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DESHMUKH M. B. ET AL.: "Solvent free accelerated synthesis of 2-hydrazinobenzothiazole derivatives using microwave", J. INDIAN CHEM. SOC., vol. 83, 2006, pages 1055 - 1057
成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) (CN)
| 权 利 要 求 书 1、 式 I所示的化合物在 的用途， 0 _H、垸基、 =0、 — 0— C— R?或- 0R7， 其中， R7为 C1-C5的垸基; R2为 -H、 垸基、 _R5-NH-R6或 -R80H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基； 为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 为 0或 S; 为 -H或垸基， 。为 C6-10的芳香基； 或， 、 。与它们连接的碳原子一起形成 C6-10的芳香基或取代的 C6-10 的芳香基。 2、根据权利要求 1所述的用途， 其特征在于： 所述蛋白激酶抑制剂为丝 氨酸 /苏氨酸蛋白激酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。 3、 根据权利要求 1或 2所述的用途， 其特征在于： 所述的蛋白激酶抑 制剂是治疗恶性肿瘤、 自身免疫性疾病、 心血管疾病、 糖尿病、 感染性疾 病、 关节炎、 免疫紊乱或老年性痴呆症的药物。 4、 根据权利要求 3所述的用途， 其特征在于： 所述恶性肿瘤是多发 性骨髓瘤、 淋巴性细胞白血病、 粒细胞白血病、 淋巴瘤、 肝癌、 肺癌、 胰腺癌、 结肠癌或乳腺癌； 所述自身免疫性疾病是类风湿型关节炎、 骨髓增殖性疾病、 移植排 斥反应、 哮喘、 红斑狼疮、 银屑病、 过敏或接触性皮炎。 5、根据权利要求 1所述的用途，其特征在于：所述化合物为式 II化合物、 2-(4-苯基 -2-噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇、 或 2-(6-甲氧基 -2-苯并噻唑 基：) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇； 其中， 式 II化合物的结构式如下 式 II ， o II _H、垸基、 =0、 — O— C— R?或- 0R7， 其中， R7为 C1-C5的垸基; R2为 -H、 垸基、 _R5-NH-R6或 -R80H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基； R3为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 为 0或5。 6、 根据权利要求 1或 5所述的用途， 其特征在于： 0 II -H、 — 0—c—R7或 -0R7， 所述 R7为 C1-C3的垸基； R2为- H、 C1-C5的垸基、 或 -R肌 所述 为 C1-C3的垸基; R3为 -H、 C1-C3的垸基、 苯基、 或卤素取代的 C1-C3的垸基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成 C3-8的环垸基； 为 0或5。 7、 根据权利要求 6所述的用途， 其特征在于： 0 II ！^为-OH、 — 0一 C_R?或 -0R7， 所述 R7为甲基； 为 -H、 或 -R80H， 所述 为乙基； 为甲基、 苯基、 或三氟取代的甲基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成 C5-C6的环垸基； 为 0或5。 8、 根据权利要求 7所述的用途， 其特征在于： 所述化合物为： 2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇、 2-(1氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇、 1-(1,3-苯并噻唑基 -2基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲唑 -4-酮、 1-(1,3-苯并噻唑基 -2基) -3,4-二甲基 -1氢 -吡唑 -5-醇、 2-(2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇、 1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) 吡唑 -5-醇、 1- (2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基 吡唑 -5-醇、 2- (2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醋酸酯、 2-(2-苯并噁唑基) - 4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇、 或 1-(2-苯并噻唑基) -3-苯基 吡唑 -5-醇。 9、 式 I所示的化合物， 其结构式如下： _H、垸基、 =0、 —0— C— R?或- 0R7， 其中， R7为 C1-C5的垸基; R2为 -H、 垸基、 _R5-NH-R6或 -R80H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基； R3为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 为 0或 S; 为 -H或垸基， 。为 C6-10的芳香基； 或， 、 。与它们连接的碳原子一起形成 C6-10的芳香基或取代的 C6-10 的芳香基。 10、 根据权利要求 9所述的化合物， 其特征在于： 所述化合物为式 II化 合物、 2-(4-苯基 -2-噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇、或 2-(6-甲氧基 -2-苯并 噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇； 其中， 式 II化合物的结构式如下 式 II， _H、垸基、 =0、 — O— C— R?