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权利要求书 1、 一种用于活化 AMPK的化合物, 其特征在于, 其为腺嘌呤及 /或其 医药学上可接受的盐。 2、 如权利要求 1的化合物,其特征在于,其治疗可被 AMPK活化剂改 善的疾病或生理状况, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予 需此治疗的哺乳动物。 3、 如权利要求 1的化合物, 其特征在于, 其降低细胞中发炎性细胞激 素的分泌及环氧化酶 -2 的表现, 因此治疗发炎性生理状况或疾病, 其中所 述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。 4、 如权利要求 1的化合物, 其特征在于, 其增加细胞葡萄糖的摄取, 因此预防或治疗选自由以下组成的群的生理状况或疾病: 前期糖尿病、 第 二型糖尿病、 代谢症候群, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。 5、 如权利要求 1的化合物, 其特征在于, 其减少哺乳动物的血浆三酸 甘油酯及减少体重, 因此预防或治疗肥胖情况, 其中所述腺嘌呤及 /或其医 药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。 6、 如权利要求 1的化合物, 其特征在于, 其抑制细胞中类淀粉 胜肽 的累积, 因此预防或治疗阿兹海默症, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可 接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。 7、 如权利要求 1的化合物, 其特征在于, 其加强细胞自体吞噬活性, 因此治疗可被自体吞噬作用改善的疾病或生理状况, 其中所述腺嘌呤及 /或 其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。 8、 如权利要求 1的化合物, 其特征在于, 其抑制纤维母细胞生长, 因 此于伤口愈合过程抑制疤痕形成, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受 的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。 99、、 如如权权利利要要求求 11的的化化合合物物,, 其其特特征征在在于于,, 其其加加强强伤伤口口愈愈合合,, 其其中中所所述述 腺腺嘌嘌呤呤及及 //或或其其医医药药学学上上可可接接受受的的盐盐,, 给给予予需需此此治治疗疗的的哺哺乳乳动动物物。。 1100、、 如如权权利利要要求求 11 的的化化合合物物,, 其其特特征征在在于于,, 其其抑抑制制细细胞胞活活性性氧氧族族的的生生 成成,, 因因此此于于哺哺乳乳动动物物中中保保护护及及治治疗疗受受活活性性氧氧族族伤伤害害的的细细胞胞,, 其其中中所所述述腺腺嘌嘌 呤呤及及 //或或其其医医药药学学上上可可接接受受的的盐盐,, 给给予予需需此此治治疗疗的的哺哺乳乳动动物物。。 1111、、 如如权权利利要要求求 11 的的化化合合物物,, 其其特特征征在在于于,, 其其抑抑制制癌癌细细胞胞生生长长,, 因因此此 预预防防或或治治疗疗癌癌症症,, 其其中中所所述述腺腺嘌嘌呤呤及及 //或或其其医医药药学学上上可可接接受受的的盐盐,, 给给予予需需此此 治治疗疗的的哺哺乳乳动动物物。。 1122、、 权权利利要要求求 11所所述述化化合合物物作作为为制制备备治治疗疗可可被被 AAMMPPKK活活化化剂剂改改善善的的疾疾 病病或或生生理理状状况况的的药药物物的的应应用用。。 1133、、 权权利利要要求求 11 所所述述化化合合物物作作为为制制备备治治疗疗发发炎炎性性生生理理状状况况或或疾疾病病的的药药 物物的的应应用用。。 1144、、 权权利利要要求求 11 所所述述化化合合物物作作为为制制备备预预防防或或治治疗疗前前期期糖糖尿尿病病、、 第第二二型型 糖糖尿尿病病、、 代代谢谢症症候候群群的的一一种种或或其其组组合合的的生生理理状状况况或或疾疾病病的的药药物物的的应应用用。。 1155、、 权权利利要要求求 11 所所述述化化合合物物作作为为制制备备预预防防或或治治疗疗前前期期糖糖尿尿病病、、 第第二二型型 糖糖尿尿病病、、 代代谢谢症症候候群群的的一一种种或或其其组组合合的的生生理理状状况况或或疾疾病病的的药药物物的的应应用用。。 1166、、 权权利利要要求求 11 所所述述化化合合物物作作为为制制备备预预防防或或治治疗疗阿阿兹兹海海默默症症的的药药物物的的 应应用用。。 1177、、 权权利利要要求求 11 所所述述化化合合物物作作为为制制备备治治疗疗可可被被自自体体吞吞噬噬作作用用改改善善的的疾疾 病病或或生生理理状状况况的的药药物物的的应应用用。。 1188、、 权权利利要要求求 11 所所述述化化合合物物作作为为制制备备伤伤口口愈愈合合过过程程抑抑制制疤疤痕痕形形成成的的药药 物物的的应应用用。。 1199、、 权权利利要要求求 11所所述述化化合合物物作作为为制制备备加加强强伤伤口口愈愈合合的的药药物物的的应应用用。。 2200、、 权权利利要要求求 11 所所述述化化合合物物作作为为制制备备哺哺乳乳动动物物中中保保护护及及治治疗疗受受活活性性氧氧 2211、、 权权利利要要求求 11所所述述化化合合物物作作为为制制备备预预防防或或治治疗疗癌癌症症药药物物的的应应用用。。 |
