TEIXIDÓ TURÀ, Meritxell (c/ Ferrocarril 22, Sant Joan Despí, E-08970, ES)
GIRALT LLEDÓ, Ernest (C/ Esglesia, 8 bis B 1º1ª, Sant Just Desvern, E-08960, ES)
TEIXIDÓ TURÀ, Meritxell (c/ Ferrocarril 22, Sant Joan Despí, E-08970, ES)
| REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo, incluyendo cualquier estereoisómero o mezclas de estereoisómeros,
Ri y R 3 son radicales independientemente seleccionados entre el grupo formado por H y (CrC 4 )-alquilo;
R 2 es H o un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos de 1-4 anillos; siendo los anillos saturados, parcialmente ¡nsaturados o aromáticos; siendo los anillos aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo 5-6 miembros; siendo cada miembro independientemente seleccionado entre C, CH, CH 2 , N, NH, O y S; estando uno o más de los átomos de hidrógeno de estos miembros opcionalmente sustituido por sustituyentes seleccionados entre el grupo formado por (CrC 6 )-alquilo y (C 1 -
C 6 )-alcoxilo;
Xi es un birradical (CrC 8 )-alquilo derivado de una cadena de carbono lineal o ramificada; y
X 2 es un birradical seleccionado entre el grupo formado por -NH-,
-NH-(CH 2 ) I-3 -COO-, -NH-(CH 2 ) I-3 -S- y -NH-CO-(CH 2 ) 1-3 -S-.
2. Compuesto según Ia reivindicación 1 , donde los miembros del anillo en R 2 se seleccionan entre C, CH y CH 2 .
3. Compuesto según Ia reivindicación 2, donde X 1 es -CH 2 - y R 2 se selecciona entre el grupo formado por fenilo, ciclohexilo, 2-naftilo y 1-pirenilo.
4. Compuesto según Ia reivindicación 2, donde X 1 es n-hexilo y R 2 es H.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde Ri y/o R 3 son metilo.
6. Compuesto según Ia reivindicación 3 que se selecciona entre el grupo formado por: el compuesto de fórmula (I) con Ri = H; R 2 = fenilo, Xi = CH 2 , R 3 = CH 3 y X 2 = NH, el compuesto de fórmula (I) con R 1 = CH 3 ; R 2 = fenilo, X 1 = CH 2 , R 3 = CH 3 y X 2 = NH, y el compuesto de fórmula (I) con R 1 = H; R 2 = fenilo, X 1 = CH 2 , R 3 = CH 3 y X 2 = NHCH 2 COO.
7. Construcción de fórmula (II),
(II) donde:
Ri, R2, R 3 , Xi y X2 son como se definen en Ia reivindicación 1 , y Z es un radical derivado de una sustancia susceptible de formar un enlace amida o un enlace éster o un enlace disulfuro con X 2 , siendo dicha sustancia incapaz de atravesar Ia barrera hematoencefálica por sí misma.
8. Construcción según Ia reivindicación 7, donde los miembros del anillo en R 2 se seleccionan entre C, CH y CH 2 .
9. Construcción según Ia reivindicación 8, donde X 1 es CH 2 y R 2 se selecciona entre el grupo formado por fenilo, ciclohexilo, 2-naftilo y 1-pirenilo.
10. Construcción según Ia reivindicación 8, donde Xi es n-hexilo y R 2 es H.
11. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde Ri y/o R 3 son metilo.
12. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 7-11 , donde Z es un radical derivado de un principio activo farmacéutico seleccionado entre el grupo formado por agentes antiretrovirales, agentes anticancerígenos, agentes anti-psicóticos, agentes antineurodegenerativos y agentes antiepilépticos.
13. Construcción según Ia reivindicación 12, donde el principio activo farmacéutico es Ia dopamina.
14. Construcción según Ia reivindicación 12, donde el principio activo farmacéutico es Ia baicalina.
15. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de Ia construcción como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-14, junto con cantidades apropiadas de excipientes o portadores farmacéuticos.
16. Uso de un compuesto de fórmula (I) definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6 como lanzadera a través de Ia barrera hematoencefálica.
17. Construcción de fórmula (II) definido en cualquiera de las reivindicaciones 7-14 para su uso como medicamento.
18. Uso del compuesto de Ia reivindicación 13, para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento de Ia enfermedad de Parkinson.
19. Uso del compuesto de Ia reivindicación 14, para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento del complexo de demencia relacionado con el SIDA o Ia encefalopatía por VIH. |
Compuestos lanzadera a través de Ia barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo
Esta invención se relaciona con los campos de Ia medicina, investigación y diagnóstico, y más específicamente a compuestos nuevos que actúan como lanzaderas a través de Ia barrera hematoencefálica ("blood-brain barrier", BBB) para Ia liberación de sustancias que no pueden atravesar Ia BBB por sí mismas. También se relaciona con construcciones BBB lanzadera-cargo y a su uso como medicamento.
ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR
Muchos de los principales problemas terapéuticos actuales requieren el tratamiento del cerebro. Esto incluye enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y Ia enfermedad de Alzheimer, pero también enfermedades del sistema nervioso central como Ia esquizofrenia, Ia epilepsia y el desorden bipolar. También el cáncer cerebral, el virus de Ia inmunodeficiencia humana (VIH) y hasta ciertos aspectos de Ia obesidad se pueden incluir como dianas farmacológicas localizadas dentro del cerebro. En muchos casos existen compuestos prometedores para su tratamiento, pero debido a sus problemas de transporte en Ia BBB más del 98% de estos medicamentos potenciales no llegan a Ia etapa de desarrollo.
La BBB es un filtro natural dentro del cuerpo que sólo permite que ciertas sustancias pasen de Ia sangre al cerebro. Es un mecanismo de defensa natural diseñado para mantener las substancias nocivas fuera del cerebro. Controla Ia composición del fluido extracelular del cerebro independiente de las fluctuaciones dentro de Ia sangre. Es también impermeable para muchos compuestos ambientales y medicamentos.
La base anatómica de Ia BBB es principalmente las uniones herméticas en las células endoteliales de los microvasos cerebrales. Los microvasos cerebrales forman una membrana continua sin fenestraciones y las uniones herméticas entre ellas son responsables de Ia alta resistencia eléctrica transendotelial. Los transportadores específicos median el acceso de ciertas moléculas importantes para el cerebro, como Ia glucosa, aminoácidos aislados e iones. Otros compuestos o medicamentos son dependientes de Ia
difusión a través de las bicapas lipídicas de las membranas endoteliales Io que requiere un cierto grado de lipofilicidad de estos compuestos.
Hay diferentes campos terapéuticos donde hay Ia necesidad de encontrar nuevos medicamentos que puedan cruzar Ia BBB para llegar a su sitio diana. Por ejemplo, el cerebro podría servir de reservorio oculto para Ia replicación viral del virus de Ia immnunodeficiencia humana (VIH). El VIH en el cerebro y en el líquido cerebro-espinal podría ser particularmente resistente a Ia quimioterapia debido al fracaso de los medicamentos anti-retrovirales a penetrar Ia BBB. El virus puede cruzar Ia BBB durante Ia infección primaria o en un estadio tardío. La infección resultante lleva a un número de desórdenes del sistema nervioso central como el complejo de demencia relacionado con el síndrome de ¡mmunodeficiencia adquirida (SIDA) y Ia encefalopatía por VIH.
El cáncer cerebral puede ser contado entre las enfermedades más mortales e intratables. En Ia actualidad el tratamiento del cáncer cerebral consiste en cirugía, radioterapia utilizando rayos X de alta energía u otros tipos de radiación y quimioterapia utilizando medicamentos anticancerígenos o citotóxicos. Estos medicamentos anticancerígenos pueden alcanzar las células cancerígenas donde quieran que estén en el cuerpo, pero en el caso de los tumores cerebrales no todos los medicamentos quimioterapéuticos son apropiados, porque Ia mayoría de ellos no pueden cruzar Ia barrera hematoencefálica (cf. D. Fortín et al., "Enhanced chemotherapy delivery by ¡ntraarterial infusión and blood brain barrier disruption in malignant brain tumors". Cáncer 2005. vol. 103, pp. 2606-15).
Otro campo de interés es el de las enfermedades psiquiátricas, como Ia esquizofrenia. La esquizofrenia afecta casi un 1% de Ia población. Aunque se están utilizando medicamentos anti-psicóticos, hay necesidad de encontrar nuevos y mejores medicamentos sin los efectos secundarios no deseados de los existentes. En Ia búsqueda de estos medicamentos novedosos Ia BBB es Ia barrera que el medicamento necesitará cruzar para llegar a su sitio diana.
