Die Erfindung betrifft einen wirkstoffhaltigen Extrakt, ein Verfahren zur Weiterverarbeitung dieses Extrakts zu neuen Stoffen der empirischen Summenformel diese Stoffe und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die erfindungsgemäßen neuen Stoffe werden durch einen Stamm des Bacteriums Myxococcus fulvus der Klasse Flexi- bacteriae, der Ordnung Myxobacterales und der Familie Myxococcaceae produziert. Der Stamm wurde 1971 aus einer Bodenprobe von Borobudur/Java isoliert. Er wurde am 22. August 1978 unter der Bezeichnung DSM 1368 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen/Gδttingen hinter¬ legt.

Die vegetativen Zellen des Stamms sind schlanke Stäb¬ chen. (3,5 bis 6 um lang und 0,8 ^ιm dick) mit leicht ver- jungten Enden. Auf geeigneten Nährböden, z.B. Wasser- agar-Ausstrichen von Escherichia coli, bildet der Orga¬ nismus rotbraune, trop en örmige, weichschleimige Fruchtkörper von etwa 200 n Durchmesser. In diesen Fruchtkörpern befinden sich kugelige, unter dem Phaaen-

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I kontrastmikroskop stark lichtbrechende Myxosporen mit einem Durchmesser von 1 ,2 bis 1 ,5 n. Das Bacterium be¬ wegt sich gleitend fort. Die Kolonien oder Schwärme breiten sich deshalb allmählich über die Kulturplatten aus. Gehalt an Guanin + Cytosin der DNS: 70,4 Mol Guanin + Cytosin (Tm = Schmelztemperatur), 69,5 l ol% Guanin + Cytosin (UZ ■ Ultrazentrifugej vgl. Behrens, Flossdorf & Reichenbach, Int. J. Syst. Bacteriol., 26 (1976) 561-562. Der Organismus läßt sich unter submer- sen aeroben Bedingungen in einem C, N und S sowie Mine¬ ralsalze enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei 15 bis 40, vorzugsweise 25 bis 35, insbesondere ca. 30° C kul¬ tivieren. Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z.B. - cy-Agar: 0,3 % eines pankreatisch verdauten Kaseins (Pepton) (Difco/Detroit); 0,1 % Bäckerhefeextrakt (Difco); 0,1 % CaCl ₂ ^« 2 H ₂ 0; 1 ,5 % Agar; oder

- vy/2-Agar: 0,5 % (bezogen auf Frischgewicht) Bäcker¬ hefe; 0,1 % CaCl ₂ -2 H ₂ 0; 1 ,5 % Agar; pH 7,2. In Flüssigmedien wächst der Stamm in homogener Suspen¬ sion sowohl in Schüttelkolben (etwa 150 Umdrehungen/min) als auch in Fermentern(bis zu 200 1 getestet). Als Me¬ dium eignet sich

- eine Peptonlδsung: 1 % tryptisches Pepton aus Kasein (Merck); 0,3 % MgS0 ^« 7 H ₂ 0; pH 7,2.

Der Stamm ist streng aerob, hat aber keine hohe O -Zeh- rung. Die Generationszeit liegt bei etwa 7 h. Aus 101 Kultur kann man etwa 100 g Zellmasse erhalten (Feucht¬ gewicht = etwa 25 g Trockengewicht). Der Stamm ist auf die Verwertung von Proteinen und Peptonen eingestellt und besitzt eine Reihe von noch nicht charakterisier¬ ten Enzymen zum Abbau anderer Mikroorganismen (Bakte¬ rien und Hefen). Der Stamm produziert mindestens drei

_ O PI /M. WIPO

verschiedene Bacteriocine, Fulvocine genannt. Diese werden ins Medium abgegeben und wirken nur gegen nahe verwandte Bakterien; vgl. Hirsch, Arch. Microbiol. 115 (1977) 45-49. Zellfreie Kulturlδsung des Stamms zeigt antibiotische Aktivität gegen grampositive Bakterien (z.B. Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus) so¬ wie manche Pilze (z.B. Botrytis cinerea). Der Stamm produziert mehrere chemisch verschiedenartige Antibio¬ tika, wie verzweigte Fettsäuren, Indolderivate, wie z.B. 3-Formylindol und die erfindungsgemäßen Stoffe.

Der Stamm kann folgendemaßen konserviert werden:

- Einfrieren vegetativer Zellen von Platten- oder Flüs¬ sigkulturen in Peptonlösung bei - 80° C; - Trocknen von Fruchtkörpern auf Filterpapier und La¬ gern bei Raumtemperatur;

- Trocknen von Myxosporen in Milch und Lagerung unter Stickstoff bei Raumtemperatur.

In Kulturen, die sich in schlechtem Zustand befinden, werden die erfindungsgemäßen Stoffe ins Medium ausge¬ schieden. Kennzeichen eines schlechten Zustands sind: Die Bakterien befinden sich in der stationären Phase; alkalischer pH-Wert von etwa 8 bis 8,5; die Zellen sind mehr oder weniger undicht, so daß sie normalerweise in¬ trazelluläre Substanzen verlieren; allmählicher Über¬ gang zu Zell-Lyse.