技术领域 本发明关于腺嘌呤, 此化合物适用于活化 AMPK (AMP-活化蛋白激 酶), 并使用该化合物于预防或治疗生理状况或疾病 。 背景技术
AMPK明确为细胞能量的感应器及能量需求的 应者。 AMPK为异三 元体由催化性 α次单元体、 调节性 β 、 γ次单元体组成, 所有次单元体在 真核生物具高度保留性。 AMPK 活化是借由其上游激酶如 LKB1、 钙离子 / 携钙素依赖的蛋白质磷酸激酶 (Ca 2+ /Calmodulin dependent kinase)及 TAK1 磷酸化 α次单元体具保留性的第 172 苏胺酸残基, 由生理或病理压力造成 高 ΑΜΡ/ΑΤΡ 比例亦活化 AMPK:。 AMPK活化后会促进分解代谢路径进行 并抑制合成代谢, 借由减少 ATP消耗及促进 ATP生成进而恢复细胞能量平 衡。
作为一能量代谢平衡调节者, AMPK被认为对代谢症候群, 包括第二 型糖尿病、 心血管疾病、 脂肪肝等为一具潜力的药物标的。 许多代谢症候 群都与胰岛素抵抗有关。 胰岛素抵抗是为一病理状态, 在此状况细胞无法 对胰岛素进行回应, 因此血液中过多的葡萄糖无法移除至骨胳肌或 脂肪组 织。 在肌肉细胞中, AMPK 活化以非胰岛素依赖性方式, 通过转录调控增 加葡萄糖运输蛋白 (GLUT4)表现量, 并诱导 GLUT4转移至细胞膜上导致 细胞摄取葡萄糖速率增加。 AMPK活化亦分别借由抑制乙酰辅酶 A羧化酶 (acetyl-CoA carboxylase) 及羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶 (HMG-CoA reductase) 抑制脂肪酸及胆固醇合成。 此外 AMPK活化导致数个转录因子 的抑制, 包括 SREBP-lc, ChREBP and HNF-4a,并下降调节脂肪酸合成及糖 质新生作用相关酵素的蛋白质表现。 上述提及的研究发现, 均支持 AMPK 是为代谢症候群尤其糖尿病的治疗标的。
除了能量代谢平衡调节外, AMPK亦参与数个细胞机制的调节, 包括 发炎反应、 细胞生长、 细胞雕亡、 自体吞噬、 老化及分化。 许多研究显示 AMPK为发炎反应抑制者。 AMPK 活化通过抑制细胞核转录因子 (NF- κ Β) 的讯息传递抑制发炎反应。 细胞核转录因子的讯息传递为活化先天免疫及 后天免疫主要路径, 当 AMPK活化后会通过刺激 SIRT1、 Forkhead box O (FoxO) 或 eroxisome proliferator-activated receptor co-activator 1 a (PGC1 a ) 抑制细胞核转录因子的转录活性以达到抑制发 炎反应的效果。此外数个 研究室亦证明 AMPK活化抑制环氧化酶 - 2 (cyclooxygenase-2 , COX-2) 的蛋 白质表现。 环氧化酶 -2 是为一诱导性酵素, 可被发炎性细胞激素及生长因 子调控, 其功能为将花生四烯酸转化成前列腺素因而导 致发炎反应及疼痛, 因此抑制环氧化酶的活性或表现已被证实具抗 发炎作用。
数个 AMPK活化剂已于生物体内实验被证实具抗发炎 能。 举例而 言, 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) 于小鼠模式已 被证实可缓解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸 酯钠所引起的急性及复发性 结肠炎, AICAR 治疗显著降低疾病小鼠的体重减少并减缓发炎 反应。 此外 AICAR 对于人类多发性硬化症动物模式 (EAE)有明显的治疗效果, 亦降低 以脂多醣诱导小鼠肺损伤的严重程度。
细胞讯息传递路径失调可能会导致细胞异常生 长, 最终导致癌症。 哺 乳动物雷帕霉素标靶蛋白 (mTOR) 是为一丝胺酸 /苏胺酸激酶,其调控细胞 生长及自体吞噬作用。 哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白讯息传递路径的活 性失 调在许多不同癌症被发现, 因此哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白抑制剂被认为 是癌症治疗的潜力药物。 大量研究证实 AMPK磷酸化 tuberous sclerosis complex 2 (TSC2)及 Raptor达到抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白路径 。各 种 AMPK活化剂包括 AICAR、 metformin, phenformin 已被证实抑制哺乳 动物雷帕霉素标靶蛋白讯息路径, 并抑制癌细胞生长。 此外 AMPK活化通 过抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白复合体 -1 诱导自体吞噬作用。 由于 AMPK抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白复合体 -1 , Ulkl上第 757丝胺酸磷 酸化减少 , 其后第 317及 777丝胺酸被 AMPK磷酸化, Ulkl被 AMPK磷 酸化后随的启动自体吞噬作用。
