L'invention a pour objet des nouveaux composés de synthèse associative d'acides aminés soufrés ou non soufrés avec des dérivés du À-4 pregnene 3.20-dione ou avec des dérivés du A -1.4 pregnadiene 3,20-dione, einsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques en présence du groupement eminé ou leurs sels 5 minéraux en présence du groupement carboxylique, leurs procédés de préparation, leur activité pharmacologique et les compositions pharmaceutiques tes renfermant.

Actuellement, les stéroïdes anti-inflammatoires présentent une hydrosolubilité ont déjà été décrits, en particulier, en vue de leur utilisation par voie injectable. A cet effet, la synthèse des esters en position 21 et/ou 17 de stéroïdes avec des acides o polybasiques ou des acides aminés est déjà décrite.

D'autre part, des stéroïdes anti-inflammatoires obtenus par synthèse associative entre des acides aminés et des stéroïdes présentent un groupement ester en 21 et soufrés au niveau de la chaîne latérale, mais ne présentent pas de groupement aminé libre salif iable ont également déjà été décrits. 5 La présente invention concerne des composés nti-infleiαmatoires stéroïdiens résultant d'une synthèse associative entre le steroïde et les acides aminés et présentent un effet réservoir associé à un tropisme cutané où un groupement hydrosoluble sous forme de sel minéral ou organique est favorable .

Pour obtenir cette double activité conjointe, les nouvelles structures 0 revendiquées présentent . et répondent aux trois formules générales I, II et III:

• Soit une liaison ester en 21 mais comprenant une structure ainlno acide soufrée au groupement a iné libre (formule générale I),

• Soit un groupement aminé en 21 d'origine amino acide soufré ou non (formule II), • Soit un groupement soufré en 21 et une structure d'amino acide terminale (formule III).

FEUILLE DE REMPLACEMENT

1/1

dans lesquelles:

-pour les trois formules générales I, II et III la liaison C1-C2 peut être une liaison saturée (dérivés de l'hydrocortisone p.ex). ou peut être une liaison éthylénique (dérivés de la dexaméthasone p.ex);

Ri représente un atome d'oxygène, ou de soufre, ou de chlore, ou encore un hydroxyle;

R2 et/ou R3 représentent un atome d'hydrogène, ou de fluor, ou de chlore, ou encore un groupement methyle;

R4 et/ ou R5 représentent un hydrogène, ou un hydroxyle, ou un methyle, ou un éthyle ; R5 pouvant aussi être un méthylène; R4 et R5 peuvent former un hétérocycle du type-0-CH(Y)-0- ou -0-C(Y)2- 0 -,

Y étant un hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de préférence 1 à 4 atomes de carbone;

X représente un oxygène.ou un soufre; -pour la formule I n vaut 1 ou 2;

R6 peut représenter un methyle, ou un groupement arylalkyle, ou tout autre groupement utilisé pour la protection de la fonction thiol;

3

R peut correspondre à l'ensemble de la structure l donnant une duplication de la formule I avec formation d'un pont disulfure; -pour la formule II

R7 représente un hydrogène d'origine glycine, ou un groupe alkyle linéaire, en particulier un methyle d'origine alanine, ou un groupe alkyle ramifié, d'origine véline, ieucine, isoleucine, ou un groupe hydroxyalkyle linéaire, d'origine serine, thréonine, ou un groupe thioalkyle d'origine éthionine, ou un groupe thiolalkyle d'origine cystéine, ou un groupe arylalkyle soit p.ex. benzyle d'origine phénylalanine .soit p.ex. hydroxybenzyle d'origine tyrosine, soit p. ex. indolyialkyle d'origine tryptophane. soit imidazolylalkyle d'origine histidine. ou un groupe amidoalkyle d'origine asparagine, glutamine, ou un groupe alkyle . car oxylique sous forme libre ou salifiée par le sodium p.ex., d'origine acide aspartique, acide glutamique ou cyclisé sous forme d'acide pyroglutamique, ou un groupe amino alkyle d'origine lysine, ou un groupe guanidinoalkyle d'origine arginine, ou encore un groupe dithiodi éthyle, d'origine cystine, fixent symétriquement deux glucocorticoïdes; le groupement HH peut former avec R? un hétérocycle azoté du type pyrrolidine d'origine proline; les différents acides aminés cités peuvent être remplacés par leurs homologues supérieurs;

R8 peut être un hydrogène, ou un sel correspondant du type, sodium, potassium, calcium;

Rδ peut aussi être un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de préférence. 1 à

4 atomes de carbone, ou un groupe arylalkyle du type benzyle ou hétérocyclique;

-pour la formule III n vaut de 1 à 6, mais on préfère n = 1 d'origine cystéine, ou n = 2 d'origine homocystéine;

R9 peut prendre les différentes structures évoquées pour R8; Rio et/ou Ril peuvent représenter un hydrogène, ou un groupement alkyle linéaire ou ramifié ayant de préférence 1 à 3 atomes de carbone, structure sous forme aminée ou ammonium;

RIO ou Ril peuvent également avoir une structure -CO-Z-, 2 étant un groupement alkyle linéaire ou ramifié, ou arylalkyle. L'invention a aussi pour objet des procédés de préparation des dérivés, tels que définis par les formules I, II et III, ci-dessus.

