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| 权利要求 1、 式 I所示化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 式 I 式 I中， 环 A为六元环或七元环， 当环 A为六元环时， X不存在， 当环 A 为七元环时， X表示 0或 NH; 3 号碳原子与 之间为单键或双键， 当为单键时， 选自如下基团中任一 种： 1- H2 +N -§-X' (X '= CI, Br, I, F) H 当为双键时， 选自如下基团中任一种： - -χτ0Η ¾ -0Me 7号碳原子、 8号碳原子、 9号碳原子和 1 1号碳原子相邻碳原子之间为单键或 双键； 当 8号碳原子与 9号碳原子之间为单键时， 8号碳原子与 9号碳原子之间存在 环氧结构或 7号碳原子与 8号碳原子之间为双键或 9号原子与 1 1号碳原子之间为 双键； 当 7号碳原子与 8号碳原子之间为单键时， R2为 Η或 2个 R2形成羰基； 当 7号碳原子与 8号碳原子之间为双键时， 7号碳原子上连接一个 R2， 为 H; 当 9号碳原子与 1 1号碳原子之间为单键时， R3为 H或 2个 R3形成羰基； 当 9号碳原子与 11号碳原子之间为双键时， 11号碳原子上连接 为 H; R4选自如下基团中任一种: 其中， R5和 Re均为碳原子数为 1-4的垸基； X' '和 X'"均选自 F、 Cl、 Br禾口 I; n为 1或 2。 2、 根据权利要求 1所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征在 于： 所述化合物的结构式如式 Π所示， 式 Π 式 II中， Ri、 R2、 R3、 R4和 n的定义同式 I中。 3、 根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 III所示， 式 III 式 III中， R'4选自如下基团中任 4、 根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 IV所示， 式 IV 式 IV中， ！^^与碳原子之间为单键或双键; 当为单键时， 选自如下基团中任一种: +OMe 顺2 当为双键时， ^^选自如下基团中任- R"4选自如下基团中任一种： 5、 根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 V所示， 式 V 式 V中， ！^^与碳原子之间为单键或双键； 当为单键时， ！^^为 ！!； 当为双键时， ^为 α 6、 根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 VI所示， 式 VI。 7、 根据权利要求 1 所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 式 W 式 W中， X表示 0或 ΝΗ。 8、 权利要求 1-7 中任一项所述化合物、 其前药或其药学上可接受的盐在制 备治疗白内障的药物中的应用。 9、 权利要求 1-7 中任一项所述化合物、 其前药或其药学上可接受的盐在制 备阻止、 缓解或逆转晶状体蛋白在细胞内聚集的产品中的应用。 10、 一种治疗白内障的药物， 其活性成分为权利要求 1-7中任一项所述化合 物、 其前药或其药学上可接受的盐。 |
| 经修改的权利要求 国际局收到日 ： 2018年 9月 30日（30.09.2018) 1、 式 I所示化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 式 I 式 I中， 环 A为六元环或七元环， 当环 A为六元环时， X不存在， 当环 A为 七元环时， X表示 0或 NH; 3号碳原子与 之间为单键或双键， 当为单键时， 选自如下基团中任一 种： 、 K o >H R7为单糖或多糖； 当为双键时， 选自如下基团中任一种： ¾ ^ - Η ,OMe R2为ΟΗ、 -F或 -Η ; ！^选自如下基团中任一种： H Me 1 I I 5号碳原子与 6号碳原子之问为单键或双键， 当为单键时， 115和 R6为 H或 OH或 R5和 形成环 fL键， 当为双键时， 为 ¾ 42 修改页 （条约第 19条) 7号碳原子、 8号碳原子、 9号碳原子和 11号碳原子相邻碳原子之间为单键或 双键； 当 8号碳原子与 9兮碳原子之间为单键时， 8号碳原子与 9兮碳原子之间存 环氧结构或 7号碳原子与 8号碳原子之问为双键或 9号原子与 11号碳原子之间为 双键； R4为多取代的醇、 羧基、 酰胺、 膦酸、 磺酸、 苷或烧烃， 具体选自如下基团 中任一种： R8为 -ΟΗ、 -Η、 碳原子数为 1~5的烷基或苯碁； R7为单糖或多糖： R9、 Rie、 R11和 R12均为碳原子数为 1 4的垸基； n为 0~4之间的数。 2、 根据权利要求 1所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 Π所示， 43 修改页 （条约第 19条) 式 π 式 Π中， R】、 R2、 R3、 、 R fl R6的定义同式 I中。 3、 根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于: 所述化合物的结构式如式 ΙΠ所示 , 式 III 式 m中， R2和 R4的定义同式 I中。 4、 根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 IV所示， 式 IV 式 IV中， R2和 R4的定义同式 I中。 5、 根据权利要求 1所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 式 V 式 V中， 和 的定义同式1中, 44 修改页 （条约第 19条) 6、根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于-: 所述化合物的结构式如 VI所示， 式 VI 式 VI中， R4的定义同式 I中。 7、 根据权利要求 2所述的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐， 其特征 在于： 所述化合物的结构式如式 ΥΪΪ、 式 vm、 式 ix、 式 x、 式 XI或式 XII所示： 式 IX 式 X 45 修改页 （条约第 19条) 式 XI 式 X0。 8、 权利要求 1-7 中任一项所述化合物、 其前药或其药学上可接受的盐在制 各治疗白内障的药物中的应用。 9、 权利要求 1-7中任一项所述化合物、 其前药或其药学上可接受的盐在制 备阻止、 缓解或逆转晶状体蛋白在细胞内聚集的产品中的应用。 10、一种治疗 Θ内降的药物， 其活性成分为权利要求 1-7中任一项所述化合 物、 其前药或其药学上可接受的盐。 46 修改页 （条约第 19条) |
本发明涉及一种化合物及其在治疗白内障中的 应用， 属于生物医药领域。 背景技术
晶状体是眼球屈光系统的重要组成部分， 也是唯一具有调节能力的屈光间 质， 晶状体由晶体囊、 晶体上皮、 晶体纤维和悬韧带组成。 如果晶状体由于各种 原因造成其部分或全部混浊， 则发生白内障。 白内障会导致单眼或者双眼的视力 降低。 通常白内障发展缓慢， 症状主要包括视力模糊、 晕光、 夜视能力降低， 严 重会致盲。 视力的降低会严重的影响人们的日常生活， 比如开车、 阅读， 视力的 降低也会导致心理疾病的产生。 白内障多发于 40 岁以上的人群， 随着且随年龄 增长而增多， 与多因素相关， 如与老年人代谢缓慢， 发生退行性病变有关， 也有 人认为与日光长期照射， 内分泌紊乱， 代谢障碍等因素有关。 外伤、 药物、 放射 性物质、 并发症等也会引起后天性白内障， 另外， 有一些先天性的白内障患者， 多在出生前后即已存在， 有内生性与外生性两类， 内生性者与胎儿发育障碍有 关， 外生性者是母体或胎儿的全身病变对晶状体造 成损害所致。
国际公认的快速有效治疗白内障的方法是手术 治疗， 通过手术将患者浑浊 的晶状体取出， 然后植入人工晶体。 但总体而言手术治疗费用较高， 对患者而言 是很大的经济负担， 随着人类平均寿命的延长、 人口老龄化的出现， 这一难题更 为突出， 因此寻找有效、 安全、 廉价的药物治疗白内障具有重要的现实意义。
晶状体内 90%的蛋白是由晶状体蛋白组成。 其中 α-、 β_和 γ_晶状体蛋白是晶 状体内最主要的可溶性蛋白。 其中， α-晶状体蛋白是由两个亚基组成的二聚体， 属于小热休克蛋白家族， 它可以在不依赖 ΑΤΡ的情况下有效地结合损伤的或者未 能正确折叠的蛋白质从而阻止这些蛋白的聚集 。 从白内障患者的晶状体中可以分 离得到的很多不同种类的蛋白， 其中有很多是以高分子量的蛋白聚集体形式存 在。 这些蛋白聚集体导致了整个白内障晶状体的浑 浊遮光性。 因此需要提供一种 可以逆转蛋白聚集的小分子化合物， 其可以逆转白内障晶状体内的蛋白聚集， 使 其变为可溶蛋白， 该小分子可以应用到白内障的预防或者治疗中 。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有新颖结构的小分 子化合物， 该小分子化合物 在抑制晶状体细胞内蛋白聚集方面具有更好的 活性， 具有更好的水溶性， 并且对 正常晶状体细胞没有毒副作用。
本发明首先提供式 I所示化合物、 其前药或其药学上可接受的盐，
式 I中， 环 A为六元环或七元环， 当环 A为六元环时， X不存在， 当环 A 为七元环时， X表示 0或 NH;
3 号碳原子与 之间为单键或双键， 当为单键时， 选自如下基团中任一 种：
R 7 为单糖或多糖；
当为双键时， Rt选自如下基团中任一种：
1-0 -N †N
R 2 为- OH、 -F或 -H;
R 3 选自如下基团中任一种:
H Me 1 I i
F OH 〇Ac
Ac表示乙酰基；
5号碳原子与 6号碳原子之间为单键或双键， 当为单键时， 1 5 和 R 6 为 H或 0H或 R 5 和 R 6 形成环氧键， 当为双键时， R 5 为 H;
7号碳原子、 8号碳原子、 9号碳原子和 1 1号碳原子相邻碳原子之间为单键或 双键；
当 8号碳原子与 9号碳原子之间为单键时， 8号碳原子与 9号碳原子之间存在 环氧结构或 7号碳原子与 8号碳原子之间为双键或 9号原子与 1 1号碳原子之间为 双键； R 4 为多取代的醇、 羧基、 酰胺、 膦酸、 磺酸、 苷或垸烃， 具体选自如下基团 中任一种：
R 8 为 -OH、 -H、 碳原子数为 1~5的垸基或苯基；
R 7 为单糖或多糖；
R 9 、 R 10 、 R 11 和 R 12 均为碳原子数为 1~4的垸基;
n为 0~4之间的数。
式 I中， 7号碳原子、 8号碳原子、 9号碳原子和 1 1号碳原子相邻碳原子之 间的连接情况可为： 当 7号碳原子与 8号碳原子之间为单键时， 8号碳原子与 9 号碳原子之间为双键或 9号原子与 1 1号碳原子之间为双键； 当 7号碳原子与 8 号碳原子之间为双键时， 9号原子与 1 1 号碳原子之间为双键； 9号碳原子与 1 1 号碳原子之间的连接情况与 7号碳原子与 8号碳原子之间的连接情况相似。
所述化合物的结构式进一步如式 Π所示，
式 II中， Ri、 R 2 、 R 3 、 R 4 、 R 5 和 R 6 的定义同式 I中 所述化合物的结构式具体如式 III所示，
式 III 式 III中， R 2 和 R 4 的定义同式 I中。
III所示化合物具体如式 III-1或式 ΠΙ-2所示:
式 IV 式 IV中， R 2 和 R 4 的定义同式 I中。 式 IV所示化合物具体为式 IV - 1 -式 IV-25中任
-1 IV -2
式 IV -9 式 IV-10
式 IV-17 式 IV-18
式 IV-21 式 IV -22
式 V
式 V- 所述化合物的结构式具体如式 I所示，
式 VI
式 VI中， R 4 的定义同式 I中。
式 VI所示化合物具体如式 VI-1所示：
式 νι-ι。
所述化合物的结构式具体如式 νπ、 式環、 式 IX、 式 X、 式 XI或式 ΧΠ所示:
式 IX 式 X
式) (I 式) (Π。
本发明化合物可根据现有的常规方法进行制备 ， 如采用氧化反应、 还原反 应和 /或缩合反应等常规反应进行。
本发明所提供的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐可用于治疗白内 障。