或- 0R7， 其中， R7为 C1-C5的垸基; R2为 -H、 垸基、 _R5-NH-R6或 -R80H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基； 为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基； 为 0或 S; 当 R2、 与它们连接的碳原子一起形成 C6的环垸基、 时， R4不 为 ^ 11、 根据权利要求所述的化合物， 其特征在于： 所述化合物为： 2-(1氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇、 1-(1,3-苯并噻唑基 -2基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲唑 -4-酮、 1- (1,3-苯并噻唑基 -2基) -3 ,4-二甲基 -1氢 -吡唑 -5-醇、 2- (2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇、 1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) 吡唑 -5-醇、 1- (2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基 吡唑 -5-醇、 2- (2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醋酸酯、 2-(2-苯并噁唑基) - 4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇、 或 1-(2-苯并噻唑基) -3-苯基 吡唑 -5-醇。 12、权利要求 11所述 2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3- 醇的合成方法， 其特征在于： 它包括如下步骤： 取式 III化合物、 2-肼基苯并噻唑， 进行缩合反应后， 即得目标化合物； 其中， 式 III化合物的结构式如下： 其中， （^为^-^的垸基。 13、根据权利要求 12所述的合成方法， 其特征在于： 所述式 III化合物为 2-环己酮甲酸乙酯、 2-环己酮甲酸甲酯或 2-环己酮甲酸丙酯中的一种或两种 以上的混合物； 式 III化合物与 2-肼基苯并噻唑的摩尔用量比为（0.5-1.5): 1； 反应中选用有机酸或无机酸为催化剂， 催化剂与式 III化合物的摩尔用量比为 (0.01-0.1 )： 1 ; 溶剂选用甲苯、 乙醇、 甲醇； 反应温度为 20-200°C。 14、 根据权利要求 13 所述的合成方法， 其特征在于： 所述式 III化合物 2-环己酮甲酸乙酯， 式 III化合物与 2-肼基苯并噻唑的摩尔用量比为 （0.7-1 ): 1。 15、 根据权利要求 13所述的合成方法， 其特征在于： 催化剂选自醋酸、 对甲基苯磺酸、 甲酸、 或非氧化性无机酸酸。 16、 根据权利要求 15所述的合成方法， 其特征在于： 催化剂选自醋酸， 醋酸与式 III化合物的摩尔用量比为 (0.012-0.014)： 1； 或 催化剂选自对甲基苯磺酸， 对甲基苯磺酸与式 III化合物的摩尔用量比为 (0.056-0.057)： 1。 17、 根据权利要求 13所述的合成方法， 其特征在于： 所述溶剂为甲苯。 18 根据权利要求 13 所述的合成方法， 其特征在于： 反应温度为 120-125°C。 19、 根据权利要求 12所述的合成方法， 其特征在于： 缩合反应后， 用乙 醇重结晶。 |
一种抑制蛋白激酶的化合物及其用途 技术领域
本发明涉及一种抑制蛋白激酶的化合物及其用 途。
背景技术
蛋白激酶 (protein kinases )又称蛋白质磷酸化酶 (protein phosphakinase)。 一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。 它能把腺苷三磷酸 （ATP) 上的 γ-磷酸转 移到蛋白质分子的氨基酸残基上某些丝氨酸、 苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上， 从而改变蛋白质、 酶的构象和活性。 蛋白质的磷酸化是多种信号传导途径的 重要环节， 细胞内大部分重要的生命活过程都离不开蛋白 质磷酸化。 这些酶 在调节细胞信号包括细胞增殖和细胞分化中是 关键的因素。
蛋白激酶分为 5类： 蛋白丝氨酸 /苏氨酸激酶、 蛋白酪氨酸激酶、 蛋白组 氨酸激酶、 蛋白色氨酸激酶和蛋白天冬氨酰基 /谷氨酰基激酶。 蛋白激酶在 细胞过程的调节和维持起到了重要作用， 在许多疾病状态中都观察到了 激酶活性异常， 所述疾病状态包括： 恶性肿瘤， 免疫性疾病、 心血管疾 病、 糖尿病、 感染性疾病、 关节炎和其它免疫紊乱、 神经系统如老年性 痴呆症、阿默海茨症 AD等，现已发现超过 400种人类疾病与蛋白激酶相 关。
蛋白激酶抑制剂， 是一类抑制蛋白激酶活性的化合物。 根据蛋白激 酶的种类， 可分为丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂 前者又可根据作用部位， 分为三组， 一组作用于催化区， 一组作用于调 节区， 另一组对调节区和催化区均有作用。 目前有多种蛋白激酶抑制剂 的相关研究报道， 如专利申请： CN201110310167, CN200810028982等。 众多研究报道， 蛋白激酶抑制剂可以用于治疗由蛋白激酶活化 引起的恶 性肿瘤、 关节炎等疾病， 同时， 它还能阻止 Τ淋巴细胞的激活， 对多种 免疫性疾病有治疗作用 （周意明， 等， 酪氨酸蛋白激酶抑制剂的研究进 展， 2000年 6卷 3期）。 由于蛋白激酶抑制剂的医药用途显著， 因此， 对 该类药物的研究显得格外重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一类抑制蛋白激酶的新 化合物。 本发明的另一目 的在于提供该类化合物的新用途。
具体地， 本发明提供了式 I所示的化合物在制备蛋白激酶抑制剂中的用 途，
_H、垸基、 =0、 — O— C— R?或- 0 R 7 ， 其中， R 7 为 C1-C5的垸基;
R 2 为 -H、 垸基、 _R 5 -NH-R 6 或 -R 8 0H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基；
R 3 为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
为 0或 S;
为 -H或垸基， 。为 C6-10的芳香基；
或， 、 。与它们连接的碳原子一起形成 C6-10的芳香基或取代的 C6-10 的芳香基。