Wenn die Kulturen in gutem Zustand sind, befinden sich die erfindungsgemäßen Stoffe in den Zellen. Kennzeichen eines guten Zustands sind:

Die Bakterien befinden sich in der logarithmischen Wachstumsphase; die Zellen sind bei balanciertem Stoff-

Wechsel völlig intakt und auf Wachstum programmiert.

Die Ausbeuten aus Zellen sind höher als aus überstand, d.h. zellfreiem Medium; außerdem sind die erfindungsge- mäßen Stoffe leichter bei der Gewinnung aus Zellen zu reinigen, als wenn man von zellfreiem Medium ausgeht.

Die Produktion ^' der erfindungsgemäßen Stoffe hängt mit dem Wachstum zusammen, wobei sich keine spezifische Pro- duktionsphase erkennen läßt. Jedoch kann die Produktion der erfindungsgemäßen Stoffe trotz guten Wachstums ab¬ geschwächt oder unterdrückt sein, z.B. in Gegenwart von Hefeextrakt.

Man kann einen wirkstoffhaltigen Extrakt mit u.a. einem Gehalt an den erfindungsgemäßen Stoffen dadurch gewin¬ nen, daß man a) Zellen von Myxococcus fulvus DSM 1368 oder b) Kulturflüssigkeit nach Abtrennung der Bakterienzel- len mit einem polaren organischen Lösungsmittel extra¬ hiert und den Extrakt gewinnt.

Als polare organische Lösungsmittel eignen sich bei der Arbeitsweise a) Alkohole, wie Methanol, oder Ketone, wie Aceton, oder Nitrile, wie Acetonitril oder Propioni- tril, und bei der Arbeitsweise gemäß a) und b) Ester, wie Methyl- oder Äthylester von Essigsäure oder Pro- pionsäure, oder CHC1-, oder CH ₂ C1 ₂ .

Die erfindungsgemäßen Stoffe besitzen die empirische .

Summenformel C _ς H-x. _ϊ N _^ O. _ϊ S _?» sind in Aceton, Methanol, Es- sigsäureäthylester und Acetonitril löslich und besitzen Spektren mit folgenden Peaks:

_ OMPI _

a) UV in Isopropanol (la bda max. (log epsilon)): 227 (4,58), 307 (3,84); b) IR in Chloroform (ny (cm~ )):

3540, 3490, 3415 (stark), 3340 (breit), 2980, 2950 (Schulter), 2900 (Schulter), 2850 (Schulter), 1680 (stark), 1655 (Schulter), 1625 (stark), 1590 (stark); c) Massenspektrum (bei 220° C und 12 bzw. 70 eV): M ⁺ = m/e 487; d) H-NMR(3 mg/0,4 ml CDC1 ₃ mit 0,3 % TMS), (ppm) (Multiplizität, Integral):

7,89 (s, 1), 7,14 (s, 1), 6,63 (d, 1, A-Teil eines ABX-Systems) , 6,41 (dd, 1, B-Teil des ABX-Systems mit J^ » 15 Hz und J _Bχ - 7 Hz^ 6,26 bis 5,60 (m, 6, davon 2 H austauschbar), 4,97 (s, 1), 4,16 (Quin¬ tett, 1), 3,96 (Quintett, 1), 3,82 (t, 1), 3,58 (s, 3), 3,35 (s, 3), 2,33 (m, 1), 1,54 (d, 3), 1,17 (d,

3), 1,01 (d, 6); e) ¹³ C-NMR (15 mg/0,4 ml C C1 ₃ mit 0,3 % TMS), delta

(ppm) (Multiplizität des Off-ResonanzSpektrums):

176.3 (s), 171,9 (s), 169,4 (s), 162,6 (s), 154,5 (s), 149,0 (s), 142,4 (d) , 132,6 (d), 131,9 (d),

131.4 (d), 126,6 (d) , 126,0 (d), 115,6 (d), 115,3 (d), 94,3 (d), 85,2 (d) , 56,8 (q), 55,1 (q), 41,3 (d), 39,7 (d), 31,1 (d), 22,3 (q), 20,9 (q), 14,4 (q).

Das UV-Spektrum wird durch Zusatz von 2 n Natronlauge sowie 2 n Salzsäure nicht verändert.

Elementaranalyse gefunden berechnet c (96) 61,53 61,58

H (96) 7,09 6,82

N (96) 7,63 8,62 m

S (96) 10,84 13,12

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Die empirische Summenformel folgt aus dem Massenspektro- gra m und der Elementaranalyse.

Das 1H-NMR-Spektrum wurde mit 3 mg Substanz und 0,4 ml

mit 15 mg Substanz und 0,4 ml DeuteroChloroform und

0,396 Tetramethylsilan als interner Standard in einem

5 ml-Rohr durchgeführt.

