BETA AMILOIDE

La presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general 5 (I) para la elaboración de una composición farmacéutica, más preferiblemente para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto.

I O (0

ESTADO DE LA TÉCNICA

15 La enfermedad de Alzheimer (AD) es la causa más común de declive progresivo de la función cognitiva en ancianos. Se caracteriza por la presencia de numerosas placas seniles y ovillos neurofibrilares, y se ve acompañada por pérdida de neuronas colinérgicas. Las placas seniles neurofibrilares están compuestas por péptidos beta amiloides (Αβ),

20 fragmentos peptídicos de 40-42 residuos de una proteína precursora (APP) codificada en el cromosoma 21 . Se ha demostrado que el péptido Αβ y fragmentos del mismo son tóxicos in vitro e in vivo, lo que indica un papel importante de Αβ en la patogénesis de AD.

25 La naturaleza precisa de la forma tóxica de Αβ no ha sido establecida por completo pero, recientemente, la toxicidad se ha relacionado con formas tempranas de agregados peptídicos llamadas ADDLs (ligandos difundibles derivados de Αβ), protofibrillas u oligómeros solubles (Walsh D.M., Selkoe D.J., Protein Pept Lett, 2004. 1 1 (3): p. 213-28). Las dianas principales para intervención terapéutica en la cascada Αβ se clasifican en: (i) Inhibición de la producción de Αβ, (ii) Inhibición de la agregación de Αβ y de la formación de fibras (iii) Inhibición de la respuesta inflamatoria causada por el depósito de Αβ (Grundman y Thal., Neurol Clin, 2000. 18(4): p. 807-28). La inhibición de formación de fibras y, mejor aún, de agregación de Αβ es de interés terapéutico en el tratamiento de AD (Findeis y Molineaux., Methods Enzymol, 1999. 309: p. 476-88) porque los agregados de bajo peso molecular de Αβ son extremadamente tóxicos para neuronas (Pike et al., J Neurosci, 1993. 13(4): p. 1676-87). Aunque se ha hecho mucho esfuerzo para desarrollar agentes terapéuticos tales como inmunoterapia (Thatte., Curr Opin Investig Drugs, 2001 . 2(5): p. 663-7) así como compuestos que rompan láminas β (Findeis y Molineaux., Methods Enzymol, 1999. 309: p. 476-88), la terapia específica disponible para combatir AD está limitada a la basada en la mejora de la función colinérgica y el efecto clínico no es suficiente (Grundman y Thal., Neurol Clin, 2000. 18(4): p. 807-28).

Por tanto, la necesidad de intervención terapéutica es imperiosa. La utilidad de los compuestos que reducen la agregación de Αβ o su neurotoxicidad in vitro se ve a menudo comprometida por su toxicidad in vivo. Los tratamientos de los síntomas de AD incluyen el uso de inhibidores de acetilcolinesterasa (AchE). Los disponibles clínicamente para tratar AD suave o moderado son galantamina, donepecil-hidrocloruro y rivastigmina (Matharu et al., J Neurol Sci, 2009. 280(1 -2): p. 49-58). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona unos compuestos que son útiles para la elaboración de un medicamento y más preferiblemente para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de u compuesto de fórmula general (I) para la elaboración de un medicamento ( partir de ahora compuesto de la invención):

( donde:

Xi y X2 se seleccionan, de manera independiente, de entre S, O ó NH;

R1 se selecciona de entre -NR _a R _b , -OR _c y -SRd¡ donde R _a y Rb se selecciona, de manera independiente, de entre un grupo alquilo (C1-C5) o H o se unen formando un heterocicloalquilo, y R _c y Rd son, de manera independiente, un grupo alquilo (C C ₅ );

R ₂ se selecciona entre un halógeno o un hidrógeno; y

n tiene un valor de 1 , 2 o 3, preferiblemente es 2. El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /-propilo, n-butilo, íero-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc., preferiblemente el grupo alquilo tiene de 1 a 3 átomos de carbono y más preferiblemente es un grupo metilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como arilo, halógeno, (denominándose haloalquilo), hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto o tioalquilo. Preferiblemente el grupo alquilo no esta sustituido. Por "heterocicloalquilo" se refiere a una cadena carbocíclica saturada, que tiene de 3 a 12 átomos de carbono y al menos uno de esos carbonos está sustituido por un nitrógeno y en concreto el que se une al anillo aromático (N-cicloalquilo), pudiendo ser monocíclíco o bicíclico, en este último caso los anillos pueden estar separados o condensados. Preferiblemente el heterocicloalquilo es un monocíclico y más preferiblemente tiene de 3 a 6 átomos de carbono. El heterocicloalquilo puede estar opclonalmente sustituido por uno o más sustituyentes tales como alquilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, amino o nitro. Por "halógeno" se entiende en la presente invención a un átomo de bromo, cloro, yodo o flúor. Preferiblemente es cloro.

En una realización preferida, X es NH. En otra realización preferida, X2 es S.

En otra realización preferida, R1 es -NR _a Rb, más preferiblemente R _a y R _b se unen formando un heterocicloalquilo, y aún más preferiblemente el heterocicloalquilo es piperidinila.