Otro campo de interés es el de las enfermedades neurodegenerativas, como Ia enfermedad de Parkinson. La enfermedad de Parkinson es uno de los desórdenes neurodegenerativos más importantes, afectando a un 3% de Ia
población mayor de 65 años. Actualmente no hay terapia preventiva para Ia enfermedad de Parkinson. El tratamiento actual consiste en mejorar los síntomas motores por suplementación del neurotransmisor deficiente dopamina. Como Ia dopamina no cruza Ia BBB, desde los 60 se está utilizando un precursor de Ia dopamina, Ia L-dopa, en el tratamiento de Ia enfermedad de Parkinson. Sin embargo, frecuentemente se observan efectos secundarios severos al cabo de unos pocos años de terapia con L-dopa. La L-dopa cruza Ia BBB utilizando el transportador de aminoácidos y una vez dentro se transforma en dopamina por Ia descarboxilasa de L-aminoácidos aromáticos.
Por último, otro campo de interés es el de Ia epilepsia, un síndrome de disfunciones episódicas del cerebro que afecta a casi un 1 % de Ia población general. Alrededor de un 30% de las epilepsias se clasifican como sintomáticas ya que se asocian a una lesión identificable del sistema nervioso central, mientras que el resto de ellas no tienen causas identificadas. La terapia médica actual para Ia epilepsia es en gran parte sintomática y está dirigida a controlar los ataques en individuos afectados. Si Io medicamentos antiepilépticos fallan, una lobectomía temporal, una operación que implica extirpar Ia región del cerebro donde se originan los ataques, proporciona un tratamiento alternativo. Esta operación es muy exitosa en Ia mayoría de los casos, pero falla en algunos, y además muchos individuos son reacios a someterse a cirugía que implique extirpar partes del cerebro.
En todos estos casos, se conocen muchos compuestos prometedores para su tratamiento, aunque, debido a sus problemas de transporte en Ia BBB, no se desarrollan más. La investigación en estos campos ha seguido varias aproximaciones. Algunos métodos de administración de medicamentos al cerebro, sea para terapia o para diagnosis, son técnicas invasivas, como Ia administración intracraneal, Ia administración por alteración de Ia integridad de Ia BBB o Ia disrupción osmótica. Otros métodos de administración de medicamentos al cerebro tienen efectos secundarios indeseados derivados de Ia administración a dosis altas.
Otra aproximación es Ia modificación del medicamento. Estas modificaciones incluyen por ejemplo Ia reducción del tamaño del medicamento o el incremento de su lipofilicidad, pero no siempre es posible introducir estas
modificaciones. En el caso de introducir una modificación irreversible es necesario que no altere Ia actividad del medicamento una vez llegue al sitio diana. En el caso de una modificación bioreversible, es necesario encontrar un enzima o proceso químico que recupere el medicamento activo una vez el profármaco está dentro del sistema nervioso central.
Otra aproximación es Ia administración por conjugación a un portador biológico. Esta estrategia usa anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de transferrina y sufren una endocitosis mediada por receptor, como caballos de Troya moleculares de los compuestos con un uso terapéutico que no pueden cruzar Ia BBB por sí mismos.
Así, a pesar de todos los esfuerzos en investigación invertidos en el pasado, todavía hay una necesidad de encontrar sustancias con utilidad farmacológica o de diagnóstico que puedan atravesar Ia BBB.
EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN
Los inventores proporcionan nuevos compuestos, a los que se hace referencia como compuestos "lanzadera", los cuales tienen Ia habilidad de atravesar Ia BBB y son capaces de entrar en el cerebro fármacos u otras sustancias tales como agentes de diagnóstico, a las que se hace referencia como "cargos", que no pueden atravesar Ia BBB por sí mismas. Los compuestos lanzadera son biodegradables y biocompatibles, no tienen toxicidad intrínseca y antigenicidad puesto que están hechos de aminoácidos.
Así, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a proporcionar compuestos lanzadera de fórmula (I), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o solvatos de los mismos, incluyendo estereoisómeros o mezclas de estereoisómeros,
donde: R 1 y R 3 son radicales independientemente seleccionados entre H y (Ci-C 4 )-alquilo; R 2 es H o un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos de 1-4 anillos; siendo los anillos saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; siendo los anillos aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo 5-6 miembros; siendo cada miembro independientemente seleccionado entre C, CH, CH 2 , N, NH, O y S; estando uno o más de los átomos de hidrógeno de estos miembros opcionalmente sustituido por sustituyentes seleccionados entre (C 1 -C 6 )- alquilo y (C-i-CβJ-alcoxilo; Xi es un birradical (Ci-C 8 )-alquilo derivado de una cadena de carbono lineal o ramificada; y X 2 es un birradical seleccionado entre -NH-, -NH-(CH 2 ) 1-3 -COO-, -NH-(CH 2 J 1-3 -S- y -NH-CO-(CH 2 ) 1-3 -S-.
Compuestos preferidos son aquéllos de fórmula (I) donde los miembros del anillo en R 2 son C, CH o CH 2 . Compuestos más preferidos son aquéllos donde X 1 es -CH 2 - y R 2 es fenilo, ciclohexilo, 2-naftilo o 1-pirenilo, o aquéllos compuestos donde X 1 es n-hexilo y R 2 es H. Especialmente preferidos son aquellos compuestos donde R 1 y/o R 3 son metilo. Todos estos compuestos se pueden preparar a partir de N-metil aminoácidos Io que incrementa Ia vida media de las construcciones en el cuerpo, evitando Ia degradación por diferentes peptidasas en Ia sangre o asociada a microvasos cerebrales.
Los compuestos más preferidos son los siguientes: el compuesto de fórmula (I) con R 1 = H; R 2 = fenilo, X 1 = CH 2 , R 3 = CH 3 y X 2 = NH; el compuesto de fórmula (I) con R 1 = CH 3 ; R 2 = fenilo, X 1 = CH 2 , R 3 = CH 3 y X 2 = NH; y el compuesto de fórmula (I) con R 1 = H; R 2 = fenilo, X 1 = CH 2 , R 3 = CH 3 y X 2 = -NH-(CH 2 J-COO-. También se hace referencia a estos tres compuestos como
DKP Phe(p-NH 2 )-λ/-MePhe, DKP λ/-MePhe-λ/-MePhe(p-NH 2 ) y DKP Phe(p- NH-CH 2 -COOH)-λ/-MePhe respectivamente, DKP indicando dicetopiperazina.
Los compuestos de fórmula (I) tienen Ia capacidad de transportar al cerebro sustancias, llamadas cargos, que no pueden atravesar Ia BBB por sí mismas. Así, otro aspecto de Ia invención se refiere a los usos de los compuestos de fórmula (I) como BBB-lanzaderas. El uso de estos compuestos hace posible por ejemplo que Ia investigación de nuevos fármacos no esté limitada sólo a compuestos que pueden atravesar Ia BBB por sí mismos.
El mecanismo de transporte a través de Ia BBB de los compuestos de fórmula (I) es por difusión pasiva y este mecanismo es independiente de Ia configuración L o D de los aminoácidos. Así, una de las ventajas principales de los compuestos de fórmula (I) es que se pueden preparar a partir de L o D aminoácidos, o incluso de mezclas racémicas.
Los compuestos de fórmula (I) tienen grupos funcionales apropiados para Ia unión covalente de cargos manteniendo Ia actividad original del cargo, hasta que alcanza el lugar de acción. Así, otro aspecto de Ia presente invención es proporcionar construcciones de fórmula (II), llamadas construcciones BBB lanzadera-cargo,
donde R 1 , R 2 , R 3 , Xi y X 2 son como se define anteriormente, incluyendo las preferencias mencionadas; y Z es un radical derivado de una sustancia susceptible de formar un enlace amida o éster o disulfuro con X 2 , siendo dicha sustancia incapaz de atravesar Ia barrera hematoencefálica por sí misma. Las sustancias de las que deriva el radical Z incluyen una gran
variedad de sustancias que tienen utilidad farmacológica o de diagnóstico. Estas sustancias pueden ser principios activos farmacéuticos, en particular agentes antiretrovirales, agentes anticancerígenos, agentes anti-psicóticos, agentes antineurodegenerativos o agentes antiepilépticos. Ejemplos de principios activos farmacéuticos son Ia dopamina o Ia baicalina. La dopamina es un neurotransmisor clave en el sistema nervioso central, en particular Ia disminución de Ia dopamina estriatal se asocia con condiciones clínicas del parkinsonismo. La baicalina, es un inhibidor flavonoide no-nucleósido de Ia transcriptasa reversa ("flavonoid non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor", NNRTI), aislado de Ia planta de medicina tradicional china
Scutellaria Baicalensis Georqi. Ambos compuestos muestran propiedades interesantes pero no pueden atravesar Ia BBB. En particular, como se ilustra en los ejemplos, las construcciones de fórmula (II) permiten que tanto Ia dopamina como Ia baicalina tengan un futuro en su camino a convertirse en fármacos comerciales, evitando los efectos secundarios de Ia terapia actual, y siendo una técnica no invasiva comparada con las existentes.
