la matière biologique avant ou après traitement par le procédé selon l'invention grâce au kit de détection de la protéine prion décrit dans le brevet US 2003/009 2090. Avantageusement, le procédé de l'invention est mis en œuvre au sein d'un procédé général de recyclage des matières contaminées, dans lequel ces matières sont placées dans un réservoir, avant d'être traversées par un flux de vapeur d'eau sous pression. Dans un tel cas, l'étape (a) du procédé de mise en contact et de mélange de la matière contaminée avec une bactérie, se fait lorsque la matière contaminée est placée dans le réservoir, et l'étape (b) d'incubation est réalisée lors de la mise en place du flux de vapeur sous pression. Un tel mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet, grâce au recours à la vapeur d'eau, d'utiliser une plus grande variété de bactéries. De préférence, les bactéries utilisées pour mettre en œuvre le procédé de l'invention ont subi un criblage au cours duquel les bactéries sont sélectionnées en fonction de leur capacité à croître sur de la kératine, comme cela est illustré dans l'exemple 3. En outre, les bactéries peuvent être soumises à une deuxième étape de criblage au cours de laquelle lesdites bactéries sont sélectionnées pour leur capacité à dégrader des oligomères dérivés du prion. Ce double criblage permet de disposer de bactéries qui sont capables de croître sur un milieu constitué de farines animales, et qui sont aussi capables de dégrader la protéine prion, au sein de ces farines. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les bactéries utilisées pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, sont choisies parmi les bactéries thermophiles anaérobes, et les bactéries appartenant au genre Streptomyces. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite bactérie est une bactérie thermophile anaérobe choisie dans le groupe comprenant la souche AT1243 appartenant à l'espèce d'archaea Thermococcus, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3140, et la souche AT1222 appartenant à l'espèce Thermosipho, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3139. Alternativement, la bactérie choisie est une bactérie de souche S290 appartenant au genre Thermoanaerobacter, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM I- 3177. La disposition de plusieurs genres et espèces de bactéries permet d'appliquer le procédé de l'invention à des substrats de porosité, granulométrie, composition chimique variables. Par exemple, en fonction de la compacité de la matière contaminée à traiter et donc de l'importance des échanges gazeux au sein de la matière à traiter, une bactérie thermophile anaérobe ou une bactérie aérobe appartenant au genre Streptomyces sera choisie pour réaliser le procédé. L'homme du métier pourra également envisager de réaliser des mélanges entre bactéries de différentes espèces pour réaliser le procédé de l'invention. Néanmoins, le procédé selon l'invention ne se limite pas uniquement à l'utilisation des souches bactériennes décrites ci- dessus mais comprend aussi d'autres bactéries, possédant des caractéristiques enzymatiques similaires à celles décrites dans les exemples 1 et 2 et dans le tableau 1 pour les bactéries appartenant aux souches AT1243, AT1222 et S290. Pour comparer les caractéristiques enzymatiques de différentes bactéries, l'homme du métier aura recours à des techniques classiques comme des zymogrammes ou des tests de dégradation de peptides tel qu'illustré dans les exemples 1 et 2 et dans le tableau 1. Un premier intérêt de l'utilisation de bactéries vivantes directement sur la matière organique à traiter réside dans le fait que les bactéries (i) produisent les enzymes spécifiques de manière continue et (ii) se multiplient dans ladite matière organique, ce qui amplifie encore l'effet destructeur vis-à-vis de la protéine prion infectieuse. Un second intérêt est que les bactéries vivantes produisent simultanément une variété d'enzymes protéolytiques de spécificité de coupure des liaisons peptidiques variée, ce qui accroît encore l'efficacité de destruction de la protéine prion infectieuse. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 2O0C et 15O0C. Cette gamme de température permet de conci lier à la fois les exigences nécessaires à la survie des bactéries, à l'activité des enzymes protéolytiques synthétisées par celles-ci, et à la sensibilité de la protéine prion aux enzymes protéolytiques. La gamme de température décrite ci-dessus étant assez large, les inventeurs se sont attaché à rechercher des optima de température de mise en œuvre du procédé selon l'invention, qui font l'objet de modes de réalisation particuliers, décrits ci-après : Dans un mode de réalisation particulier de l'invention l'étape (a) est réalisée en utilisant la souche AT1243 ou AT1222 à une température de 8O0C. Alternativement l'étape (a) est réalisée en utilisant la souche S290 à une température de 600C. Par ailleurs, les tests réalisés par les inventeurs ont permis de mesurer la durée minimale de l'étape (b) compatible avec une disparition totale de la protéine prion. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'étape (b) d'incubation a une durée de 4 heures. Les modes de réalisation décrits ci-dessus s'appuient sur les exemples 3 et 4, montrant que des extraits enzymatiques des souches AT1243, AT1222 et S290 sont capable de croître sur des farines animales et de dégrader totalement la protéine prion native ou dénaturée après 4 à 5 heures d'incubation à une température de 6O0C pour la souche S290 ou 8O0C pour les souches AT1243 et AT1222. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'étape (a) est précédée d'une étape de chauffage de la matière contaminée à une température et pendant une période de temps suffisantes pour augmenter la sensibilité de la protéine prion infectieuse à la protéolyse. La réalisation d'une étape du procédé, préalable à l'étape (a) de mise en contact et de mélange des bactéries avec la matière contaminée permet d'augmenter la sensibilité de la protéine aux enzymes protéolytiques et par conséquent d'abaisser la température nécessaire au déroulement correct de l'étape (b). Cette alternative du procédé selon l'invention présente donc un avantage dans le cas où un chauffage prolongé de la matière contaminée lors de l'étape (b) n'est pas envisageable, pour des raisons d'ordre économique ou technique par exemple. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention ladite étape de chauffage de la matière contaminée est réalisée à une température de 8O0C et dans un mode de réalisation particulier du procédé décrit ci-dessus, l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 2O0C et 8O0C. Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé décrit ci-dessus, l'étape (a) est réalisée en utilisant une bactérie appartenant au genre Streptomyces, à une température de 2O0C, pendant 20 à 40 heures. Les modes de réalisation décrits ci-dessus sont particulièrement avantageux, car il est connu de l'homme du métier que l'utilisation de la protéinase K dans les mêmes conditions aurait conduit à une dégradation partielle de la protéine prion en larges fragments de 14 kDa, ce qui n'est pas le cas avec le procédé de l'invention. De manière à assurer une innocuité totale à la matière organique -traitée par le procédé de l'invention^ il est -possible de prévoir une étape supplémentaire consistant à chauffer la matière contaminée à une température, une pression et pendant une période de temps, suffisantes pour détruire les bactéries introduite au cours de l'étape (a). Par exemple cette température peut être de 12O0C, et cette pression peut être de 1 ,5 at. A l'issue de cette étape de chauffage, la matière contaminée est débarrassée de la protéine prion, et les bactéries introduites pour réaliser l'étape (a) du procédé sont détruites. Dans le cas où le procédé est appliqué à des farines animales celles-ci peuvent alors être réutilisées comme complément alimentaire ou engrais par exemple, ce qui constitue une alternative intéressante économiquement à l'incinération. Dans un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, des ions cuivre sont ajoutés au cours de l'étape (a). L'addition d'ions cuivre à la matière contaminée à traiter permet d'augmenter l'efficacité de la dégradation de la protéine prion par les bactéries décrites ci-dessus. Comme l'illustre l'exemple 4, l'addition d'ions cuivre aux souches AT1243 et AT1222 permet d'augmenter l'efficacité de la dégradation de la protéine prion. De préférence, la matière contaminée est choisie dans le groupe comprenant : les tissus animaux, les farines animales, et leurs dérivés Compositions nettoyantes