综上所述, AMPK被认为对许多人类疾病或病理状况, 包括发炎性疾 病、 伤口愈合、 神经退化、 癌症、 氧化压力及心血管疾病为一很好的治疗 标的。 事实上, AMPK活化剂已被应用于至少 24类疾病的临床试验,包括: 细菌及真菌疾病、 行为及心理失调、 血液及淋巴疾病、 癌症、 肿瘤、 消化 系统疾病、 耳鼻喉疾病、 眼疾、 腺体及贺尔蒙相关疾病、 心血管疾病、 免 疫系统疾病、 嘴巴及牙齿疾病、 肌肉、 骨胳、 软骨疾病、 神经系统疾病、 营养及代谢性疾病、 呼吸道疾病、 皮肤及结締组织疾病、 伤口愈合等。 发明内容 本发明提供了一种新颖 AMPK 活化剂-腺嘌呤及使用该化合物于预防 或治疗疾病。
本发明提供一种用于活化 AMPK的化合物,其为腺嘌呤及 /或其医药学 上可接受的盐。
上述化合物治疗可被 AMPK活化剂改善的疾病或生理状况,其中所述 腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。
上述化合物, 其可降低细胞中发炎性细胞激素的分泌及环氧 化酶 -2 的 表现, 因此治疗发炎性生理状况或疾病, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上 可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。
上述化合物, 其增加细胞葡萄糖的摄取, 因此预防或治疗选自由以下 组成的群的生理状况或疾病: 前期糖尿病、 第二型糖尿病、 代谢症候群, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。
上述化合物, 其减少哺乳动物的血浆三酸甘油酯及减少体重 , 因此预 防或治疗肥胖情况, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需 此治疗的哺乳动物。
上述化合物, 其抑制细胞中类淀粉 胜肽的累积, 因此预防或治疗阿 兹海默症, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的 哺乳动物。
上述化合物, 其加强细胞自体吞噬活性, 因此治疗可被自体吞噬作用 改善的疾病或生理状况, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给 予需此治疗的哺乳动物。
上述化合物, 其抑制纤维母细胞生长, 因此于伤口愈合过程抑制疤痕 形成, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳 上化合物, 其加强伤口愈合, 其中所述腺嘌呤及 /或其医药学上可接受 的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。
上述化合物, 其抑制细胞活性氧族的生成, 因此于哺乳动物中保护及 治疗受活性氧族伤害的细胞,其中所述腺嘌呤 及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。
上述化合物, 其抑制癌细胞生长, 因此预防或治疗癌症, 其中所述腺 嘌呤及 /或其医药学上可接受的盐, 给予需此治疗的哺乳动物。
本发明提供上述化合物作为制备治疗可被 AMPK活化剂改善的疾病或 生理状况的药物的应用。
本发明提供上述化合物作为制备治疗发炎性生 理状况或疾病的药物的 应用。
本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗前 期糖尿病、 第二型糖尿 病、 代谢症候群的一种或其组合的生理状况或疾病 的药物的应用。
本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗前 期糖尿病、 第二型糖尿 病、 代谢症候群的一种或其组合的生理状况或疾病 的药物的应用。
本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗阿 兹海默症的药物的应 用。
本发明提供上述化合物作为制备治疗可被自体 吞噬作用改善的疾病或 生理状况的药物的应用。
本发明提供上述化合物作为制备伤口愈合过程 抑制疤痕形成的药物的 应用。
本发明提供上述化合物作为制备加强伤口愈合 的药物的应用。
本发明提供上述化合物作为制备哺乳动物中保 护及治疗受活性氧族伤 害的细胞的药物的应用。
本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗癌 症药物的应用。
综上, 根据本发明的实施例, 提供一新颖 AMPK活化剂-腺嘌呤, 可于 细胞内活化 AMPK , 因此可于哺乳动物预防或治疗可被 AMPK改善的生理 状况或疾病。
根据本发明的实施例, 提供一通过活化 AMPK降低血糖的方法, 从而 预防或治疗疾病包括:代谢症候群、 前期糖尿病、 第二型糖尿病、 胰岛素抵 抗, 其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺 嘌呤及 /或医药学上可接 根据本发明的实施例, 提供一通过活化 AMPK抗发炎的方法, 从而预 防或治疗发炎性状况或疾病, 其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的 腺嘌呤及 /或医药学上可接受的盐。
根据本发明的实施例, 提供一通过活化 AMPK抑制纤维母细胞生长 的方法, 从而于伤口愈合期间预防疤痕组织生成。
根据本发明的实施例, 提供一加强伤口愈合的方法, 其中给予需要此 治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及 /或医药学上可接受的盐。
