COMPUESTO PARA EL ETIQUETADO DE BIOMOLECULAS BASADO EN VINILSULFONA. PREPARACIóN Y USOS

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) que contiene una molécula etiqueta y un grupo vinilsulfona, cuya función es llevar a cabo Ia unión covalente a las moléculas susceptibles de etiquetado. La presente invención también se refiere a sus procedimientos de obtención y a sus usos. Más particularmente, se refiere al uso de estos compuestos, conteniendo un fluoróforo, para el etiquetado de biomoléculas y a sus aplicaciones biotecnológicas.

(O

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

El etiquetado de biomoléculas es una herramienta básica en el campo de Ia genómica y Ia proteómica para Ia detección, purificación y estudio de interacciones entre biomoléculas.

De entre Ia gama de etiquetados de biomoléculas que son plausibles, destacan por su especial importancia los etiquetados con fluoróforos y con biotina debido a sus aplicaciones biotecnológicas y su impacto comercial.

El etiquetado fluorescente es un elemento clave para Ia detección y análisis de biomoléculas (Patton, W. F. Electrophoresis (2000), vol. 21 , pp. 1123- 1144) y es el motor de una industria de miles de millones de euros. Las ventajas del etiquetado fluorescente, frente a métodos convencionales como son el azul Coomassie, Ia plata, el oro coloidal o Ia radioactividad son las siguientes:

-Detección rápida y de sensibilidad elevada: cada etiqueta fluorescente puede originar del orden de 10 ⁷ -10 ⁸ fotones por segundo. -Versatilidad: Distintos etiquetados originan distintos "colores", siendo posible realizar un etiquetado "policromático" como el empleado, por ejemplo, en Ia secuenciación de ADN (Smith, L., et al., Nature (1986), vol. 321 , pp. 674-679).

-Inercia: Tamaño y propiedades del fluoróforo raramente interfieren con Ia biomolécula marcada.

-Localización de Ia señal en el punto de etiquetado, a diferencia del etiquetado enzimático.

Sin embargo, su potencial va más allá de Ia detección pasiva dado que técnicas como Ia polarización de fluorescencia y FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer, también denominado Fórster Resonance Energy Transfer) permiten evaluar cambios conformacionales, interacciones entre proteínas o entre proteína y ligando. La medida de Ia polarización proporciona información sobre orientaciones y movilidad que permite estudiar las interacciones receptor-ligando (Jameson, D. M., Seifried, S. E., Methods (1999), vol. 19, pp. 222-233). FRET es una interacción entre fluoróforos en Ia cual Ia excitación pasa de un fluoróforo excitado (donante) a otro que se excita (aceptor) sin Ia emisión de un fotón. Esta interacción se produce cuando Ia longitud de onda de emisión del donante es muy próxima a Ia de excitación del aceptor y es muy dependiente de Ia distancia entre donante y aceptor, por Io que se ha empleado como regla (Remedios, CG. , Moens, P. D., J. Struct. Biol. (1995), vol. 115, pp. 175-185) para analizar cambios conformacionales e interacción entre biomoléculas.

Actualmente existe una gran cantidad y variedad de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de biomoléculas se encuentran el dansilo, Ia fluoresceína y Ia rodamina B, cuyas características fundamentales y algunas de sus aplicaciones se resumen en Ia tabla adjunta:

Por otro lado, el etiquetado con biotina también tiene gran importancia biotecnológica (Wilchek, M.; Bayer, E. A., Anal. Biochem. (1988), vol. 171 , pp. 1-32). La biotina es una molécula que actúa como coenzima de determinadas carboxilasas relacionadas con el metabolismo del dióxido de carbono. Sin embargo, su interés biotecnológico radica en Ia alta especificidad y afinidad que Ia avidina, estreptavidina y otras proteínas relacionadas presentan por esta biomolécula (constante de disociación del orden de 10 ^"15 M ^"1 ), haciendo que Ia interacción tenga Ia fortaleza de un enlace covalente sin serlo. Así, Ia biotinilización transforma moléculas

