COMPOSTO, PROCESSO DE OBTENÇÃO DO COMPOSTO, COMPOSIÇÃO

FARMACÊUTICA, USO DO COMPOSTO NA PREPARAÇÃO DE UM

MEDICAMENTO PARA TRATAR DISTÚRBIO CAUSADO POR BACTÉRIA DO GÉNERO MYCOBACTERÍUM E MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO CAUSADO POR BACTÉRIA DO GÉNERO MYCOBACTERÍUM

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção descreve um composto, processo de obtenção do composto, composição e uso do composto para a preparação de um medicamento para tratar distúrbio causado por bactéria do género Mycobacteríum e um método de tratamento de um distúrbio causador por bactéria do género Mycobacteríum. A presente invenção se situa nos campos da Farmácia, Química Medicinal e Síntese Orgânica.

Antecedentes da Invenção

[0002] A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa, que ataca principalmente o pulmão, ela pode ser contraída através do contato com o Mycobacteríum tuberculosis {M. tuberculosis), seu principal agente causador. Segundo dados do relatório de 2013 da Organização Mundial da Saúde (OMS), a TB foi responsável pela morte de 1 .3 milhões de pessoas em 2012, sendo que desses óbitos, 25% foram entre pacientes HIV positivos. No mesmo ano, foram identificados 8.6 milhões de casos novos de tuberculose, sendo que em 13% dos casos os pacientes eram HIV positivos (WHO, 2013). A TB é a segunda maior causa de morte por doenças infecciosas em todo o mundo, estando somente atrás da síndrome da imunodeficiência humana (SIDA) (WHO, 2013). Esse panorama evidencia as proporções pandémicas da TB e as razões da doença ser considerada um dos maiores problemas de saúde pública do mundo (WHO, 2013). Todos os países do mundo têm registro de casos de TB e, a cada ano, estima-se o surgimento de milhões de novos casos. No Brasil, no ano de 2012, a OMS estimou o surgimento de 20 - 49 casos de TB a cada 100.000 habitantes. Dentre as capitais brasileiras Porto Alegre é a terceira com a maior incidência, registrando 100 novos casos de TB a cada 100.000 habitantes, no ano de 2012, ficando atrás somente de Cuiabá e Recife, com registros de 1 17 e 101 novos casos, respectivamente (Ministério da Saúde, 2012).

[0003] As micobactérias possuem uma alta taxa de resistência intrínseca a maioria dos antibióticos e agentes quimioterápicos devido à difícil permeabilidade da sua parede celular. No entanto, tal barreira não tem capacidade suficiente para produzir níveis significativos de resistência, o que requer um mecanismo adicional (Jarlier et al., 1994). Fármacos de ação lenta, prescrição imprópria, dificuldade de acesso aos medicamentos e, sistemas de saúde ineficientes, têm resultado em tratamento incompleto e relapso, podendo resultar na supressão parcial do crescimento micobacteriano e favorecer o surgimento de populações bacterianas resistentes a fármacos (Sacchettini et al., 2008; Dorman et al., 2007).

[0004] A TB-MDR é definida como aquela na qual o paciente possui a doença ativa com bacilo resistente a, pelo menos, isoniazida (INH) e rifampicina (RIF), podendo ser contraída através de infecção com bacilos já resistentes (resistência primária) ou pode ser desenvolvida no decorrer do tratamento (resistência adquirida) (WHO 2010). Embora o Tratamento Diretamente Observado de Curta Duração (DOTS, do inglês Directly Observed Treatment Short-Course) seja altamente eficiente no controle da TB susceptível a fármacos (ou resistente somente à INH), ele é comumente insuficiente no controle da TB-MDR (Yew et al., 2008; WHO, 2010). Casos de TB-MDR são mais difíceis de curar e requerem um tratamento com medicamentos de segunda linha (fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, tioamidas), as quais são menos efetivas e mais tóxicas, com exceção de algumas fluoroquinolonas, além de ter um custo mais elevado que os regimes baseados em medicamentos de primeira linha (Yew et al., 2008; Zager et al., 2008; Dorman et al., 2007; WHO, 2010).

[0005] Nos últimos anos, casos de TB extensivamente resistente a fármacos (TB-XDR) têm sido relatados em diversos países. A definição mais recente para TB-XDR denota a condição em que os isolados são resistentes à INH e RIF, a alguma fluoroquinolona e a qualquer medicamento injetável de segunda linha (capreomicina, canamicina, amicacina), resultando em limitadas opções de tratamento (WHO, 2010). Indivíduos infectados com TB-XDR possuem um prognóstico ruim, com altos índices de falha do tratamento e alta mortalidade (Yew et al., 2008).

