Les techniques d'électrophorèse de zone en gel d'agarose permettent la séparation des constituants protéiques contenus dans des échantillons notamment biologiques, tels que sérum, sang, urine, liquide céphalo-rachidien etc... Dans un milieu gélifié et contenant une solution tampon, les protéines déposées à la surface du gel s'ionisent et vont migrer, sous 1'effet d'un champ électrique, à des vitesses différentes en fonction de leur charge respective. La finesse des bandes obtenues après électrophorèse correspondant aux constituants séparés de l'échantillon et donc le pouvoir de résolution de la technique dépend principalement de la finesse du dépôt de l'échantillon.

Afin d'améliorer la finesse du dépôt, différents types d'applicateurs d'échantillons peuvent tre utilisés. Ces applicateurs, souvent appelés peignes de dépôt, peuvent se présenter sous différentes formes. Ils sont notamment illustrés par les dispositifs suivants : Les peignes à « gorge » dont les dents portent une gorge, dont les bords sont parallèles au plan d'application, qui permet de récupérer par capillarité une goutte d'échantillon biologique. Le peigne est ensuite appliqué sur le gel d'électrophorèse sous 1'effet de son propre poids. Les dents sont alors en contact avec la surface du gel et l'échantillon transfère de la dent vers le gel. Ces peignes peuvent tre réalisés dans une matière métallique ou plastique.

Les peignes à « lamelles », dont le principe est identique aux peignes à gorge, mais dont les dents comportent à leur extrémité, deux lamelles parallèles et disposées dans un plan perpendiculaire au plan d'application. L'échantillon est prélevé par capillarité dans l'espace délimité par les deux lamelles et déposé sur le gel de la mme façon que dans le cas du peigne à gorge. Ces peignes peuvent, comme les précédents, tre réalisés dans un matière métallique ou plastique.

Les peignes à membrane dont les dents sont constituées de membrane microporeuse. Ces peignes sont décrits dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516. Les dents sont imprégnées de l'échantillon jusqu'à saturation de la membrane microporeuse. Les dents du peigne sont ensuite mises en contact avec la surface du gel de la mme manière que dans les deux cas

précédents. Dans ce cas, I'échantillon est déposé par diffusion des protéines de la membrane microporeuse vers le gel.

Ces différents types d'applicateurs permettent tous d'obtenir, avec une plus ou moins grande efficacité, des dépôts fins.

Pour réaliser une électrophorèse, et en particulier dans l'optique d'effectuer une immunofixation, I'échantillon est habituellement dilué. Les dilutions les plus généralement utilisées sont de 1/3 à 1/10. Généralement, la dilution est réalisée dans de l'eau physiologique afin de maintenir les protéines solubilisées. Après application de I'échantillon dilué sur le gel au moyen d'un applicateur tel que ceux décrits précédemment pendant une durée moyenne de 30 secondes à 120 secondes, de préférence de 60 secondes à 120 secondes en fonction de I'applicateur et de la dilution de l'échantillon, on constate que le gel présente, à l'endroit du contact avec la dent, une marque en creux qui ne disparaît pas au cours de la migration. Ce creux se traduit, après l'étape de coloration, par l'absence de coloration ou par la diminution de l'intensité de coloration décrite précédemment.

Compte tenu de leur poids (de quelques grammes à une dizaine de grammes en fonction du mode de réalisation), I'application de ces peignes à la surface du gel entraîne, à l'endroit où les dents sont en contact avec le gel, une compression du gel qui conduit à une déformation sous la forme d'une marque en creux à la surface. En absence de précaution, cette déformation subsiste pendant la migration et devient visible après la coloration du gel qui est effectuée pour la révélation du profil électrophorétique. C'est cette déformation qui se traduit par une zone moins ou non colorée qui peut gner considérablement l'interprétation de l'électrophérogramme.

L'invention a pour but de fournir un moyen d'éliminer cette marque de dépôt, quel que soit le type d'applicateur utilisé.

Les inventeurs ont observé que la marque de dépôt produite sur le support d'électrophorèse, et en particulier sur le gel peut tre éliminée ou à tout le moins neutralisée de façon qu'elle n'affecte pas l'interprétation des résultats obtenus à

I'issue de l'électrophorèse, en hydratant le support d'électrophorèse au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon comprimée par l'application de I'applicateur d'échantillon. Cette hydratation doit tre réalisée dans des conditions permettant aux constituants et en particulier aux protéines contenues dans t'échantillon testé, de pénétrer dans cette zone du support d'électrophorèse pour y subir la migration électrophorétique.