本发明提供的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐可用于阻止、 缓解或 者逆转晶状体蛋白在细胞内的聚集；
在晶状体细胞中， 90%以上的蛋白组分是晶状体蛋白 （crystallin, CRY) ， 包括 α-、 β-和 γ-CRY三个家族， 而晶状体蛋白发生突变后， 会引发细胞内的蛋 白聚集， 导致白内障疾病， 本发明将选取 α-CRY家族突变体 aA-Y118D、 αΒ- R120G、 β-CRY家族突变体 βΒ2-νΐ87Ε、 γ-CRY家族突变体 yC-G129C禾 P γϋ- W43R为白内障疾病的研究模型来检测本发明化 物的效果。
活性成分为本发明提供的化合物、 其前药或其药学上可接受的盐的治疗白内 障的药物也属于本发明的保护范围。
附图说明
图 1为晶状体蛋白突变体 αΒ R120G在细胞内发生错误折叠形成聚集小体的 示意图。
图 2为本发明化合物对多种晶状体蛋白突变体形 聚集体的效应。
图 3为本发明化合物对晶状体蛋白突变体 αΒ R120G聚集的半效应浓度。 图 4为本发明所示化合物细胞毒性的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 实施例 1、 式 IV-1所示化合物的制备 反应方程式如下所示:
化合物 IV-23 ( 1.0 当量） 、 HCTU ( 1.2 当量） 和环丙胺 （1.5 当量） 溶于 DCM/DMF混合溶剂中， 室温搅拌 12小时。 反应完成后采用二氯甲垸萃取所得产 物， 水洗除去 DMF。 无水碳酸钠干燥， 然后用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采 用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 20: 1 ) ， 得化合物式 IV-1 , 产率为 80%。
1H- MR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 5.50 (s, 1H), 3.25-3.21 (m, 1H), 2.72-2.67 (m, 1H), 2.23-2.17 (m, 1H), 0.86 (s, 3H), 0.47 (s, 2H); 13 C- MR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 175.2, 134.5, 134.5, 79.1, 50.5, 50.4, 49.9, 44.6, 39.0, 37.2, 36.3, 35.7, 33.8, 32.1, 31.1, 30.9, 29.8, 28.1, 28.0, 26.6, 24.4, 22.7, 21.1, 19.3, 18.6, 18.4, 15.9, 15.6, 7.8.
实施例 2、 式 IV-13和式 IV-14所示化合物的制备
反应方程式如下所示：
化合物 1 140mg溶于无水 DCM (20mL) 中， 在冰浴条件下， 氮气保护加入 TBDMSOTf ( 291uL, 4.0 eq ) ， 2,6-lutidine ( 187uL， 5.0eq ) 。 反应液在室温 下搅拌， TLC检测反应至原料消失 （2h) 。 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用 硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 200: 1 ) ， 得化合物 2 ( 190mg) ， 产率 90%。
化合物 2 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.62-4.60 (m, 1H), 1.19 (s, 3H),
1.18 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 0.95 (s, 12H), 0.86 (s, 12H), 0.73 (s, 3H), 0.17 (s, 3H), 0.15 (s, 3H), 0.07 (s, 6H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 156.5, 156.5, 135.2, 133.1, 98.9, 73.7, 50.6, 50.2, 49.5, 45.7, 44.6, 38.5, 37.0, 36.7, 36.4,
31.3, 31.2, 30.3, 29.8, 28.6, 28.4, 27.1, 26.7, 26.1, 26.0, 24.4, 21.0, 20.8, 19.8, 19.6, 18.9, 18.6, 18.5, 18.3, 16.1, -1.88, -3.9, -4.5.
化合物 2 ( lOOmg) 溶于 3ml的 DCM和 2ml的 DMF的混合溶液， 在冰浴条 件下加入 selectfluor ( 50mg， l .Oeq) ， 反应液在室温下搅拌 lh。 反应液用饱和 碳酸氢钠溶液洗涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采 用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 50: 1 ) ， 得化合物 3 ( 60mg) ， 产率 71%。
化合物 3 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 5.34 (ddd, =48.0 Hz, J = 13.0
Hz, J = 6.2 Hz, 1H), 2.53-2.74 (m, 1H), 1.31 (s, 3H), 1.177 (s, 3H), 1.170 (s, 3H), 1.15 (s, 3H), 1.11 (s, 3H), 0.91 (d, = 6.4 Hz, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.71 (s : 3H), 0.05 (s, 6H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 210.2 (d, = 11.8 Hz, 1C), 135.75, 133.0, 89.3 (d, J = 184.9 Hz, 1C), 73.6, 52.1, 50.4, 49.9, 48.5, 45.6, 44.6, 43.7, 43.6, 38.1, 38.0, 36.9, 36.5, 30.8, 30.2, 29.8, 28.3, 26.1, 26.0, 24.6, 24.4, 21.6,
21.4, 20.9, 20.1, 19.0, 18.8, 18.2, 15.8, -1.9.
化合物 3 ( 57mg ) 溶于 DCM/MeOH ( lmL/3mL ) ， 室温下硼氢化钠 ( 20mg, 5eq) 加入到反应液中， 室温搅拌 lh。 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗 涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 (石油醚： 乙酸乙酯 50 : 1 ) ， 得化合物 4 ( 30mg ) ， 产率 70% ; 化合物 5 ( 9mg) ， 产率 20%。
化合物 4 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.69-4.53 (m, 1H),3.29 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 1.18 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.08 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 0.87 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.88 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.85 (s, 9H), 0.69 (s, 3H), 0.06 (s, 6H).
化合物 5 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 5.00-4.85 (m, 1H), 3.67 (d, =
6.8 Hz, 1H), 1.18 0, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 0.90 (d, = 6.4 Hz, 3H), 0.897 (s, 3H), 0.88 (s, 3H), 0.85 (s, 9H), 0.69 (s, 3H), 0.06 (s, 6H).
化合物 4 ( 30mg) 溶于乙腈 /THF ( lml/lmL) ， 40% HF水溶液加入到反应 液， 50摄氏度搅拌过夜。 反应液残留 HF用氯化钙溶液中和， 化合物用 DCM萃 取， 无水碳酸钠干燥， 然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 (石油醚： 乙酸乙酯 10: 1) ， 得化合物 （式 IV-13) (18mg) ， 产率 75%.
化合物 (式 IV-13) 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.66-4.49 (m, 1H), 3.28 (dd, = 13.0 Hz,/ = 9.6 Ηζ,ΙΗ), 1.21 (s, 6H), 1.07 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 0.90 (d : J = 6.3 Hz, 3H), 0.88 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.68 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.9, 133.5, 93.4 (d, J = 165.6 Hz, 1C), 81.0 (d, J = 15.4 Hz, 1C), 71.1, 50.4, 50.2, 50.1, 49.8, 44.5, 44.4, 41.1, 40.9, 39.5, 39.4, 38.7, 38.5, 36.7, 36.5, 30.8, 30.76, 29.7, 29.3, 29.2, 28.4, 28.2, 26.2, 24.3, 21.3, 21.1, 20.2, 18.7, 18.0, 16.6, 15.7. 化合物 5 (20mg) 溶于乙腈 /THF (Iml/lmL) ， 40% HF水溶液加入到反应 液， 50摄氏度搅拌过夜。 反应液残留 HF用氯化钙溶液中和， 化合物用 DCM萃 取， 无水碳酸钠干燥， 然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 (石油醚： 乙酸乙酯 10: 1) ， 得化合物 （式 IV-14) (14mg) ， 产率 85%.
化合物 (式 IV-14) 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 5.01-4.85 (m, 1H), 3.67 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 1.21 (s, 6H), 1.05 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 0.92-0.88 (m, 9H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.7, 133.9, 91.5 (d, J = 167.1 Hz, 1C), 76.7, 71.2, 50.5, 50.0, 44.6, 44.5, 43.5, 38.8, 38.7, 38.6, 38.5, 36.8, 36.6, 35.8, 35.6, 31.0, 30.9, 29.8, 29.5, 29.4, 28.3, 28.2, 26.1, 24.4, 21.9, 21.3, 21.26, 20.3, 18.8, 17.9, 15.8.