difícilmente detectables en sondas que pueden ser detectadas o capturadas con avidina/estreptavidina marcadas o inmovilizadas. Este principio es común para localizar antígenos en tejidos, células y para detectar biomoléculas en inmunoensayos y en pruebas de hibridación de ADN. Sin embargo, para determinadas aplicaciones, como por ejemplo Ia purificación mediante cromatografía de afinidad, se necesita que Ia interacción biotina-avidina sea reversible, para Io cual se puede modificar tanto Ia avidina (por nitrosación de las tirosinas del centro activo (Morag, E., et al., Biochem. J. (1996), vol. 316, pp. 193-199) como usar derivados de biotina (destiobiotina e iminobiotina). Existen biotinas marcadas fluorescentemente para cuantificar los sitios activos de Ia avidina (Gruber, H. J, et al., Biochim. Biophvs. Acta (1998), vol. 1381 , pp. 203-212) y biotina etiquetada con DNP (DNP-X-biocytin-X, US5180828A) (dinitrofenol), etiquetado versátil que además de actuar como cromóforo es reconocido por anticuerpos anti-DNP, permitiendo Ia correlación entre fluorescencia y estudios de microscopía electrónica. Existe también en el mercado peroxidasa de rábano picante (HRP) etiquetada con biotina.

Un aspecto fundamental de cara al uso de cualquier etiquetado es Ia unión a Ia biomolécula y Ia estabilidad de dicha unión. Desde un punto de vista químico existen cuatro grupos presentes en las biomoléculas susceptibles de actuar como dianas para el anclaje de los reactivos de etiquetado convenientemente derivatizados a través de Ia formación de un enlace covalente, como son las aminas, tioles, alcoholes y ácidos carboxílicos, que a continuación se detallan:

Aminas: Son Ia diana más común de los reactivos de modificación covalente y Ia principal en proteínas. En Ia mayoría de estas biomoléculas el extremo amino esta libre y además prácticamente todas tienen lisina, residuo en cuya cadena lateral hay un grupo ε-amino fácilmente modificable dado que se localiza mayoritariamente en Ia superficie de las proteínas. Estos grupos reaccionan con reactivos acilantes y Ia reactividad es dependiente del reactivo acilante, del tipo de amina, basicidad y pH de reacción. Las aminas alifáticas, como Ia de Ia cadena lateral de Ia lisina, son moderadamente básicas y reaccionan con Ia mayoría de los reactivos acilantes a pH superior a 8.

Tres son las derivatizaciones de los reactivos de etiquetado que reaccionan con las aminas de las biomoléculas:

- Succinimidil esteres. Reaccionan con aminas para originar amidas. Es Ia derivatización más frecuente dada Ia estabilidad del enlace amida que se genera. Reaccionan bien con aminas alifáticas y presentan baja reactividad con aminas aromáticas, alcoholes, fenoles (tirosina) e imidazoles (histidina). En presencia de fióles (cisteína) pueden formar tiosteres pero en proteínas el grupo acilo puede ser transferido a una amina vecina. Uno de los principales inconvenientes de los succinimidil esteres es su solubilidad, que en algunos casos puede ser muy baja. Por ello, en el mercado existen derivados de ácidos carboxílicos que pueden convertirse en sulfosuccinimidil esteres (Staros, J.V., et al., Anal. Biochem. (1986), vol. 156, pp. 220-222) o STP esteres (Gee, K.R., et al., Tetrahedron Lett. (1999), vol. 40, pp. 1471-1474), que son más polares, y por ello más solubles en agua, aunque también menos reactivos con aminas poco expuestas.