Un autre objet de l'invention concerne des compositions nettoyantes réduisant la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant au moins une bactérie telle que définie dans la description ci-dessus, en association avec un support approprié. Dans ce mode de réalisation, la composition nettoyante comprend les cellules de la ou des souche(s) de bactéries telles que définies ci-dessus, de préférence sous la forme de particules. La fabrication d'une composition nettoyante sous forme de particules peut se faire par exemple par lyophilisation des bactéries qui seront associées à un support. Le support dans lequel sont incorporées les bactéries peut être de diverses natures. Par exemple, ledit support peut être constitué exclusivement ou constitué essentiellement, d'amidon, y compris l'amidon de riz ou de maïs qui a été mélangé avec les cellules bactériennes avant sa transformation en particules, par exemple en granulés. Le support dans lequel sont incorporées les cellules bactériennes peut également être constitué exclusivement ou constitué essentiellement de β-cyclodextrine, la β-cyclodextrine étant alors mélangée avec les cellules bactériennes préalablement à une étape de séchage, puis de fabrication de particules, en particulier de granulés. Par exemple, pour la fabrication d'une composition nettoyante selon l'invention, l'homme du métier peut mélanger la β- cyclodextrine avec une quantité appropriée de cellules bactériennes aérobes Streptomyces, de telle manière à obtenir une composition comprenant de 103 à 108 unités formant des colonies (cfu) de ladite ou desdites bactérie(s) par gramme de la composition finale contenant la β-cyclodextrine, puis soumettre la composition ainsi obtenue à une étape de séchage, avant la fabrication de particules, en particulier de granulés, selon des méthodes conventionnelles. Préférentiellement, le support peut être composé de carbonate de calcium, le cas échéant en combinaison avec du lactose. Le support utilisé pour la fabrication d'une composition selon l'invention peut également être exclusivement constitué ou essentiellement constitué de lactose, le cas échéant en combinaison avec du silico-aluminate de sodium, combinaison à laquelle on ajoute le milieu de culture de la souche ou du mélange de souches de bactéries d'intérêt, qui a été préalablement soumis à une étape de séchage. Selon un autre aspect, pour fabriquer une composition prophylactique alimentaire selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser des supports commerciaux, tels que le verre poreux, le Porolon®, les fibres de carbone, l'alginate ou la chitine. Dans un- mode de réalisation - préféré,, la composition nettoyante selon l'invention peut comprendre des ions cuivre. Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs pensent que l'addition d'ions cuivre à une concentration de 1 mM à la composition de l'invention permet d'augmenter l'efficacité de la composition vis-à-vis de la dégradation de la protéine prion.

