La présente invention concerne le domaine pharmaceutique. Plus précisément l'invention concerne de nouveaux composés synthétiques analogues de lipides membranaires d'archaebactéries.

L'invention concerne également de nouvelles compositions liposomiales mettant en œuvre de tels composés ainsi que l'utilisation de telles compositions pour la vectorisation de molécules d'intérêts thérapeutiques et/ou la vectorisation de molécules d'ARN ou d'ADN. Le développement de systèmes performants pour administrer et transporter une molécule biologiquement active jusqu'à sa cible biologique constitue un enjeu majeur. En effet, aucun médicament ne peut exercer une activité thérapeutique si la substance active qu'il renferme n'est pas capable de franchir les barrières biologiques qui séparent le site d'administration du site d'action. Les liposomes se sont désormais positionnés comme des candidats prometteurs dans ce domaine et leur introduction récente dans l'arsenal thérapeutique en cancérologie et en infectiologie représente l'aboutissement d'efforts considérables déployés en recherche et en développement.

Néanmoins, de nombreux problèmes demeurent notamment si l'on considère des modes d'administration par voie orale ou par voie sanguine. Ces problèmes sont liés à l'instabilité du liposome in vivo dans des milieux acides tels que par exemple celui observé dans le compartiment stomacal où règne un pH égal à 2, et/ou à la déstabilisation de la paroi liposomiale par interaction avec des protéines et lipoprotéines du sang. Une approche possible pour améliorer les propriétés de ces formulations consiste à utiliser des lipides bipolaires d'archaebactéries thermophiles et méthanogènes apportant une stabilité accrue comparativement aux liposomes conventionnels. Pour cette raison, ceux-ci offrent un potentiel d'applications intéressant en tant que vecteurs de principes actifs et de gènes thérapeutiques ou comme systèmes d'administration de vaccins.

Cependant, les techniques de culture, d'extraction et de purification utilisées actuellement ne permettent pas d'obtenir des quantités importantes de lipides naturels. La préparation de liposomes à partir de lipides synthétiques de structure parfaitement définie, s'avère donc être une alternative intéressante.

Un objet de la présente invention est de proposer des analogues de lipides membranaires d'archaebactéries dont la longueur de l'espaceur lipophile est comparable à celle des molécules naturelles.

Un autre objet de la présente invention est de décrire de nouvelles compositions liposomiales intégrant de tels analogues.

Ces objectifs sont atteints grâce à l'invention, qui concerne des composés de formule générale (I) :

dans laquelle : . x est égal à zéro ou un ; . Z représente un O, un S ou un CH ₂ ;

. R ₁ et R ₂ qui peuvent être identiques ou différents, représentent l'un ou l'autre des substituants suivants :

. OH

. OY avec Y qui représente un groupement protecteur, préférentiellement un groupement allyle ou benzyle ou tétrahydropyranyle, ou trialkylsilyle ;

. OR ₃ , R ₃ représentant un substituant monosaccharidique ou disaccharidique ;

. A _r CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ , X ^" , X représentant un halogène, A ₁ représente une liaison amide (NHC(O)) ou ester (OC(O)) ;

. OPO(OM) ₂ , M représentant un cation de métal alcalin ou alcalino-terreux ;

. OP(O)O -O(CH ₂ ) ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ,

.A ₂ -(PEG _X1 -A ₃ ) _n -R ₄ , n étant égal à O ou 1, PEG _xι étant un polyéthylèneglycol de poids moléculaire X ₁ , X ₁ étant inférieur ou égal à 5000 daltons, A ₂ et A ₃ pouvant être identiques ou différents et représentant une liaison éther (O), ester (OC(O)), amide (NHC(O)), urée (NHC(O)NH), thiourée (NHC(S)NH), ou thioéther (S), R ₄ représentant un agent de ciblage.