[0006] Pacientes coinfectados com TB-MDR ou TB-XDR e HIV são os que possuem o pior prognóstico, uma vez que tal associação tem provocado altas taxas de mortalidade, especialmente quando diagnosticada tardiamente (Elston et al., 2008; Yew et al., 2008).

[0007] Velayati e colaboradores (Velayati et al., 2009) documentaram o surgimento de novas formas de bacilos encontrados em pacientes diagnosticados com TB-TDR. Esses isolados foram classificados como linhagens totalmente resistentes aos fármacos (TDR), uma vez que apresentaram resistência in vitro a todos os fármacos de primeira e segunda linha testados. Durante o estudo, os pacientes infectados não responderam a nenhuma terapia padrão e permaneceram com culturas positivas após 18 meses de tratamento com fármacos de segunda linha (Velayati et al., 2009).

[0008] Enquanto a TB-MDR e XDR significam uma ameaça à saúde pública e ao controle da TB no mundo, possíveis casos de TB-TDR aumentam a preocupação quanto a uma futura epidemia de TB incurável (Velayati et al., 2009).

[0009] O desenvolvimento de novos compostos com amplo espectro de atividade anti-TB e índice terapêutico (IC ₅₀ em células normais/ MIC; deve ser uma relação > 10) aceitável no tratamento de tuberculose resistente é de extrema relevância para solucionar esse problema de saúde pública. [0010] O núcleo quinolínico é um importante grupo farmacofórico presente em fármacos anti-TB empregados como tratamento de segunda escolha como as fluoroquinolona: ofloxacina, gatifloxacina e moxifloxacina (Drlica, 1999; Kumar et al, 2014). Estes compostos agem por inibir a subunidade catalítica da DNA Girase e/ou topoisomerase II (Mathew et al, 2013), enzimas essenciais que catalisam o superenovelamento negativo no DNA circular e a decatenação do DNA durante a segregação dos cromossomos (Drlica & Zhao, 1997). Moxifloxacina e gatifloxicina, ambas são os compostos mais avançados anti-TB da classe 8-metoxiquinolona com MIC para o M. tuberculosis H37Rv in vitro de 0,18-0,5 μg/mL e 0,12-0,25 μg/mL, respectivamente (Aubry et al 2004; Aubry et al 2006; Hu et al, 2003). No entanto, algumas cepas de M. tuberculosis, conhecidas como extensivamente resistentes a múltiplos fármacos (TB-XDR), têm apresentado resistência a esta classe de compostos (WHO, 2010).

[0011] Aprovado em 2012, a bedaquilina (Sirturo™), tem sido utilizada especificamente para o tratamento da TB-MDR, inibindo tanto a forma replicante como não replicante de cepas resistentes a múltiplos fármacos de M. tuberculosis. Esta diarilquinolina é um inibidor da enzima adenosina 5'-trifosfato sintase (ATP sintase) de M. tuberculosis (Andries, 2010), aprovado pela FDA (Food and Drug Administration, EUA) especificamente para o tratamento de pacientes adultos com TB-MDR (Palomino, et al, 2013). O valor de MIC em relação ao M. tuberculosis cepa H37Rv é de 0,03 μg/mL e em relação a diferentes isolados clínicos de M. tuberculosis o MIC é de 0,03 a 0,120 μg/mL (Andries et al, 2005). No entanto, em estudos de fase II nos testes clínicos, o SirturoTM apresentou maior incidência de efeitos adversos potencialmente fatais, como: disfunção hepática, mudança nos níveis de transaminases, prolongamento no intervalo QT, o qual tem sido relacionado a arritmias cardíacas graves e morte (Palomino et al, 2013).

[0012] Uma recente descoberta feita através de triagens fenotípica pelo grupo GlaxoSmithKline (GSK) corresponde a quatro compostos antituberculose da classe quinoloxiacetamida: GSK358607A (MIC = 0,70 μΜ); GSK749336A (MIC = 0,25 μΜ), GSK124576A (MIC = 2,30 μΜ) e GW857165X (MIC = 3,3 μΜ). Destes, o composto GSK358607A apresentou-se como um potente inibidor no crescimento celular do M. tuberculosis H37Rv, baixa citotoxicidade frente às células HepG2 (Ιΰ ₅₀ >50μΜ) e um índice terapêutico aceitável (I.T.=HepG2 IC ₅₀ /H37RvMIC> 50 vezes) e, portanto, considerado pelos autores como o composto líder da classe (Ballell, 2013). No entanto, o composto GSK358607A limita-se quanto à utilização frente a cepas sensíveis de M. tuberculosis. Nossas pesquisas conduziram a compostos estruturalmente diferentes dos previamente propostos e apresentaram atividades inibitórias otimizadas sobre o bacilo atuando também sobre cepas resistentes (um dos maiores problemas atuais para o tratamento da doença). Além disso, estes compostos, embora estruturalmente semelhantes à bedaquilina (Sirturo®), apresentam, preliminarmente, um alvo molecular diferente. Este fato pode conduzir a compostos com diferentes e, quiçá, reduzidos efeitos colaterais, resultando em um candidato a fármaco com perfil de segurança superior ao até então existente.