Matériel et méthodes

Les composés suivants, à savoir les sels, les milieux, la chaîne B d'insuline bovine, la gélatine bovine, le MOPS et tous les autres composés chimiques ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Company Saint-Louis MO. Les préparations purifiées de prion ovin recombinant ont été obtenues comme décrits par Rezaei et al, 2000. La kératine de poulet a été obtenue auprès de Yu. Zuev, Kazan Centre of Science, Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia. Les poils de porc ont été obtenus auprès de la société SIFDDA, Plouvara, France.

Souches bactériennes, milieux et conditions de croissance Les souches bactériennes thermophiles anaérobes ont été isolées de souches collectées au site Rainbow (36°, 14' Nord, 33°, 54' Ouest, 2300 mètres de profondeur). Les souches AT1243 et AT1222 ont été isolées d'un puits de chaleur. La souche AT1222 a été enrichie à 6O0C en milieu SP (30 g/l de sel marin 2 g/l de poils de porc). La souche AT1243 a été enrichie à 800C dans un milieu SPS (SP + 5 g/l de sulfure). Les sous-cultures réalisées pour les dosages de protéases ont été effectuées dans les mêmes conditions. Des amplifications par PCR et un séquençage indiquent que la souche AT1222 appartient à l'espèce Thermosipho sp. (bactérie thermophile) et que la souche AT1243 est une bactérie archaïque qui appartient à l'espèce thermophile Thermococcus genus. La souche S290 a été isolée du point chaud de caldera Uzon, Kamchatka > et a été identifiée comme appartenant -au genre. Thermoanaerobacter par des réactions avec des oligonucléotides spécifiques à savoir des oligonucléotides dirigés contre des ARNr- 16S. Les souches S290 ont été cultivées à 6O0C pendant 5 jours sur un milieu minéral Th (0,33 g/l de KH2PO4, 0,33 g/l de NH4CI1 0,33 g/l de MgCI2, 0,33 g/l de CaCI2, 0,33 g/l de KCI, 0,5 g/l de NaHCO3, et 0,5 g/l de Na2S), supplémenté avec 2 g/l de laine de porc ou par des plumes. Lorsque les différentes espèces et souches de bactéries sont cultivées sur des farines animales, la kératine de tous les milieux a été remplacée par 2 g/l de farines de viande, d'os, de sang ou de farines comprenant un mélange de ces trois composants.