Les composés hémimacrocycliques de formule générale (I) selon la présente invention sont caractérisés par : un squelette lipophile hémi-macrocyclique comprenant un espaceur incluant un motif cyclopentane 1,3-disubstitué au milieu de la chaîne lipophile et deux chaînes ramifiées dérivées du phytanol dont la longueur cumulée correspond à celle de l'espaceur et - deux têtes polaires identiques ou différentes, neutres, anioniques, cationiques ou zwittérioniques.

Les composés selon la présente invention se caractérisent notamment par la présence inédite d'un motif cyclopentane dans leur formule.

Préférentiellement, lorsque les composés selon la présente invention intègrent un agent de ciblage, celui-ci est avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide folique, les structures multiantennées comportant plusieurs motifs R ₃ , les anticorps, les peptides ; ces ligands étant reconnus spécifiquement par les récepteurs membranaires correspondants : récepteurs au folate pour l'acide folique, les intégrines pour les peptides RGD, les lectines pour les glycoconjugués.

Egalement préférentiel îement, lorsque les composés selon la présente invention intègrent un substituant R ₃ celui-ci est avantageusement choisi dans le

groupe constitué par les substituants D-galactosyle, D-glucosyle, D-mannosyle, lactosyle, maltosyle.

Egalement préférentiellement, les composés selon la présente invention répondent à la formule générale (I) dans laquelle : . x est égal à zéro ou un ;

. Z représente un O ou un CH ₂ ;

. R, et R ₂ sont identiques ou différents et représentent l'un ou l'autre des substituants suivants :

. OH . OR ₃ , R ₃ représentant un substituant lactosyle ;

. OP(O)O -O(CH ₂ ) ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ; . OPO(OM) ₂ , M représentant un cation de métal alcalin ou alcalino-terreux ;

. A _r CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ , X ^" , X représentant un halogène, A ₁ représente une liaison amide (NHC(O)) ou ester (OC(O)).

Selon une variante intéressante de l'invention, les composés selon celle-ci présentent des substituants R _t et R ₂ identiques et égaux à OR ₃ , R ₃ étant un β- lactosyle.

Selon une autre variante intéressante de l'invention, les composés selon celle-ci présentent des substituants R,et R ₂ identiques et égaux à OP(O)O - O(CH ₂ ) ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) _3.

Selon encore une autre variante intéressante de l'invention, les composés selon celle-ci présentent des substituants R ₁ Ct R ₂ identiques et égaux à NHC(O)CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ , X\ X représentant un halogène. La présente invention couvre notamment les diols de formules (I) et (2)

La présente invention couvre aussi les espaceurs de formules (3) et (4) utilisables pour la synthèse des composés décrits ci-dessus.

4

Cette synthèse pourra être effectuée par différentes voies connues de l'homme de l'art.

En ce qui concerne les composés dans lesquels Z est égal à CH ₂ ou à O cette synthèse peut comprendre une première étape consistant à coupler les espaceurs de formules (3) et (4) et le synthon chiral de formule (5)

dans laquelle Y représente un groupe protecteur de type benzyle, allyle, tétrahydropyranyle ou trialkylsilyle.

L'espaceur de formule (3) peut être préparé selon un procédé qui consiste à créer deux doubles liaisons C=C simultanées par une double réaction de Wittig en un seul pot impliquant le diiodure de phosphonium de formule (6)

et l'aldéhyde de formule (7)

YO

dans laquelle Y représente un groupe protecteur de type benzyle, allyle, tétrahydropyranyle ou trialkylsilyle.

Le diiodure de phosphonium de formule (6) est préparé en deux étapes à partir du m-l,3-bis(hydroxyméthyl)cyclopentane de formule (8)

HO -OH

via une réaction de iodation suivie d'une substitution nucléophile par la triphénylphosphine.

Après l'étape de double réaction de Wittig, la déprotection des groupements hydroxyles et la réduction des doubles liaisons formées permettent de conduire à l'espaceur de formule (3).