En una realización más preferida, el compuesto de la invención es el 2,5- dicloro-N-(4-piperid¡nofenil)-3-tiofenesulfonamida, de fórmula:

Los compuestos de la invención pueden presentarse en forma de sales farmacéuticamente aceptables, solvatos o esteroisómeros.

El término "sales farmacéuticamente aceptables, solvatos o estereoisómeros" se refiere a cualquier sal farmacéutica, éster, solvato o cualquier otro compuesto que, siendo administrado a un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto descrito en el presente documento. Sin embargo se observará que las sales farmacéuticamente inaceptables están también en el ámbito de la invención ya que estas últimas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, estereoisómeros y derivados pueden ser llevadas a cabo por medio de métodos conocidos en la materia.

La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de fórmula (I) junto con un transportador farmacéutico aceptable, adyuvante o vehículo para la administración a un paciente. Dicha composición se pueden utilizar junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, ser provistos en una forma de una composición separada para su administración simultanea o no, con la composición farmacéutica que comprende un compuesto de de la invención. Por tanto, la composición farmacéutica de la invención puede comprender además otro principio activo.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención, además de al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

Las formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen cualquier composición sólida (tabletas, pastillas, cápsulas, formas granuladas, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, etc.) y pueden contener excipientes convencionales conocidos en la materia.

Los compuestos descritos en esta invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros y/o solvatos, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen, pueden ser administrados de forma oral o parenteral. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intratecal o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral. La administración puede ser también sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.

A lo largo de la presente descripción, el término "tratamiento" se refiere a eliminar, reducir o disminuir la causa o efectos de la enfermedad. Para los propósitos de esta invención, tratamiento incluye, aunque sin quedar limitados a los mismos, aliviar, disminuir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad; reducir el grado de enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, aliviar o mejorar el estado de la enfermedad y remitir (ya sea total o parcial). Los autores de la presente invención han demostrado en los ejemplos el compuesto de la invención, en concreto el compuesto 2,5-dicloro-N-(4- piperidinofenil)-3-tiofenesulfonamida (en adelante, "compuesto") inhibe fuertemente la agregación del péptido Αβ humano, por lo que una de sus aplicaciones es el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (I) para la inhibición de la agregación del péptido Αβ, preferiblemente del péptido Αβ humano, y aún más preferiblemente para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURAS

Fig. 1. Muestra la fluorescencia de tioflavina asociada a la agregación del péptido en presencia y ausencia del compuesto, u.a. es unidades arbitrarias. Fig. 2. Representa el incremento de dispersión de luz en solución asociado a agregación del péptido en presencia del compuesto. Fig. 3. Muestra las imágenes por microscopía electrónica de la formación de fibras amiloides en distintas condiciones: control negativo: en ausencia de péptido Αβ, control positivo: péptido Αβ (17-40) a concentración 50 μΜ, compuesto: péptido Αβ (17-40) a concentración 50 μΜ + compuesto a una concentración 100 μ .

Fig. 4. Muestra la viabilidad celular de células humanas de neuroblastoma y células HeLa mediante un ensayo con XTT. MCC es concentración mínima citotóxica.

Fig. 5. Muestra la supervivencia celular en levadura relacionada con la inhibición de la agregación del péptido Αβ (1 -42). Las barras se refieren a ensayos equivalentes realizados en presencia de 10 μΜ (columna negra) y 20 μΜ (columna blanca) de MTX (metotrexato), el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR).

EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores. En todos los ejemplos se ha utilizado el compuesto 2,5- dicloro-N-(4-piperidinofenil)-3-tiofenesulfonamida (en adelante llamado compuesto), disponible comercialmente (Maybridge, Thermo Fisher Scientific). Como se demuestra en los ejemplos, el compuesto inhibe fuertemente la agregación del péptido Αβ humano. Se han realizado tres ensayos secuenciales in vitro que cuantifican el grado de agregación del péptido Αβ (fragmento 17-40).

Ejemplo 1 El primer ensayo se llevó a cabo como está descrito en LeVine, Protein Sci, 1993. 2(3): p. 404-10. Este ensayo monitoriza la fluorescencia de tioflavina asociada a la agregación del péptido Αβ (fragmento 17-40) y compara la agregación de dicho péptido que tiene lugar en ausencia y en presencia del compuesto (Fig. 1 ). El compuesto se adquirió liofilizado y fue resuspendido en DIVISO 100% a una concentración stock 4 mM y posteriormente diluido en PBS hasta una concentración final 100 μ .

Como muestra la figura 1 , el compuesto disminuye la fluorescencia de tioflavina y por tanto la agregación del péptido Αβ.

Ejemplo 2

El segundo ensayo monitoriza el incremento de dispersión de luz en solución asociado a agregación del péptido Αβ (fragmento 17-40) en presencia del compuesto (Fig. 2). La presencia del compuesto impide la formación de las fibras amiloides.