实施例 3、 式 IV-20所示化合物的制备
式 IV- 20 化合物 2 (380mg， 0.56mmol) 溶于 DCM中， 在冰浴条件下， 将 m-CPBA (l.Oeq) 与 NaHC0 3 (0.7eq) 的 DCM混悬液缓慢加入反应液中， 搅拌 20min， TLC 检测反应完成， 反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液停止反应， 用水洗涤， DCM萃取， 无水硫酸钠干燥， 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品用硅胶柱分离 (石油醚： 乙酸乙酯 80: 1) ， 得化合物 6 (290mg) ， 产率 90%。
化合物 (f) 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.65-4.60 (q, Ji = 6Hz, J 2 = 12Hz, 1H), 1.17-1.16 (d, 6H), 1.11 (s, 3H), 1.08 (s, 3H), 0.90 (s, 6H), 0.71 (s, 3H), 0.14 (s, 3H), 0.02 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 214.08, 135.16, 133.69, 73.64, 71.62, 52.11, 50.45, 49.86, 48.19, 46.85, 45.62, 44.60, 37.87, 36.87, 36.52, 32.02, 30.91, 30.84, 30.18, 29.74, 29.45, 28.29, 26.21, 25.96, 25.94, 24.97, 24.34, 22.78, 21.84, 21.55, 20.92, 20.07, 19.31, 19.17, 18.81, 18.71, 18.19, 15.82, 14.50, -1.98, -4.50, -5.45.
化合物 6 (290mg, 0.51mmol) 溶于 MeOH/DCM中， 将 NaBH 4 (lO.Oeq) 缓慢加入反应液中， 室温下搅拌过夜， TLC检测反应完成， 旋转蒸发仪蒸干溶 剂， 所得产品用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 40: 1) ， 得化合物 7， 全部用 于下一步反应。
化合物 7溶于乙腈 /THF (lml/lmL) ， 40% HF水溶液 （lOOul) 加入到反应 液， 50摄氏度搅拌过夜。 反应液残留 HF用氯化钙溶液中和， 化合物用 DCM萃 取， 无水硫酸钠干燥， 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 (DCM: MeOH50: 1) ， 得化合物 （式 IV-20) (36mg) ， 两步产率 15%。
化合物 （式 IV -20) 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ (ppm) 3.66-3.60 (m, 1H), 2.93-2.91 (d, J = 9.6Hz, 1H), 1.05 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.93-0.91 (d, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 0.92 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ (ppm) 135.48, 135.14, 83.97, 71.26, 69.66， 51.49， 51.41， 50.61， 45.38, 44.98， 44.75， 40.02, 38.91, 37.70, 37.39, 31.88, 31.57, 29.11, 28.99, 28.95, 28.91, 27.18, 24.55, 21.97, 21.84, 20.58, 19.12, 19.09, 17.07, 16.18.
实施例 4、 式 IV-8、 式 IV-11和式 IV-12所示化合物的制备
反应方程式如下所示：
化合物 8 16 g (40%, 13.7mmol) 溶于 DCM中， 前 3h在室温下加入一半 m-CPBA与 NaHC0 3 ， 后 3h在冰浴条件下加入剩下的 m-CPBA， TLC检测反应 完， 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 无水硫酸钠干燥， 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 80: 1 ) ， 得化合物 9， 产率 80%。
化合物 9 1.1 g ( 2.4mmol ) 溶于乙醚中， HI0 4 加入反应液中， 室温下搅拌 20min, TLC检测反应完全， 反应液用水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 旋转蒸发仪蒸 干溶剂， 所得产品即化合物 （c) 可直接用于下一步反应。
化合物 10 200 mg ( 0.4mmol ) 溶于 DCM中， 将前处理后的叶立徳试剂加入 反应液中， 氮气保护室温下搅拌 4h， 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶 柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 50: 1 ) ， 得化合物 1 1 ( 190mg) ， 产率 90%。
化合物 1 1 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 5.01-4.85 (m, 1H), 3.67 (d, = 7.7 Hz, 1H), 1.21 (s, 6H), 1.05 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 0.92-0.88 (m, 9H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.7, 133.9, 91.5 (d, J = 167.1 Hz, 1C), 76.7, 71.2, 50.5, 50.0, 44.6, 44.5, 43.5, 38.8, 38.7, 38.6, 38.5, 36.8, 36.6, 35.8, 35.6, 31.0, 30.9, 29.8, 29.5, 29.4, 28.3, 28.2, 26.1, 24.4, 21.9, 21.3, 21.26, 20.3, 18.8, 17.9, 15.8. 化合物 1 1 100 mg ( 0.2mmol ) 溶于乙醇 /水 （4ml/ 2 ml ) 中， 加入 KOH ( 3.0 eq ) ， 120°C加热过夜， TLC检测反应完全， 反应液用旋转蒸发仪蒸去乙 醇， 水相中滴加浓盐酸调至 PH<7， 过滤所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙 酸乙酯 5 : 1 ) ， 得化合物式 IV-12 ( 30 mg) ， 产率 33%。
化合物 （式 IV-12 ) 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm) 12.09 (s, IH), 6.63 (s,
IH), 4.31-4.32 (d, IH), 3.00-2.97 (dd, IH), 1.98 (s, 3H), 1.12 (s, 3H), 0.96-0.90 (m, 9H), 0.83 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, DMSO) δ (ppm) 168.81, 141.99: 134.30, 133.48, 127.38, 76.72, 50.01, 49.75, 49.34, 44.02, 38.50, 36.52, 35.74, 35.16: 34.50, 30.48, 30.37, 28.07, 27.65, 27.54, 25.97, 24.94, 23.99, 20.47, 18.96, 18.30, 17.85, 15.79, 15.52, 12.10.
化合物 1 1 80 mg ( 0.15mmol ) 溶于甲醇中， 加入 20%钯碳， 在氢气中室温 下搅拌过夜， TLC检测反应完全， 反应液用硅藻土过滤， 旋转蒸发仪蒸干后所得 产品溶于乙醇 /水 （3 ml/ 1.5 ml ) ， 加入 KOH ( 3.0 eq) ， 120°C加热过夜， TLC 检测反应完全， 反应液用旋转蒸发仪蒸去乙醇， 水相中滴加浓盐酸调至 PH<7， 过滤所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 5 : 1 ) ， 得化合物式 IV-1 1 ( 20 mg) ， 总产率 29%。
化合物 (式 IV-1 1 ) 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm) 3.02-2.98(dd, IH), 2.31-2.28 (t, IH), 1.98 (s, 3H), 1.03-1.02 (d, 3H), 0.91-0.89 (d, 3H), 0.85-0.83 (m, 3H), 0.69 (s, 3H);
化合物 1 1 100 mg ( 0.19mmol ) 溶于无水 DCM， 在冰浴中缓慢滴加 DIBAL
( 5.0 eq) ， 在氮气条件下反应 3h， 反应液中缓慢滴加甲醇中和剩余 DIBAL, 旋 转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 10: 1 ) ， 得 化合物 IV-9 ( 68 mg) ， 产率 85%。
化合物 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 5.41-5.38 (t, IH), 4.00 (s, 2H), 3.25-3.21 (dd, IH), 1.06-0.98 (m, 9H), 0.93-0.92 (d, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.80 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.52, 134.47, 134.41, 127.19, 79.10, 69.22, 50.51, 50.48, 49.92, 44.61, 39.00, 37.13, 36.40, 36.09, 35.69, 31.10, 30.94, 29.81, 28.33, 28.07, 27.95, 26.61, 24.62, 26.36, 21.1 1, 19.25, 18.72, 18.36, 15.87, 15.53, 13.75.
化合物 1 1 ( lOOmg ) 溶于 THF ( 10ml ) 中， 搅拌条件下加入四氢锂铝
( 2.0eq ) ， 反应在室温下搅拌 6个小时。 反应结束后， 向反应液滴加甲醇， 中 和未反应的四氢锂铝， 硅藻土过滤， 然后用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用 硅胶柱分离 （二氯甲垸： 甲醇 5 : 1 ) ， 得化合物式 IV-8 , 产率 80%。
化合物 (式 IV-8 ) 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 3.52-3.48 (m, IH), 3.44-3.39 (m, IH), 3.25-3.21 (m, IH), 0.68 (s, 3H);"C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.5, 79.1, 68.7, 68.5, 50.6, 50.5, 49.9, 44.6, 39.0, 37.2, 36.7, 36.6, 36.5, 36.0, 35.7, 33.8, 33.7, 31.1, 31.0, 29.8, 28.4, 28.1, 28.0, 26.6, 24.4, 21.1, 19.3, 18.9, 18.8, 18.4, 16.9, 16.6, 15.9, 15.6
实施例 5、 式 IV-9和式 IV-10所示化合物的制备
反应方程式如下所示：
化合物 12 400 mg ( 0.8mmol ) 溶于 DCM中， 将前处理后的叶立徳试剂加入 反应液中， 氮气保护室温下搅拌 4h， 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶 柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 30: 1 ) ， 得化合物 13 (436 mg) ， 产率 95%。
化合物 13 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 5.01-4.85 (m, IH), 3.67 (d, = 7.7 Hz, IH), 1.21 (s, 6H), 1.05 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 0.92-0.88 (m, 9H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.7, 133.9, 91.5 (d, J = 167.1 Hz, 1C), 76.7, 71.2, 50.5, 50.0, 44.6, 44.5, 43.5, 38.8, 38.7, 38.6, 38.5, 36.8, 36.6, 35.8, 35.6, 31.0, 30.9, 29.8, 29.5, 29.4, 28.3, 28.2, 26.1, 24.4, 21.9, 21.3, 21.26, 20.3, 18.8, 17.9, 15.8.