Die erfindungsgemäßen Stoffe werden als öl gewonnen und verhalten sich wie neutrale Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Stoffe lassen sich nach dem Chro- matographieren unter den folgenden Bedingungen durch

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zwei Fraktionen noch näher kennzeichnen: Säule mit 800 g Kieselgel (32 bis 64 α) , Länge 320 mm, Durchmes¬ ser 65 mm; 3 bar; 1 g Extrakt von Myxococcus fulvus-Zel- len DSM 1368 in Methylenchlorid/Isopropanol (90 : 10), 5 ml/min.

Dabei weist die schneller eluierbare Fraktion folgen¬ des CD-Spektrum auf (Zirkulardichroismus; nm): 300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum, 230 teta - 0,

220 positives Maximum; die langsamer eluierbare Fraktion weist folgendes

CD-Spektrum (nm) auf:

300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum, 230 teta - 0, 220 negatives Maximum.

Beide Fraktionen unterscheiden sich nicht hinsichtlich der 'empirischen Summenformel, der Lδslichkeit in den an¬ gegebenen Lösungsmitteln und der Peaks der UV-, IR-, Massenspektren-, H-NMR- und ³ C-NMR-Spektren.

Wenn man jede der beiden angegebenen Fraktionen für sich unter den angegebenen Bedingungen chromatographiert, erhält man jeweils wiederum zwei Fraktionen, und zwar die schneller und die langsamer eluierbare Fraktion.

Die erfindungsgemäßen Stoffe zeigen beim Pl ttchen-Test folgendes WirkungsSpektrum (zum Plattchen-Test vgl. z.B. Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 2. Aufl., Springer-Verlag 1974):

Testorganismus Hemmung a) Pilze

Botrytis cinerea TU 157 +

Microsporum gypseu CBS 424.66 + Penicillium digitatu CBS 319.48 +

Mucor hiemalis Tu +

Geotrichum candidu CBS 187.38 +

Polyporus spec. +

Phycomyces blakesleeanus + Rhizoctonia solani CBS 177.44

Alternaria brassicola CBS 106.41 Gliocladium roseu

b) Hefen Candida albicans CBS 187.38

Schizosaccharomyces pombe Tu.501

c) Bakterien

Bacillus subtilis ATCC 6051 + Staphylococcus aureus +

Escherichia coli K 12 Pseudomonas sp.

Minimale Hemmkonzentration (getestet in Flüssigkulturen mit weitgehend gereinigtem Stamm):

Mucor hiemalis 1 ,5 ϊig/ml

Staphylococcus aureus 50 ug/ml und nur bis maximal 3596 gehemmt

Wlrkungsmechanismus (untersucht an Sporen von Mucor hie¬ malis):

Die erfindungsgemäßen Stoffe wirken fungistatisch. Sie hemmen sofort nach Zugabe (2 ug/ml) die Protein-, RNS-

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und Chitinsynthese, wie an dem abbrechenden Einbau spe¬ zifischer Prekursoren in die Makromoleküle abgelesen werden kann. Auch der Einbau von 14C aus Glucose bricht sofort ab. Der genaue Wirkungsort ist noch nicht be- kannt.

Biosynthese: Wenn man Kulturen des Stammes DSM 1368 mit radioaktiven Substanzen füttert, so findet man in den gereinigten, erfindungsgemäßen Stoffen Radioaktivität - ^~ t ^~ A 1 aus "^S-Cystein, C-Isoleucin, C-Leucin eingebaut.

14 14 14

Bei Fütterung mit C-Phenylalanin, C-Tyrosin, C- Mevalonat und 14C-Valin erfolgt kein Einbau.

Nach einer ersten Verfahrensvariante lassen sich die er- findungsgemäßen Stoffe dadurch gewinnen, daß man a) aus einem Kulturmedium von Myxococcus fulvus DSM 1368 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren organi¬ schen Lösungsmittel extrahiert, c) ein unpolares organisches Lösungsmittel zugibt und ein Zweiphasen-System bildet und d) die Phase des polaren organischen Lösungsmittels chromatographiert und das Laufmittel von den erfindungs¬ gemäßen Stoffen abtrennt.

Als polares organisches Lösungsmittel kann man einen Al¬ kohol, z.B. Methanol, ein Keton, z.B. Aceton, einen Ester, z.B. Methyl- oder Äthylester von Essigsäure oder Propionsäure, oder ein Nitril, z.B. Acetonitril oder Propionitril, und als unpolares organisches Lösungsmit¬ tel einen bei Raumtemperatur flüssigen aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z.B. einen e n" Kohlenwasserstoff, verwenden.

Man kann dabei so vorgehen, daß man a) aus dem Kulturmedium die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton oder Methanol extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt mit Essigsäureäthylester auf¬ nimmt und mit Methanol versetzt, e) den Niederschlag abtrennt und gegebenenfalls mehrmals mit Methanol wäscht, f) die methanolische Fraktion bzw. Fraktionen zwischen Acetonitril und einem Alkan verteilt, g) die Acetonitrilphase abtrennt, einengt und« chromato¬ graphiert und h) eine Fraktion mit einem Gehalt an erfindungsgemäßen Stoffen gewinnt, von der man das Laufmittel abtrennt.