[0013] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:

[0014] O documento "Fueling Open-Source Drug Discovery: 177 Small- Molecule Leads against Tuberculosis" de Ballell et ai. revela compostos sugeridos para o tratamento de tuberculose. Dentre os compostos propostos encontram-se as quinoloxiacetamidas (QOA) como a GSK358607A. É importante mencionar que o dito documento não demonstra a atividade das quinoloxiacetamidas contra cepas resistentes a fármacos utilizados comumente para o tratamento da tuberculose. Embora o composto GSK358607 apresente alguma capacidade de inibir cepas resistentes, os compostos da presente invenção apresentaram resultados surpreendentemente superiores. [0015] O documento de título " Mycobacterium tuberculosis Gyrase Inhibitors (MGI) as a New Class of Antitubercular Drugs" descreve o uso de 1 ,5- naftiridin-2-onas como inibidores de DNA girase e sua capacidade de inibir o crescimento de M. tuberculosis. Porém, os compostos sugeridos no dito documento são estruturalmente diferentes dos propostos na presente invenção.

[0016] O pedido de patente WO200401 1436 em nome de JANSSEN PHARMACEUTICA N.V. descreve compostos derivados de quinolina que são úteis para o tratamento de doenças causadas por micobactérias. Porém, os compostos sugeridos no dito documento são estruturalmente diferentes dos propostos na presente invenção.

[0017] O pedido de patente WO20051 17875 em nome de JANSSEN PHARMACEUTICA N.V. descreve o uso de derivados de quinolina para a preparação de um medicamento para tratar infecção de uma cepa de Mycobacterium resistente à fármacos. Porém, os compostos sugeridos no dito documento são estruturalmente diferentes dos propostos na presente invenção.

[0018] O pedido de patente WO201 1031926 em nome de VERTEX PHARMACEUTICALS INCORPORATED descreve composições deN- benzil-3- (4-clorofenil)-2-[metil-[2-oxo-2-(3,4,5-trimetoxifenil)aceti l]amino]-N-[3-(4-piridil)- 1 -[2-(4-piridil)etil]propil]propanamida para tratar pacientes com infecções de Mycobacterium como por exemplo M. tuberculosis. Porém, os compostos sugeridos no dito documento são estruturalmente diferentes dos propostos na presente invenção.

[0019] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

[0020] Diante de tal cenário abordado no tópico acima, há uma urgente necessidade de pesquisa por novos candidatos a fármacos anti-TB. Os novos agentes devem, idealmente, possuir atividade bactericida contra o M. tuberculosis, tanto no estado de multiplicação ativa quanto no estado de dormência e serem efetivos tanto no combate da TB susceptível a fármacos quanto em casos MDR/XDR (Ducati et al., 2006; Balganesh et al., 2008). Um dos alvos atrativos para o desenvolvimento de novos antimicobacterianos é a DNA girase e/ou topoisomerase II, enzimas necessárias para a replicação do DNA, por sua vez essenciais nos processos de crescimento e divisão celular. Estas enzimas estão associadas aos eventos de transcrição, reparo e recombinação do DNA (Rahul, et al., 2013).

Sumário da Invenção

[0021] Dessa forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir de compostos capazes de inibir cepas resistentes e que apresentam baixa citotoxicidade. A presente invenção apresenta como vantagens uma rota sintética simplificada (em duas etapas), em condições reacionais brandas, com custo baixo de produção e passível de escalonamento industrial.

[0022] Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um composto da fórmula 1

fórmula 1

em que

X é selecionado do grupo que consiste de CH ₂ , O, NH ou S; n ₁ é 0, 1 , 2 ou 3;

R1 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R2 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios; R3 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R4 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R5 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R6 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R7 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, tetrahidronaftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

em que quando R1 for H; R2 for OCH ₃ ; R3 for H; R4 for H; R5 for CH ₃ ; R6 for H; X for O; ni for 1 ; R7 for

em que n ₂ é 0 e R8 é OCH ₃ ligado ao anel aromático na posição orto em relação ao grupo amida,

R9 é selecionado do grupo consistindo de OCH ₃ , Y, CF ₃ , NO ₂ , CH ₃ , etila, propila, butila _, pentila, NH _2; em que Y é um halogênio.