化合物 13 140 mg ( 0.25mmol ) 溶于乙醇 /水 （4ml/ 2 ml ) 中， 加入 KOH ( 3.0 eq) ， 120°C加热过夜， TLC检测反应完全， 反应液用旋转蒸发仪蒸去乙 醇， 水相中滴加浓盐酸调至 PH<7， 过滤所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙 酸乙酯 5 : 1 ) ， 得化合物 IV-10 (反式， 24.4 mg) ， 产率 22%。
化合物 (式 IV-10 ) 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 6.83-6.76 (td, IH), 5.77-5.73 (d, IH, J=15.2Hz), 4.33-4.31 (d, IH), 3.02-2.97 (dd, IH), 1.15-1.11 (t, 3H) : 0.97-0.88 (m, 9H), 0.84 (s, 3H), 0.70 (s, 3H);"C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 167.12, 149.37, 134.29, 133.47, 121.64, 76.71, 66.97, 50.00, 49.77, 49.33, 44.02, 38.49, 36.50, 35.58, 35.15, 34.09, 30.35, 28.30, 28.07, 27,59, 27.53, 25.96, 23.99, 20.46, 18.95, 18.23, 17.84, 15.79, 15.52.
化合物 13 50 mg ( 0.09mmol ) 溶于甲醇中， 加入 20%钯碳， 在氢气中室温 下搅拌过夜， TLC检测反应完全， 反应液用硅藻土过滤， 旋转蒸发仪蒸干后所得 产品溶于乙醇 /水 （3 ml/ 1.5 ml ) ， 加入 KOH ( 3.0 eq) ， 120°C加热过夜， TLC 检测反应完全， 反应液用旋转蒸发仪蒸去乙醇， 水相中滴加浓盐酸调至 PH<7， 过滤所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 5 : 1 ) ， 得化合物 IV-9 (反 式， 10 mg) ， 总产率 25%。
化合物 (式 IV-9 ) 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.32-4.31 (d, 1H), 3.01-2.96 (dd, 1H), 2.19-2.16 (t, 2H), 1.14-1.09 (t, 3H), 1.02-0.89 (m, 9H), 0.85-0.83 (m, 7H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 174.50, 133.53, 76.75, 50.04, 49.90, 49.36, 43.99, 38.52, 36.54, 35.71, 35.36, 35.19, 33.70, 30.52, 30.38, 28.10, 27.70, 27.56, 26.00, 25, 16, 24.94, 24.03, 20.50, 18.98, 18.49, 17.87, 15.82, 15.55.
实施例 6、 式 IV-7和式 VI-1所示化合物的制备
式 I-1 式 IV- 25-hydro-lanosterol(224 mg)， Rh 2 (OAc) 4 (8mg, 5%)和重氮乙酸乙酯溶于 lOmL二氯甲垸中， 反应液在密封管中加热到 40摄氏度， 反应 12h。 所得反应液 用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 20 : 1 ) ， 得化合物投入到 MeOH/H20(2mL/lmL)中， 加入 5个当量碳酸钾， 加入到 80摄氏度， 反应 5h。 化合物用 DCM萃取， 无水碳酸钠干燥， 然后再旋转蒸发 仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （二氯甲垸： 甲醇 50: 1 ) ， 得化合物式 VI-1和式 IV-7, 产率分别为 20%和 30%。
化合物 ( VI-1 ) 1H-NMR (400 MHz, CD 3 OD/ CDC1 3 (2: 1)) δ (ppm) 4.13-4.01 (m, 2H),2.90 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 1.15 (s, 6H), 1.01 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 0.87-0.82 (m, 8H), 0.66 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD/ CDC1 3 (2: 1)) δ (ppm) 134.4,
88.5, 70.8, 67.1, 50.8, 50.5, 49.7, 44.4, 44.1, 38.9, 36.9, 36.7, 36.4, 35.4, 30.9, 30.7,
28.6, 28.4, 28.1, 27.8, 26.4, 24.1, 23.2, 21.1, 20.9, 19.0, 18.5, 18.0, 16.0, 15.6.
化合物 (式 IV-7) H1H-NMR (400 MHz, CD 3 OD/ CDC1 3 (2: 1)) δ (ppm) 3.94 (s,
2H), 3.18-3.14 (m, 1H), 1.15 (s, 6H), 0.94 (s, 6H), 0.86 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.84 (s, 3H), 0.76 (s, 3H), 0.65 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD/ CDC1 3 (2: 1)) δ (ppm) 134.4, 134.3, 78.6, 50.4, 50.3, 49.6, 44.3, 40.2, 38.7, 36.8, 36.5, 36.3, 35.5, 30.8, 30.6, 29.5, 28.1, 27.6, 27.2, 26.3, 24.9, 24.0, 20.8, 18.9, 18.4, 18.1, 15.5, 15.2.
实施例 7、 式 IV-16、 式 IV-18和式 IV-19所示化合物的制备
化合物 14 ( 215mg ) 溶于 THF ( 10ml ) 中， 搅拌条件下加入四氢锂铝 ( 38mg， 2.0eq) ， 反应在室温下搅拌 6个小时。 反应结束后， 向反应液滴加甲 醇， 中和未反应的四氢锂铝， 硅藻土过滤， 然后用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产 品采用硅胶柱分离 （二氯甲垸： 甲醇 5 : 1 ) ， 得化合物式 IV-19, 产率 90%。
化合物式 IV-19:1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 3.64 (m, t, = 6.6 Hz,2H),
3.25-3.21 (m, 1H), 1.00 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.81 (s, 3H), 0.68 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.53, 79.13, 63.25, 50.57, 50.53, 49.94, 44.59, 39.02, 37.15, 36.51, 36.31, 35.72, 33.03, 31.11, 30.97, 28.36, 28.10, 27.98, 26.63, 26.35, 26.28, 24.40, 21.14, 19.28, 18.84, 18.39, 15.88, 15.56.
三苯基膦 （262mg, l .Oeq) ， 咪唑 （75 mg, 1.1 eq) 溶于 20 mLDCM中， 碘
(252mg, l .Oeq)加入到上述溶液中， 搅拌至碘被完全消耗， 形成黄色的悬浊液 (大约需要 20分钟） ， 之后化合物 14H (431mg) 加入到上述溶液中， 室温搅 拌过夜， 化合物用 DCM萃取， 无水碳酸钠干燥， 然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 50: 1 ) ， 得化合物式 14-1， 产率 为 50%。
化合物式 14-1: 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 3.24-3.1 (m, 3H), 0.80 (s, 3H), 0.68 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 134.53, 134.49, 79.07, 50.53 49.92, 44.59, 39.00, 37.13, 36.47, 36.10, 35.72, 33.76, 31.12, 30.96, 28.34, 28.10, 27.97, 26.63, 25.40, 24.39, 21.12, 19.27, 18.82, 15.88, 15.55, 7.42.
化合物 14-1 ( 30mg) 溶于乙醇 /THF/5%亚硫酸钠 （2ml/2mL/2mL) 混合溶液 中， 用密封管密封， 加热到 100摄氏度， 反应过夜。 反应液用旋转蒸发仪蒸干， 所得产品采用硅胶柱分离 （DCM : 甲醇 8 : 1 ) ， 得化合物 （式 IV-16 ) (26mg) ， 产率 95%。
化合物式 IV-16: 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 4.30 (s, d, = 4.4 Ηζ,ΙΗ), 3.16 (d, J = 4.8 Ηζ, ΙΗ), 3.00-2.99 (m, 1H), 0.69 (s, 3H), 0.65 (s, 3H); 13 C- NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 134.80, 134.05, 77.25, 52.07, 50.48, 49.86, 44.49, 39.01, 37.03, 36.33, 36.07, 31.04, 30.88, 29.42, 28.59, 28.23, 28.06, 26.49, 26.05, 25.64, 24.53, 20.99, 19.47, 19.04, 18.37, 16.31, 16.06.
实施例 8、 式 IV-5所示化合物的制备
化合物 15 ( 50mg) 溶于 DCM， DMP ( 50mg， 1.2eq) 加入到反应体系中， 室温搅拌 5小时， 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再用 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 10: 1 ) ， 得化合物 16 (43mg) ， 产率 85%。
1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.51-4.47 (m, 1H), 2.60-2.43 (m, 2H),
2.04 (s, 3H), 1.38 (s, 6H), 1.00 (s, 3H), 0.91-0.88 (m, 12H), 0.68 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDCI3) δ (ppm) 215.2, 171.2, 134.5, 134.4, 81.0, 76.3, 50.6, 50.5, 50.0, 44.7, 37.9, 37.0, 36.2, 35.4, 32.7, 31.1, 30.9, 30.3, 28.3, 28.0, 26.7, 26.5, 24.4, 24.3, 21.5, 21.1, 19.3, 18.6, 18.2, 16.7, 15.9.