进一步地，所述蛋白激酶抑制剂为丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶抑制剂或酪氨 酸激酶抑制剂。
其中， 所述的蛋白激酶抑制剂是治疗恶性肿瘤、 自身免疫性疾病、 心 疾病、 糖尿病、 感染性疾病、 关节炎、 免疫紊乱或老年性痴呆症的药物。
进一步地， 所述恶性肿瘤是多发性骨髓瘤、 淋巴性细胞白血病、 粒 细胞白血病、 淋巴瘤、 肝癌、 肺癌、 胰腺癌、 结肠癌或乳腺癌； 所述自 身免疫性疾病是类风湿型关节炎、 骨髓增殖性疾病、 移植排斥反应、 哮 喘、 红斑狼疮、 银屑病、 过敏或接触性皮炎。
其中， 所述化合物为式 II化合物、 2-(4-苯基 -2-噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2H- 吲唑 -3-醇、 或 2-(6-甲氧基 -2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇； 其中， 式 II化合物的结构式如下
式 II， o
II
_H、垸基、 =0、 — O— C— R?或- 0 R 7 ， 其中， R 7 为 C1-C5的垸基;
R 2 为 -H、 垸基、 _R 5 -NH-R 6 或 -R 8 0H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基；
为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
为 0或5。
进一步地， R1为 -0H、 -H、 垸基、 =0;
R2为 -H、 垸基、 -R5-NH-R6 , 其中， R5为垸基或烯基； R6为垸基、 环垸 基；
R3为 -H、 垸基；
或， Rl、 R2与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
或， R2、 R3与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
R4为 N或S。
进一步地，
〇
！^为-OH、 -H、 —〇— c— R 7 或- 0R 7 ， 所述 R 7 为 C1-C3的垸基；
R 2 为- H、 C1-C5的垸基、 或 -R肌 所述 为 C1-C3的垸基;
R 3 为 -H、 C1-C3的垸基、 苯基、 或卤素取代的 C1-C3的垸基；
或， 、 与它们连接的碳原子一起形成 C3-8的环垸基；
为 0或5。
更进一步地，
0
II
！^为-OH、 _ Q — C _ R7 或 -0R 7 ， 所述 R7为甲基；
为 -H、 或 -R 8 0H， 所述 为乙基；
为甲基、 苯基、 或三氟取代的甲基；
或， 、 与它们连接的碳原子一起形成 C5-C6的环垸基；
为 0或5。
进一步优选地， 所述化合物为：
2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇、 2-(l氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇、
1-(1,3-苯并噻唑基 -2基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲唑 -4-酮、
1- (1,3-苯并噻唑基 -2基) -3,4-二甲基 -1氢 -吡唑 -5-醇、
2- (2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇、
1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) 吡唑 -5-醇、
1- (2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基 吡唑 -5-醇、
2- (2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醋酸酯、
2-(2-苯并噁唑基) - 4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇、 或
1-(2-苯并噻唑基) -3-苯基 吡唑 -5-醇。
本发明还提供了式 I所示的化合物， 其结构式如下：
式 I
0
II
_H、垸基、 =0、 —0— C— R?或- 0 R 7 ， 其中， R 7 为 C1-C5的垸基;
R 2 为 -H、 垸基、 _R 5 -NH-R 6 或 -R 8 0H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基；
R 3 为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
为 0或 S;
为 -H或垸基， 。为 C6-10的芳香基； 或， 、 。与它们连接的碳原子 一起形成 C6-10的芳香基或取代的 C6-10的芳香基。
进一步地， 所述化合物为式 II化合物、 2-(4-苯基 -2-噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇、 或 2-(6-甲氧基 -2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇； 其 中， 式 II化合物的结构式如下
式 II， o
II
_H、垸基、 =0、 — O— C— R?或- 0 R 7 ， 其中， R 7 为 C1-C5的垸基;
R 2 为 -H、 垸基、 _R 5 -NH-R 6 或 -R 8 0H， 其中， 为垸基或烯基， 为垸基、 环垸基， 为 C1-C5的垸基；
为 -H、 垸基、 C6-10的芳香基、 取代的垸基或取代的 C6-10芳香基； 或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
或， 、 与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
为 0或 S;
当 R 2 、 与它们连接的碳原子一起形成 C6的环垸基、 时， R 4 不 为？ >。
进一步地， R1为 -0H、 -H、 垸基、 =0;
R2为 -H、 垸基、 -R5-NH-R6 , 其中， R5为垸基或烯基； R6为垸基、 环垸 基；
R3为 -H、 垸基；
或， Rl、 R2与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
或， R2、 R3与它们连接的碳原子一起形成环垸基、 环垸酮基或被取代的 环垸基、 环垸酮基；
R4为 N或 S;
当 R 2 、 与它们连接的碳原子一起形成 C6的环垸基、 时， R 4 不 为
进一步优选地， 所述化合物为：