Pour les dérivés de formule I, le procédé consiste aux transformations successives du steroïde en mesylate puis en dérivé iodé, ce dernier réagissant avec la fonction carboxyliqu d'un acide aminé dont la fonction a iné est protégée par le groupement tertio-butyloxycarbonyle. Par la suite, le groupement protecteur de la fonction aminé est éliminé. Le steroïde peut être l'hydrocortisone, ou la dexaméthasone ou tout autre steroïde glucocorticoïde à chaîne -C0-CH20H, l'acide aminé est en particulier la cystine, la methionine, ou encore la cystéine dont la fonction thiol est protégée.

Pour les dérivés de la formule II, le procédé consiste aux transformations successives du steroïde en mesylate puis en dérivé iodé, ce dernier réagissant avec la fonction aminé d'un acide aminé dont la fonction carboxylique est protégée par différents groupements dont les esters. La réaction peut être réalisée dans les mêmes conditions à partir du mésylate-21 du steroïde. Le steroïde peut être l'hydrocortisone ou la dexainéthasone ou tout autre steroïde glucocorticoïde à chaîne -C0-CH20H. l'acide aminé peut être en particulier la cystine, la m thionine, l'acide glutamique, ou encore l'acide pyroglutamique.

Pour les dérivés de la formule III, le procédé consiste à la transformation du steroïde en mesylate qui réagit avec un acide aminé présentent un groupement thiol SH libre, tel que par exemple, la cystéine, ou homocystéine. L'invention a aussi pour objet la préparation des composés définis par les formules I, II et III, sous forme de sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques en présence du groupement aminé, ou leurs sels minéraux en présence du groupement carboxylique, en particulier sous forme de carboxylates de sodium, de potassium, ou de colcium. Les composés de formules I, II, ou III sont caractérisés en ce qu'ils représentent avantageusement l'un des composés ci-après:

-ester entre l'hydrocortisone et la cystine (formule I);

-ester entre la dexaméthasone et la cystine (formule I);

-ester entre l'hydrocortisone et la methionine (formule I); -ester entre la dexaméthasone et la methionine (formule I );

-aminé en C21 entre l'hydrocortisone et la methionine (formule II);

-β.α_ine en C21 entre la dexaméthasone et la methionine (formule II);

-aminé en C21 entre l'hydrocortisone et la cystine (formule II);

-aminé en C21 entre la dexaméthasone et la cystine (formule II); -éther thiol en 21 entre l'hydrocortisone et la cystéine (formule III);

-éther thiol en 21 entre la dexaméthasone et la cystéine (formule III);

L'invention va maintenant être décrite plus en détail dans les exemples donnés ci-après à titre non limitatif, parmi lesquels:

Exemple 1 : Synthèse de diesters de la cystine à partir de stéroïdes anti-inflammatoires, (exemple correspondant aux composés de formule générale I). Le steroïde est transformé en mésylate-21 par l'action de chlorure d'acide méthane sulfonique dans la pyridine. Le dérivé synthétisé a été transformé par l'action de l'iodure de sodium dans l'acétone, en dérivé iodé. Le diester a été formé par la réaction du dérivé iodé avec la cystine, dont la fonction aminé a été préalablement protégée par le groupement tertio-butyloxycarbonyle, dans le DMF et en présence de triéthylamine. Le produit final au groupement aminé libre a été obtenu sous forme de sel d'addition avec l'acide bromhydrique. après avoir éliminé le groupement tertio-butyloxycarbonyle par l'action d'un mélange d'acide acétique/acide bromhydrique.

Le produit final a été caractérisé sur la plaque chromatographique par la coloration spécifique (rouge sur fond jaune) des disulfures, après pulvérisation avec une solution de nitroprussiate de sodium, suivie par une pulvérisation avec une solution de cyanure de sodium . La caracterisation a été complétée par des analyses spectrales en infra-rouge et résonance magnétique nucléaire. La structure a été vérifiée par la détermination de la masse moléculaire en spectrométrie de masse.