Bei einer zweiten Verfahrensvariante kann man die erfin¬ dungsgemäßen Stoffe dadurch gewinnen, daß man a) aus dem Kulturmedium von Myxococcus fulvus DSM 1368 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren organi¬ schen Lösungsmittel extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt ^{^} einengt und mit einem unpola¬ ren organischen Lösungsmittel aufnimmt, d) die erhaltene Lösung mit Aktivkohle versetzt und die Aktivkohle von dem unpolaren organischen Lösungsmittel abtrennt, e) die Aktivkohle mit einem polaren organischen Lösungs¬ mittel auswäscht und f) die erhaltene Lösung chromatographiert und das Lauf- mittel von den erfindungsgemäßen Stoffen abtrennt.

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Als polares organisches Lösungsmittel kann man dabei ein Keton, z.B. Aceton, und als unpolares organisches Lö¬ sungsmittel einen bei Raumtemperatur flüssigen aliphati- schen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z.B. einen verwenden.

Man kann dabei so vorgehen, daß man a) aus dem Kulturmedium die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt in Chloroform aufnimmt, die gebildete wäßrige Phase verwirft und die Chloroformphase trocknet, e) die getrocknete Chloroformphase einengt, f) den Rückstand in einem Alkan aufnimmt, g) die Alkanlδsung mit Aktivkohle versetzt, h) die Aktivkohle über Kieselgel von dem Alkan abfil¬ triert und gegebenenfalls mehrmals mit dem Alkan wäscht, i) die Aktivkohle auf dem Kieselgel mit Dichlormethan auswäscht, j) an dem Kieselgel gegebenenfalls mehrmals chromato¬ graphiert und k) eine Fraktion mit einem Gehalt an erfindungsgemäßen Stoffen gewinnt, von der man das Laufmittel abtrennt.

Bei beiden VerfahrensVarianten kann man das Einengen bei einer Temperatur von bis zu 60° C, vorzugsweise bis zu 40° C und vorzugsweise unter reduziertem Druck vorneh¬ men und/oder n-Pentan, n-Hexan oder n-Heptan als Alkan verwenden und/oder an Kieselgel chromatographieren.

Sofern man bei den Verfahren zur Gewinnung der erfin¬ dungsgemäßen Stoffe nicht von Zellen, sondern von zell-

freiem Medium ausgeht, kann man das zellfreie Medium mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel extrahieren, z.B. mit einem Carbonsäure¬ ester, wie Essigsäureäthylester, und den Extrakt danach in die Stufe c) einsetzen.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher er¬ läutert.

Beispiel 1. Vermehrung

Es wurde ein 501-Fermenter (Giovanola, Manthey/Schweiz) mit einem Arbeitsvolumen von 701 verwendet. Das einge¬ setzte Medium enthielt 1 6 tryptisches Pepton aus Ka- sein (Merck), 0,396 MgSO^-7 H ₂ 0 und 0,03 % eines ober¬ flächenaktiven Mittels (Antischaum Umlub Lb 625 von Brenntag, Mülheim/Ruhr) bei einem pH von 7,2 und Auto- klavierung. Das eingesetzte Animpfvolumen betrug 71 von Schüttelkulturen (entsprechend 3 x 10 Zellen/ml). Die Temperatur betrug 30° C. Die Flüssigkeit wurde mit 500 Umdrehungen/min in einemKonvexionsstrom bewegt (Umwurf). Man belüftete bis zur 13. h mit 1 Nl/ in 1 Kulturvolu¬ men und danach mit 1 ,7 Nl/min 1 Kulturvolumen. Der p0 ₂ fiel innerhalb von 10 h gegen 0 ab und wurde danach niedrig gehalten. Der Ausgangs-pH-Wert von 7,2 stieg während des Wachstums auf 7,5 an und wurde durch Gegen¬ titrieren mit Essigsäure bei diesem Wert gehalten. Die Gesamtfermentationsdauer betrug 30 h. Aus den abzentri- fugierten Zellen wurden 2 bis 3 mg erfindungsgemäße Stof- fe pro 1 1 Kultur gewonnen. Der Überstand war unter diesen Bedingungen praktisch frei von erfindungsgemäßen Stoffen.

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».. IPO

Beispiel 2

Die mit einer DurchlaufZentrifuge vom Nährmedium des Beispiels 1 getrennte rote Zellmasse wurde mit Aceton (oder Methanol in einem Parallelversuch) bis zur Ent¬ färbung extrahiert. Der eingeengte Extrakt wurde in we¬ nig Essigsäureäthylester gelöst und mit Methanol ver¬ setzt. Die daraufhin ausfallenden unpolaren Substanzen wurden abgenutscht und mehrmals mit Methanol gewaschen. Die eingeengte methanolische Lösung wurde nun zwischen Acetonitril und n-Heptan verteilt, wobei die restlichen unpolaren Substanzen in die Alkanphase übergingen. Da¬ nach wurde die Acetonitrilphase eingeengt. Sie enthielt die erfindungsgemäßen Stoffe.