L'espaceur de formule (4) peut être préparé selon un procédé qui consiste à réaliser une double alkylation entre le triflate (ou le mésylate, le paratoluène sulfonate ou les halogénures correspondants) de formule (9) et le diol (8) YC

dans laquelle : Y représente un groupe protecteur de type benzyle, allyle, tétrahydropyranyle ou trialkylsilyle.

Le triflate de formule (9) est préparé par action de l'anhydride triflique en présence de 2,6-lutidine à partir de l'alcool de formule (10) dans laquelle Y représente un groupe protecteur de type benzyle, allyle, tétrahydropyranyle ou trialkylsilyle.

m

La réaction de di-O-alkylation entre le triflate (9) et le diol (8) s'effectue dans le dichlorométhane à reflux en présence de l,8-bis-(diméthylamino)- naphtalène. Après la di-O-alkylation, l'élimination des groupements protecteurs Y permet d'obtenir l'espaceur de formule (3).

Après réaction des espaceurs (3) et (4) avec le synthon de formule (5), les groupements protecteurs Y sont éliminés pour conduire aux diols (1) et (2).

La dernière étape consiste ensuite, le cas échéant, à greffer un ou deux groupements hydrophiles de façon simultanée ou séquentielle selon le caractère recherché symétrique (R1=R2) ou dissymétrique (Rl différent de R2) des composés de formule générale (I). L'accès aux composés symétriques β-bislactosylé dans lesquels Rl et R2 sont identiques et égaux à OR ₃ , R ₃ étant un β-lactosyle repose sur une réaction de bisglycosylation des diols de formules (2) et (3) à partir du thiolactosyle peracétylé de formule (1 1) :

11

dans des conditions standard d'activation (iV-iodosuccinimide (NIS), triflate de triéthylsilyle (Et ₃ SiOTf), dichlorométhane), suivie par une désacétylation des hydroxyles du disaccharide selon la procédure de Zemplèn (CH ₃ ONa, CH ₃ OH).

L'accès aux composés dans lesquels Rl et R2 sont identiques et égaux à OR ₃ , R ₃ étant un substituant mannosyle ou galactosyle sont préparés selon des conditions similaires.

Les composés symétriques dans lesquels Rl et R2 sont des phosphatidylcholines (R ₁ =R ₂ = OP(O)O -O(CH ₂ ) ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ) sont obtenus en deux étapes par réaction entre le brornoéthyldichlorophosphate Cl ₂ P(O)O-(CH ₂ ) ₂ -Br et les diols de formules (2) et (3) en présence de triéthylamine, suivie de la réaction de la triméthylamine avec les dérivés bromophosphates ainsi obtenus (R ₁ =R ₂ = OP(O)O -(CH ₂ ) ₂ -Br). Les composés de formule générale (I) symétriques dans lesquels Rl et R2 sont des bétaïnes (R1=R2= NHC(O)CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ , X\ X représentant un halogène), reliés au segment lipophile via préférentiellement des liaisons de type amide, sont obtenus par couplage entre la diamine (12) et la glycine bétaïne sous forme activée (chlorure d'acyle (13) ou thiazolidine-2-thione (14)) en présence de triéthylamine dans le dichlorométhane.

H ² NOOONH ² OO

12

13 M

Les composés de formule générale (I) disymétriques comportant deux têtes polaires Rl et R2 différentes sont préparés selon un procédé qui consiste à désymétriser les diols de formules (1) et (2) par l'introduction d'un groupement benzylique (ou un autre groupement protecteur analogue) pour conduire aux alcools de formules (15) et (16) :

15

Cette mono-protection des diols de formules (1) et (2) est réalisée préférentiellement par action du bromure de benzyle (BnBr) en présence d'oxyde d'argent (Ag ₂ O) dans le dichlorornéthane. A ce stade, une première tête polaire est introduite au niveau de l'hydroxyle libre, puis avec hydrogénolyse, la seconde tête est incorporée. L'élimination finale des groupes protecteurs présents au niveau des têtes polaires permet de conduire aux structures dissymétriques cibles.