- Isotiocianatos. Reaccionan con aminas para formar tioureas, las cuales son razonablemente estables en Ia mayoría de los casos. - Cloruros de ácido sulfónico. Reaccionan con aminas y producen sulfonamidas. Son muy reactivos e inestables en medios acuosos, especialmente al pH alcalino necesario para que reaccionen con las aminas alifáticas, por Io que se trabaja a baja temperatura. Una vez conjugados el enlace es extremadamente estable y resistente. También reaccionan con fenoles (tirosina), alcoholes alifáticos (polisacáridos), tioles (cisteína), e imidazoles (histidina), aunque los conjugados con tioles e imidazoles son inestables y los conjugados con alcoholes alifáticos pueden sufrir desplazamientos nucleofílicos.

- Otras funcionalizaciones pueden ser: aldehidos y agentes arilantes. Aldehidos que reaccionan con las aminas para formar bases de Schiff. Se han preparado derivados del o-ftalaldehído (OPA), naftalendicarboxaldehído (NDA) y 3-acrilquinilencarbaxaldehído (OTTO- TAG) y se han empleado para cuantificación de aminas en solución (Liu, J., Hsieh, et al., Anal. Chem. (1991), vol. 163, pp. 408-412). Y agentes arilantes como el cloruro o fluoruro de 4-nitro-2,1 ,3-benzoxadiazol (NBD) (Watanable, Y., Imai, K., J. Chromatogr. (1982), vol. 239, pp. 723-732)

Tioles. Son dianas más selectivas que el grupo amino, pues son poco frecuentes en biomoléculas y para ser reactivos tienen que estar libres (no formar puente disulfuro). El grupo sulfhídrico puede ser introducido en Ia macromolécula a marcar vía modificación química, reducción de puentes disulfuro o vía inteína (Tan, L.P., Yao, S.Q., Protein and Pept. Lett. (2005), vol. 12, pp. 769-751) (en el caso de proteínas), o mediante mutagénesis dirigida para introducir cisteína. Los grupos tioles reaccionan a pH fisiológico (pH 6.5-8) con reactivos alquilantes (como son las yodoacetamidas y las maleimidas) o arilantes (como el 7-cloro ó 7-fluor-4-nitro-2,1 ,3-benzoxadiazol (NBD)), para originar tioéteres estables. Reaccionan también con muchos de los reactivos acilantes de aminas, incluyendo isotiocianatos y succinimidil esteres. También los disulfuros simétricos como Ia didansyl-L-cisteína o el ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) (DaIy, TJ. , et al., Biochemistrv (1986), vol. 25, pp. 5468-5474) reaccionan con los tioles para dar uniones de tipo disulfuro no simétrico.

Alcoholes. La función hidroxilo está presente en las cadenas laterales de Ia tirosina, serina y treonina, en esteróles y carbohidratos, pero su reactividad en soluciones acuosas es extremadamente baja, especialmente en proteínas por Ia presencia de nucleófilos más activos como las aminas y los tioles. Una función que reacciona específicamente con dioles vecinales es el ácido borónico y forma complejos cíclicos (Gallop, P. M., et al., Science (1982), vol. 217, pp. 166-169). Sin embargo, un procedimiento estándar para incrementar Ia reactividad, especialmente en el caso de carbohidratos, es Ia oxidación con peryodato para originar Ia función aldehido. Las principales funcionalizaciones de los reactivos de etiquetado que reaccionan con Ia función aldehido de las biomoléculas son: amina, hidrazidas, semicarbazida, carbohidrazida y O-alquilhidroxilaminas.

ácidos carboxílicos. Son abundantes en macromoléculas pero poco reactivos, por Io que es habitual derivatizarlos de forma tal que se introducen aminas que reaccionan con las funcionalizaciones anteriormente descritas.

Actualmente es posible adquirir comercialmente toda una gama de productos de etiquetado con fluorescencia y con biotina convenientemente derivatizados. La estrategia más frecuente para funcionalizar los reactivos de etiquetado es Ia derivatización como succinimidil esteres para reaccionar con las funciones aminas de Ia biomolécula.