Las sustancias de las que deriva Z también incluyen otras sustancias que sería interesante transportar al cerebro pero que no Io pueden hacer de manera adecuada solas, por ejemplo los agentes de diagnóstico para
"Magnetic Resonance Imaging" (MRI). Entre los aparatos clínicos utilizados para diagnosticar cáncer, Ia MRI destaca como una potente modalidad de obtención de imágenes no invasiva ni destructiva que proporciona imágenes internas de organismos vivos sin límite de profundidad del análisis y con una resolución de 10-100 μm. Es una técnica muy valiosa ampliamente utilizada en diagnóstico e investigación del cáncer. Para llevar a cabo Ia MRI se necesitan agentes de contraste. Los agentes de contraste se pueden utilizar como métodos de diagnóstico para enfermedades del sistema nervioso central tales como Ia enfermedad de Alzheimer o elcáncer cerebral, o como herramienta para una exploración pre-operativa con MRI que guiará al cirujano. En todos estos casos el agente de contraste utilizado necesita atravesar Ia BBB. Ejemplos de agentes de contraste incluyen nanopartículas magnéticas tales como nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético. Otros agentes de diagnóstico incluyen colorantes o sondas fluorescentes tales como Ia carboxifluoresceina y derivados, el amarillo lucifer, Ia rodamina o el rojo texas.
Los compuestos lanzadera de fórmula (I) pueden estar formados por aminoácidos naturales y no-naturales y/o sus derivados. Los compuestos de fórmula (I) y las construcciones lanzadera-cargo de fórmula (II) se pueden generar total o parcialmente por síntesis química. Aminoácidos apropiados para Ia preparación de compuestos de fórmula (I) están disponibles comercialmente. Los compuestos de fórmula (I) y las construcciones de fórmula (II) se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, según síntesis en fase líquida o, preferiblemente, métodos de síntesis de péptidos en fase sólida, de los cuales hay descripciones generales ampliamente disponibles (cf. p.ej. J. M. Stewart et al., "SoNd Phase Peptide Synthesis", 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois 1984; E. Atherton et al., "SoNd Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach", IRL Press 1989; and P. Lloyd-Williams et al., "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press Inc, Boca Ratón, Florida, USA, 1997); o se pueden preparar en solución, o por cualquier combinación de fase sólida, fase líquida y química en solución. Por ejemplo, primero completando Ia porción BBB- lanzadera y entonces, después de eliminar cualquiera de los grupos protectores presentes, por introducción del cargo en Ia solución.
Los compuestos de fórmula (I) donde Ri y/o R 3 son metilo se pueden preparar a partir de λ/-metil aminoácidos. Los λ/-metil aminoácidos utilizados se pueden incorporar utilizando fragmentos comerciales o vía λ/-metilación en fase sólida utilizando el aminoácido que no está λ/-metilado correspondiente. La λ/-metilación de los derivados de aminoácido se puede llevar a cabo utilizando métodos descritos (cf. Biron et al., Science 2006, vol. 12, pp. 213- 219; Yang et al., Tetrahedron Letters. 1997, vol. 38, pp. 7307-7310). La N- alquilación de aminoácidos unidos a Ia resina se puede llevar a cabo en tres etapas: (a) protección y activación con cloruro de o-nitrobencenosulfonilo (O- NBS); (b) reacción de Mitsunobu y (c) eliminación de O-NBS. Los grupos protectores adecuados necesarios durante Ia síntesis de los compuestos BBB-lanzadera son ampliamente conocidos en Ia técnica (cf. e.g., Greene et al., "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. Somerset, NJ.) e incluyen 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), y t- butoxicarbonilo (Boc).
Otro aspecto de Ia invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de las
construcciones lanzadera-cargo de fórmula (II) junto con cantidades apropiadas de excipientes o portadores farmacéuticos. La persona experta en Ia materia escogerá Ia vía de administración adecuada mediante métodos usuales. La cantidad de Ia construcción a ser administrada, Ia velocidad y el tiempo de administración, dependerá de Ia naturaleza y Ia gravedad de Io que se está tratando. La naturaleza precisa del portador u otros excipientes dependerá de Ia ruta de administración, que puede ser oral, nasal o por inyección, p.ej. cutánea, subcutánea o intravenosa.
Una composición que comprende una construcción según Ia presente invención se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, tanto simultáneamente o secuencialmente dependiendo de Ia condición a tratar. Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a las construcciones de Ia presente invención para uso como medicamento. En particular Ia invención también se refiere al uso de las construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical de dopamina para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento de Ia enfermedad de Parkinson. Por Io tanto, Ia invención está relacionada con un método de tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, que padece o es susceptible de padecer Ia enfermedad de Parkinson, el método comprendiendo Ia administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (II) con Z derivado de dopamina, junto con diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
La invención también se refiere al uso de las construcciones de fórmula (II) donde Z deriva de Ia baicalina para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento del complejo de demencia relacionado con el SIDA o de Ia encefalopatía por VIH. Por Io tanto, Ia invención está relacionada con un método de tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, que padece o es susceptible de padecer el complejo de demencia relacionado con el SIDA o Ia encefalopatía por VIH, el método comprendiendo Ia administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (II) con Z derivado de baicalina junto con diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia
práctica de Ia invención. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
EXPOSICIóN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIóN
Los aminoácidos protegidos, espaciadores bifuncionales y resinas fueron suministrados por: Luxembourg Industries (Tel-Aviv, Israel), Neosystem (Strasbourg, Francia), Calbiochem-Novabiochem AG (Laüfelfingen, Suiza), Bachem AG (Bubendorf, Suiza) o Iris Biotech (Marktredwitz, Alemania). Otros reactivos y solventes utilizados se resumen en Ia Tabla 1.
Tabla 1 Suministradores comerciales y reactivos utilizados. El DCM fue pasado por una columna de AI 2 O 3 . La DMF se guardó sobre tamiz molecular de 4á y se burbujeó nitrógeno para eliminar los agentes volátiles.
Consideraciones generales sobre Ia síntesis. La elongación del péptido en fase sólida y otras manipulaciones en fase sólida se realizaron manualmente en jeringas de polipropileno provistas de un disco poroso de polietileno. Los solventes y reactivos solubles se eliminaron por succión. Los lavados entre
las diferentes etapas sintéticas se realizaron con dimetilformamida (DMF) (5 x 0.5 min) y diclorometano (DCM) (5 x 0.5 min) utilizando 10 mL de solvente/g de resina cada vez.
Tests identificativos. Los tests utilizados para Ia identificación y control de las síntesis fueron los siguientes: A) Ensayo colorimétrico de Kaiser para Ia detección en fase sólida de aminas primarias unidas (cf: E. Kaiser et al., "Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides"; Anal. Biochem. 1970, vol. 34, pp. 595-598); B) Test de De Clercq para aminas secundarias unidas a fase sólida (cf. A. Madder et al., "A novel sensitive colorimetric assay for visual detection of solid-phase bound amines". Eur. J. Orq. Chem. 1999. pp. 2787-2791 ). El ensayo de De Clercq se realiza lavando primero una pequeña muestra de Ia resina (aprox. 1 mg) con DMF (4x1 minutos) y DCM (4x1 minutos). A Ia resina se Ie añaden diez gotas de solución del reactivo (0.002 M p-nitrofenil éster de rojo disperso 1 en MeCN) y Ia mezcla resultante se calienta a 70 0 C durante 10 minutos. La solución es entonces decantada y Ia resina lavada con DMF hasta que se obtiene un sobrenadante transparente. La presencia de aminas secundarias es indicada por bolas de resina de color rojo.