Ainsi, la zone du support d'électrophorèse comprimée par I'applicateur utilisé pour déposer l'échantillon, doit tre réhydratée de façon suffisamment rapide et efficace, pour que les constituants de l'échantillon puissent pénétrer dans le support de l'électrophorèse et subir la migration dans le champ électrique appliqué.

Ainsi lorsque l'électrophorèse est réalisée sur une durée déterminée, I'hydratation doit se produire dans un intervalle de durée correspondant à 10 à 20% du temps de l'électrophorèse (ce dernier correspondant à la durée d'application de la tension aux bornes du support d'électrophorèse), à partir de la mise sous tension du support d'électrophorèse. Avantageusement, la réhydratation peut se produire plus rapidement, c'est à dire dans un temps inférieur à 10% du temps de i'électrophorèse, à partir de la mise sous tension.

Les inventeurs ont identifié certains composés qui, lorsqu'ils sont introduits dans le diluant de l'échantillon et sont donc déposés en mme temps que l'échantillon sur le support d'électrophorèse, sont capables de faire disparaître la marque claire laissée par la compression du support d'électrophorèse. Ces composés ont pour effet de supprimer ou au moins d'atténuer cette marque claire dès les premiers instants de la migration électrophorétique, alors que cette marque persiste durant toute la migration en l'absence desdits composés.

Les inventeurs ont observé que ces composés provoquent un regonflement du support d'électrophorèse à l'endroit marqué par le dépôt de l'échantillon, résultant d'une réhydratation rapide de la zone comprimée.

L'invention a donc pour objet une composition utilisable dans un procédé de séparation des constituants d'un échantillon, par électrophorèse sur un support

d'électrophorèse, comprenant un ou plusieurs composés ioniques permettant lors de I'application d'un champ électrique au niveau d'un support d'électrophorèse présentant des charges de surface négatives, une hydratation de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer, lorsque cette zone porte une marque de compression résultant du dépôt de l'échantillon. Cette compression résulte de la pression exercée par I'applicateur, sur le support.

La présence de charges de surface négatives au niveau du support d'électrophorèse, traduit une électro-endosmose (ou capacité d'écoulement électro-osmotique) non nulle.

La compression du support d'électrophorèse résultant du dépôt de l'échantillon au moyen de I'applicateur peut tre observée à l'oeil nu et correspond à une marque en creux dans ledit support. Une telle marque peut par exemple tre décrite comme ayant le forme d'un V, généralement d'une profondeur inférieure à 100 u et ayant une largeur d'environ 1 mm entre les deux parties hautes du V pour un support d'électrophorèse constitué par un gel à 0,8%, lorsque la pression de I'applicateur est supérieure à 0,1 g/mm2.

Les composés ioniques utilisés pour l'élaboration de la composition de l'invention peuvent selon le cas se déplacer ou au contraire rester essentiellement immobiles au cours de la migration électrophorétique.

L'absence de déplacement dans le champ électrique est attribuable soit à la nature du composé soit à sa concentration dans la composition, voire à une combinaison de ces éléments.

Pour un support d'électrophorèse donné, notamment dont l'indice d'électro- endosmose (indice-mr, indice de mobilité relative) est déterminé, la concentration de composés ioniques présents dans la composition est déterminée en fonction de la nature de ces composés, et en particulier de leur capacité ou non à migrer dans le support d'électrophorèse après l'application du champ électrique. Cette concentration doit tre choisie de façon à permettre l'hydratation, dès les premiers instants de la migration électrophorétique, de la zone de dépôt de l'échantillon au niveau du support d'électrophorèse.

L'effet d'hydratation, ou de réhydratation, du support d'électrophorèse recherché qui dépend, comme indiqué plus haut, de la nature des composés ioniques utilisés, peut tre également influencé par la composition du support d'électrophorèse et en particulier de son indice d'électro-endosmose.

A cet égard, lorsque le support d'électrophorèse est un gel d'agarose, pour permettre un apport d'eau suffisant pendant la migration, en particulier au niveau de la zone de compression du gel, on aura recours à des gels d'agarose présentant une capacité d'écoulement électro-osmotique non nulle, par exemple correspondant à un indice de mobilité relative,-mr supérieur ou égal à 0,07.