2-(1氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇、
1-(1,3-苯并噻唑基 -2基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲唑 -4-酮、
1- (1,3-苯并噻唑基 -2基) -3,4-二甲基 -1氢 -吡唑 -5-醇、
2- (2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇、
1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) 吡唑 -5-醇、
1- (2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基 吡唑 -5-醇、
2- (2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醋酸酯、
2-(2-苯并噁唑基) - 4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇、 或
1-(2-苯并噻唑基) -3-苯基 吡唑 -5-醇。
本发明还提供了 2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇的 取式 III化合物、 2-肼基苯并噻唑， 进行缩合反应后， 即得目标化合物; 其中， 式 III化合物的结构式如下
其中， （^为^-^的垸基。
进一步地， 所述式 III化合物为 2-环己酮甲酸乙酯、 2-环己酮甲酸甲酯或 2-环己酮甲酸丙酯中的一种或两种以上的混合 ； 式 III化合物与 2-肼基苯并 噻唑的摩尔用量比为 （0.5-1.5 ): 1； 反应中选用有机酸或无机酸为催化剂， 催化剂与式 III化合物的摩尔用量比为 （0.01-0.1 ): 1； 溶剂选用甲苯、 乙醇、 甲醇； 反应温度为 20-200°C。
更进一步地， 所述式 III化合物 2-环己酮甲酸乙酯， 式 III化合物与 2-肼基 苯并噻唑的摩尔用量比为 （0.7-1 ): 1。
更进一步地， 催化剂选自醋酸、 对甲基苯磺酸、 甲酸、 或非氧化性无机 酸酸。
优选地， 催化剂选自醋酸， 醋酸与式 III化合物的摩尔用量比为 (0.012-0.014)： 1； 或
催化剂选自对甲基苯磺酸， 对甲基苯磺酸与式 III化合物的摩尔用量比为 (0.056-0.057)： 1。
更进一步地， 所述溶剂为甲苯。
更进一步地， 反应温度为 120-125°C。
进一步地， 缩合反应后， 用乙醇重结晶。
实验表明， 本发明化合物能够有效抑制蛋白激酶活性、 抑制异常活 化的 T细胞增殖， 可用于治疗自身免疫性疾病、 恶性肿瘤等疾病， 特别是 对淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 乳腺癌、 肝癌、 移植排斥反应、 过敏和类风湿 性关节炎有显著的治疗作用， 具有良好的工业应用前景。
本发明 （2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇） 的合成 方法中， 反应原料易得， 反应操作简便， 产品收率可达到 40%以上， 纯度均 在 95%以上， 且可高达 98%, 收率和纯度均较高， 且重复性好， 为该化合物 提供了一种实用性良好的合成方法， 为进一步研究该类化合物提供了可靠的 来源。
附图说明
图 1 对蛋白激酶活性的影响 图 2 对移植排斥反应的影响
图 3 对迟发性变态反应的影响
图 4 化合物 1的核磁共振鉴定图
图 5 图 4中 A部分放大图
图 6 图 4中 B部分放大图
图 7 化合物 1的质谱图
图 8 化合物 1的 HPLC图
具体实施方式
实施例 1 2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -吲唑 -3-醇（简称化合 物 1 ) 的制备
N
: 剛
混合原料 2-环己酮甲酸甲酯 （0.264mol)， 2-肼基苯并噻唑 （0.333mol)， 甲苯 700mL, 取醋酸 lml (醋酸与原料 2-环己酮甲酸甲酯摩尔比约为 0.07 : 1 )， 于 lOOOmL反应瓶， 加热 120-125 °C回流反应 5h (TLC监测反应终点）。 反应 液减压蒸干， 残留物加 800mL乙醇重结晶， 过滤， 干燥， 得橙黄色固体粉末 36g， 收率 50%, 经 HPLC测定， 化合物纯度达到 98. 22%, 该化合物的结构鉴 定数据如下：
ESI-MS: m/z 270(M-l)- UV (MeOH) ληιαχ = 218 nm;
lH NMR(DMSO-d6, 600MHz): δ 8.01 (d, lH,J=7.86Hz), 7.78(d, lH,J=7.80Hz),， 7.46(t,lH,J=7.6Hz) , 7.33(t, lH,J=7.5Hz),2.50(m,2H), 2.20(m,2H), 1.73(m,2H) , 1.67(m,2H)。
13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz); δ 162.3, 154.6, 153.3, 148.9, 132.2, 126.9, 124.3, 122.6, 121.0, 102.5, 22.3, 22.2, 21.7, 18.7; ESI-MS: m/z 272 [M + 1]+; HRESIMS m/z calcd for C14H14N30S [M + 1]+ 272.0852, found 272.0849. 实施例 2 化合物 1的合成方法
混合原料 2-环己酮甲酸甲酯 （0.264mol)， 2-肼基苯并噻唑 （0.333mol)， 甲苯 700mL, 醋酸 lmL于 lOOOmL反应瓶， TLC监测反应， 室温反应 3天达 到终点。 反应液减压蒸干， 残留物加 800mL乙醇重结晶， 过滤， 干燥， 得橙 黄色固体粉末 33. 4g， 收率 45%, 纯度高于 95%。 经鉴定， 所得化合物为化合 物 1。
实施例 3 化合物 1的合成方法
混合原料 2-环己酮甲酸甲酯 ( 0. 264mol ) , 2_肼基苯并噻唑 (0. 333mol ) , 甲苯 700mL， 取甲酸 0. 5ml (甲酸与原料环己酮酯摩尔比约为 0. 05: 1 )， 于 lOOOmL反应瓶， 外加热 120_125°C回流反应 5h (TLC监测反应终点）。反应液 减压蒸干，残留物加 800mL乙醇重结晶，过滤，干燥，得橙黄色固体 末 36g， 收率 50%, 纯度高于 95%。 经鉴定， 所得化合物为化合物 1。
实施例 4 化合物 1的合成方法