Protocolos utilizados durante Ia síntesis de las construcciones de fórmula (II): Fueron sintetizadas en una escala de 100 μmoles utilizando los siguientes métodos y protocolos;
Acondicionamiento inicial de Ia resina. Las síntesis empiezan con el condicionado de Ia resina 4-metilbenzilhidrilamina (p-MBHA). Esto se hace lavando Ia resina 5 veces con diclorometano (DCM) por 30 segundos cada vez seguidos de un lavado con una solución de ácido trifluoroacético (TFA) 40% en DCM (1 x 30 s + 2 x 5 min). Este tratamiento ácido es seguido por una etapa de neutralización con λ/,λ/-diisopropiletilamina (DIEA) 5% en DCM (3 x 2 min) y finalmente lavando Ia resina 5 veces con DCM por 30 segundos cada vez.
Síntesis del ácido 4-hidroximetil-3-nitrobenzoico (espaciador bifuncional Nbb). En un balón de fondo redondo provisto con un sistema de reflujo, se colocaron 4.5 g (17.3 mmoles) de ácido 4-bromometil-3-nitrobenzoico y se añadió una solución acuosa saturada de NaHCO 3 (135 mL). La reacción se
agitó y se mantuvo a 90-95 0 C. El avance de Ia reacción se monitorizó por cromatografía de capa fina (TLC) (cloroformo/MeOH/AcOEt, 100:50:0.1 , v/v) o por HPLC de una alícuota acidificada en un gradiente lineal 0-100% MeCN en 15 minutos en una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters) el tiempo de retención para el producto final: 7.12 min; tiempo de retención para el producto inicial: 10.39 min. La reacción se completó en 30 minutos. La solución obtenida se filtró en caliente y Ia reacción se paró con HCI (12N) hasta un pH entre 1-2 y se extrajo con AcOEt (3 x 100 mL), se combinaron las diferentes fracciones orgánicas, se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCI y se secaron sobre MgSO 4 anh. El AcOEt fue evaporado al vacío. El producto se obtuvo como un sólido amarillo pálido con un 80% de rendimiento. El producto se caracterizó por HPLC (t r ) 7.12 min (gradiente lineal 0-100% en 15 minutos), HPLC-MS (196 Da) y R f = 0,3 por TLC (Cloroformo/MeOH/AcOEt, 100:50:0.1 , v/v), NMR- 1 H 400 MHz en CD 3 OD: Señales: 2H: singulete 4.98 ppm, 1 H: doblete, 7.96 ppm (J:21 Hz), 1 H: doblete de dobletes, 8.26 ppm (4 Hz, 20 Hz), 1 H: doblete, 8.56 ppm (4 Hz).
Acoplamiento del ácido 4-h¡droximetil-3-nitrobenzo¡co (espaciador bifuncional Nbb) a Ia resina p-MBHA. El espaciador bifuncional Nbb se acopló a Ia resina p-MBHA utilizando 5 equivalentes de Nbb disueltos en DCM y 5 equivalentes de ty/V-düsopropilcarbodiimida (DIPCDI) como reactivo acoplante. La mezcla se dejó reaccionar toda Ia noche. El solvente se eliminó por succión, Ia resina lavada a fondo y Ia reacción fue monitorizada con el test de Kaiser.
Eliminación del grupo Boa La eliminación del grupo protector tert- butoxicarbonil (Boc) se hizo con 40 % (v/v) TFA en DCM utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada.
Eliminación del grupo Fmoc. La eliminación del grupo protector 9- fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) se hizo con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada.
Métodos de acoplamiento:
Acoplamiento del primer aminoácido al espaciador bifuncional Nbb. Para el acoplamiento del primer aminoácido a Ia resina ya modificada con el
espaciador bifuncional se utilizó el protocolo siguiente: se añadieron secuencialmente a Ia resina derivado del aminoácido (4 equiv.), N 1 N 1 - diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) (4 equiv.) y dimetilaminopiridina (DMAP) (0.4 equiv.) disueltos en DCM (1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión, Ia resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez.
Acoplamiento del segundo aminoácido. El derivado protegido del segundo aminoácido se acopla al primer aminoácido ya anclado a Ia resina utilizando el protocolo siguiente: se añadieron secuencialmente a Ia resina el aminoácido protegido (5 equiv.) en DMF (1-3 mL/g resina) y hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi) tris(pirrolidin) fosfonio (PyAOP) (5 equiv) seguidos de 15 equiv. de λ/,λ/-düsopropiletilamina (DIEA). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El solvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó tal como se indica a arriba, y el acoplamiento se repitió 2 veces más. Se comprobó Ia extensión del acoplamiento por el test de De Clercq.
A/-alquilación del aminoácido. Este proceso se puede dividir en tres pasos:
(a) Protección y activación con cloruro de o-nitrobenzenesulfonilo (O-NBS): Para realizar Ia protección se añadieron a Ia resina 4 equiv. O-NBS y 10 equiv. de colidina en λ/-metil pirrolidona (NMP). La reacción se dejó con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se repitió una vez y se comprobó por test de Kaiser.
(b) Reacción de Mitsunobu: Los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina y 10 equiv. de MeOH en THF anh. se añadieron a Ia resina y se dejaron durante 1 minuto, después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de diisopropil azodicarboxilato (DIAD) en THF anh. y se dejaron por otros 10 minutos.
(c) Eliminación del O-NBS: Para proceder a Ia eliminación del O-NBS se añadieron 10 equiv. de β-mercaptoetanol y 5 equiv. de 1 ,8-diazabiciclo- [5.4.0]-undec-7-ene (DBU) en NMP a Ia resina y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 5 minutos bajo atmósfera de argón. Este proceso se repitió una vez.
Introducción del fragmento de anclaje: Depende de Ia naturaleza del fragmento de anclaje. Por ejemplo, el fragmento se puede introducir por aminación reductiva añadiendo 5 equiv. de ácido glioxílico (H-CO-COOH) en DMF con 1 % AcOH a Ia resina y dejándolo durante 30 min. El disolvente y los reactivos se eliminaron por filtración, se lavó Ia resina y entonces se añadieron 3 equiv. de NaBH 3 CN en DMF con 1% AcOH para realizar Ia reducción durante 1 h.
Acoplamiento del cargo. Dependiendo de Ia naturaleza del cargo, estará unido a Ia BBB lanzadera a través de diferentes tipos de enlaces químicos.
Para cargos con un grupo COOH (p.ej. baicalina): Se utilizó Ia correspondiente BBB lanzadera provista con un grupo NH 2 y se reaccionó con 5 equiv. de Cargo-COOH, utilizando 5 equiv. hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-λ/-oxi-tris(pirrolidin) fosfonio (PyBOP) y 15 equiv. 1-hidroxi-7- azabenzotriazol (HOAt) como reactivos acoplantes y 15 equiv. de N,N- diisopropiletilamina (DIEA) como base en DMF durante 2h.
Para cargos con un grupo amina o alcohol (p.ej.dopamina): Esta reacción se hizo en dos pasos: primero se activó el grupo carboxílico con 5 equiv. de
λA/V-düsopropilcarbodümida (DIPCDI) y 5 equiv. de HOAt en DMF durante 30 min, después se eliminó el solvente por succión y se lavó Ia resina. El acoplamiento se realizó utilizando 5 equiv. NH 2 -Cargo en DMF. La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente toda Ia noche. El disolvente se eliminó por filtración, se lavó Ia resina.
Neutralización-ciclación y escisión en un paso: Se llevó a cabo por tratamiento de Ia resina con DIEA 10% en DCM (3 x 10 minutos). Se recogió el filtrado y el DCM se evaporó bajo N 2 . El residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó.
La identidad de los diferentes compuestos sintetizados fue confirmada utilizando Ia espectrometría de masas "Matrix Assisted Láser Desorption/lonization" (MALDI) (Instrumento: MALDI Voyager DE RP time-of- flight (TOF) PE Biosystem) o HPLC-MS (Instrumento: Waters modelo Alliance 2796, bomba cuaternaria, detector UV/Vis modelo 2487, ESI-MS modelo Micromass ZQ y software Masslynx versión 4.0) utilizando una columna
Symmetry 300 Ci 8 (150 x 3.9 mm x 5 μm), 300 á. 1 ml_/m¡n flujo, solventes: A: H 2 O con 0.1 % ácido fórmico; B: MeCN con 0.07 % ácido fórmico. Su pureza fue controlada por HPLC de fase inversa utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), 1 mL/min flujo, solventes: A: H 2 O con 0.045% TFA; B: MeCN con 0.036% TFA, Instrumento: Waters modelo Alliance 2695 formado por una bomba cuaternaria, un detector diodo array modelo 966, controlado por el software Millenium versión 3.5.