化合物 16溶于 10%的氢氧化钾乙醇溶液中， 90°C， 反应两个小时， 反应结 束后， 乙醇溶液在旋转蒸发仪上蒸干， 加入稀盐酸调节 PH值到酸性， 用 DCM 萃取， 有机相用无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用 硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 5 : 1 ) ， 得化合物式 IV-5 ( 43mg ) ， 产率 90%。
化合物式 IV-5 : 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 3.25-3.22 (m, 1H), 2.57-
2.48 (m, 2H), 1.00 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 0.91-0.88 (m, 10H), 0.81 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 215.1, 134.6, 134.5, 79.1, 76.4, 50.60, 50.57, 50.0, 44.7, 39.1, 37.2, 36.3, 35.8, 32.8, 32.1, 31.2, 31.0, 30.4, 29.9, 29.5, 28.3, 28.1, 26.72, 26.67, 24.4, 22.8, 21.2, 19.3, 18.6, 18.4, 15.9, 15.6, 14.3
实施例 9、 式 IV-3和式 IV-2合物的制备
反应
化合物 17 ( 60mg) ， 三氯乙腈糖供体 （130mg， 1.3eq) 和活化过的 3A分 子筛溶于无水二氯甲垸中， 氮气保护， 在冰浴条件下， 加入 （3uL， 10% ) 的 TMSOTf, 室温搅拌 lh。 加入 1当量三乙胺中和未反应的原料。 反应液用饱和碳 酸氢钠溶液洗涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采 用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 10: 1 ) ， 得化合物 18 ( 118mg) ， 产率 85%
1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 8.00 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.55-7.50 (m, 3H), 7.44- 7.33 (m, 10H), 7.30-7.26 (m, 2H), 5.92 (t, J = 9.7 Hz, IH), 5.58 (t, J = 9.7 Hz, IH), 5.50 (t, J = 8.4 Hz, IH), 5.00 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.60-4.56 (m, IH), 4.50-4.45 (m, IH), 4.19-4.15 (m, IH), 2.62-2.54 (m, IH), 2.42-2.37 (m, IH), 1.20 (s, 6H), 1.12 (s, 3H), 1.09 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 0.84 (s, 3H), 0.72 (d, = 6.1 Hz, 3H), 0.67 (s, 3H). 化合物 18 ( lOOmg) 溶于甲醇 （5mL) ， 硼氢化钠 （lOmg) 加入到反应体 系中， 室温下搅拌 30 分钟， 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 无水碳酸钠干 燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙 酯 5 : 1 ) ， 得化合物式 IV-3 ( 95mg) ， 产率 95%。
化合物式 IV-3 : 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 8.00 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.55-7.50 (m, 3H), 7.44-7.33 (m, 10H), 7.30-7.26 (m, 2H), 5.92 (t, J = 9.7 Hz, IH), 5.58 (t, J = 9.7 Hz, IH), 5.50 (t, J = 8.4 Hz, IH), 5.00 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.60-4.56 (m, IH), 4.50-4.49 (m, IH), 4.17-4.15 (m, IH), 3.24-3.22 (m, IH), 0.64 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDCI3) δ (ppm) 166.21, 165.9, 165.4, 165.0, 134.49, 133.52, 133.28, 133.18, 129.93, 129.87, 129.79, 129.73, 129.55, 129.00, 128.92, 128.52, 128.44, 128.41, 128.38, 95.91, 79.06, 78.92, 73.25, 72.14, 72.10, 70.32, 63.81, 50.61, 50.50, 49.86, 44.51, 42.84, 38.99, 37.10, 36.69, 36.50, 35.70, 31.05, 30.91, 28.28, 28.07, 27.95, 27.19, 26.59, 25.31, 24.37, 21.09, 20.70, 19.25, 18.64, 18.35, 15.85, 15.54. 化合物式 IV-3 ( 58mg ) 溶于 DCM/MeOH(l : 3)溶液中， 加入甲醇钠 ( 6mg) ， 室温反应 3h， 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 二氯甲垸萃取， 无水 碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油 醚： 乙酸乙酯 5 : 1 ) ， 得化合物式 IV-2 (28mg) ， 产率 80%。
化合物式 IV-2: 1H-NMR (400 MHz, CD 3 OD/ CDC1 3 (2: 1)) δ (ppm) 4.43 (d, J = 7.7 Ηζ, ΙΗ), 3.79-3.77 (m, IH), 3.70-3.66 (m, IH), 3.38-3.35 (m, 2H), 3.24-3.23 (m, IH), 3.18-3.14 (m, 2H), 0.85 (s, 3H), 0.77 (s, 3H), 0.67 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz: CD3OD/ CDCI3 (2: 1)) δ (ppm) 135.05, 134.91, 97.67, 79.10, 79.00, 77.22, 76.32, 74.25, 70.94, 62.41, 51.16, 51.06, 50.32, 49.63, 48.36, 45.00, 42.90, 39.34, 37.51, 37.35, 37.07, 36.24, 31.55, 31.32, 30.14, 28.74, 28.24, 27.82, 27.01, 26.72, 26.37, 24.55, 21.49, 19.44, 19.00, 18.78, 16.09, 15.80.
实施例 10、 式 IV-17所示化合物的制备 反应方程式如下所示:
化合物 19 ( 50mg) 溶于四氢呋喃溶液， 顺丁烯二酸甲酯 （1.2eq) 和三正丁 基膦相继加入到反应体系中， 室温搅拌 4小时反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石 油醚： 乙酸乙酯 10: 1 ) ， 得化合物 20， 产率 65% ( Z/E构型 9: 1 ) 。 化合物 20 溶于 10%的氢氧化钾乙醇溶液中， 90°C加热， 反应 2个小时， 反应结束后， 乙醇 溶液在旋转蒸发仪上蒸干， 加入稀盐酸调节 PH值到酸性， 用 DCM萃取， 有机 相用无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 (二氯甲垸： 甲醇， 20: 1 ) ， 得化合物 IV-17产率 90%。
化合物式 IV-17: 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 12.20(s, 1H), 6.75 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 3.18 (s, 2H), 3.02-2.97 (m, 1H), 0.69 (s, 3H), 0.65 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 171.97, 168.09, 144.48, 134.32, 133.53, 126.42, 76.76, 50.04, 49.76, 49.38, 44.06, 38.53, 36.55, 35.72, 35.20 34.51, 31.94, 30.50, 30.41, 28.11, 27.63, 27.57, 26.01, 25.13, 24.03, 20.51, 18.99, 18.32, 17.89, 15.83, 15.57.
实施例 11、 式 IV-21所示化合物的制备
反应方程式如下所示：
化合物 21溶于 THF中， N-羟基琥珀酰亚胺 （1.5当量） 禾 P DCC ( 1.5当量） 加入到反应体系中， 室温搅拌 12小时， 反应也采用二氯甲垸和饱和碳酸氢钠萃 取， 有机相用无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅 胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯， 10: 1 ) ， 得化合物 22， 产率 80%。 化合物 22 溶于甲醇之中， 盐酸羟胺 （10 当量） 和醋酸钠 （10 当量） 加入到反应体系中。 室温反应过夜， 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 采用硅胶柱分离 （DCM/MeOH 20 : 1 ) ， 得到化合物 IV-21 , 产率 80%。 化合物式 IV-21 : 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 12.20(s, 1H), 6.75 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 3.18 (s, 2H), 3.02-2.97 (m, 1H), 0.69 (s, 3H), 0.65 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 171.97, 168.09, 144.48, 134.32, 133.53, 126.42, 76.76, 50.04, 49.76, 49.38, 44.06, 38.53, 36.55, 35.72, 35.20 34.51, 31.94, 30.50, 30.41, 28.11, 27.63, 27.57, 26.01, 25.13, 24.03, 20.51, 18.99,
化合物 23溶于 ImL 甲苯溶液中， 吡啶 （50当量） 、 醋酸酐 （50当量） 和 三氧化硫吡啶 （3 当量） 加入到反应溶剂中， 60°C反应 4小时， 随后过滤得到白 色固体即为磺酸衍生物的吡啶盐。 所得吡啶盐化合物 24 ( 66 mg, O. lmmol ) 溶于 DCM ( 3 mL) 中， 在反应体系中加入 Et 3 N ( 304 uL， 20.0 eq) ， 反应液在室温 下搅拌 4h。 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （二氯甲垸： 甲醇 10： 1 ) ， 得产物式 IV-24 ( 16 mg) ， 产率 20%。
1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 3.95-3.91 (dd, J = 15.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1H), 3.24-3.18 (q, 10H), 1.33-1.29 (t, 18H), 0.94-0.92 (t, 6H), 0.86 (d, 3H), 0.74 (s, 3H); "C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 135.83, 135.76, 87.51, 85.73, 52.40 51.97, 50.99, 47.92, 45.68, 44.05, 39.62, 38.05, 37.79, 36.70, 32.27, 31.88, 29.26 28.67, 27.53, 26.90, 25.82, 24.64, 22.07, 21.97, 19.62, 19.38, 19.21, 16.76, 16.31. 实施例 13、 式 V -l所示化合物的制备
化合物 25 (44mg) 、 三氯乙腈糖供体 （185mg， 2.5eq) 和活化过的 3A 分子筛 (lOOmg)溶于无水二氯甲垸 (10ml)中， 氮气保护， 室温搅拌 30min。 在冰浴 条件下， 加入 （4uL， 20%) 的 TMSOTf, 室温搅拌 lh。 加入 1当量三乙胺中和 未反应的原料。 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再用旋 转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 10: 1 ) ， 得 化合物 26 ( 133mg) ， 产率 80%。
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 8.09-7.82 (m, 14H), 7.57-7.28 (m, 26H), 5.92 (td, J = 9.7 Hz, J = 2.2 Hz, 2H), 5.58 (t, J = 9.5 Hz, 3H), 5.51 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 5.00 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.86 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.61-4.45 (m, 4H), 4.16-4.09 (m, 3H), 3.13-3.09 (m, 1H), 0.80 (s, 3H), 0.74 (d, = 6.0 Hz, 3H), 0.66 (s, 3H), 0.61 (s, 3H)
化合物 26 ( lOOmg ) 溶于 DCM/MeOH(l： 3)溶液中， 加入甲醇钠 ( 6mg) ， 室温反应 12h， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱 分离 （甲醇： 二氯甲垸 10: 1 ) ， 得化合物式 V -l ( 39mg) ， 产率 80%。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD/CDCI3 (2: 1)) δ (ppm) 4.43 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 3.80-3.69 (m, 4H), 3.39-3.35 (m, 3H), 3.24 (s, 3H), 3.18- 3.16 (m, 2H), 1.03 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.88-0.84 (m, 12H), 0.67 (s, 3H)
实施例 14、 式 V -3所示化合物的制备
反应方程式如下所示：
化合物 27 ( 1.0当量） 、 乙酰氯 （5.0当量） 、 三乙胺 （5.0当量） 禾 P DMAP ( 0.25当量） 溶于适量 DCM中， 室温搅拌反应 24小时。 反应完成后采用二氯甲 垸萃取所得产物， 饱和碳酸氢钠洗涤。 无水碳酸钠干燥， 然后用旋转蒸发仪蒸干 溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 50: 1 ) ， 得化合物 28， 产 率为 50%。 所得化合物 （1.0当量） 和硼氢化钠 （2.0当量） 溶解到适量甲醇中， 室温搅拌 1 小时， 旋干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 50： 1 ) ， 得化合物 29， 产率为 90%。
1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 3.25-3.21 (m, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.42 (s,
6H), 1.00 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 0.81 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDCI3) δ (ppm) 170.6, 134.6, 82.7, 79.1, 50.7, 50.6, 50.0, 44.7, 41.3, 39.0, 37.2, 36.6 36.5, 35.8, 31.2, 31.0, 29.8, 28.4, 28.1, 28.0, 26.7, 26.2, 24.4, 22.6, 21.2, 20.8, 19.3, 18.8, 18.4, 15.9, 15.6.