L'invention concerne également des compositions liposomiales incorporant au moins un composé de formule générale (I) selon l'invention décrits ci-dessus seul(s) ou en mélange avec un ou plusieurs colipide(s) synthétique(s)ou naturel(s).

Les composés selon l'invention permettent de conférer à de telles compositions liposomiales, une plus grande stabilité, notamment en milieu acide et vis-à-vis des protéines et lipoprotéines du sang. L'invention concerne notamment mais, non exclusivement, de telles compositions liposomiales dans lesquels le colipide est de ia phosphatidylcholine de iécithine d'œuf.

L'invention concerne aussi de telles compositions liposomiales contenant au moins un composé de formule générale (I) dans laquelle R ₁ et R ₂ sont identiques ou différents et représentent l'un et/ou l'autre des motifs suivants :

. A _r CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ , X ^" , X représentant un halogène, A ₁ représente une liaison amide (NHC(O)) ou ester (OC(O)) ;

. A ₂ -(PEG _xr A ₃ ) _n -R ₄ , n étant égal à O ou 1, PEG _x , étant un polyéthylèneglycol de poids moléculaire X ₁ , X ₁ étant inférieur ou égal à 5000 daltons, A ₂ et A ₃ pouvant être identiques ou différents et représentant une liaison éther (O), ester (OC(O)), amide (NHC(O)), urée (NHC(O)NH), thiourée (NHC(S)NH), ou thioéther (S), R ₄ représentant un agent de ciblage ; et au moins un co-lipide cationique et au moins un co-lipide fusogène.

Le co-lipide cationique pourra par exemple être un lipide cationique bicaténaire de formule MM12 ou MM16 (J.Gene Med ; 2002 ;4 ;415- 427):

Le co-lipide fusogène pourra par exemple être la dioléylphosphatidyléthanolamine (DOPE) ou le cholestérol.

La présente invention concerne également l'utilisation des compositions liposomiales décrites ci-dessus pour la vectorisaton, c'est-à-dire le transfert

transmembranaire de molécules d'intérêt thérapeutique et/ou de molécules d'ADN ou d'ARN.

Notamment l'invention concerne l'utilisation de ces compositions liposomiales pour le transfert transmembranaire de gènes. L'invention sera plus facilement comprise grâce à la description qui va suivre d'exemples non limitatifs de réalisation donnés en référence aux dessins dans lesquels les figures 1 et 2 représentent l'influence du plasmide (pCMVLuc) sur le potentiel zêta et la taille de différents complexes intégrant des compositions liposomiales selon l'invention.

Exemple 1 : espaceur de formule (4)

Le diol (8) (500 mg ; 3.85 mmol) est dissout dans 50 mL de CH ₂ Cl ₂ anhydre et le proton sponge (1.7 g ; 2.3 éq) y est rajouté. Le milieu est agité pendant une heure à température ambiante. Ensuite le triflate (9) est ajouté lentement (4.4 g ; 2.6 éq) et le mélange est porté à reflux pendant 2 jours. Après refroidissement, le brut réactionnel est filtré pour éliminer les sels de proton sponge. Le CH ₂ Cl ₂ est concentré sous vide.

Le produit dibenzylé obtenu est purifié par colonne sur gel de silice (éluant : éther de pétrole/acétate d'éthyle 95/5 v/v) et 1.92 g de solide blanc sont récupérés (rendement : 74%).

Ce produit dibenzylé ainsi préparé (2,6 g ; 4mmol) est solubilisé dans 100 mL de cyclohexane et le palladium acétate est ajouté (150 mg ; 5% en masse). Le milieu est placé sous atmosphère d'hydrogène et agité pendant 5 heures. Ensuite le milieu est chauffé jusqu'à dissolution totale du produit et filtré à chaud sur célite et concentré sous vide. Le solide est solubilisé à chaud dans du cyclohexane ; après refroidissement le produit est récupéré par filtration sur Bϋchner. On récupère ainsi 1,7 g du composé (4) qui se présente sous la forme d'un solide blanc (rendement : 90%).