Por otro lado, y desde una perspectiva química las sulfonas α,β- insaturadas (vinil sulfonas) son reconocidas como intermediarios sintéticos de gran utilidad debido fundamentalmente a su capacidad para participar en reacciones de adición 1 ,4 (aceptores de Michael). Adicionalmente, las vinilsulfonas son fáciles de preparar, a través de una amplia variedad de procesos sintéticos, y de manipular (Simphinks, N. S., Tetrahedron (1990), vol. 282, pp. 6951-6984). Estas características han encontrado recientemente utilidad en el diseño de fármacos y en química médica cuando se demostró su capacidad para inhibir de forma potente y reversible una variedad de procesos enzimáticos, fundamentalmente aquellos en los que están implicados cistein proteasas a las que se unen a través de reacciones de adición con el grupo tiol presente en el residuo de cisteína del sitio activo de estas enzimas (Meadows, D. C, et al., Med. Res. Rey, (2006), vol. 26(6), pp. 793-814).

Sin embargo, desde un punto de vista biotecnológico su potencial va más allá. La reactividad de las vinilsulfonas con biomoléculas se ha aprovechado para Ia introducción de polietilenglicol vía reacción con tioles (Morpurgo, M., et al., Bioconiuq. Chem. (1996) vol. 7, pp. 363-368), para Ia formación de hidrogeles mediante entrecruzamiento de péptidos con polietilenglicol funcionalizado con vinilsulfona (Rizzi, S. C, et al., Bíomacromolecules (2006), vol. 7, pp. 3019-3029) y para Ia introducción de moléculas de glucosa derivatizada con vinilsulfona vía reacción con las aminas de las proteínas (López-Jaramillo, et al., Acta Crvst. (2005) vol. F61 , pp. 435-438).

Como marcadores, se han descrito diferentes compuestos coloreados que contienen grupos vinilsulfona. En este sentido, Ia patente US4473693 describe colorantes, para el mareaje intracelular, basados en amarillo

Lucifer y que contienen un grupo vinilsulfona. En Ia patente EP0187076 se

describen compuestos fluorescentes que contienen un grupo vinilsulfona, estos compuestos son útiles para estudios ¡nmunológicos.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

En Ia presente invención se proporciona un nuevo compuesto de fórmula general (I) que comprende una molécula etiqueta, además de un grupo vinilsulfona, y que permite llevar a cabo el etiquetado de biomoléculas de una forma altamente eficaz y sencilla. Estos compuestos constituyen una alternativa a las derivatizaciones empleadas en proteómica y genómica para introducir un reactivo de etiquetado en biomoléculas.

Así, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a los compuestos de fórmula general (I) (a partir de ahora compuestos de Ia invención):

(i)

donde:

X se selecciona de entre NR, oxígeno (O) ó azufre (S), donde:

R es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre un grupo alquilo (C ₁ -C _1O ), hidroxialquilo o el grupo (CHaCHaO) _n CHaCHaOH; donde n toma valores de entre 2 y 20.

R ¹ es un grupo alquilo (C ₁ -C ₁₀ ), sustituido o no sustituido; preferiblemente R ¹ es un grupo alquilo (C ₂ -C ₆ ); más preferiblemente R ¹ es un grupo etilo (CH ₂ -CH ₂ );

Y no existe o es un grupo -SO ₂ R ² , donde R ² es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona del grupo que comprende las siguientes fórmulas: -CH ₂ CH ₂ OR ³ OCH ₂ CH ₂ , ó - (CH ₂ CH ₂ O) _m CH ₂ CH ₂ ; donde m toma un valor de entre 2 y 20; y

R ³ es un radial, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre los grupos alquilo (C-I-C-I _O ) ó dialquilarilo ((CrCio)Ar(Ci-Ci _O )); y

^- * representa una molécula etiqueta.