根据本发明的实施例, 提供一抑制反应性氧族 (ROS) 生成的方法, 从 而保护或治疗哺乳动物的细胞远离反应性氧族 伤害, 其中给予需要此治疗 的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及 /或医药学上可接受的盐。
根据本发明的实施例, 提供一抑制癌细胞生长的方法, 从而预防或 治疗癌症, 其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺 嘌呤及 /或医药学 上可接受的盐。
本发明是关于腺嘌呤, 此化合物适用于活化 AMPK, 并使用腺嘌呤于 预防或治疗生理状况或疾病, 包括: 前期糖尿病、 胰岛素抵抗、 第二型糖 尿病、 代谢症候群、 肥胖、 发炎、 伤口愈合、 阿兹海默症、 癌症、 氧化压 力及心血管疾病。
本发明发现, 腺嘌呤为一新颖的 AMPK活化剂, 并具有各种生物性功 能。 近年来, AMPK 活化已被证实有助于疾病的预防及治疗, 如前期糖尿 病、 胰岛素抵抗、 第二型糖尿病、 代谢症候群、 肥胖、 发炎、 伤口愈合、 阿兹海默症、 癌症、 氧化压力、 心血管疾病以及促进伤口愈合。 本发明认 为, 此效果可归因于 AMPK活化所导致但不限于降低环氧化酶 -2表现量、 抑制应性氧族(ROS ) 的生产及葡萄糖摄取活性的增加。
预期适应症 基于本发明的研究成果 (见实施例), 腺嘌呤可通过活化 AMPK作为使 用于各种生理状况或疾病的治疗剂。 以下提供预期适应症的示例性引导及 证据。
腺嘌呤于高血糖、 前期糖尿病、 胰岛素抵抗、 第二型糖尿病的治疗 最近已有报告指出 AMPK活化剂包括 metformin, A769662, AICAR于糖 尿病或肥胖小鼠模式降低血浆葡萄糖浓度。 于本发明中, 1 μΜ〜600 μΜ 的 腺嘌呤显著增加肌肉细胞 C2C12的葡萄糖摄取(表 2)。 更进一步以高脂肪 饲料喂养小鼠作为第二型糖尿病动物模型评估 腺嘌呤对血浆葡萄糖浓度调 节效果。 与控制组的高脂肪饲料喂养小鼠比较, 给予腺嘌呤显著减少高脂 肪饲料喂养小鼠的血浆葡萄糖 30%以上,并减少血浆三酸甘油酯 35%以上, 15%以上的体重减少 (实施例 3)。 这里使用的术语「高血糖」是指一生理状 况, 其特征为血糖高于 126亳克 /分升。 这里使用的术语 「前期糖尿病」是 指一生理状况,其特征为空腹血糖高于 100亳克 /分升但低于 140亳克 /分升。 这里使用的术语 「胰岛素抵抗」是指一生理状况, 其中全身或组织包括肝 脏、 骨胳肌、 脂肪组织无法对胰岛素反应。 这里使用的术语 「第二型糖尿 病」亦指非胰岛素依赖型糖尿病或成人发病型 糖尿病。 是指代谢失调引起 的胰岛素生产不足或胰岛素抵抗, 其特征通常为空腹血糖高于 140亳克 /分 升。 根据此实施例, 腺嘌呤被证实加速葡萄糖摄取, 因此可作为与高血糖 有关的生理状况或疾病的有效治疗方式。
腺嘌呤于发炎性疾病的治疗
各种 AMPK 活化剂已被证实于生物体内具抗发炎功能。 举例而言, 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) 于小鼠模式已被证 实可缓解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯钠 所引起的急性及复发性结肠 炎, AICAR 治疗显著降低疾病小鼠的体重减少并减缓发炎 反应。 此外 AICAR 对于人类多发性硬化症动物模式 (EAE)有明显的治疗效果, 亦降低 以脂多醣诱导小鼠肺损伤的严重程度。 于本发明中, 腺嘌呤于体外试验中 抑制脂多醣诱导的发炎反应: 于脂多醣刺激下, 经腺嘌呤处理的巨噬细胞 的发炎性细胞激素分泌量,包括肿瘤坏死因子 a (TNF- a )、介白素 -1 β ( -1 β ) 及介白素 -6 (IL-6), 与控制组相比有显著性减少。 腺嘌呤亦减少人类巨 噬细胞因脂多醣诱导表现的环氧化酶 -2表现量 (实施例 4)。 于三硝基苯磺 酸诱导的发炎性肠病 (IBD)小鼠模式中, 给予腺嘌呤治疗组别的结肠发炎性 细胞激素,包括肿瘤坏死因子 (TNF)、 干扰素 Y (INF Y )及介白素 (IL- 17)均较 控制组小鼠显著减少, 且挽救体重损失 (实施例 5)。
这里使用的术语 「发炎性细胞激素」是指促进系统性发炎反应 的细胞 激素。 这里使用的术语 「发炎性疾病」是指与发炎相关的疾病, 包括但不 限制于僵直性脊推炎、 关节炎 (骨关节炎、 风湿性关节炎、 干癣性关节炎)、 气喘、 动脉粥样硬化、 克隆氏症、 结肠炎、 皮肤炎、 大肠憩室炎、 纤维肌 痛症、 肝炎、 激躁性结肠症、 系统性红斑性狼疮、 肾炎、 阿兹海默症、 帕 金森式症、 溃疡性大肠炎等。 近年来, 许多报告已证实 AMPK是环氧化酶 -2上游调控者, 可抑制环氧化酶 -2的蛋白质表现。 与先前研究相符, 发明 人发现一新颖 AMPK活化剂, 腺嘌呤, 可有效抑制环氧化酶 -2的蛋白质表 现, 由此可知腺嘌呤可抑制环氧化酶 -2 介导的发炎。 根据本发明, 腺嘌呤 被发现可抑制发炎, 因此可作为发炎相关的生理状况或疾病的治疗 。
腺嘌呤于伤口愈合及疤痕形成