Los compuestos fueron purificados si era necesario por HPLC fase inversa utilizando una columna Symmetry Ci 8 (100 x 30 mm x 5 μm, 100 A, Waters), 10 mL/min flujo, solventes: A: H 2 O con 0.1% TFA; B: MeCN con 0.1 % TFA, Instrumento: Waters system con una bomba cuaternaria, autoinyector Simple Manager 2700, detector UV/Vis modelo 2487 y un Fraction collector II, controlado por el software Masslynx versión 3.5.
EJEMPLOS
En los ejemplos siguientes se han utilizado L-aminoácidos.
Ejemplo 1 : Preparación de Ia DKP Phe(p-NH-Fmoc)-λ/-MePhe
La síntesis se realizó en una escala 100 μmoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a Ia resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el siguiente protocolo: Derivado de aminoácido del primer aminoácido (Boc-λ/-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μmoles, 184.2 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 μmoles, 62 μL) y DMAP (0.4 equiv., 40 μmoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g resina) se añadieron secuencialmente a Ia resina. La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión, Ia resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. Entonces se realizó Ia eliminación del Boc utilizando TFA 40% en DCM (sin hacer el paso de neutralización). Alternativamente el primer aminoácido puede ser unido como Boc-Phe-OH y entonces después de eliminar el Boc realizar Ia λ/-alquilación en Ia resina utilizando el protocolo que puede dividirse en tres pasos: (a) protección y activación con O-NBS, (b) reacción de Mitsunobu, (c) eliminación del O-NBS.
El derivado protegido del aminoácido (Boc-Phefp-NH-Fmoc)-OH) fue acoplado al primer aminoácido ya anclado a Ia resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a Ia resina el aminoácido protegido (Boc-Phe(p-N H-Fmoc)-OH, 5 equiv., 500 μmoles, 251.3 mg) en DMF (1-3 mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 μmoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv. DIEA (1500 μmoles, 255 μL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq.
El grupo Boc se eliminó utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización). Finalmente Ia neutralización-delación y escisión todo en un paso se realizó por tratamiento de Ia resina con DIEA 10% en DCM 3 veces durante 10 min cada una . Se recogieron los filtrados, se evaporó el DCM bajo N 2 y el residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de desalado utilizando Ia resina DOWEX MR-3 Mixed Bed toda Ia noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), DKP Phe(p-NH-Fmoc)-λ/-MePhe t r : 13.17 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): DKP Phe(p-NH-Fmoc)-λ/-MePhe 545.7 Da.
Ejemplo 2: Preparación de Ia DKP Phe(p-NH-Boc)-λ/-MePhe
La síntesis se realizó en una escala 100 μmoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a Ia resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a Ia resina el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Boc-λ/-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μmoles, 184.2 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 μmoles, 62 μL) y DMAP (0.4 equiv., 40 μmoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó entonces por succión, Ia resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez.
Entonces se realizó Ia eliminación del Boc utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización). Alternativamente el primer aminoácido puede unirse como Boc-Phe-OH y entonces después de Ia eliminación del Boc llevar a cabo Ia λ/-alquilación en Ia resina utilizando el protocolo que puede dividirse en tres pasos: (a) protección y activación con O-NBS, (b) reacción de Mitsunobu, (c) eliminación del O-NBS. El derivado protegido de aminoácido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a Ia resina utilizando el protocolo siguiente: se añadieron secuencialmente a Ia resina el aminoácido protegido (Fmoc-Phe(p-NH-Boc)- OH 1 5 equiv., 500 μmoles, 251.3 mg) en DMF (1-3 mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 μmoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv. DIEA (1500 μmoles, 255 μl_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración, se lavó Ia resina y el acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento fue controlada por el test de De Clercq.
La eliminación del grupo Fmoc y Ia ciclación-escisión se realizó en un paso utilizando 20 % (v/v) piperidina en DMF, 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se recogieron los filtrados, Ia DMF se evaporó bajo presión reducida y el residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Para eliminar las sales y los subproductos del Fmoc restantes el compuesto se purificó por HPLC de fase inversa utilizando una columna Symmetry C 1S (100 x 30 mm x 5 μm, 100 A, Waters).
Caracterización del producto: HPLC fase inversa: gradiente lineal de 0 a
100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), DKP Phe(p-NH-Boc)-λ/-MePhe t r : 11.04 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): DKP Phe(p-NH-Boc)-λ/-MePhe 424.1 Da.
Ejemplo 3: Preparación de Ia DKP Phe(p-NH?)-N-MePhe (compuesto de fórmula (I) con R 1 = H; R 2 = fenilo, X 1 = CH 2 , R 3 = CH 3 , X 2 = NH)
La DKP Phe(p-NH 2 )-λ/-MePhe puede ser preparada fácilmente a partir de los compuestos obtenidos en los Ejemplos 1 o 2 por desprotección del grupo Boc o Fmoc respectivamente en solución.
En el caso de un grupo Boc, el grupo Boc se eliminó utilizando TFA 50% en DCM durante 1 h. Entonces el DCM se evaporó bajo presión reducida y el residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó.
En el caso de un grupo Fmoc, el compuesto se disolvió en 1 ml_ de DMF y a Ia solución a 0 0 C, se Ie añadieron 50 μl_ de dietilamina (DEA). La reacción se dejó que llegará a temperatura ambiente y se dejó a temperatura ambiente durante 3h bajo agitación. Para eliminar Ia base y los subproductos restantes del Fmoc el compuesto se purificó por HPLC fase inversa utilizando una columna Symmetry Ci 8 (100 x 30 mm x 5 μm, 100 á, Waters).
Caracterización del producto: HPLC fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), DKP Phe(p-NH 2 )-λ/-MePhe t r : 6.30 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): DKP Phe(p-NH 2 )-λ/-MePhe 324.1 Da. Rendimiento (después de Ia purificación): DKP Phe(p-NH 2 )-λ/-MePhe 8%.
Ejemplo 4: Preparación de Ia DKP λ/-MePhe-λ/-MePhe(p-NH?) (compuesto de fórmula (I) con R 1 = CH 3 ; R 2 = fenilo, Xi = CH 2 , R 3 = CH 3 , X 2 = NH)
La síntesis se realizó en una escala 100 μmoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a Ia resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente a Ia resina el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-Phe(p-NH- BoC)-OH, 4 equiv., 400 μmoles, 201 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 μmoles, 62 μL) y DMAP (0.4 equiv., 40 μmoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión, Ia resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. La N- alquilación de los aminoácidos unidos a Ia resina se hizo siguiendo el protocolo que se puede dividir en tres pasos: (a) Protección y activación con O-NBS: Para realizar Ia protección y activación se añadieron a Ia resina 4 equiv. O-NBS (400 μmoles, 89 mg) y 10 equiv. de colidina (1000 μmoles, 132 μL) en NMP. La reacción se dejó con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se repitió una vez y se controló por test de Kaiser; (b) reacción de Mitsunobu: Los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina (500
μmoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000 μmoles, 24 μL) en THF anh. se añadieron a Ia resina y se dejaron durante 1 minuto, después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500 μmoles, 98 μL) en THF anh. y se dejaron otros 10 minutos; (c) Eliminación del O-NBS: Para proceder á Ia eliminación del O-NBS se añadieron a Ia resina 10 equiv. de β-mercaptoetanol (1000 μmoles, 70 μL) y 5 equiv. de 1 ,8-diazabiciclo-[5.4.0]-undec-7-ene (DBU) (500 μmoles, 75 μL) en NMP y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 5 minutos bajo atmósfera de argón. Este proceso se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a Ia resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a Ia resina el aminoácido protegido (Boc-λ/- MePhe-OH, 5 equiv., 500 μmoles, 191.9 mg) en DMF (1-3 mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 μmoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv. DIEA (1500 μmoles, 255 μL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó y el acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento se controló por el test de De Clercq. Los grupos Boc se eliminaron utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización). Finalmente Ia neutralización-delación y escisión todo en un paso se realizó por tratamiento de Ia resina con DIEA 10% en DCM 3 veces durante 10 min cada una. Se recogieron los filtrados, el DCM se evaporó bajo N 2 y el residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Para eliminar las sales el compuesto se purificó por HPLC fase inversa utilizando una columna Symmetry C-is (100 x 30 mm x 5 μm, 100 á, Waters).