Exemple 2 : espaceur de formule (3)

A une suspension du sel de phosphonium (6) (300 mg ; 0,34 mmol) dans 6 mL de THF anhydre, on ajoute, à 0 ⁰ C, le butyllithium en solution dans l'hexane (2M) (360 μL ; 0,72 mmol ; 2, 1 éq) ; une coloration orangée apparaît. Le milieu réactionnel est agité pendant 15 minutes à O ⁰ C, puis l'aldéhyde (7) (Y est un benzyl) (239 mg ; 0,69 mmol ; 2,0 éq) en solution dans 6 mL de THF anhydre est canule. Une décoloration progressive est observée ainsi que la formation d'un précipité. Après quelques minutes, l'excès de butyllithium est détruit par de l'eau. Le mélange est extrait trois fois avec un mélange EP/AcOEt (6/4 v/v) puis les phases organiques sont lavées à l'eau, séchées, filtrées et concentrées. Une chromatographie sur colonne de gel de silice (25 éq, éluant : EP/AcOEt (99/1 v/v)) permet d'isoler 150 mg d'espaceur insaturé (0,21 mmol) se présentant sous la forme d'un solide blanc (rendement : 63%).

Le produit benzylé (1,93 g ; 2,8 mmol) est solubilisé dans l'éthanol (150 mL) puis additionné de Palladium sur charbon actif (500 mg). Le mélange réactionnel est placé sous atmosphère d'hydrogène pendant une nuit. Après avoir légèrement chauffé le milieu réactionnel, celui-ci est filtré à chaud sur célite, le solvant est évaporé. On obtient 1,34 g ( 2,6 mmol) de produit (3) qui se présente sour la forme d'un solide blanc (rendement : 93 %)

Exemple 3 : composé de formule (2)

Dans un ballon sec sont introduits de la 2,6-lutidine (425 μL ; 3,8 éq) puis 20 mL de dichlorométhane anhydre. A O ⁰ C, l'anhydride triflique (600 μL ; 3,8 éq) est ajouté et Ie mélange est agité 15 minutes à température ambiante. Le diol (4) (500 mg ; 1 mmol) sous la forme solide est additionné en une seule fois. Après quelques minutes, de l'eau est ajoutée, la phase aqueuse est extraite 3 fois au dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution aqueuse à 5% d'acide chlorhydrique, puis une solution aqueuse à 5% d'hydrogénocarbonate de sodium et enfin avec une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur MgSO ₄ , filtrée, et concentrée. Le produit est purifié rapidement, car instable, par chromatographie sur colonne de

gel de silice (éluant : EP/AcOEt (8/2 v/v)). Le ditriflate ainsi obtenu (Rf 0,8 (EP/AcOEt 8/2 v/v)) est mis immédiatement en réaction.

A une suspension d'hydrure de potassium (568 mg ; 4 éq), en suspension dans 6 mL de THF anhydre on additionne, à O ⁰ C, l'alcool (5) (Y est un benzyl) (1,5 g ; 3 éq) dissous dans 6 mL de THF anhydre. Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à température ambiante. Le triflate (800 mg ; 1.05 mmol ; 1 éq) dissous dans 8 mL de THF anhydre est ajouté goutte à goutte. Après 2 heures, l'excès d'hydrure de potassium est détruit par de l'eau. Une extraction à l'éther éthylique est réalisée. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium puis filtrée et concentrée. Une purification par chromatographie sur colonne de gel de silice (40 éq, éluant : EP/AcOEt (99/1 v/v)) permet d'isoler 23 mg (0,45 mmol) du composé benzylé qui se présente sous la forme d'une huile incolore (rendement 45% (sur les deux étapes)).

Le produit ainsi préparé (623 mg ; 0,45 mmol) est solubilisé dans 10 mL d'acétate d'éthyle et le palladium acétate est ajouté (30 mg ; 5% en masse). Le milieu est placé sous atmosphère d'hydrogène et agité pendant 24 heures. Le milieu réactionnel est ensuite filtré sur célite et concentré sous vide. On récupère ainsi 463 mg du composé (2) qui se présente également sous la forme d'une huile incolore (Rendement : 85%).