AMPK被认为可促进细胞能动性并加强伤口愈合 一 AMPK活化剂, 白藜芦醇, 已被证实可加强手术伤口的愈合。 除了伤口愈合外, 在愈合过 程中减少疤痕的形成一直为现代医学的首选目 标。 新生儿伤口愈合不同于 成人的伤口愈合, 不会伴随疤痕的形成, 此间差异在于环氧化酶 -2的活化。 于成人的伤口愈合过程, 环氧化酶 -2活性会经由 TGF-beta被提升, 因而导 致伤口处前列腺素生产的增加。 前列腺素已被证实可促进纤维母细胞增生 及胶原蛋白的形成, 此两种因素可导致疤痕形成。 因此, 抑制环氧化酶 -2 的活性被认为可有效预防疤痕形成。 于本发明中, 腺嘌呤抑制纤维母细胞 生长 (实施例 8) 并降低环氧化酶 -2的蛋白质表现。 于动物模式中, 于伤口 处直接施用腺嘌呤不仅可加强伤口愈合并可减 少疤痕生成 (实施例 9)。 依据 上述资料, 局部施用腺嘌呤可有效加强伤口愈合并防止疤 痕形成。
神经退化
许多细胞机制的缺陷已被证实与神经退化性疾 病有关, 包括发炎、 细 胞内运输、 自体吞噬等。 自体吞噬的功能在于移除细胞内失去功能的胞 器 或蛋白质团块, 并且对细胞内平衡扮演重要角色。 许多神经退化性疾病的 发病机制涉及细胞内或细胞外蛋白质团块的沉 积, 而移除这些蛋白质团块 已显示可改善此类疾病的进展。 此外, 自体吞噬途径受损或移除负责自体 吞噬的蛋白质已被证实导致神经退化。 AMPK 活化已证实可促进自体吞噬 路径。 因此, 通过活化 AMPK以促进自体吞噬路径可作为预防或控制神 退化性疾病的有效策略。 AMPK 活化剂已被证实可经由自体吞噬路径减少 类淀粉沉积。每日给予 AMPK活化剂-白藜芦醇可增加阿兹海默症小鼠的 命。 另一 AMPK 活化剂-姜黄素亦被证实可作为阿兹海默症治 的潜在药 物。 于本发明中, 发明人发现腺嘌呤于神经细胞 Neuro-2A中显著加强自体 吞噬活性并降低 A累积, 此外腺嘌呤改善阿兹海默症疾病小鼠的认知功 能 (实施例 6、 7)。 根据上述发现, 腺嘌呤可作为神经退化性疾病的治疗使用。
这里使用的术语「神经退化」是指神经元结构 或功能逐渐丧失的情况。 神经退化性疾病是为神经退化的结果, 包括但不限制于阿兹海默症、 帕金 森氏症、 汉丁顿舞蹈症、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症、 脊髓小脑萎缩症、 脊 髓性肌肉萎缩症等。
反应性氧族相关疾病
生物组织中, 反应性氧族包括超氧化物自由基、 羟基自由基及过氧化 氢不断的被产生, 且过量的反应性氧族与许多疾病有关, 包括但不限制于: 神经组织肌肉无力伴随运动失调与色素沉积性 视网膜炎 (NARP)、 MELAS 症候群、 肌抽跃癫痫合并红色褴褛肌纤维症 (MERRF)、 Leber遗传性视神 经萎缩症 (LHON)、 KSS 症候群、 阿兹海默症、 帕金森氏症、 汉丁顿舞蹈 症、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症、 弗里德赖希氏共济失调 (FA) 及老化。 许多 研究报告证实 AMPK活化剂如 AICAR, 于高葡萄糖、棕梠酸或白蛋白诱导 状况下, 可减少反应性氧族产生。 于本发明中, 腺嘌呤降低 HUVEC 细胞 中反应性氧族的生产 (表 6), 因此腺嘌呤可作为反应性氧族相关的生理状况 或疾病的治疗使用。
癌症
AMPK活化抑制环氧化酶 -2与哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白途径, 此二 路径为癌细胞生长的重要机制。 基于环氧化酶 -2 与哺乳动物雷帕霉素标靶 蛋白对癌症的重要性, 活化 AMPK以达抑制环氧化酶 -2与哺乳动物雷帕霉 素标靶蛋白途径被认为是合理的癌症治疗策略 。 事实上, 许多研究报告证 实 AMPK活化剂中断癌症发展, 举例而言, phenformin及 metformin于异 体移植的癌症小鼠模式被发现抑制乳癌肿瘤发 展及生长。 于本发明中, 腺 嘌呤抑制人类肝癌细胞 Hep G2、人类乳腺癌细胞 MCF7及结肠癌细胞 HT29 的细胞生长 (实施例 11)。 腺嘌呤对 Hep G2、 MCF7、 HT29的 50%生长抑 制浓度分别为 544.1 , 537.5 and 531.9 μ Μ。 于 Hep G2 移植小鼠模式, 长期 给予腺嘌呤显著延迟肿瘤生长。 根据本发明, 以腺嘌呤活化 AMPK的治疗 方式, 可预防或控制癌症的形成或发展。 具体实施方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明, 以使本领域的技术人员 可以更好的理解本发明并能予以实施, 但所举实施例不作为对本发明的限 定。
实施例 1
AMPK 活性分析
于小鼠肌肉细胞 C2C12、小鼠纤维母细胞 3T3、人类肝癌细胞 Hep G2、 人类乳腺癌细胞 MCF7 及人类结肠癌细胞 HT29 人类脐带静脉内皮细胞 HUVEC、 人类急性单核白血球细胞株 THP1、 人类巨噬细胞 U937、 小鼠微 神经胶细胞 BV-2、神经母细胞瘤细胞 Neuro2A及毛乳突细胞 Dermal Papilla 进行腺嘌呤对 AMPK 磷酸化影响的分析。 细胞以 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 含 10% 胎牛血清 (FBS), 4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate及 1% penicillin I streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA) 于 37 。 C、 5% C0 2 环境下培养。 