混合原料 2-环己酮甲酸乙酯（0. 264mol )， 2_肼基苯并噻唑（0. 333mol )， 乙醇 700mL， 醋酸 lmL于 lOOOmL反应瓶，回流反应 36h (TLC监测反应终点）。 反应液减压蒸干， 残留物加 800mL乙醇重结晶， 过滤， 干燥， 得橙黄色固体 粉末 30g， 收率 42%, 纯度高于 95%。 经鉴定， 所得化合物为化合物 1。
实施例 5 化合物 1的合成方法
混合原料 2-环己酮甲酸乙酯（0. 264mol )， 2_肼基苯并噻唑（0. 333mol )， 甲苯 700mL， 醋酸 lmL于 lOOOmL反应瓶，回流反应 42h (TLC监测反应终点）。 反应液减压蒸干， 残留物加 800mL乙醇重结晶， 过滤， 干燥， 得橙黄色固体 粉末 35g， 收率 49%。 经鉴定， 所得化合物为化合物 1。
实施例 6 化合物 1的合成方法
在 50ml反应瓶中加入 2-环己酮甲酸甲酯 （0.0132 mol)， 2-肼基苯并噻 唑（0.0133mol)，甲苯 20ml，醋酸 0.01ml (醋酸与环己酮酯的摩尔比约为 0.013 : 1 )， 外加热 120-125 °C回流反应 5h; 反应液减压蒸干； 残留物加 20mL乙醇 重结晶， 过滤， 干燥， 得橙黄色固体即为 2-(1 氢 -苯并噻唑基 -2 基 )-4,5,6,7- 四氢 -2氢 -吲唑 -3-醇。 收率为 58%, 纯度高于 95%。 经鉴定， 所得化合物为化 合物 1。
实施例 7 化合物 1的合成方法
在 250ml反应瓶中加入 2-环己酮甲酸甲酯 （0.0132 mol) , 2-肼基苯并噻唑 (0.0133mol)， 甲苯 100ml, 对甲基苯磺酸 0.45g (对甲基苯磺酸与环己酮酯 的摩尔比约为 0.0568: 1 )， 外加热 120-125°C回流反应 5h; 反应液减压蒸干； 乙酸乙酯萃取， 水洗， 干燥， 浓缩， 残留物加 200mL乙醇重结晶，过滤，干燥， 得橙黄色固体即为 2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇。 收 率为 59%, 纯度高于 95%。 经鉴定， 所得化合物为化合物 1。
实施例 8 2-(2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇（简称化合物 5 ) 的 制备
除用原料环戊酮酯代替上述反应中的环己酮酯 ， 其余同实施例 1制备。 实施例 9 1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) 吡唑 -5-醇（简称化合物 6) 的 制备
按反应式混合原料酯 （2g， O.Ol lmol) , 原料肼（2.2g， 0.013mol)， 甲苯 70mL, 醋酸 O. lmL于 150mL反应瓶， 外加热 120-125 °C回流反应 5h (TLC 监测反应终点）。反应液减压蒸干，残留物加 70mL乙醇重结晶，过滤，干燥， 得白色固体粉末 0.23g， 收率 5%。 该化合物的结构鉴定数据如下：
1H NMR(DMS0-d6， 600MHz)： δ 8.08(d,lH,J=6.0Hz), 7.94(d, lH,J=6.0Hz), 7.52(t,lH,J=6.0Hz) , 7.43(t, lH,J=6.0Hz),5.95(s, 1H), 3.43(s,lH)。
ESI-MS: m/z 284(M-l)- 实施例 10 l-(2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基 -IH-吡唑 -5-醇（简称化合 物 7 ) 的制备
按实施例 3的制备方法， 替换反应原料后， 制备得白色固体粉末 0.89g， 收率 8%。 该化合物的结构鉴定数据如下：
1H NMR(DMS0-d6， 600MHz) : δ 8.02(d,lH,J=12.0Hz), 7.80(d, lH,J=6.0Hz), 7.47(t,lH,J=12.0Hz), 7.33(t,lH,J=6.0Hz),3.47(t,2H,J=6.0Hz), 2.37(t,2H,J=6.0Hz), 2.20(s,3H)。
ESI-MS: m/z 274(M-l)- 实施例 11 2-(6-甲氧基 -2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇（简称化合 -丄 ^骈璨 °%Γ8*
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01
L96UO/£lOZ l3/13d lH NMR(DMSO-d6， 600MHz): δ 8.05(d,lH,J=6.0Hz), 7.89(m,3H), 7.50(m,4H) , 7.38(t,lH,J=6.0Hz),6.10(s,lH)。
ESI-MS: m/z 292(M-l)- 实施例 15 2-(2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醋酸酯（简称化合物 9) 的制备
取实施例 1制备的 2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇 ( l.Og, 0.0037mol)， Ac 2 0 20mL于 lOOmL反应瓶，回流反应 lh (TLC监测 反应终点）。 反应液减压蒸干， 残留物加 20mL乙醇重结晶， 过滤， 干燥， 得 淡黄色固体粉末 0.91g， 收率 90%。 该化合物的结构鉴定数据如下：
1H NMR(DMSO-d6， 600MHz): δ 8.02(d,lH,J=6.0Hz), 7.85(d,lH,J=6.0Hz), , 7.48(t,lH,J=6.0Hz) ， 7.38(t,lH,J=6.0Hz),2.64(t,2H,J=6.0Hz), 2.47(s,3H), 2.41(t,2H,J=6.0Hz), 1.76(d,2H,J=6.0Hz), 1.68(d,2H,J=6.0Hz)。
ESI-MS: m/z 314(M+l)+
综上所述， 本发明化合物的合成方法中， 反应原料易得， 反应操作简便， 产品收率可达到 40%以上， 纯度均较高， 且重复性好， 为本发明化合物提供 了一种实用性良好的合成方法，为进一步研究 该类化合物提供了可靠的来源。 以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例 1 本发明化合物对蛋白激酶活性的影响
CTLL-2 细胞按照 1 X 10 7 个细胞 /孔铺平底 6孔板， 并加入本发明化合 物 1。 IL-2饥饿培养 6小时后， 加入 IL-2, 终浓度为 100U/ml， 孵育 10min。 收集细胞， 600G, 5min离心去掉上清， PBS洗涤一次， 取细胞沉淀， 加入 细胞裂解液裂解细胞。收集蛋白供 Western-blot检测，待测激酶为磷酸化 Akt、 磷酸化 JAK3以及磷酸化 STAT5。