Zur Reindarstellung wurde über eine Kieselgelsäule mit einer Länge von 320 mm und einem Durchmesser von 65 mm mit einer Dosierpumpe bei 3 bar chromatographiert, wo¬ bei die Kieselgelsäule 800 g Kieselgel einer Teilchen- große von 32 bis 64 um enthielt (Riedel de Haen). Dazu wurde 1g eingeengter Zellextrakt im Laufmittel Methylen- chlorid/lsopropanol (10 : 1; nachdestillierte pa Lö¬ sungsmittel von Merck/Dar stadt) mit einer Durchflußrate von 5 ml/min chromatographiert. Mit einem selbstregi- strierenden Durchfluß-UV-Spektrographen (bei 254 nm) wurden die erfindungsgemäßen Stoffe nach 2,5 h im Aus¬ lauf ermittelt. Es erschienen zwei Fraktionen, die mit einer Retentionszeitdifferenz von 20 min eluiert wurden. Die eingeengten Fraktionen erhielten zusammen 15 mg Sub- stanz. In der folgenden Zusammenstellung sinddie RF-Wer- te der erfindungsgemäßen Stoffe in verschiedenen Lauf¬ mittelsystemen angegeben. Die Werte gelten für Dün-n- schichtchromatographie-Alufolien mit Kieselgel einer.

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Schichtdicke von 0,2 mm (60 F ₂₅ > Merck/Darmstadt).

RF-Werte der erfindungsgemäßen Stoffe in verschiedenen Laufmitteln (Kammern mit Laufmittel gesättigt, Laufhδhe 10 cm) RF-Werte Laufmittelsystem

0,26 Dichlormethan/lsopropanol

(95 : 5) 0,29 Essigsäureäthylester 0,32 Toluol/Dioxan/Eisessig

(30 : 10 : 1)

Die sehr stark Fluoreszenz löschenden Flecke der erfin¬ dungsgemäßen Stoffe lassen sich durch Ansprühen mit Mo- lybdatophosphorsäure und anschließendes Erhitzen auf 150° C schwach sichtbar machen. Ebenfalls schwach rea¬ gieren die erfindungsgemäßen Stoffe mit Benzidin nach vorgehender Behandlung mit Chlor. Die Jodazid-Stärke- Reaktion ist positiv.

Beispiel 3

Der Inhalt eines 81-Fermenters wurde folgendermaßen aufgearbeitet. Die vom Nährmedium abzentrifugierten Zel- len wurden bis zur Entfärbung mit etwa 21 Aceton ex¬ trahiert. Der Acetonextrakt wurde im Wasserstrahlvakuum bei etwa 40° C so weit eingeengt, bis sich Carotinoide und andere Substanzen am Kolbenrand abzusetzen begannen. Zur Abtrennung von Wasser wurde nunmehr in etwa 500 ml Chloroform aufgenommen, die Wasserphase im Scheidetrich¬ ter abgetrennt und die Chloroformphase über Natriumsul¬ fat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde erneut im Ro¬ tationsverdampfer bei etwa 40° C abdestilliert; der

Rückstand wurde in etwa 200 ml n-Heptan aufgenommen; in Parallelversuchen wurden n-Pentan und n-Hexan verwendet. Die n-Alkanphase wurde nun mit so viel Aktivkohle (2186 zur Analyse, Merck) versetzt, daß die vorher rötlich ge- 5 färbte Lösung farblos bis blaß gelbgrünlich aussah. Da¬ nach wurde die Aktivkohle über einer Kieselgelsäule (Höhe 50 mm, Durchmesser 15 mm) von der überstehenden Lösung abfiltriert. Man wusch noch dreimal mit 50 ml- Portionen des verwendeten n-Alkans. Die Filtration ließ

10 sich beschleunigen, wenn man einen Überdruck auf die

Säule anlegte. Danach wurden die erfindungsgemäßen Stof¬ fe mit etwa 50 ml Dichloπnethan aus der Aktivkohle auf das Kieselgel gewaschen. -Anschließend wurde nochmals Dichlor ethan verwendet, bis das Kieselgel von sämtli-

15 chen gelben Zonen entfärbt war (Chromatographie). Auf diese Weise wurden alle unpolareren Stoffe als die er¬ findungsgemäßen Stoffe herausgewaschen, da die Stoffe ge¬ mäß der Erfindung bei dieser Polarität auf Kieselgel festgehalten werden und nicht wandern. Anschließend wur-

20 de Dichlormethan/i-Propanol (95 : 5) auf die Säule auf¬ gegeben, so daß eine gelbbräunliche Zone mit einem Ge¬ halt an den erfindungsgemäßen Stoffen wanderte. (Wenn zuvor zu wenig Aktivkohle verwendet wurde, war diese Zo¬ ne infolge eines Gehalts an Carotinoiden rotbräunlich

25 gefärbt.) Nach Einengen der gefärbten Zone erhielt man 400 mg Rohprodukt, das etwa 25 mg der erfindungsgemäßen Stoffe enthielt.

Das Rohprodukt ließ sich gemäß Beispiel 2 feinreinigen.