Caracterización del producto: HPLC fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), DKP λ/-MePhe-λ/-MePhe(p-NH 2 ) t r : 6.39 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): DKP λ/-MePhe-λ/-MePhe(p-NH 2 ) 337.7 Da. Rendimiento (después de Ia purificación): DKP N-MePhe-N- MePhe(p-NH 2 ) 7,1%.
Ejemplo 5: Preparación de los compuestos de fórmula (II) con Z derivado de Baicalina)
Se prepararon los siguientes compuestos dicetopiperazina DKP Phe(p-NH- Baicalina)-λ/-MeX donde X: fenilalanina (Phe) (5a), ciclohexilalanina (Cha) (5b), 2-naftilalanina (2NaI) (5c), 1-pirenilalanina (I PirenilAla) (5d), homofenilalanina (HomoPhe) (5e), y ácido 2-amino-octanoico (Oct) (5f) utilizando Ia misma metodología.
Tabla 2: Ejemplos de compuestos de fórmula (II)
Las síntesis se realizaron en una escala 100 μmoles/cada. Para el acoplamiento del primer aminoácido a Ia resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a Ia resina el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Boc-X-OH o Fmoc-X-OH, 4 equiv., 400 μmoles, Boc-Phe-OH 106.1 mg, Boc- HomoPhe-OH 111.7 mg, Boc-Cha-OH 108.6 mg, Boc-Oct-OH 103.7 mg, Fmoc-2Nal-OH 175 mg, Fmoc-1 PirenilAla-OH 204.6 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 μmoles, 62 μl_) y DMAP (0.4 equiv., 40 μmoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión, Ia resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. Entonces se realizó Ia eliminación del grupo Boc o Fmoc utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización) o 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno para Ia eliminación del grupo Fmoc. La λ/-alquilación del aminoácido unido a Ia resina se realizó siguiendo el
protocolo que puede dividirse en tres pasos: (a) Protección y activación con O-NBS: Para realizar Ia protección y activación se añadieron a Ia resina 4 equiv. O-NBS (400 μmoles, 89 mg) y 10 equiv. de colidina (1000 μmoles, 132 μL) en NMP. La reacción se dejó con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se repitió una vez más y controlado por el test de Kaiser; (b) reacción de Mitsunobu: se añadieron a Ia resina los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina (500 μmoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000 μmoles, 24 μL) en THF anh. y se dejó durante 1 minuto, después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500 μmoles, 98 μL) en THF anh. y se dejó durante 10 minutos; (c) eliminación del O-NBS: Para proceder a Ia eliminación del O-NBS se añadieron a Ia resina 10 equiv. de β- mercaptoetanol (1000 μmoles, 70 μL) y 5 equiv. de DBU (500 μmoles, 75 μL) en NMP y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 5 minutos bajo atmósfera de argón. Este proceso se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido fue acoplado al primer aminoácido ya anclado a Ia resina utilizando el siguiente protocolo.
Se añadieron secuencialmente a Ia resina el aminoácido protegido (Boc- Phe(p-NH-Fmoc)-OH, 5 equiv., 500 μmoles, 260.3 mg) en DMF (1-3 mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 μmoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv. DIEA (1500 μmoles, 255 μL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó y el acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento se controló por el test de De Clercq. El grupo Fmoc fue eliminado utilizando 20% (v/v) piperidina en DMF, 2 tratamientos de 10 minutos cada uno fueron utilizados para Ia eliminación del grupo Fmoc. Acoplamiento del cargo con un grupo COOH (p.ej. Baicalina) a un grupo amino: Para el acoplamiento del cargo a Ia BBB-lanzadera anclada en Ia resina se utilizó el siguiente protocolo: Cargo-COOH (Baicalina) (5 equiv., 500 μmoles, 224 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (5 equiv., 500 μmoles, 260.2 mg) y HOAt (15 equiv., 1500 μmoles, 196 mg) se añadieron secuencialmente a Ia resina seguidos de 15 equiv. DIEA (1500 μmoles, 255 μL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó y el acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Boc fue eliminado utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar
el paso de neutralización). Finalmente Ia neutralización-ciclación y escisión todo en un paso se realizó por tratamiento de Ia resina con DIEA 10% en DCM 3 veces durante 10 min cada una. Se recogieron los filtrados, el DCM se evaporó bajo N 2 y el residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1) y se liofilizó. El producto es purificado si es necesario.
Caracterización del producto: HPLC fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), compuesto 5a t r : 9.30 min, compuesto 5b t r : 8.65 min, compuesto 5c t r : 9.48 min, compuesto 5d t r : 9.50 min, compuesto 5e t r : 8.87 min, compuesto 5f t r : 10.47 min. (Confirmado por HPLC-MS). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): compuesto 5a: 752.2 Da, compuesto 5b: 758.1 Da, compuesto 5c: 801.4 Da, compuesto 5d: 876.3 Da, compuesto 5e: 766.1 Da, compuesto 5f: 745.4 Da. Rendimiento (después de purificación): compuesto 5a: 1.2%, compuesto 5b: 2.4%, compuesto 5c: 2.5%, compuesto 5d: 1.4%, compuesto 5e: 1.7%, compuesto 5f: 1.1%.
Ejemplo 6: Preparación de los compuestos de fórmula (II) con Z derivado de dopamina
Los siguientes compuestos DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-Dopamina)-λ/-MeX donde X: fenilalanina (Phe) (6a), ciclohexilalanina (Cha) (6b), 2-naftilalanina (2NaI) (6c), 1-Pirenilalanina (I PirenilAla) (6d), homofenilalanina (HomoPhe) (6e), y ácido 2-amino-octanoico (Oct) (6f), se han preparado utilizando Ia misma metodología.
Tabla 3: Ejemplos de compuestos de fórmula (II)
Las síntesis se realizaron en una escala 100 μmoles/cada. Para el acoplamiento del primer aminoácido a Ia resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente a Ia resina el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Boc-X-OH o Fmoc-X-OH, 4 equiv., 400 μmoles, Boc-Phe-OH 106.1 mg, Boc- HomoPhe-OH 111.7 mg, Boc-Cha-OH 108.6 mg, Boc-Oct-OH 103.7 mg, Fmoc-2Nal-OH 175 mg, Fmoc-1 PirenilAla-OH 204.6 mg), DIPCDI (4 equiv., 400 μmoles, 62 μL) y DMAP (0.4 equiv., 40 μmoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente fue entonces eliminado por succión, Ia resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. Entonces Ia eliminación del grupo Boc o Fmoc se realizó utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización) o bien 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno para Ia eliminación del grupo Fmoc. La λ/-alquilación de los aminoácidos unidos a Ia resina se realizó siguiendo el protocolo que puede ser dividido en tres pasos: (a) Protección y activación con O-NBS: Para realizar Ia protección y activación 4 equiv. O- NBS (400 μmoles, 89 mg) y 10 equiv. de colidina (1000 μmoles, 132 μL) en NMP se añadieron a Ia resina. La reacción se dejó con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se repitió una vez y se controló por el test de Kaiser; (b) reacción de Mitsunobu: Los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina (500 μmoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000 μmoles, 24 μL) en THF anh. fueron añadidos a Ia resina y se dejaron durante 1 minuto, después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500 μmoles, 98 μL) en THF anh. y se dejó durante otros 10 minutos; (c) eliminación del O- NBS: Para proceder a Ia eliminación del O-NBS 10 equiv. de β- mercaptoetanol (1000 μmoles, 70 μL) y 5 equiv. de DBU (500 μmoles, 75 μL) en NMP fueron añadidos a Ia resina y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 5 minuto bajo atmósfera de argón. Este proceso se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido fue acoplado al primer aminoácido ya anclado a Ia resina utilizando el siguiente protocolo, se añadieron a Ia resina el aminoácido protegido (Boc-Phe(p-NH-Fmoc)-OH, 5 equiv., 500 μmoles, 260.3 mg) en DMF (1-3 mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 μmoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv. DIEA (1500 μmoles, 255 μL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h.