化合物 29 ( 1.0当量） 、 三氯乙腈糖供体 （2.0当量） 和活化过的 3A分子筛 溶于无水二氯甲垸中， 氮气保护， 室温搅拌 30min。 在冰浴条件下， 加入 (20%) 的 TMSOTf, 室温搅拌 lh。 加入 1当量三乙胺中和未反应的原料。 反应 液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 10 : 1 ) ， 得化合物 30， 产率 80%。 所得化合物 30 ( 1.0 当量） 溶于 DCM/MeOH(l : 3)溶液中， 加入甲醇钠 ( 5 当量） ， 室温反应 12h， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶 柱分离 （甲醇： 二氯甲垸 10: 1 ) ， 得化合物 31， 产率 80%。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD/CDCI3 (2: 1)) δ (ppm) 4.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.80-3.59 (m, 4H), 3.38-3.37 (m, 2H), 3.23 (s, 2H), 3.14-3.13 (m, 1H), 1.93 (s, 3H), 0.64 (s, 3H). 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD/ CDC1 3 (2: 1)) δ (ppm) 170.7, 133.8, 104.5 89.4, 82.4, 75.8, 74.9, 73.5, 69.6, 61.3, 50.1, 49.9, 49.1, 48.9, 48.6, 48.4, 48.2, 48.0, 47.8, 47.6, 43.8, 40.5, 38.5, 36.1, 35.8, 35.7, 35.0, 30.4, 30.1, 29.0, 27.5, 27.0, 25.9, 25.8, 25.2, 23.5, 21.7, 20.3, 20.0, 18.4, 17.9, 17.4, 15.5.
化合物 31 ( 1当量） 溶于水 /甲醇 /THF ( 1： 1： 2) 的混合溶液中， 氢氧化锂 (2.0当量） 加入到反应体系中， 反应 55摄氏度搅拌 24小时。 采用旋转蒸发仪 旋干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （DCM/MeOH 10： 1 ) ， 得化合物式 V -3， 产率为 56%。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD/CDCI3 (2: 1)) δ (ppm) 3.85-3.52 (m, 3H), 3.45-3.39 (m, 2H), 3.29 (s, 2H), 3.19-3.15 (m, 1H), 0.69 (s, 3H).
实施例 15、 式 V -4所示化合物的制备
化合物 IV-10 ( 1.0当量） 、 碘甲垸 （2.0当量） 、 碳酸钾 （2.0当量） 和 DMF 加入到圆底烧瓶中， 50°C搅拌过夜， 采用二氯甲垸萃取所得产物， 水洗除去 DMF。 无水碳酸钠干燥， 然后用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 (石油醚： 乙酸乙酯 50: 1 ) ， 得化合物 32， 产率为 80%。
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 6.99-6.95 (m, 1H), 5.81 (d, J = 15.6 Hz,
1H), 3.71 (s, 3H), 3.26-3.18 (m, 1H), 0.68 (s, 3H).
化合物 32 ( 1.0当量） 、 三氯乙腈糖供体 （1.3当量） 和活化过的 3A分子筛 溶于无水二氯甲垸中， 氮气保护， 在冰浴条件下， 加入 TMSOTf ( 0.1 当量） ， 室温搅拌 lh。 加入 1 当量三乙胺中和未反应的原料。 反应液用饱和碳酸氢钠溶 液洗涤， 无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱 分离 （石油醚： 乙酸乙酯 10: 1 ) ， 得化合物 33， 产率 70%。 随后该化合物 33 ( 1.0 当量） 溶于 DCM/MeOH(l : 3)溶液中， 加入甲醇钠 （5 当量） ， 室温反应 3h, 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 二氯甲垸萃取， 无水碳酸钠干燥， 然后再 用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 5 : 1 ) ， 得化合物 34产率 81%。
化合物 34: 1H-NMR (400 MHz, CD 3 OD/ CDCI3 (2: 1)) δ (ppm) 6.99-6.95 (m, 1H), 5.81 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.79-3.77 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.70-3.66 (m, 1H), 3.38-3.35 (m, 2H), 3.24-3.23 (m, 3H), 3.18-3.14 (m, 1H), 0.67 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CD3OD/ CDCI3 (2: 1)) δ (ppm) 167.7, 150.8, 134.4, 134.2, 120.3, 105.1, 90.0, 76.4, 75.5, 74.0, 70.1, 61.9, 51.4, 50.6, 50.2, 49.7, 44.4, 39.0, 36.6, 36.1, 35.5, 34.4, 30.9, 30.7, 29.6, 29.2, 28.1, 27.6, 26.5, 26.3, 24.1, 20.9, 19.0, 18.3, 18.0, 16.1, 15.6.
化合物 34 ( 1.0 当量） 溶于甲醇 /THF/水 （1/2/1 ) 的混合溶剂中， 氢氧化锂 (2.0当量） 加入到上述溶液中， 55摄氏度反应 6小时。 反应结束后加入 1M盐 酸调节溶液 pH值至酸性， 过滤得到白色固体。 所得固体采用反相填料柱分离纯 化 (Daisogel, SP-120-50-ODS RPS ) 。
化合物式 V -4 : 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm) 6.29-6.18 (m, 1H), 5.68 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.68-3.62 (m, 1H), 3.18-2.95 (m, 7H), 0.84 (s, 3H), 0.67 (s, 3H)
实施例 16、 式 W所示化合物的制备
将 250 mg豆甾醇 （式 35所示） 溶于 5 ml吡啶中， 加入 116 mg TsCl， 8 mg DMAP催化， 室温下搅拌 12h后， TLC监测反应完全。 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸萃取， 分离有机相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分离纯化得到 190mg化合 物式 36。
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7.79(d, J = 8.24 Hz, 2 H), 7.32(d, J = 8.08 Hz, 2 H), 5.29-5.29(m, 1 H), 5.14-5.10(m, 1 H), 5.04-4.97(m, 1 H), 2.46-2.39(m, 4 H), 2.28-2.23(m, 1 H), 2.04-1.91(m, 4 H), 0.67(s, 3 H);
13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 144.5, 138.9, 138.4, 134.8, 134.8, 129.8, 129.4, 127.7, 123.6, 82.46, 56.8, 56.0, 51.3, 50.0, 42.3, 40.6, 39.6, 39.0, 37.0, 36.6, 36.4, 32.0, 31.9, 31.8, 29.0, 28.7, 25.5, 24.4, 21.7, 21.3, 21.2, 21.1, 19.2, 19.1, 12.4, 12.1;
将 190mg化合物式 36溶于 5 ml甲醇中， 加入 190 mg醋酸钾， 加热回流 3 小时。 TLC监测反应完全。 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸萃取， 分离有机 相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分离纯化得到 109mg化合物式 37。
1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 5.18-5.12(m, 1H), 5.04-4.98(m, 1H), 3.32(s, 3H), 2.76(dd, J = 2.5 Hz, J' = 2.5 Hz, 1H), 0.74(s, 3H), 0.66(dd, J = 4.5, J' = 4.5 Hz, 1H), 0.44(dd, J = 8.0 Hz, Γ = 5.0 Hz, 1H)
13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 138.4, 129.2, 82,4, 56.7, 56.6, 56.1, 51.3:
48.1, 43.4, 42.7, 40.6, 40.2, 35.3, 35.0, 33.4, 31.
将 70mg化合物式 37溶于 4ml二氯甲垸中， 冰浴下加入 33mg间氯过氧苯甲 酸， 15mg碳酸氢钠搅拌 10分钟， 然后允许恢复室温搅拌 12小时。 12小时后 TLC监测反应完全， 加入 1 ml水终止反应。 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸 萃取， 分离有机相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分离纯化得到 42mg化合物式 38。
将化合物式 38溶于 5ml 1,4-二氧六环水溶液中 （1， 4-二氧六环： 水 =4: 1 ) ， 加入一水合对甲苯磺酸 5mg， 80°C下搅拌 10小时， TLC监测反应完全， 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸萃取， 分离有机相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分 离纯化得到 20mg化合物式 W。
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 5.35(d, J = 4.80 Hz, 1 H), 3.56-3.50(m, 1 H), 2.74(dd, Jl = 7.04 Hz, J2 = 2.00 Hz, 1 H), 2.49(d, J = 3.56 Hz, 1 H), 0.68(s, 3 H);
13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 140.93, 121.72, 71.92, 62.28, 56.50, 53.56, 50.21, 48.45, 42.78, 42.41, 39.70, 38.86, 37.37, 36.63, 32.00, 31.78, 29.29, 28.09, 24.70, 21.17, 21.00, 20.34, 19.70, 19.54, 16.36, 12.63, 11.99.