[0023] Em um segundo aspecto, a presente invenção apresenta um processo de obtenção do composto, compreendendo:

a) pelo menos uma etapa de acilação com cloreto de bromoacetila de um composto da seguinte fórmula

em que R7 é selecionado de um grupo que consiste de

em que n é 0 ou 1 ; R8 e R9 são independente selecionados do grupo consistindo de H, OCH ₃ , Y, CF ₃ , NO ₂ , CH ₃ , etila, propila, butila _, pentila, NH _2; em que Y é um halogênio;

b) pelo menos uma etapa de O-, N- ou S-alquilação com o composto obtido na etapa (a) de um com osto da seguinte fórmula

em que R1 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R3 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R4 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R5 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R6 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

X é selecionado do grupo que consiste de CH ₃ , OH, NH ₂ ou SH. [0024] Em um terceiro aspecto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do composto e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0025] Em um quarto aspecto, a presente invenção apresenta o uso do composto na preparação de um medicamento para tratar distúrbio causado por bactéria do género Mycobacteríum. Em uma concretização do uso, a dita bactéria é Mycobacteríum tuberculosis resistente à pelo menos um antibiótico selecionado do grupo que consiste de isoniazida e rifampicina.

[0026] Em um quinto aspecto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de um distúrbio causado por bactéria do género Mycobacteríum compreendendo uma etapa de administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do composto.

[0027] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados é o uso dos compostos reivindicados para a preparação de um medicamento para tratar distúrbio causado por bactéria do género Mycobacteríum.

[0028] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0029] Com o intuito de melhor definir e esclarecer o conteúdo do presente pedido de patente são apresentadas as presentes figuras:

[0030] A figura 1 mostra um esquema das reações para síntese dos compostos da presente invenção, exemplificando reagentes e condições de reação: (a) CH ₂ CI ₂ , DMAP, atmosfera inerte (e.g. ar), 30 °C, 4h; e (b) DMF, K ₂ CO ₃ , 30 °C, atmosfera inerte (e.g. ar), 16h.

[0031] A figura 2 mostra a imagem do gel que descreve o ensaio de superenovelamento do DNA girase frente ao composto INCT 454 com valor de IC50 de 170 nM, quando realizadas em cinco concentrações diferentes de 5; 1 ; 0,5; 0,25 e 0,125 μΜ; R - DNA relaxado (substrato + DMSO); C - Controle (substrato DNA relaxado + DNA girase + DMSO); N - novobiocina à 5 μΜ.

[0032] A figura 3 mostra um gráfico em barras com a média (± SEM) da taxa de batimento cardíaco dos compostos 453, 469 e 422, grupo teste. ^*** P < 0.001 comparado com o grupo controle (Dunnett post-test). ^**** P < 0.0001 comparado com o grupo controle (Dunnett post-test). Significância estatística foi determinada entre o grupo controle e o grupo teste.

[0033] A figura 4 mostra um gráfico da comparação entre os MICs dos fármacos utilizado no tratamento clínico da tuberculose (IGQ607 foi adicionado para comparação; não é um fármaco utilizado na clínica e não faz parte das moléculas descritas neste documento).

[0034] A figura 5 mostra um gráfico da comparação entre as atividades antimicobacterianas dos novos compostos descritos no presente documento e as atividades apresentadas por moléculas em ensaio clínico de fase II e fase III.

Descrição Detalhada da Invenção

[0035] A presente invenção aborda a síntese de uma série de 43 quinoloxiacetamidas, sendo que 42 destes compostos são inéditos e possuem surpreendentemente resultados na inibição seletiva do crescimento celular em diferentes cepas do M. tuberculosis resistentes (vide Tabela 1 abaixo).

[0036] As etapas sintéticas consistem em: obtenção dos derivados acetilamida substituídos por acetilação das aminas desejadas, utilizando cloreto de bromoacetila (MacPherson et al., 2010). Subsequentemente, os derivados quinoloxiacetamida são sintetizados por meio da reação de O- alquilação da 2,6-dissubstítuido-4-hidroxiquinolina com os derivados acetilamida na presença de carbonato de potássio e DMF como solvente (Yang, 2005). Convém destacar que a síntese proposta no estado da técnica da bedaquilina envolve 4 etapas com rendimento global baixo de aproximadamente 0,2% (Janssen Pharmaceutica, 2005). Além disso, as moléculas proposta na presente invenção são estruturalmente simples, em comparação ao Sirturo, o que facilita um melhor entendimento das propriedades físico-químicas e farmacológicas inerentes à atividade antitubercular.

[0037] A presente invenção propõe moléculas ainda não descritas na literatura que apresentam ação inibitória sobre o crescimento de cepas de M. tuberculosis sensíveis e resistentes à isoniazida e rifampicina (cepas MDR) como candidatas a fármacos para o tratamento da tuberculose.