El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó y el acoplamiento fue repetido 2 veces más. La extensión del acoplamiento se controló por el test de De Clercq test. El grupo Fmoc se eliminó utilizando 20% (v/v) piperidina en DMF, se llevaron a cabo 2 tratamientos de 10 minutos cada uno para eliminar el grupo Fmoc. La introducción del grupo funcional para el anclaje del cargo se realizó por aminación reductiva. Este proceso se realiza utilizando el siguiente protocolo: se añadió a Ia resina acido glioxílico (H-CO-COOH) (5 equiv., 500 μrnoles, 37 mg) en DMF con 1 % AcOH (1-3 mL/g resina y Ia mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por filtración y Ia resina se lavó. Entonces se añadió a Ia resina NaBH 3 CN (3 equiv., 300 μmoles, 18.8 mg) en DMF con 1 % AcOH y se dejó reaccionar durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración y se lavó Ia resina. El acoplamiento del cargo con un grupo NH 2 (p ej.. dopamina) a un grupo ácido carboxílico fue realizado en dos pasos: Primero el ácido carboxílico se activó con DIPCDI (5 equiv., 500 μmoles, 78 μL) y HOAt (5 equiv., 500 μmoles, 68 mg) en DMF durante 30 min, después de esto el disolvente se eliminó por succión y Ia resina se lavó. El acoplamiento se realizó utilizando 5 equiv. NH 2 -Cargo (dopamina) (5 equiv., 500 μmoles, 98 mg) en DMF. La mezcla se dejó reaccionar toda Ia noche. El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó.
El grupo Boc fue eliminado utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización). Finalmente Ia neutralización-delación y escisión todo en un paso se realizó por tratamiento de Ia resina con DIEA 10% en DCM 3 veces durante 10 min cada uno. Se recogieron los filtrados, se evaporó el DCM bajo N 2 y el residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1 ) y liofilizó. El producto se purifica si es necesario.
Caracterización del producto: HPLC fase inversa: gradiente lineal de 15 a 65% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), compuesto 6a t r : 7.83 min, compuesto 6b t r : 9.36 min, compuesto 6c t r : 9.61 min, compuesto 6d t r : 11.75 min, compuesto 6e t r : 7.85 min, compuesto 6f t r : 10.58 min. (Confirmado por HPLC-MS). Espectrometría de masas (HPLC-MS): compuesto 6a: 516.5 Da, compuesto 6b: 522.5 Da, compuesto 6c: 566.2 Da, compuesto 6d: 640.4 Da, compuesto 6e: 530.3 Da, compuesto 6f: 510.4 Da. Rendimiento (después de Ia
purificación): compuesto 6a: 10.8%, compuesto 6b: 7.2%, compuesto 6c: 10.9%, compuesto 6d: 9.6%, compuesto 6e: 9.1%, compuesto 6f: 8.2%.
Ejemplo 7: Preparación de Ia DKP Phe(p-NH-CH9-COOH)-λ/-MePhe (compuesto de fórmula (I) con Ri = H; R 2 = fenilo, Xi =CH 2 , R3 = CH 3 , X 2 = NHCH 2 COO)
La síntesis se realizó en una escala de 100 μmoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a Ia resina ya modificada con el espaciador bifuncional Nbb se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron a Ia resina el derivado de aminoácido 4 equiv., 400 μmoles, Boc-Phe-OH 106.1 mg, DIPCDI (4 equiv., 400 μmoles, 62 μl_) y DMAP (0.4 equiv., 40 μmoles, 4.9 mg) disueltos en DCM (1-3 ml/g resina). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por succión, Ia resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. Entonces se realizó Ia eliminación del grupo Boc utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización). La λ/-alquilación del aminoácido unido a Ia resina se realizó siguiendo el protocolo que puede dividirse en tres pasos: (a) protección y activación con O-NBS: Para realizar Ia protección y activación se añadieron a Ia resina 4 equiv. O-NBS (400 μmoles, 89 mg) y 10 equiv. de colidina (1000 μmoles, 132 μL) en NMP. La reacción se dejó con agitación manual intermitente durante 1 h y este paso se repitió una vez y controló por el test de Kaiser, (b) reacción de Mitsunobu: Los reactivos de Mitsunobu, 5 equiv. trifenilfosfina (500 μmoles, 131 mg) y 10 equiv. de MeOH (1000 μmoles, 24 μL) en THF anh. se añadieron a Ia resina y se dejó durante 1 minuto, después sin filtrar se añadieron 5 equiv. de DIAD (500 μmoles, 98 μL) en THF anh. y se dejó otros 10 minutos, (c) eliminación del O-NBS: para proceder a Ia eliminación del O-NBS 10 equiv. de β-mercaptoetanol (1000 μmoles, 70 μL) y 5 equiv. de DBU (500 μmoles, 75 μL) en NMP se añadieron a Ia resina y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 5 minuto bajó atmósfera de argón. Este proceso se repitió una vez.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a Ia resina utilizando el siguiente protocolo, se añadieron secuencialmente a Ia resina el aminoácido protegido (Boc-Phe(p- NH-Fmoc)-OH, 5 equiv., 500 μmoles, 260.3 mg) en DMF (1-3 mL/g resina) y PyAOP (5 equiv., 500 μmoles, 260.2 mg) seguidos de 15 equiv. DIEA (1500
μmoles, 255 μl_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó y el acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento se controló por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó utilizando 20% (v/v) piperidina en DMF, se utilizaron 2 tratamientos de 10 minutos cada uno para eliminar el grupo Fmoc. La introducción del grupo funcional para el anclaje del cargo se realizó por aminación reductiva. Este proceso se realizó utilizando el siguiente protocolo: se añadieron a Ia resina el ácido glioxílico (H-CO-COOH) (5 equiv., 500 μmoles, 37 mg) en DMF con 1 % AcOH (1-3 mL/g resina), y Ia mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 30 min. El disolvente se eliminó por filtración y Ia resina se lavó. Entonces se añadió a Ia resina NaBH 3 CN (3 equiv., 300 μmoles, 18.8 mg) en DMF con 1 % AcOH y se dejó reaccionar durante 1 h. El disolvente se eliminó por filtración y Ia resina se lavó. El ácido carboxílico se modificó con un éster de metilo en dos pasos: Primero el ácido carboxílico se activó con DIPCDI (5 equiv., 500 μmoles, 78 μL) y HOAt (5 equiv., 500 μmoles, 68 mg) en DMF durante 30 min, después de esto el solvente se eliminó y Ia resina se lavó. El acoplamiento se realizó utilizando 5 equiv. de MeOH (500 μmoles, 8 μL) en DMF. La mezcla se dejó reaccionar toda Ia noche. El disolvente se eliminó por filtración, Ia resina se lavó. El grupo Boc se eliminó utilizando TFA 40% en DCM (sin realizar el paso de neutralización). Finalmente Ia neutralización-delación y escisión todo en un paso se realizó por tratamiento de Ia resina con DIEA 10% en DCM 3 veces durante 10 min cada. Se recogieron los filtrados , el DCM se evaporó bajo N 2 y el residuo se disolvió en H 2 O: MeCN (1 :1 ) y liofilizado. Después el éster metílico se hidrolizó con 1.5 equiv. LiOH (150 μmoles, 6.3mg) en H 2 O:MeOH (1 :1 ) agitando a temperatura ambiente durante 30 min. Entonces Ia solución se acidificó y liofilizó. El producto se purificó.
Caracterización del producto: HPLC fase inversa: gradiente lineal de 0 a
100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry Ci 8 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 A, Waters), DKP Phe(p-NH-CH 2 -COOH)-λ/-MePhe t r : 7.86 min (Confirmado por HPLC-MS). Espectrometría de masas (HPLC-MS): DKP Phe(p-NH-CH 2 -COOH)-λ/-MePhe 381.0 Da. Rendimiento (después de Ia purificación): DKP Phe(p-NH-CH 2 -COOH)-λ/-MePhe 13%.
Ejemplo 8: Técnicas de evaluación del transporte en Ia BBB
Ensayo paralelo de permeabilidad en membrana artificial (PAMPA). El método de evaluación escogido es el ensayo paralelo de permeabilidad en membrana artificial (PAMPA), que permite predecir o evaluar solo este mecanismo de transporte. En términos generales, es un método simple, automatizable con un alto rendimiento, que tiene un bajo coste y solo requiere una pequeña cantidad del compuesto a probar. El método PAMPA originariamente introducido por Kansy en Roche utiliza una membrana artificial en forma de bicapas de fosfolípidos soportadas en un filtro (cf. M. Kansy et al., " Physicochemical high throughput screening: Parallel artificial membrane permeability assay in the description of the absorption processes" J. Med. Chem. 1998, vol. 41 , pp. 1007-1010). La membrana de fosfolípidos mimetiza Ia membrana celular, pero no tiene los medios para el transporte activo o paracelular de las moléculas fármaco. Es una herramienta muy práctica para evaluar el transporte de compuestos por difusión pasiva. Esta técnica permite Ia evaluación de compuestos puros, crudos e incluso mezclas de compuestos.