^• 30

Allgemein läßt sich sagen, daß sich die erfindungsge¬ mäßen Stoffe mit der Fluoreszenz löschenden B nde bei 25 nm identifizieren lassen. Damit läßt sich die Wirk¬ samkeit von Maßnahmen zur Gewinnung dieser Stoffe ohne weiteres beurteilen.

Chemische Charakterisierung von AB-Mx f!6-l: AB-1 wird als 01 gewon¬ nen und läßt sich nicht kristallisieren. AB-1 verhält sich wie eine neutrale Verbindung.

UV-Spektren: max(log£) 227(4.58), 307(3.84) (Isopropanol) Zusatz von 2N NaOH, sowie von 2N HC1 verursachen keine

-Veränderung des Spektrums.

IR-Spektrum* Kern ^"1 ) 3540,3490,3415(stark),3340(breit),2980,2950,

2900,2850,1680(stark) ,1655,1625(stark) ,1590 (stark) in CHC1 ₃ Ermittlung der Summenformel von AB-1:

Massenspektroskopische Bestimmung: (MS 9)

Normal aufgelöstes Spektrum bei 220°C und 70 eV:

M = m/e 487 (14.3 %); Basis-Peak : m/e 359 (100 %)

Normal aufgelöstes Massenspektrum bei 220°C und 12 eV: M*= m/e 487 (100 %), Fragment-Ion m/e 359 (33.3 %).

Hochaufgelöstes Massenspektrum des Molekül-Ions bei m/e 487 : gefunden : 487,1982 d berechnet: 487,1980 d für Summenformel ^C 25 ^H 33 ^N 3°3 ^S 2

Hochauflösung des Fragment-Ions bei m/e 359 : gefunden : 359,1265 d berechnet: 359,1264 d für C _ιg H ₂₃ N ₂ 0S ₂ (= M- C ₅ H ₁₀ N0 ₂ )

Isotopenmuster des Molekül-Ions : gefunden : 487 (100%), 488(31.4%), 489 (14.2%), 490 (3.7%) berechnet: 487 (100%), 488(31,3%), 489 (14.2%), 490 (3.4X7 für M* AB-1 besitzt die Summenformel .

NMR-Untersuchungen an AB-1 und Derivaten von AB-1:

Die NMR-Daten für AB-1 wurden mit einem Varian XL-100-12 Spektro e- ter mittels Fourier-Transformations-Technik bei 100.06 MHz für

1 13 H und 25.16 MHz für C-Spektren bei Raumtemperatur erhalten.Das

Gerät war auf die Deuterium-Resonanz (15.40MHz) des Lösungsmittels gelockt und kontrolliert mit einem Varian 620-L Rechner. Alle homo- und heteronuklearen Experimente sind mit dem Gyrocode^ Modul des

Gerätes ausgeführt worden.Die chemischen Verschiebungen sind relativ zu Tetramethylsilan in σ-Werten angegeben.

OMPI WIPO

Ergebnisse der NMR-Untersuchungen:

Die H-NMR Daten für AB-1 sind in Tabelle 2 gezeigt. Homonukleare

Doppelstrahl-Experimente und Spektren-Analyse erlauben die Zuordnung zu den PartialStrukturen in Fig.l.

Die Analysen zeigen, daß die Protonen der Doppelbindungen trans-orientiert sind. Es wurden Protonen-entkoppel e und proton Single frequency off-

13 resonance decoupled (SFORD) C-Spektren erhalten. Von AB-1 konnte auch

13 ein C-Protonen-gekoppeltes Spektrum aufgenommen werden,zu dem an - schließend zahlreiche selektive Protonen Dekopplungs-Experimente ausge- mführt wurden. Damit gelang die Kreuz-Korrelation zwischen den H- und

13 C, -NMR Verschiebungen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 aufgelistet.

Integration des H-NMR-Spektrums, Multiplizität der C-Atom-Signale im SFORD-Spektrum und die Anzahl der Signale im 13C-Spektrum stimmen mit der Molekularformel aus dem hochaufgelöstem Massenspektrum von AB-1 überein. ,-

Die selektiven Protonen-entkoppelten C-Spektren führten zu der Partial-

Struktur des aromatischen Teiles von AB-1, die in Fig. 2 wiedergegeben ist.

Die Werte der Kopplungskonstanten sind, verglichen mit denen vom Thiazol , von richtiger Größenordnung(Tabelle 4). Für die Konstitution von AB-1 wird daher die Strukturformel in Fig. 3 angenommen.