Exemple 4: composé de formule (1)

Dans un ballon bien sec on introduit la 2,6-lutidine (423 μL ; 3,60 mmol ;

3,8 éq), 20 mL de dichlorométhane anhydre et à 0 ⁰ C, l'anhydride triflique (611 μL ; 3,60 mmol ; 3,8 éq). Après 10 minutes d'agitation à 0 ⁰ C, le diol (3) (500 mg ; 0,96 mmol) sous la forme solide est additionné en une seule fois. Le mélange réactionnel est remonté à température ambiante, puis chauffé à 3O ⁰ C ; le diol se dissout. Après quelques minutes, après addition d'eau, la phase aqueuse est extraite 3 fois au dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution aqueuse à 5% d'acide chlorhydrique, puis une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium 5% et enfin avec une solution saturée

de chlorure de sodium. La phase organique est séchée, filtrée, et concentrée. Le produit est purifié rapidement par chromatographie sur colonne de gel de silice (20 éq, éluant : EP/AcOEt (9/1 v/v)). Le triflate ainsi obtenu, qui se présente sous la forme d'un solide blanc, est mis immédiatement en réaction. A 0 ⁰ C, le triflate précédemment décrit (750 mg ; 0,96 mmol ; 1 éq) dans 6 mL de THF anhydre est ajouté goutte à goutte à une suspension d'hydrure de potassium (438 mg ; 3,8 mmol ; 4 éq) et d'alcool 5 (1,32 g ; 2,87 mmol ; 3 éq) dans 12 mL de THF anhydre. Le mélange réactionnel est agité 10 minutes à 0 ⁰ C. Après quelques minutes, après addition d'eau, une extraction à l'éther diéthylique est réalisée. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium puis filtrée et concentrée. Une purification par chromatographie sur colonne de gel de silice (40 éq, éluant : EP/AcOEt (1/0 puis 95/5 v/v)) permet d'isoler le produit pseudo- macrocyclique benzylé (860 mg ; 0,61 mmol) qui se présente sous la forme d'une huile jaunâtre (rendement : 64 % (2 étapes)). Le diol hémi-macrocyclique dibenzylé (1,77 g ; 1,2 mmol), solubilisé dans de l'acétate d'éthyle (50 mL), est mis sous atmosphère d'hydrogène pendant une nuit, en présence de palladium sur charbon actif (500 mg). Une filtration sur célite, à chaud est réalisée et le composé (1) (1,2 g ; 0,97 mmol), qui se présente sous la forme d'une huile, est isolé après concentration sous pression réduite (rendement : 80 %).

Exemple 5 : Compositions liposomiales

Différentes compositions liposomiales B, C , D, E, El ont été préparées par hydratation d'un film lipidique par une solution contenant de la carboxyfluorescéine à 2,5%. Après hydratation des films lipidiques constitués d'un mélange de lipides ou de lipides synthétiques purs, puis agitation de la solution pendant quelques heures, les échantillons ont été extrudés à travers une membrane en polycarbonate (400nm puis 200nm). Une filtration sur gel Sephadex G75 a permis de recueillir les compositions liposomiales.

La stabilité de ces différentes compositions liposomiales selon l'invention a été testé à une température de 37 ⁰ C : en présence d'un composé tensio-actif (solution aqueuse de cholate de sodium à 0.4%) afin de modéliser le comportement de ces compositions en présence de sels biliaires (test n°l) ; en présence de sérum de veau riche en lipoprotéines afin de modéliser le comportement de ces compositions dans le milieu sanguin (test n°3) ; en milieu acide, à pH 2-3 (tampon IXKRB), afin de mimer le comportement de ces compositions dans le compartiment stomacal (test n° 3).