实验结果： 结果参见图 1。
结果表明， 本发明化合物 1 (实施例 1制备） 可以抑制蛋白质激酶 Akt (丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶）、 JAK3 (酪氨酸激酶） 以及 STAT5 (信号传导及 转录激活因子） 磷酸化， 表明本发明化合物可有效抑制蛋白激酶活性。
试验例 2 本发明化合物对 T细胞的影响
1、 对静息 T细胞毒性
方法： 1. 人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC)制备： 健康人员献血，利用 PBS等比例稀释血液，在 10ml尖底玻璃离心管中加入 3ml PBMC分离液后， 倾斜 45°C缓缓加入 6ml血液 -PBS混合液， 600g离心 20min， 吸取富含 PBMC中间层， PBS洗涤 2次后用细胞培养基重悬。
2. 从 PBMC中纯化 T细胞： 利用 MiltenylT细胞磁珠纯化试剂盒从 PBMC中 分离得到 T细胞， 步骤如下： 上述制备的 PBMC细胞悬液， 500G离心 5分钟， 去掉上清； PBS缓冲液 1 (pH=7.2, 含 0.5%BSA , 2mM EDTA) 45 μΐ重悬后加入 生物素标记抗 CD14, CD 16, CD 19, CD36,CD56, CD123, and Glycophorin A抗体 30μ1， 混匀后 4°C孵育 20分钟。 加入上述缓冲液 lml 500G, 5分钟洗涤细胞， 去 上清。 重悬细胞， 安装吸附柱， 让细胞悬液通过吸附柱， 吸附非 T细胞， 得到 纯化 T细胞。
3. T胞按照 2xl0 5 个细胞 /?L， 铺 96孔板， 体积为 200μ1。 化合物最高浓度为 50μΜ， 按照 5倍梯度稀释， 培养 72小时后， 使用 CCK-8染色法检测药物对 Τ细 胞毒性。细胞存活率 =药物组细胞 OD/不加药物组细胞数量 xOD。存活率为 95% 以药物浓度视为对 T细胞没有毒性。 IC50为药物抑制 T细胞活性一半时的浓度。 结果参见表 1。
2、 抑制 CD3,CD28双抗刺激的人 T细胞增殖
方法：
1. 制备含有抗人 CD3、 CD28双抗的培养基： 含抗人 CD3抗体 2 g/ml PBS 包被 12小时后， PBS洗涤 2次后，加入含有 l g/ml抗人 CD28抗体的培养基 100μ1。
2. 羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE): 加入 CFSE到纯化好的 T细 胞当中， 其中 CFSE终浓度为 2.5μΜ， Τ细胞浓度为 lxlO 6 个 /ml。 37°C孵育 10分 钟， 300G离心 5分钟， 弃上清， 加入培养基洗涤 2次后， 用 l g/ml抗人 CD28抗 体的培养基重悬后铺 96孔板。 化合物按照梯度稀释后加入， 培养 72小时上流 式细胞仪进行观察， 并计算抑制 T细胞增殖的 IC50。 实验结果： 结果参见表 1。
表 1
注： "ΝΑ"表示无抑制活性或活性极低。
Τ细胞的异常增殖， 对自身免疫性疾病和恶性肿瘤的产生有重要影 响。 实验结果表明， 本发明化合物能够显著抑制人活化 τ细胞， 但对静息 Τ细胞 没有毒性。 说明本发明化合物对 τ细胞的异常增殖导致的自身免疫性疾病和 恶性肿瘤有一定的预防或治疗作用。
试验例 3 本发明化合物抑制人淋巴细胞瘤细胞增殖
方法： Jurkat细胞按照 1500个细胞 /孔铺平底 96孔板。 培养体系中， 化 合物最高浓度为 50μΜ， 按照 5倍梯度做药物浓度稀释。 化合物作用 48小时 后加入 l(^l CCk-8， 孵育 6h后， 利用酶标仪测定 450nM波长吸收值。
化合物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美 国国家癌症研究所 (National Cancer Institute, NCI)标准方法进行：当 Ti (药物组培养 48h， CCK-8 显色吸收 OD值）≥Tz (不含药物组培养起始时 CCK-8显色吸收 OD值）， 肿 瘤细胞存活率 =[ΓΠ-Τζ)/(^-Τζ)]χ100， 其中 C为不含药物组 48小时后 CCK-8 显色吸收 OD值； 当 Ti<Tz时， 肿瘤细胞存活率=[0^2) 2：^100。
实验结果： 结果参见表 2。
表 2
化合物 名称
抑制 Jurkat细胞增殖 50(μΜ)
2-(1 氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
1 2.1
吲唑 -3-醇
2-(1 氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
2 2.3
吲唑 -3-醇
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲
3 4
唑 -4-酮
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -3,4-二甲基 -1 氢-吡
4 23.3
唑 -5-醇 氮 -(6-甲基 -1,3-苯并噻唑基 -2 基) -4,5,6,7-四
对比例 1 NA
氢 -1-苯并噻吩 -3-甲酰胺
氮 -1,3-苯并噻唑基 -2基小甲基 -1氢 -吡唑 -5- 对比例 2 NA
甲酰胺
5-[(1,3-苯并噻唑基 -2 甲基)氨基] -1-乙基-氮- 对比例 3 NA
甲基 -4,5,6,7-四氢 -1氢 -吲唑 -3-甲酰胺
注： "NA"表示无抑制活性或活性极低。 化合物编号参见试验例 2。 实验结果表明， 本发明化合物对淋巴细胞瘤细胞抑制作用明显 ， 其中， 化合物 1、 2、 3的抑制作用较优。
试验例 4 本发明化合物抑制人多发性骨髄瘤细胞增殖
方法： 多发性骨髓瘤细胞 RPMI8226细胞按照 5000个细胞 /孔铺平底 96 孔板。 培养体系中， 化合物最高浓度为 50μΜ， 按照 5倍梯度做药物浓度稀 释。化合物作用 48小时后加入 ΙΟμΙ CCk-8，孵育 6h后，利用酶标仪测定 450nM 波长吸收值。 药物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美国 国家癌症研究所 (National Cancer Institute, NCI)标准方法进行：当 Ti (药物组培养 48h， CCK-8 显色吸收 OD值）≥Tz (不含药物组培养起始时 CCK-8显色吸收 OD值）， 肿 瘤细胞存活率 =[Cn-Tz)/(;C-Tz)]xl00， 其中 C为不含药物组 48小时后 CCK-8 显色吸收 OD值； 当 Ti<Tz时， 肿瘤细胞存活率=[0^2) 2：^100。