Weitere Absicherung der Strukturaufkl rung durch chemische Modifikation und oxidativen Abbau:

Einwirkung von methanolischer IN Salzsäure über Nacht auf AB-1 liefert eine Verbindung, die nach Hochauflösung des Molekül-Ions die Summenformel

1

^C 24 ^H 31 ^N _? °3 ^S 2 ' ^Des" ' ^{tz't und we} 9 ^{en des} fehlenden Methyl-Signals im H-NMR- Spektrum bei 3.576 ppm als Demethyl-AB-1 bezeichnet wird. NMR-Vergleich mit AB-1 zeigt, daß der Verlust des Methyl-Signals im H-NMR-Spektrum ein¬ hergeht mit dem Auftreten einer CH^-Gruppe mit einem Signal bei 3.56 ppm, deren Protonen nach Schütteln mit D ₂ 0 gegen Deuterium ausgetauscht werden. Der Verlust des Singuletts bei 4.94 ppm, das dem Methin-Proton des Enol- ethers zugeordnet wird,korrespondiert mit dem Verlust des entsprechenden

13

C-Signals bei 94.32 ppm und dem Auftreten eines Signals bei 207.92 ppm, eines gesättigten Carbonyl-C-Atoms. Die Tabellen 5 und 6 zeigen die ehe -

1 13 mischen Verschiebungen der H- bzw. C-NMR-Spektren von Demethyl-AB-1.

In Fig.4 ist die Partialstruktur von Demethyl-AB-1 abgebildet.

OMPI _ /.„ IPO -.

Katalytische Reduktion von AB-1 für 3 h mit Pd/BaS0 ₄ bei 2.5 atm H ₂ liefert..e n Produkt, das nach assenspektroskopischer Hochauflösung die Summenformel C25 ^H 39 ^N 3°3 ^S 2 aufweist, also gegenüber AB-1 sechs Wasserstoff-Atome mehr aufweist. Das H-NMR Spektrum (Tabelle 7 ^■ H ₂ -AB-1 zeigt die Enol-Ether Funktion unverändert. Im Massenspektrum tritt auch das dem Enol-Ether zugeordnete Fragment -Ion=M-CgH, ₀ N0 ₂ auf. Damit ist klar, daß die Enol-Ether-Funktion unter den angegebenen Be¬ dingungen nicht reduziert worden ist.

Ozonolyse bei -80°C in Methanol lieferte nach oxidativer Aufarbeitung mit Ameisensäure und H ₂ 0 ₂ eine UV-aktive Substanz, die durch chroma - tographisehe.- Reinigung an Kieselgel kristallin gewonnen werden konnte. Das hochaufgelöste Massenspektrum zeigte eine Summenformel von C, ₀ HgN ₂ 0 ₃ S ₂ an. Interpretation der Spektren führte zu der in Fig.5 angegebenen Struktur des Saramycetinsäuremethylester. In einer Un - abhängigen Synthese nach dem Schema in Fig.6 konnte der bisher nicht synthetisierte Ester ebenfalls kristallin erhalten werden. Er war in den spektroskopischen und chromatographischen Eigenschaften identisch mit dem aus der Ozonolyse von AB-1 erhaltenen Ester. Die H-NMR Daten sind in Tabelle 8 wiedergegeben.

Anmerkung: AB-Mx f16-1 « AB- - erfindungsge aßer Stoff der

Bummenformel

OMP ^~

Tabelle J: H-NMR Daten von AB-1 , gemessen in CDC1 ₃

Peak Nr. Chemische Ver- Multiplizitä?) Zahl der Kopplungs- schiebung(ppm) Protonen konstanten (Hz)

1 . 1.012 d 6 (1-4)6.6 (2-9)7.0

2 1.178 d 3 (3-8)7.5 (4-13)6.6

3 1.547 d 3 (7-9)6.8 (7-17)8.6

4 2.313 d.sp 1 (8-14)7.4(13-15)15.5

5 3.334 s 3 (14-16)15.3(15-16)10.'4

6 3.576 s 3 (17-18)15.6(4-15) 1.0/

7 3.806 d,d 1 (8-16) 1.0 ³⁾

8 3.938 d,q 1

9 4.098 d,q 1

10 4.937 s(bre"it)4) ι ^•

11,12 5.6-5.8 s(bre ^; it) 2(austauschbar)

13 5.687

14 5.793

1)

15 6.020

16- 6.183

17 6.419

1)

18 6.556

19 7.108 s

20 7.847 s

Fußnoten:

1) Aus Spektren-Analysen

2) sp=Septett, q= Quartett, d=dublett und s=Singulett

3) Aus einem 270 MHz-Spektrum.

4) Einstrahlen bewirkt Verschärfung der Resonanzlinie bei 3.576 ppm

Tabelle 3: 13C-NMR Daten von AB-1, gemessen in CDC1 ₃ und Korrelation mit den ¹ H-NMR Daten

Chemische Ver- Multiplizität Kopp!ungskonstanten Korrelation mit

/u \ schiebung(ppm) SFORDι Gekoppelt " ^z ^Protonen-Shift(ppm 1) ^J CH ^J CH 2)

14.37 q "q" 127.4 3.6 1.178

20.91 q "t" 130.0 1.547

22.29 q q 126.9 3.9 1.012

31.14 d "quin" 134.0 3.6 2.313

39.66 d m 132.6 4.098 ³ )

41.29 d ^' "q" _d o _ä er 130.1 .3.6; 5 3.938 ³ )

55.14 q 144.8 3.576

56.78 q d 141.0 4.0 3.334

85.19 d m(l/2 20) 146 3.806 ³ )