实施例 17、 式環所示化合物的制备
反应方程式如下所示：
将 90.5 mg化合物式 38溶于 5ml二氯甲垸中， 冰浴下加入 120mg三氯化 铝， 90m四氢铝锂搅拌 10分钟， 然后置于 80°C下搅拌 2小时， TLC监测反应完 全， 加入 1 ml水终止反应。 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸萃取， 分离有机 相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分离纯化得到 70mg化合物式 39。
将化合物式 39溶于 5ml 1,4-二氧六环水溶液中 （1， 4-二氧六环： 水 =4: 1 ) ， 加入一水合对甲苯磺酸 16mg， 80°C下搅拌 10小时， TLC监测反应完全， 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸萃取， 分离有机相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分 离纯化得到 30mg式環所示化合物。
1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 5.34(s, 1 H), 3.91(t, J = 6.66 Hz, 1 H),
3.56-3.48(m, 1 H), 2.32-2.19(m, 2 H), 0.06(s, 3 H);
13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 140.89, 121.79, 71.91, 70.76, 57.06, 56.84, 50.20, 49.37, 42.67, 42.54, 42.42, 39.91, 37.37, 36.62, 34.34, 32.00, 31.78, 28.74, 28.62, 24.42, 21.28, 21.20, 19.56, 18.47, 13.99, 11.96.
实施例 18、 式 IX和式 X所示化合物的制备
将 106mg化合物 40于 5ml THF中， 于冰浴条件下缓慢加入 90mg四氢铝 锂， 加完后允许恢复至室温并回流搅拌 1.5小时， TLC监测反应完全， 加入 1 ml 水终止反应。 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸萃取， 分离有机相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分离纯化得到 90mg式 IX所示化合物和 13mg式 X所示化合物。
式 IX所示化合物： 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.07-4.05(m, 1 H), 2.71(d, J = 6.76 Hz, 1 H), 2.47(d, J = 8.68 Hz, 1 H), 1.97-1.81(m, 5 H), 0.63(s, 3 H);
1 3 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 75.39, 67.34, 63.22, 62.24, 58.65, 56.21, 55.88, 53.58, 53.54, 48.86, 48.38, 45.99, 45.90, 44.00, 43.15, 43.11, 40.02, 39.90, 38.98, 38.88, 38.80, 34.83, 34.50, 30.95, 30.91, 29.41, 29.22, 28.05, 27.19, 26.02, 24.46, 24.42, 21.45, 21.40. 21.02, 20.96, 20.29, 19.66, 19.55, 19.45, 16.33, 16.25, 12.57, 12,47, 12.36, 12.21.
式 X所示化合物： 1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 3.80(s, br, 1H), 3.69- 3.60(m, 1H), 2.74(d, J = 6.12 Hz, 1 H), 2.49(d, J = 7.88 Hz, 1 H), 0.68-0.66(m, 6 H);
13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 72.15, 71.85, 67.49, 63.25, 62.78, 58.71,
57.16, 56.31, 55. 91, 54.44, 54.36, 48.93, 48. .45, 47.52, 46.00, 43.17, 40.18, 39.97,
39.80, 39.04, 38. .76, 38.67, 35.54, 34.54, 34. .37, 31.65, 31.03, 30.94, 30.53, 29.75,
29.48, 29.30, 27. ■22, 26.06, 24.62, 24.23, 21. .49, 21.21, 21.09, 20.31, 20.06, 19.58,
19.51, 18.49, 16. .42, 15.93, 12.53, 12.39, 12. .24.
实施例 19、 式 XI所示化合物的制备
反应
将 200mg豆甾醇 35溶于 7ml二氯甲垸中， 于冰水浴条件下加入 300mg间氯 过氧酸 （85% ) 和 164mg碳酸氢钠， 搅拌 1 小时后恢复至室温继续搅拌 12小 时， TLC监测反应完全。 用饱和碳酸氢钠水溶液、 二氯甲垸萃取， 分离有机相， 旋转蒸干， 硅胶色谱柱分离纯化得到 126mg式 XI所示化合物， 其中包含 4种异 构体。
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 0.61 (m, 3H), 0.95 (m, 3H), 1.05 (s, 3H), 2.91 (d, J = 4.3 Hz, 1H,), 3.06 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.61-3.78 (m, 1H), 3.81-3.99 (m, 1H);
13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 12.01, 12.15, 12.53, 12.66, 16.08, 16.36, 16.45, 19.51, 19.59, 19.68, 20.38, 20.75, 20.80, 20.98, 21.07, 24.42, 24.27, 27.04, 27.94, 28.91, 29.29, 29.46, 30.03, 31.17, 32.56, 35.01, 38.89, 39.01, 39.34, 39.35, 39.96, 42.70, 42.81, 42.81, 42.83, 48.43, 48.91, 53.26, 55.91, 56.58, 56.61, 58.74, 59.41, 59.48, 62.26, 62.42, 63.28, 65.96, 68.74, 1 1.90， 12.61， 16.25， 17.22， 19.75， 20.33， 22.09， 22.14， 24.60， 27.19， 29.94， 32.72， 37.41， 38.70， 42.33， 51.44, 51.53, 53.62 , 55.97, 56.22, 63.18, 63.8, 69.48.
实施例 20、 式 ΧΠ所示化合物的制备
反应方程式如下所示：
化合物 41 (1.0当量） 、 醋酸钯 （0.1当量） 、 碘苯二乙酸 （2.0当量） 和醋酸 / 醋酸酐的混合溶液加入到密封管中， 将磁子加入到密封管中， 密封后在 80摄氏度 反应， TLC检测反应进程， 反应完成后， 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 无水 硫酸钠干燥， 旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离 （石油醚： 乙酸乙 酯 10: 1) ， 得化合物式 XL 产率 50%。
1H-NMR (400 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 4.64 (d, J = 11.56 Hz, 1 H), 4.45 (d, J = 11.16 Hz, 1 H), 4.27 (d, J = 11.48 Hz, 1 H), 4.00 (d, J = 11.16 Hz, 1 H), 3.78 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 0.78 (s, 3H); 13 C-NMR (100 MHz, CDC1 3 ) δ (ppm) 171.1, 170.9, 157.2, 135.2, 133.5, 71.2, 65.1, 64.0, 61.7, 50.6, 50.0, 47.1, 45.8, 44.6, 44.5, 36.8, 36.7, 36.6, 34.4, 31.1, 31.0, 29.5, 29.3, 28.3, 26.5, 24.3, 21.3, 21.2, 21.1, 21.0, 19.2, 19.0, 18.8, 16.0.
本测试例用到的部分实验材料来源：
高纯度羊毛甾醇 （L5768) 、 胆固醇 （C3045) 、 二甲基亚砜 （D8418) 、 多 聚甲醛、 Triton X-100和 NP-40 (Nonidet P40) 购买自 Sigma公司。
DAPI-Fluoromount-G 荧光封片剂 （ 0100-20 ) 购买自 SouthernBiotech (SBA) 。
Anti-p62抗体 (ab56416) 购买自 Abeam公司。
羊毛甾醇粗品购买自 TCI (C0427) ， 纯度 >50.0% (GC) 。
细胞培养基、 抗生素、 转染试剂 Lipofectamine™ 2000均购买自 Invitrogen 公司。
Cell counting kit-8 (CK04-500) 购买自日本同仁化学。
其他未注明具体来源的化学试剂均为分析纯。
晶状体蛋白 aA-Y118D、 aB-R120G pB2-V187E yC-G129C禾 P yD-W43R 突变体为本研究组克隆构建， 具体过程如下：
将 DNA分子 1插入 pEGFP-Nl载体 （Clontech) 的 Xho /和 BamH /酶切位 点之间， 得到重组质粒 1。 DNA分子 1: 将序列表的序列 1所示的 DNA分子的 第 354位核苷酸由 T突变为 G (相应的第 118位氨基酸由 Y突变为 D) 得到的 DNA分子。 序列表的序列 1所示的 DNA分子为 CRY-aA的开放阅读框。