Cuando Y es un grupo -SO ₂ R ² , los compuestos de Ia invención tienen Ia siguiente fórmula general (II):

(II) donde: R ¹ , X y R ² están definidos anteriormente.

En una realización preferida, R ² es un grupo de fórmula - (CH ₂ CH ₂ θ) _m CH ₂ CH ₂ . En otra realización preferida, m puede tomar un valor de 2 a 10, más preferiblemente m es 2, 3, 4, 5 ó 6; y aún más preferiblemente m puede ser 2 ó 5.

Cuando Y no existe, los compuestos de Ia invención tienen Ia siguiente fórmula general (III):

(Hl)

donde: R ¹ y X están definidos anteriormente.

El término "alquilo" se refiere en Ia presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n- pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 2 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes como por ejemplo arilo, halógeno, hidroxilo,

alcoxilo, amino, etc.. Si están sustituidos por un hidroxilo se refiere a un "hidroxialquilo".

Por "dialquilarilo" se entiende en Ia presente invención a un grupo arilo que está sustituido con dos grupos alquilo que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente tiene de 1 a 5 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden ser iguales o diferentes, preferiblemente son ¡guales y por "arilo" se entiende en Ia presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 12 átomos de carbono, puede ser de anillo único ó múltiple, separados y/o condensados. Los grupos arilo típicos contiene de 1 a 3 anillos separados o condensados y desde 6 hasta 18 átomos de carbono de anillo, tales como radicales fenilo, naftilo, indenilo, fenantrilo o antracilo.

El término "molécula etiqueta" se refiere en esta descripción a cualquier sustancia biorreconocible, colorante, fluoróforo o cualquier otro grupo detectable por técnicas espectrofotométricas, fluorímétricas, de microscopía óptica, fluorescencia o confocal, anticuerpos y /o RMN, y que permite fácilmente Ia detección de otra molécula que por sí sola es difícil de detectar y/o cuantificar.

Preferiblemente, esta molécula etiqueta es un fluoróforo seleccionado del grupo de marcadores fluorescentes que son susceptibles de ser derivatizados para Ia introducción de un grupo hidroxilo, tiol o amina secundaria, con mantenimiento de sus propiedades fluorescentes. Más preferiblemente este fluoróforo es dansilo ó cualquiera de sus derivados.

Un segundo aspecto de Ia presente invención se refiere al método de obtención de los compuestos de Ia invención, es decir, de los compuestos de fórmula general (I), y que comprende reaccionar:

(a) una vinilsulfona funcionalizada de fórmula general (IV), para su unión con las moléculas de etiquetado:

^ _Y 'SO ₂ ^

(IV)

donde Y está definido anteriormente.

(b) con una molécula etiqueta o cualquiera de sus derivados funcionalizados, que contiene un grupo amino secundario, hidroxilo ó tiol, según Ia siguiente fórmula general (V):

H CZ>— N-R ¹ -XH

(V) donde X y R ¹ están definidos anteriormente.

Los compuestos (IV) y (V) reaccionan a través de una reacción de adición tipo Michael, según el siguiente esquema:

<d> — donde: X, Y y R ¹ están definidos anteriormente.

En una realización preferida, estos compuestos de fórmula general (IV), cuando Y es -SO ₂ R, se obtienen por reacción de divinilsulfona (DVS) con dioles (fórmula general (Vl)) en una proporción mayor o igual de 2:1 (>2:1) para dar bis-vinilsulfonas.

donde m toma valores de entre 2 y 20.

En una realización aún más preferida, estos dioles son etilenglicol (cuando m es 2) y tetraetilenglicol (cuando m es 5), es decir, las bis-vinilsulfonas de fórmula general (IV) son los siguientes compuestos:

De esta forma, se obtienen compuestos homod ¡funcionales altamente reactivos pero que permiten modular su reactividad mediante el control de

Ia estequiometria de los reactivos. Así, según el método de la presente invención las vinilsulfonas de fórmula general (IV) permiten llevar a cabo Ia incorporación, a través de reacciones de adición tipo Michael, de cualquier etiqueta o derivado de las mismas que contenga grupos funcionales con una reactividad complementaria (grupos amino, hidroxilo ó tiol) y que dejen inalterado uno de los grupos vinilsulfona para Ia posterior ligación de los compuestos de Ia invención resultantes a biomoléculas.