Les composés ioniques utilisés dans le cadre de l'invention sont mis en solution pour former la composition ci-dessus définie. Ils sont utilisés à une concentration déterminée inférieure à leur limite de solubilité.

Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la composition comprend un ou plusieurs composés ioniques choisis parmi ceux qui ne subissent pas de déplacement sensible dans un champ électrique.

Ainsi, ces composés permettent la réhydratation de la zone du support d'électrophorèse comprimé, mais ne migrent pas avec les constituants de l'échantillon lors de l'électrophorèse.

L'invention concerne de façon avantageuse une composition comprenant un ou plusieurs composés ioniques choisis parmi les composés zwittérioniques.

A titre d'exemple pour la réalisation de l'invention, on citera les composés zwittérioniques de type acides aminés ou encore les tampons zwittérioniques.

Par exemple, on aura recours pour la réalisation de la composition sur l'invention à des acides aminés répondant à la formule NH2-R-COOH dans laquelle R comporte une chaîne latérale polaire non chargée.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les acides aminés choisis peuvent tre des acides aminés répondant à la formule NH2-R-COOH, dans laquelle R comporte une chaîne latérale basique.

Les acides aminés répondant à l'une ou l'autre des définitions précédentes peuvent tre utilisés seuls ou le cas échéant, en mélange, éventuellement en

mélange avec d'autres composés, ioniques ou non ioniques, utilisables pour obtenir la réhydratation du support d'électrophorèse, lorsque ce support peut subir une électro-endosmose.

A titre d'exemple d'acide aminé propre à la préparation de la composition de l'invention, on citera : la glycine (de préférence à une concentration compatible avec sa solubilité dans l'eau à 25°C et à cet égard, une concentration comprise entre 1 M et 3,33 M est utilisable), la phénylalanine à une concentration de 0,28 M.

D'autres exemples sont les acides aminés choisis parmi la L-lysine avantageusement à une concentration supérieure ou égale à 1 M, la L-arginine de préférence à une concentration comprise entre 0,45 M et 0,86 M, la L-histidine de préférence à une concentration de 0,27 M.

Parmi les tampons zwittérioniques utilisables dans le cadre de l'invention, à concentration supérieure à 0,3 M et dans la limite de leur solubilité, on citera à titre d'exemple les tampons biologiques suivants ou leur sel : TRICINE (N-tris (Hydroxymethyl) methyl-glycine) HEPES (N- (2Hydroxyethyl) piprazine-N'- (2-ethanesulfonic acide)) PIPES (Piperazine-N-N'-bis (2-ethanesulfonic acide) MOPS (3- (N-Morpholino) propanesulfonic acide) TAPS (N-tris (Hydroxymethyl) methyl-3aminopropanesulfonic acide) AMPSO (3- ( (1, 1-Dimethyl-2-hydroxyethyl) amino)-2-hydroxy-propanesulfonic acide) TES (N-tris (Hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acide) BES (N, N'-bis (2-Hydroxyethyl)-2aminoethanesulfonic acide) BICINE (5N, N-bis (2-Hydroxyethyl) Glycine) CHES (2- (N-Cyclohexylamino) ethanesulfonic acide) DIPSO (3- (N, N-bis (2-Hydroxyethyl) amino)-2-hydroxy-propanesulfonic acide) EPPS (N- (2-Hydroxyethyl) piperazine-N'- (3-propanesulfonic acide)) MOPSO (3- (N-Morpholino) propanesulfonic acide) POPSO (Piperazine-N, N'-bis (2'hydroxypropanesulfonic acide)) MES (2-Morpholino-éthane sulfonique acide).

Alternativement, les inventeurs ont observé que l'effet recherché de réhydratation du support d'électrophorèse dès les premiers instants de la migration de I'échantillon peut tre obtenu avec des composés ioniques qui sont susceptibles de subir une migration électrophorétique, dès lors que ces composés sont présents en une concentration suffisante pour que malgré leur migration, I'hydratation du support d'électrophorèse soit permise au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon. De tels composés sont par exemple des sels utilisés à forte concentration et en particulier à une concentration déterminée selon les techniques habituelles, prenant en compte la mobilité de fanion. Plus l'anion a une mobilité lente, plus la concentration efficace de sel peut tre faible.