El péptido Αβ17-40 se resuspendió en una solución de NH ₄ OH al 0,02% hasta obtener una solución stock 500 μΜ, posteriormente fue centrifugado a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos a 4 ^s C, y diluido en una solución de tampón fosfato (PBS) hasta una concentración final 50 μΜ. A la solución del péptido Αβ17-40 fue adicionado el compuesto a una concentración final 100 μΜ, el cual previamente había sido resuspendido en DMSO 100% (concentración stock del compuesto de 20 mM).

El valor de absorbancia a 360 nM, fue analizado cada 30 minutos durante 8 horas y comparado con el control negativo, el cual es una muestra de NH ₄ OH al 0,002%, DMSO 0,5% y PBS, y el control positivo, el cual es una muestra del péptido Αβ17-40 50 μΜ en PBS y DMSO 0,5%. El ensayo se llevo a cabo utilizando un espectrofotómetro Varían Cary 100 Bio, y cubetas de cuarzo Hellma 104QS de 10 mm de paso de luz. Este ensayo permite cuantificar y confirmar el efecto inhibidor de la formación de fibras amiloides que presenta el compuesto, ya que en una muestra donde ocurre el proceso de agregación (control positivo), los valores de absorbancia incrementan proporcionalmente a la formación de agregados amiloides en el tiempo.

Ejemplo 3

El tercer ensayo permite visualizar directamente la formación de fibras amiloides (o la ausencia de formación en presencia del compuesto) por microscopía electrónica (Fig. 3). Como muestra la figura 3, el compuesto redujo significativamente la formación de fibras amiloides.

Como control negativo se empleó NH ₄ 0H al 0,002%, DMSO 0,5% y PBS. Como control positivo se empleó el péptido Αβ (17-40) 50 μΜ, PBS y DMSO 0,5%. El péptido Αβ inicialmente se resuspendió en una solución de NH ₄ OH 0,02% a una concentración inicial 500 μΜ, centrifugado a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos a 4 ^Q C y posteriormente diluido en solución PBS hasta obtener una concentración 50 μΜ, el cual fue incubado durante 24 horas a 37 ^s C en presencia del compuesto, el cual estaba a una concentración final 100 μΜ (y que había sido previamente resuspendido en DMSO 100%, solución stock 20 mM).

Para la observación de las muestras (control positivo, control negativo y péptido Αβ incubado con el compuesto), se realizó el siguiente procedimiento: sobre una rejilla de cobre se adicionaron 10 μΙ de la muestra, que se dejó reposar 5 minutos, se retiró el exceso de muestra con ayuda de una tira de papel Watman, se adicionaron 10 μΙ del colorante Acetato de Uranilo, el cual se dejó actuar durante 1 minuto. Posteriormente, se retiró el exceso de colorante y las rejillas se dejaron secando a 37 ^s C para su posterior observación en un microscopio electrónico HITACHI H-7000 a 75 kV. Ejemplo 4

La toxicidad del compuesto hacia células humanas de neuroblastoma SH- SY5Y y células HeLa se determinó por ensayo con el compuesto XTT. El compuesto muestra una toxicidad razonablemente baja a juzgar por su Concentración Mínima Citotoxica (MCC) (Fig. 4).

Las células se cultivaron en DMEM con rojo fenol, suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 g /mi de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. El cultivo se mantuvo a 37 ^Q C en una atmósfera de 5% de C0 ₂ . Las células fueron cultivadas en frascos de cultivo de 25 mi y subcultivadas cada 3 días. Para evaluar la toxicidad del compuesto en células HeLa, las células fueron cultivadas en placas de 96 pocilios. Se sembraron 3 x 10 ⁴ células por pocilio en 100 μΙ de medio durante 24 horas. Posteriormente, las células fueron incubadas con el compuesto a diferentes concentraciones, como muestra la figura 4.

A las 24 horas de incubación con el compuesto, la viabilidad celular fue determinada utilizando el compuesto 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5- [(fenil-amino)carbonil]- 2H-hidróxido de tetrazolio (XTT) (Cell Proliferation Kit II, Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del periodo de incubación de 24 horas, el medio de cultivo es remplazado por medio DMEM sin rojo fenol y 50 μΙ del reactivo XTT se añaden a cada pocilio. Las placas de cultivo se incuban nuevamente durante 4 horas a 37 ⁹ C a una atmosfera de 5% de C0 ₂ . Posteriormente, la densidad óptica fue leída a 450 nm, con una longitud de onda de referencia de 650 nm, usando un lector de placas. Los valores obtenidos con controles no tratados se consideraron como 100% de viabilidad. La concentración mínima citotoxica (MCC) fue calculada por ajuste de los valores de viabilidad a cada concentración del compuesto evaluada, utilizando una función dosis-respuesta con una pendiente variable, utilizando el software Origin Pro ® 8 (Northampton, USA). Ejemplo 5

La capacidad del compuesto de inhibir la agregación del péptido Αβ (1 -42) expresado en células de levadura ha sido determinada usando un ensayo que relaciona supervivencia celular con inhibición de la agregación de Αβ como se describe en orell, et al., Mol. BioSyst, 201 1 , 7, 1 121 -1 128. El compuesto aumenta la supervivencia de las células de levadura Saccharomyces Cerevisiae, de manera dosis dependiente, inhibiendo la agregación intracelular del péptido Αβ (1 -42) (Fig. 5).