3xl0 5 细胞接种于 6-well 盘, 24小时后以指定化合物处理细胞 30分钟,接着溶解细胞并以西 方墨点法进行分析。 等量蛋白质以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳进 行分离,接着转印至聚偏氟乙烯膜。转印后的 聚偏氟乙烯膜浸泡至溶于 PBS 缓冲液的 3% 牛血清白蛋白 60分钟后, 分别加入抗磷酸化 AMPK (Thrl72) 抗体(1 :2000, Cell signaling)、 抗 AMPK抗体(1 :2000, Cell signaling) , 于 4 。 C 作用。 16小时后加入对应的二抗于室温下反应 1小时。 具免疫反应带 以冷光受质侦测, 并以底片纪录信号。 所得的信号扫描后以 TotalLab Quant 软件 (TotalLab) 进行分析。
腺嘌呤对 AMPK活化的影响统整于表 1。 于所有测试细胞中, 腺嘌呤 均显著活化 AMPK:。 表 (1 )
细胞 腺嘌呤浓度 (microM) AMPK 活化 (fold to
control)
C2C12 1 1.2
10 1.7
100 3.2
200 3.9
600 4.1
3T3 1 1.1
10 1.5
100 2.9
200 4.0
600 4.2
HepG2 1 1.1
10 2.1
100 3.3
200 3.8
600 4.2
MCF7 1 1.2
10 1.6
100 2.5
200 3.4
600 3.7
Papilla
10 1.4
100 2.1
200 2.5
600 2.8
实施例 2
葡萄糖摄取-生物体外分析
使用萤光葡萄糖类似物 (2-NBDG, Molecular Probes)于肌肉细胞 C2C 12 分析腺嘌呤对葡萄糖摄取的影响。 C2C12细胞以各浓度的腺嘌呤于 37°C下 处理 30分钟后, 加入 500 μΜ萤光葡萄糖类似物, 于室温下培养 5分钟后, 细胞以 Kreb-Hepes 缓冲溶液清洗三次, 并以 70%乙醇固定。 细胞内葡萄糖 类似物的萤光以萤光光度计侦测。
腺嘌呤对葡萄糖摄取的影响统整于表 2。 腺嘌呤显著促进 C2C12细胞 的葡萄糖摄取且具浓度依赖性。 数据表示为三个独立实验的平均值 ±标准 差。 表 (2)
腺嘌呤的抗糖尿病效果
为了进一步评估腺嘌呤对血浆葡萄糖水平调节 的影响, 以高脂肪饲料 喂养小鼠作为第二型糖尿病动物模型进行试验 。 C57BL/6J 小鼠饲养于 22 ° C、 12小时曰 /夜循环并以不限制饮食方式喂养高脂肪饲料 (60% kcal% fat) 或正常饲料。 0.1-50 亳克 /公斤的腺嘌呤以腹腔注射方式给于 24周龄小鼠, 注射后 1 与 3小时测量血糖值。 腹腔注射高脂肪饲料喂养小鼠一天两次并 持续 6天, 最后一次投药 1小时后, 收集血浆并测量血浆葡萄糖及三酸甘 油脂含量。
与施打生理食盐水的高脂肪饲料喂养小鼠相比 , 发现腺嘌呤降低血浆 葡萄糖量大于 30%, 降低三酸甘油脂量大于 35%, 并且降低体重 15%以上。
实施例 4
腺嘌呤抑制脂多醣引起的发炎反应
借由检测人类巨噬细胞内环氧化酶 -2 蛋白质量及肿瘤坏死因子 α (TNF- a )、 介白素 -1 P (IL-1 β ) 及介白素 -6 (IL-6)分泌量评估腺嘌呤对发炎 反应的影响。 以 50 ηΜ ΡΜΑ处理 24小时, 诱导人类急性单核白血球细胞 株 THP1 分化至巨噬细胞。 THP1巨噬细胞进一步以 50 ng脂多醣含 10〜600 μ Μ腺嘌呤或载体刺激 6小时, 接着溶解细胞并以西方墨点法进行分析。 等量蛋白质以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行分离, 接着转印至 聚偏氟乙烯膜。 转印后的聚偏氟乙烯膜浸泡至溶于 PBS缓冲液的 3% 牛血 清白蛋白 60分钟后, 分别加入抗环氧化酶 -2 抗体(1:1000, Cell signaling), 抗机动蛋白抗体 (1:5000, Cell signaling), 于 4 。 C 作用。 16小时后加入对 应的二抗于室温下反应 1 小时。 具免疫反应带以冷光受质侦测, 并以底片 纪录信号。所得的信号扫描后以 TotalLab Quant 软件 (TotalLab) 进行分析。 肿瘤坏死因子 a (TNF- a )、 介白素 -1 β (IL-1 β )及介白素 -6 (IL-6)分泌量以 酵素连结免疫吸附法分析。
腺嘌呤对免疫反应的影响统整于表 3。 与控制组胞比较, 经腺嘌呤处理 的巨噬细胞, 其环氧化酶 -2 蛋白质表现量及肿瘤坏死因子 a (TNF- a )、 介 白素 -1 P (IL-1 β )及介白素 -6(IL-6)分泌量均显著下降。 表 (3)
腺 嘌 呤 TNF a (% IL-1 β (% to IL-6(% to COX-2 (%
(microM) to control) control) control) to control)
0 100+4.7 100+11.3 100+8.5 100+2.9
10 85±9.1 91+8.4 88+6.3 81+4.4
100 41+2.6 29±5.5 21±7.8 59+3.5
600 23+1.8 17±3.7 14+6.2 38+5.3 实施例 5
腺嘌呤于生物体抑制三硝基苯磺酸诱发的发炎 反应