En particular se pueden utilizar, pero sin limitarse a, derivados de moléculas etiqueta conteniendo al menos a) Ia función amino, b) Ia función hidroxilo o c) Ia función tiol (compuestos de fórmula general (V)) que en su reacción con las bis-vinilsulfona de fórmula general (IV) conducen a los agentes de etiquetado de Ia presente invención. En una realización preferida, los compuestos de fórmula general (V) se obtienen por reacciones de moléculas etiquetas o de sus derivados del tipo cloruros de ácido o cloruros de sulfonilo con compuestos aminados de fórmula general (VII) que sean portadores a su vez de las funciones amina secundaria (X = NR), hidroxilo (X = OH) o tiol (X = SH) según se indica en el esquema 1.

Esquema 1 : Síntesis de los derivados funcionalizados de moléculas etiqueta de fórmula (V):

H ₉ N- R ¹ — XH > — N-R ¹ - XH

(VII) (V)

En una realización preferida del método de obtención de los compuestos de Ia presente invención, el agente de etiquetado utilizado es dansilo. En una realización aún más preferida se utilizan los cloruros derivados de este agente de etiquetado:

En una realización preferida de Ia presente invención, las aminas de fórmula general (VII) usadas son a) 2-(2-aminoetil)-aminoetanol, b) 2- aminoetanol ó c) 2-aminoetanotiol.

En una realización preferida de Ia presente invención, los derivados funcionalizados de las moléculas etiqueta de fórmula general (V) reaccionan con las bis-vinilsulfonas de fórmula general (IV) a través de una reacción de adición tipo Michael usando una estequiometria 1:1. De esta forma se obtiene los compuestos de Ia invención de fórmula general (I) conteniendo un grupo vinil-sulfona.

Los compuestos de Ia invención proporcionan una técnica de etiquetado que se basa en Ia ligación quimioselectiva de Ia función vinilsulfona con grupos presentes de forma natural en las biomoléculas (grupos amino y grupos tioles) y con los que reaccionan a través de reacciones de adición tipo Michael. Además, los compuestos son compatibles con Ia naturaleza biológica de las biomoléculas y Ia técnica no requiere ninguna estrategia de activación.

El uso de Ia función vinilsulfona como derivatización de los reactivos de etiquetado para lleva a cabo Ia unión covalente biomolécula-etiqueta presenta las siguientes ventajas: a) Formación de una unión covalente estable. b) La reacción es rápida y con altos rendimientos no generándose ningún tipo de subproducto. c) No se requieren grandes excesos de reactivos. d) Las reacciones se llevan a cabo en ausencia de catalizadores por simple mezcla de los reactivos.

e) Las reacciones pueden llevarse a cabo en agua sin el uso de co- solventes. f) Las reacciones pueden llevarse a cabo bajo condiciones fisiológicas: medio acuoso, rango de pH estrecho, temperaturas suaves. g) Procesos de purificación y aislamiento sencillos. h) Existe una tolerancia hacia los otros grupos funcionales presentes en las biomoléculas distintos de los grupos amino y tioles con los que reaccionan las vinil-sulfonas.

Por tanto, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula general (I) como agentes de etiquetado.

Los agentes de etiquetado comprenden un grupo vinilsulfona (compuestos de fórmula general (I)) y pueden ser ligados a cualquier biomolécula que contenga grupos funcionales complementarios (grupos amino y/ó tiol) presentes en las mismas de forma natural o artificial a través de una reacción de adición tipo Michael (Esquema 2). En una realización preferida de Ia presente invención, las biomoléculas son proteínas.