Dosage des protéases

Après culture, les bactéries et les éléments insolubles du milieu de culture ont été précipités par centrifugation durant 15 minutes à 7000 rpm. Les activités protéolytique et peptidasique ont été mesurées dans les surnageants résultants. La présence de protéases dans les surnageants a été déterminée par des zymogrammes. Cette méthode permet de déterminer la présence d'enzymes protéolytiques à faible concentration et consiste à identifier des protéases après séparation de tous les composants protéiques du milieu par électrophorèse. Les protéases ont été séparées par SDS-PAGE comprenant des substrats à base de gélatine hydrolysée. Les produits de faible masse moléculaire issus de l'hydrolyse de la gélatine diffusent du gel et, après coloration, la présence des protéases a été identifiée par la présence de bandes blanches au sein d'un gel coloré. Le gel de polyacrylamide a été polymérisé en présence de 0,01 % de gélatine bovine. 20 μl de tampon de lyse ont été ajoutés à 40 μl de surnageant et des gels de SDS-PAGE à 10, 12 ou 15% ont été réalisés (Laemmli, 1970). Après électrophorèse, les gels ont été rincés avec une solution de Triton X-100 à 2,5% pour éliminer le SDS, et ont été incubés dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2, NaCI ' 1-00 mM, -CaCI2 2 mM à différentes températures pendant 3...à .10. heures. Les protéines sur les gels ont été colorées avec du nitrate d'argent (Nesterenko et al. 1994). L'activité des protéases provenant des surnageants des bactéries cultivées dans la kératine hydrolysée, dans les farines animales ou avec le prion recombinant a été déterminée par électrophorèse. 50 μl de surnageants ont été ajoutés à 50 μl de kératine de plumes à 1 mg/ml, ou 2 mg/ml de kératine de poils de porc, ou 2 mg/ml de farines animales ou encore 1 mg/ml de prion recombinant dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 et furent incubés à différentes températures pendant 20 à 40 heures. L'hydrolyse du substrat par la protéinase K [0,02 mg/ml (0,6 μM)] a été réalisée à 370C. Le tampon de lyse a été ajouté aux fractions aliquotes provenant des différentes réactions protéolytiques. Les fractions aliquotes ont été portées à ébullition durant 10 minutes et ensuite un gel SDS-PAGE à 15% a été réalisé. Les protéines sur les gels ont été colorées au bleu de Coomassie Brilliant R-450.

Spécificité des protéases

L'activité peptidasique envers les acides aminés ou les peptides N-substitués par des p-nitroanilides a été déterminée en utilisant un spectrophotomètre. 900 μl de substrat à 0,1 mM ont été ajoutés à 100 μl de surnageants dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 DMSO 10%. Le mélange réactionnel est incubé à différentes températures durant 3 et 20 heures, après lesquelles l'absorption à 410 nm a été mesurée (8410 p-nitroanilides = 8800 M"1 cm"1). La spécificité des protéases provenant des surnageants des bactéries a été déterminée en mesurant la fragmentation de la chaîne B oxydée de l'insuline bovine. 100 μl de surnageant ont été incubés avec 100 μl de chaîne B d'insuline à 2 mg/ml dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 à différentes températures pendant 10 heures. Les produits de l'hydrolyse ont été séparés par HPLC en phase inversée sur une colonne de Nucléosil 300-5 Ci8 avec un gradient de 0 à 60% de CH3CN, TFA 0,1 %. Les fractions collectées - ont été soumises à des analyses d'acides aminés selon Bidlingmeyer et al. (1984). Le contenu en acides aminés provenant des peptides séparés a été calculé en comparant les chromatogrammes obtenus avec des chromatogrammes standards provenant de dérivés PITC. La séquence en acides aminés des peptides a été établie grâce à la connaissance de la structure primaire de la chaîne B de l'insuline.

Résultats

Exempte 1 : Zvmoαrammes des protéases provenant des micro- organismes d'intérêt

Dans le but de caractériser les protéases sécrétées par les cultures de bactéries d'intérêt, des zymogrammes ont été réalisés sur les surnageants provenant de telles cultures. La caractéristique principale des protéases des bactéries d'intérêt est la stabilité de leur structure à la dénaturation. En effet, comme le montre la figure 1 , pistes 1 et 2, les protéases soumises à une électrophorèse conservent leur activité protéolytique. Les zymogrammes réalisés à partir des surnageants de la souche AT1243 montrent que cette souche possède un ensemble de protéases possédant une masse moléculaire apparente de l'ordre de 45 à 100 kDa. Les zymogrammes réalisés à partir des surnageants des souches AT1222 montrent une seule bande d'activité protéolytique, correspondant à une masse moléculaire approximative de 100 kDa. Enfin, les zymogrammes réalisés à partir des surnageants de la souche S290 montrent des bandes d'activité protéolytique, correspondant à des masses moléculaires approximatives de 66, 100, 200 kDa et plus (figure 1 , piste 3).