[0038] Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um composto da fórmula 1

em que

X é selecionado do grupo que consiste de CH ₂ , O, NH ou S; n ₁ é 0, 1 , 2 ou 3;

R1 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R2 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R3 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R4 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R5 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios; R6 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R7 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, tetrahidronaftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

em que quando R1 for H; R2 for OCH ₃ ; R3 for H; R4 for H; R5 for CH ₃ ; R6 for H; X for O; n ₁ for 1 ; R7 for

em que n ₂ é 0 e R8 é OCH ₃ ligado ao anel aromático na posição orto em relação ao grupo amida,

R9 é selecionado do grupo consistindo de OCH ₃ , Y, CF ₃ , NO2, CH ₃ , etila, propila, butila _, pentila, NH _2; em que Y é um halogênio.

[0039] Em uma concretização, o composto é da fórmula 1 em que

R7 é selecionado de um rupo que consiste de

em que n ₂ é 0 ou 1 ; R8 e R9 são independente selecionados do grupo consistindo de H, OCH ₃ , Y, CF ₃ , NO2, CH ₃ , etila, propila, butila, pentila, NH ₂ ; em que Y é um halogênio.

[0040] Em uma concretização do composto, o dito halogênio é selecionado do grupo consistindo de F, Cl, I ou Br. [0041] Em uma concretização, a presente invenção apresenta um composto da fórmula 2

em que

R2 é selecionado do grupo que consiste de H ou OCH ₃ ;

R5 é selecionado do grupo que consiste de H ou CH ₃ ;

R7 é selecionado de um rupo que consiste de

em que n ₂ é 0 ou 1 ; R8 e R9 são independente selecionados do grupo consistindo de H, OCH ₃ , Y, CF ₃ , NO ₂ , CH ₃ , etila, propila, butila _, pentila, NH ₂ ; em que Y é um halogênio;

em que quando R2 for OCH ₃ , R5 for CH ₃ , R7 for

em que n ₂ é 0 e R8 for OCH ₃ ligado ao anel aromático na posição orto em relação ao grupo amida, R9 é selecionado do grupo consistindo de OCH ₃ , Y, CF ₃ , NO ₂ , CH ₃ , CH ₂ CH ₃ , NH _2;

em que Y é um halogênio.

[0042] Em uma concretização, o composto da presente invenção é da fórmula selecionada do grupo que consiste de

[0043] Em uma concretização, o composto da presente invenção é da fórmula selecionada do grupo que consiste de

[0044] Em um segundo aspecto, a presente invenção apresenta um processo de obtenção do composto, compreendendo:

a) pelo menos uma etapa de acilação com cloreto de bromoacetila de um composto da seguinte fórmula

em ue R7 é selecionado de um grupo que consiste de

em que n é 0 ou 1 ; R8 e R9 são independente selecionados do grupo consistindo de H, OCH ₃ , Y, CF ₃ , NO2, CH ₃ , etila, propila, butila, pentila, NH _2; em que Y é um halogênio;

b) pelo menos uma etapa de O-, N- ou S-alquilação com o composto obtido na etapa (a) de um composto da seguinte fórmula

em que R1 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R2 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R3 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R4 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R5 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

R6 é selecionado do grupo que consiste de H, alquilas, arilas, naftilas, heteroarilas, alcóxidos ou halogênios;

X é selecionado do grupo que consiste de CH ₃ , OH, NH ₂ ou SH.

[0045] Em uma concretização do processo, o dito halogênio é selecionado do grupo consistindo de F, Cl, I ou Br.

[0046] Em uma concretização do processo da presente invenção, a etapa (a) de acilação é realizada em meio que compreende solvente orgânico, em que o solvente orgânico é diclorometano, clorofórmio, DMSO ou Hexano, DMAP, trietilamina ou hidróxido de sódio em atmosfera inerte a 30 °C por 4-24 horas e a etapa (b) de alquilação ser realizada em meio que compreende solvente orgânico, em que o solvente orgânico é dimetilformamida, água, etanol, acetonitrina ou diclorometano e carbonato de potássio em atmosfera inerte a 30 °C por 16-36 horas. [0047] Em um terceiro aspecto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do composto e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0048] Em um quarto aspecto, a presente invenção apresenta o uso do composto na preparação de um medicamento para tratar distúrbio causado por bactéria do género Mycobacteríum. Em uma concretização do uso, a dita bactéria é Mycobacteríum tuberculosis. Em uma concretização, a dita bactéria é resistente à pelo menos um antibiótico selecionado do grupo que consiste de isoniazida e rifampicina.

[0049] Em um quinto aspecto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de um distúrbio causado por bactéria do género Mycobacteríum compreendendo uma etapa de administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do composto.

[0050] Em uma concretização, o composto está presente em uma formulação farmacêutica ou um medicamento.