Esquema 2.- Reacción entre los compuestos de fórmula general (I) y las biomoléculas:

donde: R ¹ , X e Y están definidos anteriormente y R ⁴ puede ser NH ó S.

En una realización aún mas preferida de Ia presente invención, las proteínas son seleccionadas del grupo que comprende albúmina sérica bovina (BSA), Concanalina A y lisozima.

En una realización preferida de Ia presente invención el etiquetado de proteínas se realiza en una solución de las mismas en un tampón que no contenga aminas primarias o secundarias como por ejemplo, pero sin limitarse a, fosfato o HEPES, de fuerza iónica moderada (200 mM) y pH

básico (7,5) y reacción con un exceso de los reactivos de etiquetado de fórmula general (I) durante un tiempo suficiente (aproximadamente 5 horas a temperatura ambiente) eliminándose el exceso de reactivo mediante diálisis.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Representa Ia fluorescencia de gel SDS-PAGE de una mezcla de albúmina sérica bovina (66 kDa), concanavalina A (26 kDa) y lisozima (14 kDa) etiquetadas con el compuesto 14 que revela Ia posición de las proteínas al ser iluminado con un transiluminador (D=365 nm).

Fig. 2. Representa Ia fluorescencia de gel SDS-PAGE de una mezcla de albúmina sérica bovina (66 kDa), concanavalina A (26 kDa) y lisozima (14 kDa) etiquetadas con el compuesto 15 que revela Ia posición de las proteínas al ser iluminado con un transiluminador (D=365 nm).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto Ia especificidad y efectividad de los compuestos de Ia invención.

EJEMPLO 1.- Síntesis de bis-vinilsulfonas de fórmula general (IV): compuestos 4 y 5.

Compuesto 4: A una disolución de etilenglicol 2 (330 mg, 5.3 mmol) en THF (100 ml_) se Ie adicionaron DVS (1.6 ml_, 16 mmol) y t-BuOK (119 mg, 1.1 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (30 min). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-hexano 2:1 a 3:1) obteniéndose 4 como un sirope (800 mg, 51%).

Compuesto 5: A una disolución de tetraetilenglicol 3 (1.02 g, 5.26 mmol) en tolueno (20 ml_) se Ie adicionaron DVS (1.5 ml_, 15.5 mmol) y DBU (390 mg, 2.5 mmol). La mezcla de reacción se caliento a 50 ⁰ C (40 h). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 10:1) obteniéndose 5 como un líquido (886 mg, 40%).

EJEMPLO 2.- Síntesis de derivados de moléculas de etiquetado funcionalizados con funciones amina secundaria, hidroxilo y tiol, de fórmula general (III). Síntesis de los derivados de dansilo 10-12.

Compuesto 10. A una disolución de cloruro de dansilo 6 (236 mg, 0.87 mmol) en CI ₂ CH ₂ (5 ml_) se Ie adicionaron 2-(2-aminoet¡l)-aminoetanol 7 (273 mg, 2.63 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (30 min). Tras dilución con CI ₂ CH ₂ (100 ml_) se lavó con salmuera (2 x 30 ml_). La capa orgánica se secó (Na ₂ SO ₄ ) y el disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido fue el compuesto 10 que puede ser utilizado directamente sin purificación en Ia siguiente etapa.

Compuesto 11. A una disolución de cloruro de dansilo 6 (270 mg, 1.0 mmol) en CI2CH2 (5 mL) se Ie adicionó aminoetanol 10 (183 mg, 3 mmol).

La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (60 min). Tras dilución con CI ₂ CHb (100 mL) se lavó con salmuera (2 x 30 mL). La capa orgánica se secó (Na ₂ SO ₄ ) y el disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido fue el compuesto 11 que puede ser utilizado directamente sin purificación en Ia siguiente etapa.