Exemple 2 : Spécificité des protéases

La capacité des protéases sécrétées par les bactéries thermophiles AT1243, AT1222 et S290 à hydrolyser les substrats-de faible masse moléculaire c'est-à-dire les p-nitroanilides de N-benzoylarginine, les dérivés N-succinyl de phénylalanine, le peptide Ala-Ala-Pro-Phe et le peptide Ala-Ala-Pro-Lys a été étudiée. Après trois heures d'incubation, l'activité des surnageants des souches S290 envers le peptide Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA a été observée (tableau 1 ). L'hydrolyse de la chaîne B de l'insuline oxydée, un substrat standard permettant de tester l'activité des enzymes protéolytiques a été étudiée. La chaîne B de l'insuline est composée d'un grand nombre d'acides aminés hydrophobes, et inclut également un nombre important de résidus branchés chargés. La structure primaire de la chaîne B de l'insuline est la suivante:

Phe1-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys*-Gly-Ser9-His-Leu-Val-Glu-Al a- Leu15-Tyr16-Leu-Val-Cys*-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe25-Tyr-Thr-P ro- Lys-Ala.

(* signifie que le résidu cystéyle est oxydé).

Les inventeurs ont montré en utilisant l'HPLC que les produits de l'hydrolyse de la chaîne B de l'insuline s'accumulent dans les milieux réactionnels après trois heures d'incubation avec les surnageants de la souche AT1243. L'analyse des acides aminés provenant des peptides hydrolyses permet de proposer que les protéases de la souche AT1243 clivent les liaisons peptidiques suivantes: Ser9-His10, Tyr16-Leu17 et Phe25-Tyr26. Un site de clivage additionnel (Leu15-Tyr16) a été observé dans le cas de la souche AT1222. Les protéases de la souche S290 hydrolysent la chaîne B de l'insuline au niveau des liaisons peptidiques Leu15-Tyr16 et Tyr16- Leu17. Donc, la majorité des protéases produites par les microorganismes thermophiles étudiés possède une spécificité de type chymotrypsine. Certaines des bactéries montrent également une capacité inattendue à hydrolyser les liaisons peptidiques après un résidu séryle. De manière surprenante, les protéases sécrétées par les microorganismes thermophiles n'attaquent pas les autres sites hydrophobes situés dans la molécule de la chaîne B de l'insuline. L'analyse du micro-environnement autour des liaisons clivables (les résidus dans les positions P2, P3, P1 ') ne révèle pas de régularité stricte dans l'activité des protéases envers ces sites. Néanmoins, il peut être observé qu'un résidu hydrophobe est fréquemment situé dans la position P2' de la liaison clivable, et qu'un résidu flexible de glycine ou d'alanine est en position P2 ou en position P3. Les protéases des souches sélectionnées pour l'hydrolyse des kératines reconnaissent donc des motifs structuraux particuliers dans la molécule substrat. La protéine prion contient beaucoup de résidus hydrophobes : Tyr (10), Phe (3), Trp (8), et Ile (4) et de nombreux résidus Ser (8). Par conséquent les protéases sont capables de dégrader le prion jusqu'à l'obtention de peptides relativement courts. De plus, l'accès aux sites de clivage va être augmenté pendant le chauffage à la température optimale d'hydrolyse par les protéases, parce que dans de telles conditions, la structure de la protéine sera partiellement ou complètement dénaturée.

Exemple 3 : Croissance des microorαanismes étudiés sur les milieux contenant de la kératine ou des farines animales. La capacité des bactéries thermophiles, souches S290, souches AT1243 et AT1222 à croître sur des milieux contenant de la kératine de poils de porc ou de plumes a été testée. Les bactéries sélectionnées sont capables d'utiliser des kératines α provenant de poils de porc ou β provenant de plumes, comme principale source de nutriment. La croissance sur kératine de laine a été la plus importante dans le cas des souches S290 et AT1222, la souche AT1243 fournissant des caractéristiques de croissance inférieures sur ce milieu. Le temps de culture de la plupart des bactéries fut de trois jours. Les souches de bactéries étudiées ont également prouvé qu'elles- étaient capables de croître sur les farines animales.— De plus, ces bactéries croissent sur les farines animales de manière plus rapide que sur la kératine. La croissance la plus faible a été obtenue lorsque le substrat utilisé était le sang, probablement à cause de la toxicité de certains composants présents.