将 DNA分子 2插入 pEGFP-Nl载体 （Clontech) 的 Xho /和 ffind/膽切位 点之间， 得到重组质粒 2。 DNA分子 2: 将序列表的序列 2所示的 DNA分子的 第 360位核苷酸由 A突变为 G (相应的第 120位氨基酸由 R突变为 G) 得到的 DNA分子。 序列表的序列 2所示的 DNA分子为 CRY-αΒ的开放阅读框。
将 DNA分子 3插入 pEGFP-Nl载体 （Clontech ) 的 Xho /和 ffind/膽切位 点之间， 得到重组质粒 3。 DNA分子 3 : 将序列表的序列 3所示的 DNA分子的 第 562位核苷酸由 T突变为 A (相应的第 187位氨基酸由 V突变为 E) 得到的 DNA分子。 序列表的序列 3所示的 DNA分子为 CRY-pB2的开放阅读框。
将 DNA分子 4插入 pEGFP-Nl载体 （Clontech ) 的 Xho /和 ffind/膽切位 点之间， 得到重组质粒 4。 DNA分子 4 : 将序列表的序列 4所示的 DNA分子的 第 387位核苷酸由 G突变为 T (相应的第 129位氨基酸由 G突变为 C ) 得到的 DNA分子。 序列表的序列 3所示的 DNA分子为 CRY-yC的开放阅读框。
将 DNA分子 5插入 pEGFP-Nl载体 （Clontech ) 的 Xho /和 ffind/膽切位 点之间， 得到重组质粒 5。 DNA分子 5 : 将序列表的序列 5所示的 DNA分子的 第 129位核苷酸由 T突变为 C (相应的第 43位氨基酸由 W突变为 R) 得到的 DNA分子。 序列表的序列 3所示的 DNA分子为 CRY-γϋ的开放阅读框。
HeLa (ATCC®CCL-2™) , 人类晶状体上皮细胞 HLE-B-3(ATCC® CRL-
1 142 1 TM)均购买自 ATCC细胞库， 培养条件按 ATCC公司所建议的条件进行。
本发明测试例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件。
实施例 21、 本发明化合物对晶状体蛋白突变体在细胞内聚 集的影响 本实施例用以下方法来测定本发明化合物对晶 状体蛋白 aA-Y1 18D、 αΒ- R120G、 βΒ2-νΐ87Ε、 yC-G129C禾 Ρ yD-W43R突变体在 HeLa细胞内聚集情况的 影响。
测试中以溶剂 DMSO为空白对照， Lanosterol (羊毛甾醇， 如式 A所示） 为 阳性对照， Cholesterol (胆固醇） 为阴性对照， 并测试了现有化合物 C29 ( WO2014015024 ) 和羊毛甾醇 （ WO2016029197A1禾 P WO2016029199A1 ) ， 作 为本 。 具体方法如下：
C29 式 A
( 1 ) 以晶状体蛋白 (XB-R120G突变体为研究模型研究本发明化合物的 性能 晶状体蛋白 aB-R120G突变体在细胞内发生错误折叠， 形成显微镜下可见的 聚集小体， 如图 1所示， 其形成聚集小体的形态均一， 聚集比例稳定， 是研究化 学药物缓解蛋白质错误折叠的理想模型。 因此， 本发明首先采用晶状体蛋白 αΒ- R120G突变体为研究模型筛选有效的化合物。
具体实验方案如下：
将状态良好的 HeLa细胞接种到预先已铺好细胞爬片的 12孔板中， 细胞密度 40%~50%； 培养 24h左右， 细胞密度 80%左右， 即可以进行细胞转染， 具体操 作按照 Invitrogen公司的转染试剂 Lipofectamine TM 2000所建议方案进行； 转染 4h后， 换成 DMEM新鲜培养基继续培养 16h， 这时晶状体蛋白 aB-R120G突变 体在细胞内已大量表达， 形成一定比例的聚集小体； 将细胞培养基换做 opti- MEM， 并加入本发明化合物， 至终浓度为 4uM; 培养 4h后， 换成 DMEM新鲜 培养基， 再培养 4h; 进行免疫荧光标片的制备： PBS洗细胞爬片 3遍， 4%多聚 甲醛室温固定细胞 30分钟， PBS洗细胞爬片 3遍， 0.4% Triton X-100室温孵育 细胞爬片 15分钟， PBS洗细胞爬片 3遍， 4%山羊血清室温封闭 40分钟， p62抗 体室温孵育 1小时， PBS洗细胞爬片 3遍， 相应来源的荧光二抗室温孵育 40分 钟， PBS洗细胞爬片 3遍， 用 DAPI-Fluoromount-G荧光封片剂封片， 室温避光 放置 1 小时左右； 应用 Zeiss 710三通道显微镜进行观察， 采取单盲统计细胞内 的聚集情况， 分析本发明化合物的药效。
所有样品设三组平行实验， 并对实验进行了三次重复， 通过上述方法统计分 析本发明化合物对晶状体蛋白 （XB-R120G突变体在 HeLa细胞内聚集情况， 结果 如表 1中所示。
表 1 中数据显示， 本发明化合物对对晶状体蛋白 aB-R120G突变体在 HeLa 细胞内形成的聚集现象具有缓解作用， 尤其是式 IV-9、 式 IV-10、 式 IV-12、 式 IV-13、 式 IV-22、 式 IV-23所示化合物对晶状体蛋白 aB-R120G突变体在 HeLa 细胞内形成的聚集现象具有明显的缓解作用， 相对于化合物 C29和式 A所示化 合物具有更好的活性。
表 1本发明化合物对晶状体蛋白 (XB-R120G突变体在细胞内聚集影响的统计 化合物 \ 聚集比例 化合物 ！ 聚集比例
DMSO 71.8 式 IV-12 21.32
Lanosterol 46.82 式 IV-13 26.58
Cholesterol 69.65 式 IV-14 27.98
C29 29.67 式 IV-15 26.5 式 ΠΙ-1 54.1 式 IV-16 51.0 式 ΠΙ-2 44.6 式 IV-17 61.6 式 IV-1 36.1 式 IV-18 33.1 式 IV-2 43.84 式 IV-19 41.6 式 IV-3 73.7 式 IV-20 33.6 式 IV-4 61.4 式 IV-22 21.3 式 IV-5 36.6 式 IV-23 28.1 式 IV-6 31.2 式 IV-24 29.0 式 IV-7 34.4 式 IV-25 36.5 式 IV-8 24.8 式 V-l 31.7 式 IV-9 21.52 式 V-2 43.4 式 IV-10 21.36 式 V-3 57.3 式 VI-1 69.96 式 νπ 64.83 式 IX 74.6 式環 65.3 式 XI 64.1 式 X 57.6 式 IV-11 25.44 式) (Π 36.8
(2) 多种晶状体蛋白突变体中验证本发明化合物的 有效性。
晶状体内的蛋白质突变后发生错误折叠， 大多都会导致白内障疾病。 因此， 在多种晶状体蛋白突变体中验证本发明化合物 的药效是否具有普遍效应对白内障 疾病的治疗具有重要的意义。
除 αΒ R120G突变体外， 本发明选用了晶状体蛋白 αΒ R120G、 aA-Y118D、 βΒ2-νΐ87Ε、 yC-G129C和 Y D-W43R突变体对初步筛选有效的药物做进一 步验 证。 具体方案同药物筛选的过程。 通过进一步的验证， 如图 2所示的结果表明， 本发明式 IV-9、 式 IV-10、 式 IV-13和式 IV-23所示化合物在多种晶状体蛋白 ( aB R120G、 aA-Y118D、 βΒ2-νΐ87Ε、 Y C-G129C禾口 yD-W43R) 突变体形成聚 集的细胞模型中都具有明显的效果， 而化合物 C29仅对 α 晶状体蛋白 （αΒ R120G和（XA-Y118D) ) 突变体形成聚集的细胞模型有效， 因此本发明化合物相 对于现有化合物 C29具有更好的活性。
( 3 ) 初步标定本发明物的药效
本发明初步以晶状体蛋白 （XB-R120G突变体为研究模型， 标定本发明式 IV- 9、 式 IV-10、 式 IV-13和式 IV-23所示化合物的半效应浓度 EC50值， 如图 3所 示， 所有化合对比已有化合物羊毛 醇和 C29均有很大程度的活性提高， 例如羊 毛甾醇 EC50为 1.4uM， 式 IV-10的 EC50为 5.5nM有着数量级上的提升， 白内 障疾病的药物治疗具有巨大的潜力。
实施例 22、 本发明化合物细胞毒性的检测
安全有效的药物是本发明的研究原则， 本发明将进一步检测本发明式 IV-9、 式 IV-10、 式 IV-13和式 IV-23所示化合物对细胞是否具有细胞毒性。 测试设立 1 个对照组， 转染空载体的 HLE-B3 细胞； 5 个实验组， 转染晶状体蛋白 αΑ- Y118D、 aB-R120G pB2-V187E yC-G129C禾 P yD-W43R突变体的 HLE-B3细 胞， 模拟不同晶状体蛋白突变导致的白内障疾病。
用以下方法检测本发明化合物对不同细胞株的 细胞毒性：
将状态良好的 HLE-B3 细胞接种到 12孔板中， 细胞密度 40%~50%； 培养 24h左右， 细胞密度 80%左右， 即可以进行细胞转染， 分别转染晶状体蛋白 aA- Y118D、 aB-R120G pB2-V187E yC-G129C禾 P yD-W43R突变体， 及一个空载 对照组。 具体操作按照 Invitrogen公司的转染试剂 Lipofectamine™ 2000所建议 方案进行； 转染 4h后， 换成 DMEM新鲜培养基继续培养 16h， 这时晶状体蛋白 突变体在细胞内已大量表达； 用 0.25%胰酶 （EDTA) 消化吹散后， 接种到 96孔 板， 每孔 2000细胞， 继续培养 12小时； 将细胞培养基换做 opti-MEM， 并加入 本发明化合物， 设定两个浓度梯度， 终浓度为 5uM或 50nM， 孵育 12小时； 加 入 l(^L CKK-8， 孵育 1小时， 450nm测吸收值。
所有样品设三组平行实验， 并对实验进行了三次重复， 通过上述方法统计分 析本发明化合物对正常晶状体上皮细胞以及转 染各种晶状体蛋白突变体的细胞株 均不存在细胞毒性， 反而在一定程度上提高了细胞活力， 结果如图 4所示。
实施例 23、 本发明化合物的水溶性指数测定
本发明测试了化合物的油水分配系数 （LogP和 CLogP) ， 各化合物的测试 结果如下：
羊毛甾醇： LogP为 8.17， CLogP为 10.593。
化合物 C29: LogP为 5.98， CLogP为 7.313。
式 V -4所示化合物： LogP为 5.15。
式 V -1所示化合物： CLogP为 6.4461。
由上述测试结果可以看出， 本发明化合物中部分化合物较现有化合物 （C29 和羊毛 醇） 具有更好的水溶性。
因此， 本发明提供的小分子化合物可以应用到预防或 者治疗白内障的眼药水 开发中， 小分子好的溶解度会利于眼药水的配制。 另外， 好的溶解度会增加药物 在白内障晶状体内的浓度， 提高药物的功效。
工业应用
本发明具有如下有益效果：
本发明提供的具有新颖结构的小分子， 与现有的小分子 （如 C29， Science, 350, 674 ) 相比， 在抑制细胞内晶状体蛋白突变导致的蛋白聚集 具有更好的活 性， 且提高药物的可被机体吸收性， 并且对正常晶状体细胞没有毒副作用。
Next Patent: SHIFT REGISTER CIRCUIT AND DISPLAY PANEL USING SAME