Exemple 2. : Synthèse de stéroïdes anti-inflammatoires aminés et soufrés (composés de formule générale II) Le dérivé iodé du steroïde réβgit dans le DMf avec la methionine, préalablement estérifiée. pour former le steroïde aminé et soufré. Le composé désiré est finalement obtenu sous forme de chlorhydrate après le traitement approprié du milieu réactionneK ac. chlorhydrique gazeux dans le méthanol, puis addition de l'éther éthylique) La réaction peut être réalisée dans les mêmes conditions, à partir du mésylate-21 du steroïde.

Pour les composés de formule générale III, le procédé de préparation est identique à celui des composés de formule générale II en faisant réagir la cystéine sur le mésylate-21 d'hydrocortosine ou de dexaméthasone. Les méthodologies de préparation des différents dérivés sont les suivants :

La préparation des intermédiaires de synthèse est décrite pour la dexaméthasone qui peut être remplacée par tout steroïde glucocorticoïde présentant en 21 une chaîne-CO- CH2 OH.

* Méthane sulfonate-21 de dexaméthasone 500mg (1,3 m ol) de dexaméthasone sont dissous dans 8 ml de pyridine anhydre et la solution est agitée àO°C. 0,4 ml de chlorure d ^* acide méthane sulfonique sont

ajoutés. La solution est agitée àO°C pendant lh. 0,2 ml de chlorure de l'acide méthane sulfonique sont ajoutés dans la solution et l'agitation est poursuivie pendant 30 min supplémentaires. Verser la solution dans l'eau froide sous forte agitation. Il se forme un précipité blanc qui est filtré et soigneusement lavé à l'eau, puis séché sur P205 dans un dessicateur sous vide.

P.F. = 246*C rendement : 85 %

* Iodo-21 de dexaméthasone

520 mg (1,1 mmol) de méthane sulfonate-21 de dexaméthasone sont dissous dans

10 ml d'acétone anhydre, puis 600 mg d'iodure de sodium anhydre sont ajoutés. Le mélange est porté deux heures à reflux, puis après élimination de l'excès d'acétone, le résidu est versé dans de l'eau sous forte agitation. Il se forme un précipité jaune pâle qui est filtré et lavé à l'eau, puis séché sur P2O5.

P.F. : 210°C rendement : 75 %

* Cystine di-(desoxy-21 dexaméthasone) ester dibro hydrate lg (3,4 mmoles) de ,H' di-t-butyloxycarbonyl cystine et 5,5 ml. de triéthylamine sont ajoutés dans 20 ml de DMF anhydre. La solution est agitée pendant quelques minutes, puis 3.01gr (6.3 mmoles) de iodo-21 de dexaméthasone sont ajoutés. Après 2 heures d' agitation à 40°C, la solution est versée dans 100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée succesivement à l'eau, par une solution de NaHC03 à 5 % , par une solution aqueuse de HC1 1 % et finalement à l'eau. La phase organique est séchée sur MgS04 et évaporée à sec.

Le produit a été obtenu sous forme de sel d'addition avec l'acide bromhydrique, après avoir éliminé le groupement tertio-butyloxycarbonyle par l'action d'un mélange d'acide acétique/acide bromhydrique. P F- : 220°C rendement : 12 % (après la déprotection)

Les mêmes modes opératoires ont été suivis pour la synthèse des dérivés à partir de l'hydrocotisone, ainsi que pour les dérivés de la cystine avec d'autres groupements protecteurs de la fonction aminé. *N-(desoxy-21 hydrocortisone)-21 méthionylate de methyle 0,45 gr (2,2 mmoles) d' ester méthylique de methionine sous forme de chlorhydrate sont dissous dans 30 ml de DMF anhydre. 4,76 ml de triéthylamine sont ajoutés et la solution est agitée pendant quelques minutes. Après l'addition de 1 gr (2,28 mmoles) de méthane sulfonate-21 d'hydrocortisone. le mélange réactionnel est chauffé à 40°C pendant 2 heures. La solution est versée dans 150 ml d'eau froide et extraite 3 fois par 100 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée par une solution saturée de HaCl puis séchée sur MgS04 et évaporée sous vide. Le résidu e.:t dissous

dans le méthanol et transformé en chlorhydrate par la réaction d'acide chlorhydrique gazeux. Après l'addition d'éther anhydre il se forme un précipité blanc qui est filtré, puis séché sur P205 .

P.F. : 238°C, déc. rendement : 60 7» Dans le but d'illustrer l'invention de façon non limitative, des résultats de l'étude pharmacologique qui a été menée en rapport avec ces substances sont exposés ci-après; et sont expliqués avec références aux dessins shématiques annexés dans lesquels:

-la figure 1 représente l'effet des dérivés synthétisés sur la sécrétion de r*,-MSH, induite par le CRF, chez des cellules corticotropes en culture ( courbe 1: sans CRF, courbe 2: dexaméthasone, courbe 3: hydrocortisone aminé et soufré, n=1 ); -la figure 2 représente l'effet des dérivés synthétisés sur la sécrétion de l'ACTH, induite par le CRF, chez des cellules corticotropes en culture ( courbe 4: sans CRF, courbe 5: dexaméthasone, courbe 6: dexaméthasone soufrée, n=15). On a trouvé que les composés selon l'invention peuvent être appliqués pour la fabrication d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique comme anti-inflammatoire, particulièrement au niveau cutané et ophtalmique.