A titre d'exemple, ces sels peuvent tre choisis parmi NaCI, KCI ou NaHCO3 à une concentration supérieure ou égale à 1 M ou un sel d'acide borique à une concentration supérieure ou égale à 0,15 M ou un sel d'acide phosphorique, ou d'acide acétique à une concentration supérieure ou égale à 0,5 M.

L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une composition répondant à l'une des définitions précédemment données, ou à plusieurs de ces définitions prises en combinaison, pour l'hydratation d'un support d'électrophorèse, au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer par électrophorèse.

Cette utilisation peut tre faite sous la forme d'une dilution de l'échantillon à séparer par électrophorèse au moyen de la composition selon I'invention.

L'invention a également pour objet un kit destiné à la mise en oeuvre d'un procédé de séparation par électrophorèse, des constituants d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : -une composition définie ci-dessus, -un support d'électrophorèse constitué par un gel présentant un écoulement électro-osmotique non nul.

Un kit ainsi défini peut également comprendre tout autre réactif ou dispositif habituellement présent dans les kits d'électrophorèse, tels que les tampons de migration, et les révélateurs utilisés pour identifier les constituants séparés par électrophorèse à partir de l'échantillon.

Un support d'électrophorèse utilisable pour la réalisation de l'invention est de façon générale, un gel et en particulier un gel présentant un écoulement électro-osmatique non nul.

A titre d'exemple, on citera les gels d'agarose et en particulier les gels d'agarose HOT ou HEEOO, de la société FMC-BIOWHITTAKER ou les agaroses LEO ou SHES) de la société HISPANAGAR ou leurs mélanges.

Ces gels d'agarose ont la propriété de présenter une électro-endosmose non nulle. Les gels d'agarose utilisés pour préparer les supports d'électrophorèse selon l'invention ont une concentration de 0,8 à 1% en agarose, et peuvent contenir des agaroses en mélange.

L'invention concerne égaiement un procédé de séparation par électrophorèse des constituants d'un échantillon comprenant : -le dépôt sur le support d'électrophorèse, au moyen d'un applicateur, d'un échantillon dont on cherche à séparer les constituants, -le dépôt simultanément à celui de l'échantillon, d'une composition ci-dessus définie, sur un support d'électrophorèse, -I'application d'un champ électrique pour permettre la migration des constituants de l'échantillon, -la révélation des constituants séparés par électrophorèse.

La révélation peut tre effectuée au moyen de colorants et lorsqu'il s'agit d'immunofixation, au moyen d'antisérums et de colorants.

Le procédé précédemment défini peut tre mis en oeuvre selon les méthodes habituelles de l'électrophorèse et peut notamment comporter, pour la révélation des constituants séparés par l'électrophorèse, une procédure d'immunofixation.

En particulier, le procédé selon l'invention mettant en oeuvre la composition définie précédemment peut tre efficacement utilisé pour détecter la présence de paraprotéines dans un échantillon biologique.

Ce procédé peut tre mis en oeuvre de façon avantageuse dans le cadre d'une séparation par électrophorèse de zone.

Dans le cadre de la réalisation du procédé de l'invention, le dépôt simultané de l'échantillon et de la composition de l'invention permet la réhydration du gel dans les tout premiers instants de la migration électrophorétique.

Pour réaliser un dépôt simultané, on peut le cas échéant associer, préalablement à leur dépôt sur le support d'électrophorèse, I'échantillon et la composition de l'invention, notamment en diluant l'échantillon dans la composition.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent.

Exemple de réalisation n° 1 : Typage des paraprotéines sériques diluées dans une solution de tricine (0,45 M), sur un gel d'Immunofixation.

Dans un tube à essai, on a dissout 0,32 g de tricine dans 4 ml d'eau. Le diluant ainsi constitué est prt à l'emploi. L'échantillon sérique à typer a été dilué dans le diluant au tiers pour la piste correspondant au profil électrophorétique, ainsi que pour les pistes IgA, IgM, IgK et IgX (par exemple, 30 ut de sérum et 60 ut de diluant) et au sixième pour la piste de révélation des IgG (par exemple, 20 ut de sérum et 100 ut de diluant).

Dans un autre tube à essai, on a introduit 4 ml d'eau physiologique qui a permis de diluer le mme échantillon de façon identique au cas précédent.

10 ut d'échantillon dilué ont été chargés dans chaque puits de I'applicateur à membrane décrit dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516.