Ces tests reposent sur la détermination par spectrofluorimétrie du taux de relargage d'une sonde fluorescente encapsulée. Dans les deux premiers cas, on mesure par spectrofluorimétrie le relargage de la sonde fluorescente. Pour l'étude en fonction du pH, après incubation, le pH est neutralisé et on effectue une dialyse de la carboxyfluorescéine libre. Les liposomes sont alors lysés et on dose la carboxyfluorescéine qui était restée encapsulée.

Les résultats obtenus sont donnés dans les tableaux 1 à 3 ci-après en référence à une composition liposomiale A ne contenant que de la phosphatidylcholine de lécithine d'œuf (EPC).

Résultats du test n°l (en présence du tensio actif).

Le tableau 1 ci-après donne des résultats obtenus dans le cadre du test n°l avec différentes compositions liposomiales.

Tableau 1

Ces résultats montrent que les composés de la présente invention indiqués dans la deuxième colonne de ce tableau 1 apportent aux compositions liposomiales B, C, D un gain de stabilité en présence d'un composé tensio-actif, ce qui tend à prouver que les compositions selon l'invention présenteront une stabilité accrue en présence des sels biliaires.

Il a par ailleurs été observé que ces composées synthétiques incorporés dans certaines formulations, induisent une meilleure stabilité que les diols macrocycliques naturels (diglycéroltétraéther -DGTE) obtenus après hydrolyse des têtes polaires.

Résultats du test n°2 (en présence de sérum de veau).

Le tableau 2 ci-après donne des résultats obtenus dans le cadre du test n°2 avec différentes compositions liposomiales.

Tableau 2

Ces résultats montrent que les composés de la présente invention indiqués dans la deuxième colonne de ce tableau 2 apportent aux compositions liposomiales D, E, El un gain de stabilité en présence de sérum de veau, riche en

lipoprotéines, ce qui tend à prouver que les compositions selon l'invention présenteront une stabilité accrue en milieu sanguin.

Résultats du test n°3 (en milieu acide).

Le tableau 3 ci-après donne des résultats obtenus dans le cadre du test n°3 avec différentes compositions liposomiales.

** après 10 minutes d'incubation.

Tableau 3 Ces résultats montrent que les composés de la présente invention indiqués dans la deuxième colonne de ce tableau 3 apportent aux compositions liposomiales un gain de stabilité en pH acide, ce qui tend à prouver que les compositions selon l'invention présenteront une stabilité accrue dans le compartiment stomacal. Cette stabilité est comparable (20-30% de relargage) à celle obtenue avec des lipides naturels extraits de Thermoplasma acidophilium (espèce thermoacidophile qui possède une double tolérance aux températures élevées et aux pH faibles)

Exemple 6 : Vectorisation

Différentes compositions liposomiales selon la présente invention ont également été réalisées afin de tester leur aptitude à vectoriser le plasmide pCMVLuc.

Le composé de formule générale (I) utilisé dans ces compositions est celui dans lequel x=0 ou 1 Z=O ou CH ₂ et dans lequel R ₁ =R ₂ =NHC(O)CH ₂ N ⁺ Me ₃₅ Cl. Ce composé est ci-après dénommé GRcat.

Ce composé a été associé à un mélange de co-lipides constitués à parts égales de dioléylphosphatidyléthanolamine (DOPE) ou de cholestérol (Chol) d'une part et de lipide cationique bicaténaire MM16 d'autre part.

Le détail de ces compositions liposomiales est donné dans le tableau 4 ci- après.

Tableau 4

Des mesures de diffusion dynamique de la lumière (détermination de la taille des objets) et de potentiel zêta (évaluation de la charge globale des objets) ont par ailleurs permis de déterminer la taille et le rapport de charge global de ces différentes compositions liposomiales avant et après ajout du plasmide pCMV Luc .

Les résultats obtenus sont portés sur les figures 1 et 2 jointes.

Ces résultats mettent en évidence la formation d'agrégats supramoléculaires issus de l'interaction électrostatique entre les vésicules cationiques et le plasmide (pCMV Luc).