进一步以三硝基苯磺酸诱导的发炎性肠病 (IBD)小鼠模式, 评估腺嘌呤 对发炎反应的影响。 C57BL/6J小鼠饲养于 22。 C、 12小时日 /夜循环。 以五 个逐步提升的三硝基苯磺酸剂量: 0.5 mg、 0.75 mg, 1.0 mg, 1.25 mg与 1.5 mg 溶于 50%乙醇分别每周给予小鼠 O.lmL诱发复发性结肠炎。 第三次给 予三硝基苯磺酸后每日以腹腔注射方式给予小 鼠腺嘌呤 (0.01, 0.1, 5 或 30 mg/kg体重)或生理食盐水。第五次给予三硝基苯 磺酸后两天即将小鼠牺牲。 结肠组织溶解液的发炎性细胞激素: 肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素 Y (INF Y ) 及介白素 (IL-17)以酵素连结免疫吸附法分析。
给予腺嘌呤治疗组别的结肠发炎性细胞激素包 括肿瘤坏死因子 (TNF)、 干扰素 Y (INF γ )及介白素 (IL-17), 均较控制组小鼠显著减少, 且挽救体重 损失。
实施例 6
类淀粉 胜肽及自体吞噬活性分析
以神经母细胞瘤细胞 Neuro2A分析腺嘌呤对类淀粉 β胜肽的影响。
Neuro2A细胞以 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)含 10% 月台牛血清 (FBS), 4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate及 1% penicillin I streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA) 于 37 ° C、 5% C0 2 环境下培养。 3xl0 5 细胞接种于 6-well 盘, 24小时后, 细胞以 APP695 进行转染, 并以腺嘌呤处理细胞 24小时, 接着溶解细胞并以西方墨点法进 行分析。 等量蛋白质以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行分离, 接 着转印至聚偏氟乙烯膜。 转印后的聚偏氟乙烯膜浸泡至溶于 PBS缓冲液的 3% 牛血清白蛋白 60 分钟后, 分别加入抗类淀粉 β胜肽抗体 (1: 1000, Abeam), 抗 LC3抗体 (1 :1000, Cell signaling), 抗机动蛋白抗体 (1 :5000, Cell signaling), 于 4 。 C 作用。 16小时后加入对应的二抗于室温下反应 1 小时。 具免疫反应带以冷光受质侦测, 并以底片纪录信号。 所得的信号扫 描后以 TotalLab Quant 软件 (TotalLab) 进行分析。
腺嘌呤对类淀粉 β胜肽及 LC3-II/LC3-I 比例的影响统整于表 4。 于 Neuro2A细胞中,腺嘌呤显著性减少类淀粉 β胜肽量并且增加 LC3-II/LC3-I 比例。 由于 LC3-I 转换至 LC3-II代表自体吞噬的活性, 于腺嘌呤处理的细 胞中, 较控制组细胞较高的 LC3-II/LC3-I 比例, 反映腺嘌呤活化自体吞噬 作用的功能。
表 (4)
实施例 7
腺嘌呤于阿兹海默症实验小鼠模式解救类淀粉 β胜肽诱导的神经退化 类淀粉 β胜肽 25-35购买自 Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri)„ 胜肽溶 解于无菌生理食盐水并注射前培养于 37 。 C下 7天。 C57BL/6J小鼠饲养 于 22。 C、 12小时日 /夜循环。成鼠以 ketamine (500 亳克 /公斤)及 xyline (100 亳克 /公斤)麻醉, 并放置于立体定位注射仪。 5 nmol 的类淀粉 β胜肽 25-35 以 10 μΐ注射器注射至侧脑室,侧脑是座标为 -0.5 mm (前后向)、 ± 1 mm (内 外侧向)、 -2.5 mm (背腹向)相对于前囱。 每日以腹腔注射方式给予类淀粉 β 胜肽注射小鼠腺嘌呤或生理食盐水, 腺嘌呤注射剂量为 0.01, 0.1, 5 或 30 亳克 /公斤体重, 连续注射 4周。 4周后, 小鼠认知功能以莫里斯水迷宫方 法分析。 水迷宫以圆形水池进行, 平台置于目标象限的水面下以进行隐藏 平台试验。 于 5 天隐藏平台试验期间, 每次试验小鼠均随机放置于水池内 做为起始点, 每日 6次试验。 5日隐藏平台试验后 1 日进行探索性试验。 进 行探索性试验时, 移除隐藏平台并以目标象限对面象限作为起始 点。 以摄 录机纪录小鼠于迷宫中泳动 60秒的情形, 以软件分析小鼠寻找平台时间及 于隐藏平台试验中, 经腺嘌呤治疗的小鼠, 其寻找到平台所花费时间 较控制组小鼠显著性减少。 此试验结果证实腺嘌呤可挽救阿兹海默症实验 小鼠受损的学习及记忆功能。 再者, 腺嘌呤治疗小鼠于探索性试验中, 其 停留于目标象线时间较控制组小鼠长, 证明腺嘌呤增进记忆保留。
实施例 8
腺嘌呤抑制纤维母细胞生长
人类纤维母细胞株 3T3以 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 含 10%胎牛血清 (FBS), 4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate 及 1% penicillin I streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA) 于 37 。 C、5% C0 2 环境下培养。 于细胞生长试验中, lxlO 5 细胞接种于 6-well盘,