Compuesto 12. A una disolución de cloruro de dansilo 6 (600 mg, 2.22 mmol) en CI ₂ CH ₂ (15 mL) se Ie adicionaron 2-aminoetanotiol 9 (505 mg, 4.45 mmol) y Eí ₃ N (1.1 mL, 7.78 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (30 min).EI disolvente se eliminó por evaporación a vacío. Al crudo obtenido se Ie adicionaron AcOH (30 mL) y Zn (1.8 g). La disolución resultante se refluyó (3.5 h). Tras filtrado sobre celita y dilución con CI ₂ CH ₂ (100 mL) se lavó con agua, disolución saturada de NaHCOs y agua La capa orgánica se secó (Na ₂ SO ₄ ) y el disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (éter-hexano 1 :1-» 2:1 ) obteniéndose 12 como un sólido (467 mg, 68%).

EJEMPLO 3. Síntesis de agentes de etiquetado basados en vinil sulfona de fórmula (I) conteniendo dansilo. Compuestos 13-15.

Compuesto 13. Una disolución de 10, obtenido según el procedimiento arriba indicado a partir de cloruro de dansilo 6 (236 mg, 0.87 mmol), y el compuesto 5 (490 mg, 1.14 mmol) en t-BuOH-acetonitrilo 1 :1 (10 ml_) se calentó a reflujo (2.5 h). La mezcla de reacción se evaporó a vacío y el crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 12:1) obteniéndose 13 como un simpo (276 mg, 41% rendimiento total a partir de 6).

Compuesto 14. A Una disolución de 11, obtenido según el procedimiento arriba indicado a partir de cloruro de dansilo 6 (270 mg, 1.0 mmol), y el compuesto 5 (430 mg, 1.0 mmol) en THF(IO mL), se Ie adicionaron f-BuOK (10 mg). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente (2 h). A continuación se evaporó a vacío y el crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 10:1) obteniéndose 14 como un sirope (305 mg, 47% rendimiento total a partir de 6).

Compuesto 15. A una disolución de 12 (50 mg, 0.16 mmol), y el compuesto 1 (29 mg, 0.24 mmol) en THF-isopropanol (1 :2, 10 mL), se Ie pasó una corriente de Ar (5 min) y se Ie adicionaron Et ₃ N (5 μmL). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente (16 h). A continuación se evaporó a vacío y el crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (éter-hexano 1 :1->eter) obteniéndose 15 como un sirope (45 mg, 65%).

EJEMPLO 4. Etiquetado de proteínas.

Ejemplo 4.1. Etiquetado de albúmina sérica bovina (BSA), Concanavalina A y lisozima con el compuesto 14

Se hicieron reaccionar 3.75 nmoles de una solución equimolecular (0.39 mM en agua) de BSA (SIGMA A4503), concanavalina A (SIGMA L7647) y lisozima (SIGMA L6876) con 117 nmoles de 14 (58.7 mM en 1 :1 metanol- agua) durante 5 horas en tampón HEPES 200 mM pH 7.6 y se analizó el resultado en SDS-PAGE (FIG. 1). La fluorescencia se visualizó con un transiluminador comercial (λ=365 nm). El mareaje fue compatible con Ia detección mediante Coomassie.

Ejemplo 2. Etiquetado de albúmina sérica bovina (BSA), Concanavalina A y lisozima con el compuesto 15.

Se hicieron reaccionar 3.75 nmoles de una solución equimolecular (0.39 mM en agua) de BSA (SIGMA A4503), concanavalina A (SIGMA L7647) y lisozima (SIGMA L6876) con 154 nmoles de 15 (58.7 mM en 1:1 metanol- agua) durante 5 horas en tampón HEPES 200 mM pH 7.6 y se analizó el resultado en SDS-PAGE (FIG. 2). La fluorescencia se visualizó con un transiluminador comercial (λ=365 nm). El mareaje fue compatible con Ia detección mediante Coomassie.