94.32 d m(l/2 20) 153.3 4.937

115.23 d d 187.1 2.2 7.108

115.61 d 191.9 7.847

126.02 d m(l/2 10) 155.0 6.556

126.64 d m(l/2 14) 154 6.020

131.38 d m(l/2 14) 154.8 6.419

131.98 d m(l/2 14) 154.8 6.183

132.61 d m,q(l/2 14) 154 5.793

142.45 d m,q(l/2 20) 154 5.687

149.03 s d 4.3

154.46 s (q)=d,d,d 5.1

162.65 s d 7.5

169.45 s (1/2 4)

171.88 s m(l/2 16)

176.30 s m(l/2 16)

Fußnoten:

1) Symbole wie in Tabelle 2 und quin=Quintett, m= Multiplett und (1/2 Zahl)= Peak-Breite in Hz bei halber Höhe des Signals

2) Korrelation zwischen 13C-Verschiebungen und direkt gebundenen H-Atomen

3) Die Reihenfolge dieser Signale ist auch bestimmt durch die Off-Resonanz

Effekte der selektiven Dekopplungs-Experimente.

OMPI

Tabelle 4: 1"3C-NMR Daten für Thiazol

Chemische Verschiebung (ppm) ' Kopplungskonst

C-Atom

2 153.57 (C2-H2) 212.54

4 143.80 (C2-H4) 15.15

5 119.60 (C2-H5) 6.14

(C4-H4) 186.96.

(C4-H2) 14.96

(C4-H5) 7.06

(C5-H5) 190.10

(C5-H4) 16.29

(C5-H2) 1.55

Fußnote:

1) Di .e 13 C chemischen Verschiebungen sind durch Kreuz- Korrelation mit dem

H-NMR Spektrum zugeordnet worden.

Tabelle 5: H-NMR Daten für Demethyl-AB-1, gemessen in CDC1 ₃

Peak Nr. Chemische Verschiebung(ppm) Multiplizität' Zahl der Protonen

1 1.02 d 6

2 1.19 d 3

3 1.55 d 3

4 2.33 d,sp 1

5 2.96 d,d 1

6 3.34 s 3

7 3.56 s 2(austausch bar)

8 3.94 d,q 1

9 4.03 d,d 1

10-14 5.54- 6.40 ¹ ) 5(davon 1 austauschba

15,16 6.40- 6.80 ⁱ 2

17 ^' 7.00 (breit) l(austausch bar)

18 7.14 s 1

19 7.89 s 1

Fußnoten:

1) Die Kopplungsmuster sind ähnl ich wie in AB-1

2) Siehe Fußnote 2) in Tabell e 2

OMPI /._ WIPO

Tabelle 6 : 13 C-NMR Daten von Demethyl -AB-1 , gemessen in CDCl g

Chemische Ver- Multipllizität Kopp!ungskonstanten(Hz) schiebung(ppm) SFORD Gekoppelt ' °CH ^J CH

11.46 q q 130 3.8

20.73 q q 128 3.8

22.14 ^' -(2) q q 125 4.0

30.98 d d,d 128 3.6

41.14 d 128

48.68 ² ) t 122-126

51.98 d 128

56.83 q d _. 142 4.0

82.61 d m 145

115.83 d • 190

116.35 d d 186 2.2

126.47 d

126.86 d -158

129.00 d 158

131.81 d

132.41 d

142.31 d 154

148.70 s d 4.0

153.50 s t oder q 5.0

162.89 s d 6.0

168.28 s t 6.0

176.24 s t oder quin 6.0

207.92 s

Fußnoten:

1) Siehe Fußnote 1) Tabel le 3

2) Nach Schütteln mit D O verschwindet dieses Signal

OMPI

Tabel le 7 : H-NMR Daten für H ₂ -AB-1 , gemessen in CDC1 ₃

Chemische Ver¬ Multiplizität Zahl der schiebung (ppm) Protonen

0.86 d 6

1.16 d 3

1.26 7

1.41 d 3

1.88 m 4

2.88 2

3.32 2

3.40 s 3

3.58 s 3

4.30 quin 1

4.94 s 1

5.26 s(breit) 2 (austauschbar)

6.90 s 1

7.80 s 1

Tabelle 8 : H-NMR Daten für Saramycetinsäure-methylester, gemessen in CDC1 ,

Chemi sche Ver- schiebung (ppm) Mul tipl izität Zahl der Protonen

2.78 s 3 3.99 s 3 8.25 s 1 8.45 s 1

OMPI m WlttD

Fragment I

Fragment II

Figur 1: H NMR Daten und Kopplungskonstante für Fragmente I und II

OMPI

. * ^' IPO ^" .

Figur 2: H NMR und ¹³ C NMR Daten des aromatischen Teils von AB-1

OMPI f _b WIPO

Figur 4: Hydrolyse von AB-1 zu Demethyl-AB-1

Figur 5 : Saraπ\ycetinsäuremethyl ester aus der Ozonolysereaktion von AB-1

OMPI

SARAMYCETINSÄUREMETHYLESTER

Figur 6: Reaktionsschema zur Synthese des Saramycetinsäuremethylesters