[0051] No contexto da presente invenção, nas seguintes fórmulas Markush:

quando n e/ou n ₂ for 0 significa que os dois grupos adjacentes ao carbono estão ligados diretamente.

[0052] Os compostos propostos, em comparação com, por exemplo, a bedaquilina, não apresentam centros quirais, uma vantagem importante quando vislumbrada a aplicação industrial. Tais compostos são produzidos por um processo simplificado necessitando essencialmente de apenas duas etapas para a síntese do produto. [0053] Os diferenciais desta invenção correspondem: a capacidade de inibir não apenas o crescimento celular de Mycobacterium tuberculosis H37Rv como também isolados clínicos resistentes a fármacos; não apresenta atividade citotóxica em relação à bactérias gram-positivas e gram-negativas e, portanto, é um inibidor específico de M. tuberculosis. Assim, a presente invenção pode vir a ser empregada no tratamento da tuberculose tanto para os casos iniciais da doença quanto para os casos clínicos com resistentes ao tratamento recomendado. Além disso, nossos dados têm indicado que os compostos não apresentam atividade citotóxica em relação a células Vero.

[0054] Convém ressaltar que a tuberculose é tratada com um conjunto de fármacos e, além disso, a epidemia da doença tem sido acompanhada pela presença da infecção pelo HIV. Os antirretrovirais utilizados para o tratamento do HIV sofrem interações medicamentosas severas com os fármacos de primeira linha utilizados para tratar a tuberculose. Assim, desenvolver moléculas que diminuam o risco de interações com fármacos utilizados para o tratamento da AIDS, conforme as moléculas descritas no presente pedido de patente, é um fator desejado para fármacos novos para o tratamento da doença.

Exemplos - Concretizações

[0055] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Atividade antitubercular

[0056] Os ensaios de MIC foram realizados em uma sala de nível de biossegurança 3 (NB3) em placas de 96 poços (Ballell et al., 2013). Os ensaios foram feitos com diluições seriadas dos compostos sintetizados em DMSO, estas soluções foram adicionadas ao meio Middlebrook 7H9 (meio líquido). O inoculo foi composto de 1 x10 ⁷ unidades formadoras de colónia (CFU) do M. tuberculosis cepa H37Rv ou cepas resistentes à isoniazida (Ballell et al., 2013). As placas foram incubadas a 37 °C, e, após 7 dias de incubação, uma solução resazurina foi adicionada a cada poço, e, posteriormente, incubadas por mais 48 h a 37 °C. Modificação da cor azul para rosa indica redução da resazurina e, por conseguinte, o crescimento bacteriano. O valor MIC foi definido como a concentração mais baixa de composto que inibe o crescimento da micobactéria. Também foram incluídos controles crescimento, controles de esterilidade sem inoculação, DMSO com a inoculação, e um controle contendo isoniazida. Os resultados foram obtidos após três experimentos independentes.

Tabela 1. Atividade antitubercular de novos derivados quinoloxiacetamida em relação ao M. tuberculosis cepa H37Rv (não resistente).

[0057] Os compostos descritos nesta invenção apresentaram inibitória potente sobre o crescimento celular do M. tuberculosis tanto para a cepa H37Rv como sobre isolados clínicos resistentes aos fármacos de primeira escolha, isoniazida e rifampicina (Tabela 2).

[0058] Os resultados da triagem fenotípica em relação ao M. tuberculosis H37Rv, realizados de acordo com o método colorimétrico resazurina (Palomino et al., 2002; Ballell et al., 2013), mostraram que 24 dos 42 compostos sintéticos apresentados nesta invenção foram particularmente mais efetivos (MIC < 1 μΜ) na inibição do crescimento celular do M. tuberculosis do que a isoniazida (Tabela 1 ).

[0059] O processo sintético empregado para obter os novos derivados quinoloxiacetamida foi realizado em duas etapas. Embora a rota sintética proposta evolva etapas reacionais clássicas (acetilação e O-alquilação) para síntese de diferentes classes químicas, nesta invenção apresentamos pela primeira vez a utilização das mesmas para a obtenção da classe quinoloxiacetamida. Na primeira etapa, os derivados bromo-acetamidas foram sintetizados pela reação de acilação de anilinas aril-substituídas com cloreto de bromoacetila em diclorometano utilizando o protocolo descrito por McPherson e col (2010) (Figura 1 (a)). O rendimento desta etapa foi de 50% a 85%. Após a obtenção dos precursores (bromo-acetamidas), os derivados quinoloxiacetamida foram sintetizados pela reação de O-alquilação da 2-metil- 6-metoxi-4-hidroxiquinolina (Fonte comercial Aldrich) com os derivados bromo- acetamidas em presença de carbonato de potássio e dimetilformamida como solvente (Umejiego et al, 2008). O rendimento desta etapa foi de 32% a 98%. O derivado INCT-TB 456 foi obtido após clássica redução do grupamento 4-nitro (4-NO2) do composto INCT-TB 451 a 4-amino (4-NH ₂ ) pela reação de hidrogenação catalisada com Pd/C (Figura 1 (b)).