24小时后, 以指定浓度的腺嘌呤处理细胞 72小时, 计算存活的细胞数。 细 胞以 trypsin-EDTA分离并以 trypan blue进行染色, 以血球计数器计算存活 细胞数。
腺嘌呤对 3T3细胞生长的影响统整于表 5。 由表 5结果可知,腺嘌呤显 著抑制 3T3 细胞生长并具剂量依赖性。 数据表示为三个独立实验的平均值 士标准差。 表 (5)
腺嘌呤 细胞数 (% to
(microM) control)
0 100+4.3
10 91+2.7
50 73±8.1
100 64+5.3
200 48±2.8
500 33+6.4
1000 27+1 1.3 C57BL/6J 小鼠饲养于 22° C、 12 小时日 /夜循环。 12 周龄成鼠以 ketamine (500 亳克 /公斤)及 xyline (100亳克 /公斤)麻醉,于小鼠背部以 6-mm 皮肤取样器制造伤口。 形成伤口后, 于伤口施用 10〜1200 μ Μ腺嘌呤或食 盐水。 皮肤伤口接着以半透性透明片伤口敷料固定。 小鼠以腺嘌呤或生理 食盐水处理 14天后牺牲。疤痕形成以 Masson's trichrome染色分析 (组织以 4% paraformaldehyde固定)。
经 14天处理后, 腺嘌呤处理伤口的愈合速度较控制组快, 且根据组织 染色分析, 以腺嘌呤处理的伤口再生组织, 其疤痕显著较控制组伤口小。
实施例 10
腺嘌呤降低反应性氧族生成
人类脐带静脉内皮细胞 HUVEC 以 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 含 10% 胎牛血清 (FBS), 4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate 及 1% penicillin I streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA) 于 37 。 C、 5% C0 2 环境下培养。 2xl0 4 细胞接种于 96-well 黑盘, 24小时后,将培养基置换成含 5.6或 30 mM葡萄糖的 DMEM 培养基并加入指定浓度的腺嘌呤。 处理 24 小时后, 细胞内反应性氧族以 H 2 DCF-DA侦测。 细胞以 PBS缓冲液清洗 1次后, 培养于 100 μ M DCF 37 ° C 30 分钟。 DCF萤光以盘式萤光分析仪分析 (激发波长 :485 nm; 散射波 长: 530 nm)。
腺嘌呤对反应性氧族生成的影响统整于表 6。腺嘌呤显著性减少高葡萄 糖诱导的反应性氧族生成并具剂量依赖性。 表 (6)
腺嘌呤 葡萄糖 反应性氧族生成 (% of 5.6 mM
(microM) (mM) glucose)
0 30 275± 8.1
10 30 211± 4.3
100 30 1 16+ 1.7
200 30 38.1± 2.9 600 30 21.7士 3.1
1200 30 22.4± 2.5
实施例 11
癌细胞生长抑制试验
以人类肝癌细胞 Hep G2、 人类乳腺癌细胞 MCF7及人类结肠癌细胞 HT29进行腺嘌呤对癌细胞生长的影响。 细胞以 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 含 10% 胎牛血清 (FBS), 4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate 及 1% penicillin I streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA) 于 37 。 C、 5% C0 2 环境下培养。 l xlO 5 细胞接种于 6-well 盘, 24小时后, 以指定浓度的腺嘌呤处理细胞 72小时, 计算存活的 细胞数。 细胞以 trypsin-EDTA分离并以 trypan blue进行染色, 以血球计数 器计算存活细胞数。
腺嘌呤对 Hep G2、 MCF7、 HT29 的 50%生长抑制浓度分别为 544.1, 537.5 and 531.9 μ Μ。
实施例 12
肿瘤生长试验
人类肝癌细胞 Hep G2以 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 含 10%胎牛血清 (FBS), 4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate 及 1% penicillin I streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA) 于 37
。 C、 5% C0 2 环境下培养。 5xl0 6 细胞以皮下注射方式注射至 8 周龄 NOD-SCID 小鼠。 移植后, 每日以腹腔注射方式给予小鼠 5、 20、 50 亳克
/公斤体重的腺嘌呤, 每 3日测量肿瘤大小。 移植后 14天, 相较于控制组小 鼠, 给予腺嘌呤显著延缓肿瘤的生长。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举 的较佳的实施例, 本发 明的保护范围不限于此。 本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的 等 同替代或变换, 均在本发明的保护范围之内。 本发明的保护范围以权利要 求书为准。
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