L'applicateur ainsi chargé a ensuite été appliqué à la surface du gel IF pendant 1 minute.

La séparation de ces échantillons appliqués sur le gel IF a été obtenue par électrophorèse pendant 10 minutes environ et à une puissance de 20 W, sur un instrument permettant de réguler la température à 20°C.

Après migration, le typage des paraprotéines a été réalisé en incubant chaque piste de migration avec un antisérum spécifique (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti Igk) et la piste correspondant au profil électrophorétique avec une

solution de fixation des protéines. L'excès de réactif a été éliminé, le gel a été séché et coloré au Violet acide.

Sur le gel, on a observé que les échantillons dilués dans la tricine ne présentaient pas de marque à l'endroit du dépôt tandis que ceux dilués dans !'eau physiologique présentaient une forte empreinte de I'applicateur.

Exemple de réalisation n° 2 : Typage des paraprotéines sériques diluées dans une solution de I'Arginine (0,86 M), sur un gel d'immunofixation.

Dans un tube à essai, on a dissout 0,6 g de L Arginine dans 4 ml d'eau. Le diluant ainsi constitué est prt à l'emploi. L'échantillon sérique à typer a été dilué dans le diluant au tiers pour la piste correspondant au profil électrophorétique, ainsi que pour les pistes IgA, IgM, IgK et lgk (par exemple, 30 ut de sérum et 60 pi de diluant) et au sixième pour la piste de révélation des igG (par exemple, 20 ul de sérum et 100 ul de diluant).

Dans un autre tube à essai, on a introduit 4 ml d'eau physiologique qui a permis de diluer le mme échantillon de façon identique au cas précédent.

10 ul d'échantillon dilué ont été chargés dans chaque puits de l'applicateur à membrane décrit dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516.

L'applicateur ainsi chargé a ensuite été appliqué à la surface du gel IF pendant 1 minute.

La séparation de ces échantillons appliqués sur le gel IF a été obtenue par électrophorèse pendant 10 minutes environ et à une puissance de 20 W, sur un instrument permettant de réguler la température à 20°C.

Après migration, le typage des paraprotéines a été réalisé en incubant chaque piste de migration avec un antisérum spécifique (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti IgR) et la piste correspondant au profil électrophorétique avec une solution de fixation des protéines. L'excès de réactif a été éliminé, le gel a été séché et coloré au Violet acide.

Sur le gel, on a observé que les échantillons dilués dans la solution d'arginine ne présentaient pas de marque à l'endroit du dépôt tandis que ceux dilués dans !'eau physiologique présentaient une forte empreinte de I'applicateur.

Exemple de réalisation n° 3 : Typage des paraprotéines sériques diluées dans une solution de Chlorure de sodium (1,2 M), sur un gel d'immunofixation.

Dans un tube à essai, on a dissout 0,29 g de Nacl dans 4 ml d'eau. Le diluant ainsi constitué est prt à l'emploi. L'échantillon sérique à typer a été dilué dans le diluant au tiers pour la piste correspondant au profil électrophorétique, ainsi que pour les pistes IgA, IgM, IgK et ! gaz (par exemple, 30 u ! de sérum et 60 NI de diluant) et au sixième pour la piste de révélation des IgG (par exemple, 20 pi de sérum et 100 pi de diluant).

Dans un autre tube à essai, on a introduit 4 ml d'eau physiologique qui a permis de diluer le mme échantillon de façon identique au cas précédent.

10 ul d'échantillon dilué ont été chargés dans chaque puits de I'applicateur à membrane décrit dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516.

L'applicateur ainsi chargé a ensuite été appliqué à la surface du gel IF pendant 1 minute.

La séparation de ces échantillons appliqués sur le gel IF a été obtenue par électrophorèse pendant 10 minutes environ et à une puissance de 20 W, sur un instrument permettant de réguler la température à 20 °C.

Après migration, le typage des paraprotéines a été réalisé en incubant chaque piste de migration avec un antisérum spécifique (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti IgR) et la piste correspondant au profil électrophorétique avec une solution de fixation des protéines. L'excès de réactif a été éliminé, le gel a été séché et coloré au Violet acide.

Sur le gel, on a observé que les échantillons dilués dans la solution de NaCI concentrée ne présentaient pas de marque à l'endroit du dépôt tandis que ceux dilués dans 1'eau physiologique présentaient une forte empreinte de I'applicateur.