En effet, après ajout du plasmide, on observe une augmentation de la taille des objets avec en parallèle une diminution du rapport de charge global qui reste néanmoins positif ; un potentiel zêta positif après complexation avec le plasmide étant nécessaire dans le cadre d'une vectorisation sans agent de ciblage car l'internalisation des agrégats se fait par interactions électrostatiques entre la membrane cellulaire (chargée négativement) et la vésicule (chargée positivement). II apparaît qu'une augmentation du taux d'incorporation du composé

GRcat selon la présente invention entraîne une augmentation de la taille des liposomes et une augmentation (encore plus importante) de la taille des complexes liposomes-ADN.

L'augmentation du taux d'incorporation n'entraîne pas d'effets importants sur la valeur du potentiel zêta, mais en revanche, la formation des agrégats supramoléculaires avec l'ADN entraîne une diminution du potentiel zêta.

Les compositions liposomiales selon la présente invention, dont on peut contrôler la taille et le potentiel zêta, constituent donc des systèmes susceptibles d'être utilisés pour la vectorisation de molécules d'ADN et d'ARN et notamment de gènes.

Les études de transfection in vitro menées à partir des formulations incorporant les tétraéthers I dicationiques ( Rl = R2 = NH(CO)-CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ; x = 0 et Z = O ou x = l et Z - CH ₂ ), et la DOPE ou le cholestérol comme co-lipide, pour 4 μg d'ADN délivré (plasmide pEG FP-Nl codant pour la protéine GFP sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus, pCMV), sur les cellules A549 (cellules épithéliales alvéolaires humaines de type II), à différents rapports de charges (R (+/-) = 0,5 ; 1 ; 2 ; 4 ; 8), ont montré que de faibles quantités de co- lipides (DOPE ou cholestérol) suffisent pour assurer une bonne efficacité de transfection.

En effet, les meilleurs résultats sont obtenus avec les formulations mettant en jeu le tétraéther I ( Rl = R2 = NH(CO)-CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ; x = 0 et Z = O) comme lipide cationique en présence de DOPE. Une très forte efficacité (90% de cellules vivantes et transfectées) est obtenue pour 5% ou 15% de DOPE et pour R (+/-) =8.

La figure 3 montre l'efficacité de transfection des formulations de type tétraéther I ( Rl = R2 = NH(CO)-CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ; x = 0 et Z = O)/ DOPE sur les cellules A549 pour 4 μg d'ADN délivré.

Sur cette figure « Lipofectami » correspond à la Lipofectamine (lipide cationique commercial de référence).

R représente le rapport de charges (+/-).

F20 indique 5% de DOPE. F21 15% de DOPE F22 30 % de DOPE et F23 50% de DOPE.

Dans le cas du tétraéther I ( Rl = R2 = NH(CO)-CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ; x = 1 et Z = CH ₂ ), l'efficacité maximale est observée à partir de formulations incorporant

15% de DOPE pour un rapport de charge R (+/-) inférieur à 4 (82% de cellules vivantes et transfectées). Lorsque le rapport de charges augmente, aucune efficacité n'est observée avec le composé I ( Rl = R2 = NH(CO)-CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ; x = 1 et Z = CH ₂ ). Cette observation pourrait s'expliquer, dans ce cas, par une trop forte internalisation des complexes lipides/ADN. L'entrée d'une quantité importante de lipides dans les cellules entraînerait une déstabilisation des membranes cellulaires et par conséquent un fort taux de mortalité.

La figure 4 montre l'efficacité de transfection des formulations de type tétraéther 1 ( Rl = R2 = NH(CO)-CH ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ; x = 1 et Z = CH ₂ )/ DOPE sur les cellules A549 pour 4 μg d'ADN délivré.

La référence est également la Lipofectamine.

R représente le rapport de charges (+/-).

F24 indique 5% de DOPE. F25 15% de DOPE, F26 30 % de DOPE et F27 50% de DOPE. Ces résultats démontrent clairement le fort potentiel de ces tétraéthers cationiques pour le transfert de gènes .