Dans un premier temps, on effectue l'étude des effets des molécules synthétisées sur la sécrétion de 1 MSH ou de l'ACTH, induite par le CRF. chez des cellules tumorales corticotropes AtT-20 en culture.

Le principe de ce test siège à la capacité des cellules corticotropes (dérivés d'une tumeur de l' hypophyse antérieure )de sécréter la orticotropine (ACTH). 1"

«.-MSH (ot-Mélanocyte Stimulating Hormone) et autres peptides avec une activité qui ressemble à celle des endorphiries. Cette sécrétion est stimulée par le facteur d'hypothalamus CRF

(torticotropin-Releasing Factor).

La diminution donc de la sécrétion de 1VMSH ou de l'ACTH est indicative de l'activité glucocorticoïde. des stéroïdes synthétisés. La quantité de l'αrMSH ou de l'ACTH sécrétée a été déterminée par des méthodes radioimmunologiques (RIA). Les cellules tumorales corticotropes AtT-20 ont été incubées, dans un milieu de culture constitué de 90% DME (Dulbecco's modified Eagle's médium) et 10 % de sérum

(fetal bovine sérum). L'incubation est de 6 heures en présence de stéroïdes à la concentration de 10 ^~9 . 10 ^"8 et 10 ^"7 M.

Les cellules sont ensuite lavées et préincubées pendant 60 minutes dans le milieu sens sérum .

Après addition de CRF( 10 nM) les cellules ont été incubées pendant 90 minutes en présence des stéroïdes aux concentrations données précéde ent.

L'effet des molécules synthétisées sur la sécrétion de 1V-MSH ou de l'ACTH, induite par le CRF, chez les cellules corticotropes AtT-20 en culture, est représenté à la figure 1 et à la figure 2, respectivement.

L'incubation réalisée en absence des stéroïdes et de CRF a servi pour le control.

L'activité glucocorticoïde de l'hydrocortisone aminé et soufré ( figure 1) est équivalente à celle de dexaméthasone.

En ce qu'il concerne la dexaméthasone soufrée est envrion 10 fois moins active que la dexaméthasone (figure 2).

Les résultats montrent qu'une fonction aminé ou un thioéther peuvent remplacer l'alcool primaire de la chaîne latérale du steroïde anti-inflammatoire sans entraîner une diminution importante de l'activité glucocorticoïde.

Dans un second temps on effectue l'étude de l'activité anti-inflammatoire locale des dérivés synthétisés selon la technique de l'abcès à la carragénine.

La technique de l'abcès à la carragénine consiste à injecter par voie sous-cutanée à un rat d'une solution à 2 % de carragénine, qui développe une réaction inflammatoire caractérisée par la formation d'un abcès. L'application topique de steroïde réduit cette réponse inflammatoire qui est quantifiée par la pesée du granulome après disection.

Les nouveaux composés décrits sont au moins aussi aciifs que l'hydrocortisone ou que la dexaméthasone pris comme référence.

Des exemples de préparations pharmaceutiques incluant ces nouveaux composés de synthèse associative peuvent être présentés: Collyre:

Steroïde soufré et/ou aminé 5 à 100 mg excipients : phosphate monosodique anhydre, hydrogenophosphate de sodium, chlorure de sodium, hydroxyéthylcellulose, polysorbate 80, eau distillée. Crème : Steroïde soufré et/ou aminé 5 à 100 mg excipients : alcool cétylstéarique, PEG 1000 monocétylether, huile de vaseline, vaseline, parahydroxybenzoate de methyle et de propyle, acide citrique, citrate de sodium, eau distillée. Pommade : Steroïde soufré et/ou aminé 5 à l00 mg excipients : polyethylène et huile de paraffine

FEUILLE DE R

Lotion :

Steroïde soufré et/ou aminé 5 à 100 mg excipients : glycérine, alcool isopropylique. polyvidone. excipient, acide citrique, citrate de sodium, eau distillée. Les stéroïdes soufrés en se fixant sur la kératine de la peau sont des principes actifs fortement fixés au niveau de l'épiderme (effet réservoir) ; leur libération n'est que progressive et uniforme dans le temps sous l'influence des esterases cutanées.

Les stéroïdes soufrés et aminés ont un effet réservoir en se fixant au niveau de l'épiderme et un effet d'activité augmentée.