[0060] Dos compostos sintetizados, 1 1 foram particularmente mais eficazes em inibir o crescimento de cepas provenientes de isolados clínicos resistentes à isoniazida e rifampicina (Silva et al., 2003) (Tabela 2). Além disso, os estudos de citotoxicidade in vitro em relação a células Vero mostraram que na concentração de 10 μΜ a toxicidade dos compostos não é significativa.

Tabela 2. Atividade antitubercular dos derivados quinoloxiacetamida em relação ao M. tuberculosis H37Rv e isolados clínicos resistentes à isoniazida e rifampicina.

[0061] Embora o composto GSK358607A apresente capacidade de inibir cepas resistentes (tabela 2), os compostos descritos no presente documento apresentaram atividades surpreendentemente superiores. Por exemplo, para a cepa ^* 36R o composto GSK358607A apresentou MIC de 0,441 μΜ enquanto o composto INCT-TB 416 apresentou MIC de 0,1 16 μΜ. Essa diferença corresponde a um aumento de 3,8 vezes na potência de inibição da referida cepa.

[0062] Comparado com os dados descritos no documento "Fueling Open-Source Drug Discovery: 177 Small-Molecule Leads against Tuberculosis" de Ballell et al. que descreve o GSK358607A os compostos da presente invenção apresentaram maior capacidade de inibir o crescimento de cepas H37Rv de M. tuberculosis. A partir da observação dos dados descritos na Tabela 1 pode-se observar que o composto INCT-TB 422 é capaz de inibir o crescimento do bacilo em uma concentração de 0,053 μΜ enquanto o GSK358607A apresentou a mesma atividade somente em uma concentração de 0,441 μΜ. Essa diferença corresponde a um aumento de efetividade de inibição de mais de 8 vezes demonstrando que as modificações propostas foram essenciais para melhorar a atividade.

[0063] Outro dado relevante deste invento foram os estudos de citotoxicidade in vitro em relação a células HaCat (queratinócitos humana) e células Vero (células renais de macaco verde africano) avaliados pelo método colorimétrico MTT após de 72 h de exposição das linhagens de células com os compostos. A viabilidade celular de ambas as linhagens nas concentrações de 5 μΜ e 10 μΜ não foi significativamente afetada (Tabela 3).

Tabela 3. Valores do efeito citotóxico após 72 horas de incubação dos compostos frente às células HaCat e Vero

% de viabilidade celular/dose ± SEM

Compostos HaCat Vero

INCT-TB 5 μΜ 10 μΜ 5 μΜ 10 μΜ

410 89 ±4 81 ± 14 96 ±5 105 ±7

438 97 ±7 99 ±6 87 ± 11 77 ± 12

439 89 ±2 92 ±6 87 ±15 84 ± 17

453 98 ±4 80 ±7 84 ± 11 87 ±9

416 100 ±7 81 ±15 85 ± 16 78 ± 12

415 89 ±3 94 ±7 86 ±8 85 ±8

422 87 ±3 82 ± 11 93 ±4 97 ±5

440 105 ±9 96 ±8 99 ± 16 100 ± 15

454 94 ±5 101 ±6 90 ± 10 90 ± 12

413 101 ±6 94 ±9 99 ±9 100 ± 10

443 96 ±6 95 ±5 99 ± 13 105 ± 10

444 101 ± 11 100 ±4 103 ±21 95 ± 15

§ Controle com 0,5 % de DMSO foi considerado como 100 % de viabilidade celular.

[0064] Para investigar a atividade intracelular dos compostos selecionados, foi testado o modelo funcional de macrofagos infectados (células RAW 264.7) por M. tuberculosis. A infecção de células RAW 264.7 com M. tuberculosis H37Rv foi realizada a uma multiplicidade de infecção de 1 :1 (bactérias/macrófagos) durante 3h a 37 °C com 5% de CO ₂ . As células RAW 264.7 infectadas foram lavadas três vezes com solução salina estéril a 0,9% para remover as bactérias extracelulares e o meio foi substituído com 1 ml de DMEM fresco (suplementado com 10% de FBS) (Rodrigues-Junior, et al., 2014).