El ensayo PAMPA se utiliza para determinar Ia capacidad de las construcciones BBB lanzadera-cargo para cruzar Ia BBB por difusión pasiva. La permeabilidad efectiva de los compuestos se midió por triplicado a una concentración inicial de 200 μM. La solución tampón se preparó a partir de Ia concentrada comercializada por plON siguiendo sus indicaciones. El pH fue ajustado a 7.4 utilizando una solución NaOH 0.5M. El compuesto de interés se disolvió a Ia concentración deseada (200 μM).
El sandwich de PAMPA se separó y el pocilio donador se rellenó con 200 μL de Ia solución del compuesto a estudiar. La placa aceptora se colocó en Ia placa donadora asegurándose que Ia parte inferior de Ia membrana estuviera en contacto con el tampón. Se añadieron 4 μL de mezcla de fosfolípidos (20mg/mL) en dodecano a cada pocilio y se añadieron a cada pocilio aceptor 200 μL de Ia solución tampón. La placa se cubrió e incubó a temperatura ambiente en una atmósfera saturada de humedad durante 4 horas bajo agitación orbital de 100 rpm. Después de 4 horas, 150 μL/pocillo de Ia placa donadora y 150 μL/pocillo de Ia paca aceptora se transfirieron a viales de HPLC y 100 μL/cada muestra fueron inyectados en una columna de HPLC
fase inversa, columna Symmetry C 18 (150 x 4.6 mm x 5 μm, 100 á, Waters). El transporte fue también confirmado por espectrometría MALDI-TOF y HPLC-MS de alícuotas de los pocilios aceptores. La mezcla de fosfolípidos utilizada es un extracto polar de lípidos de cerebro porcino. Composición: fosfatidilcolina (PC) 12.6%, fosfatidiletanolamina (PE) 33.1%, fosfatidilserina (PS) 18.5%, fosfatidilinositol (Pl) 4.1 %, ácido fosfatídico 0.8% y 30.9 % de otros compuestos. La permeabilidad efectiva fue calculada utilizando Ia siguiente ecuación:
donde: t tiempo (horas)
C A (t) Concentración de compuesto en el pocilio aceptor a tiempo t Cuito) Concentración de compuesto en el pocilio donador a 0 h
Como control, se evaluó en paralelo el transporte de propranolol y se calculó el balance de materia para todos los compuestos estudiados para detectar si tenía lugar retención de compuesto en los fosfolípidos.
Los diferentes compuestos se evaluaron por ensayo PAMPA. El ensayo PAMPA solo mide el transporte por difusión pasiva, así el transporte positivo medido para estos compuestos indica que estos compuestos tienen un transporte positivo a través de Ia BBB in vivo por difusión pasiva.
Uno debe considerar que probablemente Ia BBB-lanzadera óptima puede variar según el cargo unido.
En las Tablas 4 y 5, se puede ver como el uso de Ia construcción BBB lanzadera-cargo permite que cargos que no cruzan ellos mismos, como Ia baicalina y Ia dopamina, pueden ahora cruzar Ia membrana por difusión pasiva.
Tabla 4: Permeabilidad efectiva (P e ) encontrada en el ensayo PAMPA para Phe(p-NH-CO-Baicalina)-λ/-MePhe, Phe(p-NH-CO-Baicalina)-λ/-MeCha, Phe(p-NH-CO-Baicalina)-/V-Me2Nal, Phe(p-NH-CO-Baicalina)-λ/- Me1 PirenilAla, Phe(p-NH-CO-Baicalina)-/V-MeHomoPhe, Phe(p-NH-CO- Baicalina)-λ/-MeOct (construcciones BBB lanzadera-cargo) y baicalina (Cargo). * La baicalina no se detectó en el pocilio aceptor del ensayo PAMPA después de 4 h.
Tabla 5: Permeabilidad efectiva (P e ) encontrada en el ensayo PAMPA para DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-λ/-MePhe, DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO- NH-Dopamina)-λ/-MeCha, DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-/V- Me2Nal, DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-λ/-Me(1 PirenilAla), DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-λ/-MeHomoPhe, DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO- NH-Dopamina)-λ/-MeOct y dopamina (Cargo) y L-Dopa (Medicamento actual en el mercado). *Estos compuestos no se detectaron en el pocilio aceptor del ensayo PAMPA después de 4 h.
La dopamina y Ia baicalina son cargos difíciles que no pueden cruzar Ia BBB por difusión pasiva en absoluto. Las construcciones BBB lanzadera-cargo basadas en λ/-Meθct y λ/-Me2Nal han sido las más óptimas para hacer cruzar cargos como Ia dopamina y Ia baicalina.
Cromatografía de membrana artificial inmovilizada:
Para evaluar las BBB-lanzaderas y las construcciones BBB lanzadera-cargo, se utilizó una técnica cromatográfica, IAMC (immobilized artificial membrane chromatography) desarrollada por Pidgeon (cf. A. Albert, Chemical aspects of selective toxicity. Nature 1958. vol. 182, pp. 421-423). Esta técnica utiliza
moléculas de fosfolípido covalentemente inmovilizadas a partículas de sílice a una alta densidad como fase estacionaria. Se ha utilizado para purificar proteínas de membrana, para inmovilizar enzimas y para predecir el transporte a través de barreras biológicas. Exhibe una buena correlación con los ensayos celulares in vitro y es muy práctica en términos de alto rendimiento. La interacciones de IAMC incluyen interacciones iónicas, lipofílicas y de enlaces de hidrogeno que se pueden combinar bajo el parámetro conocido como fosfolípofilicidad.
Los tiempos de retención se determinaron utilizando una columna IAMC con fosfatidilcolina (PC), el fosfolípido más encontrado en las membranas celulares, inmovilizado (10 * 4.6 mm, 12 μm, 300 á, IAM.PC.DD2 columna, Regis Technologies Inc.). Los compuestos se detectaron por absorción de UV a 220 nm. Los cromatogramas se obtuvieron utilizando un HPLC trabajando ¡socráticamente con una fase móvil que contenía 10 mM tampón fosfato, 2.7 mM KCI y 137 mM NaCI a pH 7.4 y 20% MeCN (flujo 0.5 mL/min). Los tiempos de retención (f r ) se transformaron a factores de capacidad (/CIAM) según Ia ecuación siguiente: /C !A M = (U - to)/to, donde t r es el tiempo de retención del compuesto estudiado y t 0 es el tiempo de retención de un compuesto que no será retenido por Ia columna (e.g. ácido cítrico). Como control, se estudió el propranolol.
Las BBB-lanzaderas y las construcciones BBB lanzaderas-cargo también se evaluaron por IAMC (Cromatografía de membrana artificial inmovilizada), una técnica cromatográfica que mide Ia fosfolipofilicidad de nuestros compuestos, su tendencia a interaccionar con Ia fosfatidilcolina inmovilizada covalentemente. Ver resultados en Ia Tabla 6 y 7.
La IAMC muestra que las construcciones BBB-lanzaderas con baicalina exhiben valores de kiAM mejorados (Tabla 6) y Io mismo ocurre en el caso de las construcciones BBB lanzadera-cargo basadas en dopamina (Tabla 7). Estos compuestos muestran mejores fosfolipifilicidad , llegando a factores de capacidad altos (k| A ιvι).
Tabla 6: Factores de capacidad (k| A ιvι) encontrados en el ensayo de IAMC para Phe(p-NH-CO-Baicalina)-λ/-MePhe, Phe(p-NH-CO-Baicalina)-λ/-MeCha, Phe(p-NH-CO-Baicalina)-λ/-Me2Nal, Phe(p-NH-CO-Baical¡na)-/V- Mei PlrenilAla, Phe(p-NH-CO-Baical¡na)-λ/-MeHomoPhe, Phe(p-NH-CO- Baicalina)-λ/-Meθct (Construcciones BBB lanzadera-cargo) y baicalina (Cargo).
Tabla 7: Factores de capacidad (k| A ιvι) encontrados en el ensayo de IAMC para DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-λ/-MePhe, DKP Phe(p-NH-CH 2 - CO-NH-Dopamina)-λ/-MeCha, DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-λ/- Me2Nal, DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-λ/-Me(1 PirenilAla), DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO-NH-Dopamina)-λ/-MeHomoPhe, DKP Phe(p-NH-CH 2 -CO- NH-Dopamina)-λ/-MeOct y dopamina (Cargo).