实验结果： 结果参见表 3。
化合物 名称 抑制多发性骨髓瘤细胞增殖
ΙΟ50(μΜ)
2-(1 氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
1 1.1
吲唑 -3-醇
2-(1 氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
2 1.5
吲唑 -3-醇
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲
3 3.4
唑 -4-酮
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -3,4-二甲基 -1 氢-吡
4 6.1
唑 -5-醇
2-(2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇
5 1.2
1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) -Iff-吡唑 -5-
6 醇 2.3
1-(2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基
7 吡唑 -5-醇 4.6
2-(6-甲氧基 -2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2ί -
8 吲唑 -3-醇 5.7
9 2-(2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2ί -吲唑 -3-醋 6.1 酸酯
2-(2-苯并噁唑基) - 4,5,6,7-四氢 吲唑 -3-
10 醇 7.2
2-(4-苯基 -2-噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2ί -吲唑 -3-
11 醇 7.6
1-(2-苯并噻唑基) -3-苯基 -Ιί -吡唑 -5-醇
12 8.1
化合物编号参见试验例 2。
实验结果表明， 本发明化合物对多发性骨髓瘤细胞抑制作用明 显。
试验例 5 本发明化合物抑制人乳腺癌肿瘤细胞增殖
方法： 人乳腺癌肿瘤细胞 MCF-7细胞按照 3000个细胞 /孔铺平底 96孔 板。 培养体系中， 药物最高浓度为 50μΜ， 按照 5倍梯度做药物浓度稀释。 药物作用 48小时后加入 l(^l CCk-8， 孵育 6h后， 利用酶标仪测定 450nM波 长吸收值。 药物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美国 国家癌症研究所 (National Cancer Institute, NCI)标准方法进行：当 Ti (药物组培养 48h， CCK-8 显色吸收 OD值）≥Tz (不含药物组培养起始时 CCK-8显色吸收 OD值）， 肿 瘤细胞存活率 =[Cn-Tz)/(;C-Tz)]xl00， 其中 C为不含药物组 48小时后 CCK-8 显色吸收 OD值； 当 Ti<Tz时， 肿瘤细胞存活率=[0^2) 2：^100。
实验结果： 结果参见表 4。
表 4
化合物 名称 抑制多发性骨髓瘤细胞增殖
ΙΟ50(μΜ)
2-(1 氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
1 3.1
吲唑 -3-醇
2-(1 氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
2 2.7
吲唑 -3-醇
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲
3 6.5
唑 -4-酮
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -3,4-二甲基 -1 氢-吡
4 4.3
唑 -5-醇
2-(2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇
5 2.1
1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) -Iff-吡唑 -5-
6 醇 6.8
1-(2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基
7 吡唑 -5-醇 4.3
8 2-(6-甲氧基 -2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2ί - 6.7 吲唑 -3-醇
2-(2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2ί -吲唑 -3-醋
9 酸酯 2.4
2-(2-苯并噁唑基) - 4,5,6,7-四氢 吲唑 -3-
10 醇 3.1
2-(4-苯基 -2-噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2ί -吲唑 -3-
11 醇 5.4
1-(2-苯并噻唑基) -3-苯基 -Ιί -吡唑 -5-醇
12 4.3
化合物编号参见试验例 2。
实验结果表明， 本发明化合物对人乳腺癌肿瘤细胞抑制作用明 显。 试验例 6 本发明化合物抑制人肝癌肿瘤细胞增殖
方法： 多人肝癌肿瘤细胞 Hep3B按照 2500个细胞 /孔铺平底 96孔板。 培养体系中， 药物最高浓度为 50μΜ， 按照 5倍梯度做药物浓度稀释。 药物 作用 48小时后加入 l(^l CCk-8， 孵育 6h后， 利用酶标仪测定 450nM波长吸 收值。 药物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美国 国家癌症研究所 (National Cancer Institute, NCI)标准方法进行：当 Ti (药物组培养 48h， CCK-8 显色吸收 OD值）≥Tz (不含药物组培养起始时 CCK-8显色吸收 OD值）， 肿 100， 其中 C为不含药物组 48小时后 CCK-8 显色吸收 OD值； 当 Ti<Tz时， 肿瘤细胞存活率=[0^2) 2：^ 100。
实验结果： 结果参见表 5。
化合物 名称 抑制多发性骨髓瘤细胞增殖
ΙΟ50(μΜ)
2-(1 氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
1 2.7
吲唑 -3-醇
2-(1 氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢-