[0065] As células não infectadas foram incubadas com uma concentração de 5 μΜ (concentração em que os compostos não exercem atividade citotóxica) dos compostos durante 3 dias, e o ensaio de MTT foi realizado no intuito de verificar a viabilidade das células. O grupo tratado com Rifampicina (5 μΜ) mostrou um decréscimo de 0,92 log-i ₀ (P <0,001 ) nas contagens de UFC (Unidades Formadoras de Colónias) em comparação com o controle não tratado (Tabela 4). O tratamento com os compostos INCT-TB 410, 416, 422, 438, 440, 443, 444, 449, 453 e 469 resultou, também, nas reduções estatisticamente significativas em unidades de UFC em relação ao controle não tratado (Tabela 4). Esse dado demonstra que os compostos apresentam permeabilidade celular e capacidade de exercer ação sobre o patógeno internalizado em células de mamíferos.

Tabela 4. Atividade intracelular dos compostos selecionados (5μΜ) frente a cepas virulenta de M. tuberculosis H37Rv em macrofagos.

^* P < 0,05 ^** P < 0,01 ^*** P < 0,001 comparado para o grupo não tratado. Os dados foram expressos como as medias das triplicadas ± SEM para cada composto.

[0066] Portanto foram identificados 42 novos derivados de quinoloxiacetamida, sendo que 1 1 destes compostos são particularmente preferidos como potentes inibidores de cepas de M. tuberculosis sensíveis e resistentes à isoniazida e rifampicina (MDR), com um índice terapêutico aceitável (I.T. > 10 vezes) e capazes de atuar sobre a micobacteria internalizada em macrófagos.

[0067] Em uma das concretizações, a presente invenção demonstra a capacidade dos compostos de inibir seletivamente a enzima DNA Girase de M. tuberculosis. Na concentração de 0,25 μΜ, um dos novos derivados quinoloxiacetamidas inibiu 80% da atividade enzimática. A concentração que inibe 50% da atividade da referida enzima foi de 170 nM para o composto INCT 454 (Figura 2). Os outros compostos não apresentaram inibição significativa no teste descrito.

Absorção, metabolismo e toxicidade [0068] Foram avaliados parâmetros relacionados com a absorção, metabolismo e toxicidade dos compostos 453, 469 e 422, os quais possuem uma maior atividade. Tais parâmetros são essenciais para análises em modelos animais.

[0069] A solubilidade dos três compostos in vitro está adequada e condizente com dados da literatura para moléculas que são utilizadas clinicamente. Com relação à estabilidade metabólica dos compostos sintetizados, as modificações estruturais conduziram a estruturas com uma estabilidade maior do que a molécula GSK358607A, já descrita no estado da técnica. Enquanto a molécula GSK358607A apresentou meia-vida de 16,7 min, os compostos 453, 469 e 422 apresentaram meia-vida de 16,8 a 24 min (Tabela 5). Essa maior estabilidade demonstra que as moléculas novas podem ter uma meia-vida biológica maior quando administradas em seres vivos.

[0070] Outro ensaio realizado foi a determinação da capacidade de inibição de seis enzimas metabolizadoras que compõem o sistema microssomal hepático P450 (CYP3A4, CYP1 A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 ). Nenhuma das enzimas foi inibida em concentrações menores que 10 μΜ dos compostos avaliados. Esse dado demonstrou que as estruturas apresentam baixo risco de produzirem interações farmacológicas com outras classes de fármacos, por exemplo, interações com fármacos para o tratamento de HIV.

Tabela 5. Propriedades das quinoloxiacetamidas

experimentais. Os limites de detecção (LDD) alcançados para 453, 469, e 422 foram de 4,0 μΜ, 4,4 μΜ, e 4,0 μΜ, respectivamente. ^b Dados da referência "Fueling Open-Source Drug Discovery: 177 Small-Molecule Leads against Tuberculosis" de Ballell et al.". Nd: Não determinado ou avaliado durante os diferentes protocolos.

[0071] Finalmente, a toxicidade para o músculo cardíaco foi avaliada utilizando um modelo in vivo. Os ensaios com peixe zebra {Danio rerio) demonstraram que os compostos 453, 469 e 422 não apresentam toxicidade aparente para o músculo cardíaco em concentrações até 100 vezes maiores que as necessárias para impedir o crescimento do Mycobacteríum tuberculosis in vitro (MICs) (Figura 3). Uma vez que o fármaco Bedaquilina, aprovado para o tratamento da tuberculose em adultos (quando as demais alternativas terapêuticas não surtirem efeito), vem apresentando problemas potencialmente fatais para o músculo cardíaco, os resultados descritos promovem uma alternativa ao uso da Bedaquilina.

[0072] Os resultados obtidos colocam as moléculas obtidas entre as mais ativas estruturas quando comparadas aos fármacos utilizados atualmente na clínica (Figura 4) e as moléculas que estão em ensaio clínico de fase II e fase III (Figura 5).

[0073] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.