Exemple 4 : Activité des protéases produites par les bactéries thermophiles envers la protéine prion recombinante.

Il a été démontré que la protéine prion recombinante ovine se dénature à 800C et forme des structures amyloïdes. Cette protéine a donc été utilisée comme modèle de structure amyloïde cellulaire. La capacité des protéases provenant des bactéries thermophiles de l'invention à hydrolyser le prion ovin natif ou dénaturé thermiquement a été étudiée. Les figures 2a et 2b montrent que les protéases produites par la souche S290 hydrolysent le prion natif et complètement dénaturé à 6O0C en 4 heures. Les protéases produites par les souches AT1243 et AT1222 hydrolysent la protéine prion native ou dénaturée thermiquement à 8O0C, ce qui correspond à leur température de croissance optimale. Cependant à 600C, la protéine prion n'est pas hydrolysée complètement par ces souches. Dans ce cas, comme on l'observe avec la protéinase K, un fragment hydrolytique large d'une masse moléculaire d'environ 14 kDa s'accumule. Comme cela a été déjà démontré, la résistance de ce fragment à la protéolyse est causée par sa capacité à s'agréger. La formation de ces agrégats est dépendante de la concentration et de l'activité des protéases. Si la concentration et l'activité des protéases sont plus faibles qu'une valeur critique, les produits de cette protéolyse limitée s'agrègent et deviennent totalement résistants à une hydrolyse future. A 8O0C, les agrégats sont déstabilisés et/ou dénaturés et l'activité des protéases augmente considérablement, donc l'accumulation du fragment de 14 kDa n'apparaît pas. Les inventeurs ont observé que l'introduction d'ions cuivre peut faciliter la transformation des molécules de prion dans leur forme amyloïde. Utilisant ce modèle de structure -amyloïde^ il a été montré que les protéases des- souches S290 (à 6O0C), AT1243 et AT1222 (à 8O0C) hydrolysent complètement la protéine prion en 4 heures (figure 2c). Durant l'étude de l'activité protéolytique des protéases des souches AT1243 et AT1222 à 8O0C, l'accumulation de larges fragments hydrolytiques de prion n'a pas été observée dans le cas de l'hydrolyse du prion natif et dénaturé contrairement à l'activité de ces souches à 600C (figure 2c). Donc les structures amyloïdes sont déstabilisées à 8O0C facilitant leur destruction par les protéases des thermophiles.

Exemple 5 : Activité protéolvtiαue des surnageants de culture bactérienne.

Après 24 heures d'incubation avec des farines de laine/poils, de viande, de sang et de mélange avec les surnageants des souches AT1243, AT1222, et S290 une dissolution partielle du substrat a été observée. La figure 3a montre que les protéases des souches AT1243 et AT1222 hydrolysent efficacement les farines de viande, les farines de laine/poils, les farines de sang et les farines mixtes Les enzymes des souches S290 montrent une activité plus faible mais satisfaisante. Cela pourrait résulter des faibles températures d'incubation à savoir 800C dans le cas des souches AT1243 et AT1222 et 6O0C dans le cas de la souche S290. Par comparaison, les données obtenues pour l'activité de la protéinase K envers les protéines des farines sont également montrées sur la figure 3b. La protéinase K hydrolyse efficacement les farines de laine/poils et avec une plus faible efficacité, les farines de viande et les farines mixtes. La protéinase K est pratiquement inactive envers les farines de sang.

Tableau 1 Activité des protéases (pourcentage d'hydrolyse de substrat) des surnageants des bactéries thermophiles envers des substrats chromogènes de faible masse moléculaire. Les conditions de réactions sont données dans la partie matériel et méthode. Les substrats ont- été incubés pendant trois heures à 8O0C (AT1243-et AT1222) et à 6O0C (S290). Les souches sont représentées dans la colonne de gauche, les substrats sont représentés sur la première ligne.

Bzl-Arg-pNA Suc-Phe-pNA Suc-Ala-Ala- Suc-Ala-Ala- Pro-Phe-pNA Pro-Lys-pNA AT1243 0,8 0,6 0 0 Al 1222 1 ,0 0,6 1 ,3 0 S290 0, 1 0,4 30 0,3 Références

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