2 2.1
吲唑 -3-醇
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -1,5,6,7-四氢 -4H-吲
3 3.6
唑 -4-酮
1-(1,3-苯并噻唑基 -2 基) -3,4-二甲基 -1 氢-吡
4 3.7
唑 -5-醇
2-(2-苯并噻唑基) -2,4,5,6-四氢环戊吡唑 -3-醇
5 2.5
1-(2-苯并噻唑基) -3- (三氟甲基) -Iff-吡唑 -5-
6 醇 6.3 l-(2-苯并噻唑基) -4-(2-羟乙基 )-3-甲基 -lff-
7 吡唑 -5-醇 1.4
2-(6-甲氧基 -2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2ί -
8 吲唑 -3-醇 5.1
2-(2-苯并噻唑基) -4,5,6,7-四氢 -2ί -吲唑 -3-醋
9 酸酯 6.2
2-(2-苯并噁唑基) - 4,5,6,7-四氢 吲唑 -3-
10 醇 7.8
2-(4-苯基 -2-噻唑基 )-4,5,6,7-四氢 -2ί -吲唑 -3-
11 醇 3.1
1-(2-苯并噻唑基) -3-苯基 -Ιί -吡唑 -5-醇
12 5.4
化合物编号参见试验例 2。
实验结果表明， 本发明化合物对人肝癌肿瘤细胞抑制作用明显 。
试验例 7 本发明化合物抑制移植排斥反应的考察
建立不同品系小鼠的皮肤移植模型：选择 8〜12周 C57 BL/6与 Bal b/c 雌性小鼠为实验对象， 饲养在 SPF级屏障环境内， 饲料辐照消毒， 垫料和饮 用水均高压灭菌。 以 Balb/c小鼠为受者， C57/BL/6小鼠为供者。 供者麻醉 后俯卧固定，消毒后约取 lcmX lcm的背部皮肤，刮去皮下的脂肪以及血管等 组织， 放于无菌的生理盐水中备用。 受者麻醉后俯卧固定， 背部消毒后， 取 下比供体皮肤稍大一点的皮肤， 作为移植床。 将供体皮肤平铺于移植床上， 对齐后用创可贴固定。
实验共分 6组， 每组 6只小鼠： 模型组 （生理盐水） 、 阳性对照组 （环 孢菌素 CsA， 5mg/kg/天） 、 本发明化合物 1， 2， 6， 11共 4组（50mg/kg/天） (化合物编号参见试验例 2 ) 。 从移植前一周开始给药， 移植后再连续给药 一周， 均采用腹腔注射给药。
移植排斥反应检测方案： 皮肤移植 7天后拆掉创可贴， 每天观察移植皮 片的颜色、 硬度、 脱落及鼠毛生长情况， 如皮片变硬或结痂脱落， 则为移植 物排斥； 皮片柔软或鼠毛生长， 则为移植物存活。 记录皮片从移植到发生排 斥的时间， 计算皮片平均生存时间 MST。 结果参见图 2。
结果表明， 本发明化合物 1， 2， 6， 11均能够明显延长移植物存活时间， 作用效果与阳性对照环孢菌素 A相当， 本发明化合物能够有效抑制移植排斥 反应； 其中， 化合物 1的药效作用优于其他化合物。
试验例 8: 发明化合物抑制迟发型超敏反应 (DTH)。 建立二硝基氟苯（DNFB )诱导的小鼠 DTH模型： BALB/c小鼠左右脚 掌均匀涂布 20μ1 0.5% (v/v) DNFB 溶液（ 溶于 4: 1 丙酮-橄榄油中）， 以单独 涂布丙酮 /橄榄油溶剂作为对照， 每天 1次， 连续 2天。 第 2次致敏后 9天进 行激发试验： 即在小鼠右耳内外两面均匀涂布 10μ1 0.5% (v/v) DNFB 溶液。 72 h后用 8mm耳肿打耳器， 双耳打孔取耳片， 称重并计算右耳片增加的重 量。 动物分组： 将 35只 BALB/c小鼠随机分为 A、 B、 C、 D、 E、 F组， 每 组 5 只小鼠。 A组为 DNFB 致敏的阳性组， B组为阳性对照药物 CsA。 C、 D、 E、 F 组分别为本发明化合物 1， 2， 6， 11处理组 （化合物编号参见试验 例 2)。 从第 1 次 DNFB 致敏前两天至取耳片称重为止， 按照 50mg/kg/天的 剂量， 腹腔注射一次本发明化合物， 阳性对照药物 CsA按照 5mg/kg/天的剂 量， 腹腔注射。 结果参见图 3。
结果表明， 本发明化合物 1 ,2,6, 11均能够有效抑制迟发型超敏反应。
试验例 9: 本发明化合物抑制类风湿性关节炎
选择 6-10周 DBA/1J小鼠， 将 50ug牛 II型胶原与等体积完全弗氏佐剂 (CFA) 完全乳化后皮下注射。 21天后以 50ug相同抗原与不完全弗氏佐剂 (IFA) 充分乳化后， 加强免疫 1次。 从第 45天开始观察记录。 采用 1-4计 分法： 1分， 正常； 2分， 1个关节肿胀； 3分， 超过 1个关节肿胀， 但并未 累积全部关节； 4 分， 整个爪的严重肿胀或强直。 每只爪的评分相加即得到 小鼠关节炎症的总评分。 关节总评分大于 1的小鼠为模型建立成功。
实验分组： 常雄性 Balb/C小鼠 6只， 成功建立小鼠类风湿关节炎模型的 雄性 DBA/1J小鼠 30只，每组 6只，体重 30±4.7g/只，分组情况如下： A.正 常小鼠对照组； B . CIA: 生理盐水治疗组 (阴性对照组：)、 环孢菌素 CsA, 15mg/kg/day)、 本发明化合物 1 : 2-(1氢 -苯并噻唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢- 吲唑 -3-醇、本发明化合物 2: 2-(1氢 -苯并咪唑基 -2基) -4,5,6,7-四氢 -2氢 -Π引挫 -3-醇， 本发明化合物 6: 1-(2-苯并噻唑基： )-3- (三氟甲基 )- m-吡唑 -5-醇， 本发 明化合物 11 : 2-(4-苯基 -2-噻唑基）-4,5,6,7-四氢 -2H-吲唑 -3-醇给药组 (50mg/kg/day)。第 45天为治疗的第一天，选择小鼠后肢内侧进行 肉注射。 给药 2周后， 对各组小鼠关节炎症评分。 结果参见表 6。
表 6
分组 评分
Control 1
0.9% NaCl (阴性照组） 4
环孢菌素 A (阳性对照） 2
本发明化合物 1给药组 2
本发明化合物 2给药组 2 本发明化合物 6给药组 3
本发明化合物 11给药组 1
化合物编号参见试验例 2。
实验结果表明， 本发明化合物 1、 2、 6、 11能够有效治疗类风湿性关节 炎， 其药效与阳性对照环孢菌素 A相当； 其中， 化合物 11的药效作用最强， 甚至优于阳性药物。
综上所述， 本发明化合物能够有效抑制蛋白激酶活性， 能够有效抑制 异常活化的 T细胞增殖， 可用于治疗自身免疫性疾病、 恶性肿瘤等疾病， 特别是对淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 乳腺癌、 肝癌、 移植排斥反应、 过敏和 类风湿性关节炎有显著的治疗作用， 具有良好的工业应用前景。