COMPOSES POUR LE TRAITEMENT DES MALADIES MITOCHONDRIALES

L'invention a pour objet des composés pour leur utilisation dans le traitement et la prévention des maladies mitochondriales.

Les maladies mitochondriales regroupent un ensemble très large et hétérogène de maladies orphelines, qui comprend notamment les troubles liés à l'instabilité de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Parmi eux, l'ophtalmoplégie externe progressive (Progressive External Ophthalmoplegia, PEO), l'insuffisance hépatique néonatale et la maladie d'Alpers (Alpers-Huttenlocher Syndrome, AHS) sont causées par des mutations dans le gène codant la polymérase gamma de l'ADN mitochondrial : le gène POLG (Spinazzola A, Zeviani M. Disorders of nuclear-mitochondrial intergenomic communication. BiosciRep 2007;27(l-3):39- 51).

Les mutations dans le gène POLG peuvent conduire à une accumulation de substitutions de bases, à des délétions de l'ADNmt ainsi qu'à des déplétions de l'ADNmt résultant en une production altérée de l'énergie via la phosphorylation oxydative.

Jusqu'à présent, plus de 200 mutations pathogéniques dans le gène POLG ont été reportées. Ces mutations sont associées à un très large spectre de maladies mitochondriales incluant entre autres la PEO, la myopathie, le parkinsonisme, la ménopause prématurée, les troubles psychologiques, l'ataxie, l'encéphalopathie et la maladie d'Alpers (Hudson G, Chinnery PF. Mitochondrial DNA polymerase-gamma and human disease. Hum Mol Genêt. 2006;15:R244-52). Les mutations de POLG dominantes donnent lieu à une ophtalmoplégie externe progressive associée à des délétions multiples de l'ADNmt tandis que les mutations récessives provoquent une déplétion de l'ADNmt (2-10% de la quantité normale en ADNmt) et une insuffisance hépatique néonatale ou une maladie d'Alpers.

Il n'existe aujourd'hui aucun traitement curatif des maladies liées à l'instabilité de l'ADNmt. Les traitements sont actuellement limités à la gestion des symptômes et à des soins de soutien. Une grande variété de vitamines et cofacteurs a été utilisée chez des individus atteints de troubles mitochondriaux, bien qu'une revue systématique récente ait mis en évidence le manque de preuves justifiant leur utilisation (Chinnery P, Majamaa K, Tumbull D, Thorburn D. Treatment for mitochondrial disorders. Cochrane Database Syst Rev. 2006 Jan 25;(1):CD004426. Review. Update in: Cochrane Database Syst Rev. 2012;4:CD004426). La lévocarnitine, la créatine monohydrate, le coenzyme Qio, les vitamines B et des antioxydants, tels que l'acide lipoïque alpha, la vitamine E et la vitamine C, ont été utilisés comme compléments mitochondriaux.

Ainsi, des thérapies à base de vitamines et cofacteurs peuvent être proposées dans le but de fortifier les fonctions mitochondriales. Cependant, il n'y a pas eu d'études formelles sur l'utilisation de ces vitamines et cofacteurs pour la maladie d'Alpers ou d'autres maladies liées au gène POLG (Parkih S, Saneto R, Falk MJ, Anslem I, Cohen BH, Haas R. A modem approach to the treament of mitochondrial diseases. Current Treatment Options in Neurology. 2009;11:414^430). Il a également été rapporté que l'emploi de la lévo-arginine aide à réduire la fréquence et la sévérité des accidents vasculaires cérébraux associés au syndrome MELAS et pourrait être considéré chez les patients atteints de maladies liées à POLG, en particulier si une carence dans le plasma ou une concentration d'arginine dans le liquide céphalorachidien est confirmé.

Le recours à des traitements de l'épilepsie réfractaire tels que la corticotropine ou la prednisone, le régime cétogène et les immunoglobulines G intraveineuses n'a pas été démontré être efficace pour le traitement de l'AHS.

Une transplantation du foie chez les adultes souffrant de l'AHS et possédant une qualité de vie acceptable peut être bénéfique. Toutefois, la transplantation du foie n'est pas conseillée pour les enfants, celle-ci n'ayant pas d'effet sur la progression rapide de l'atteinte neurologique (Kelly DA. Liver transplantation: to do or not to do? Pediatr Transplant. 2000;4:170-2).

Le clofilium tosylate est un agent antiarythmique de classe III dont le mécanisme d'action repose sur le blocage des canaux potassium, augmentant ainsi la durée des potentiels d'action cardiaque (US 4 289 787).

L'Ibutilide est un agent antiarythmique de classe III commercialisé sous le nom de Corvert (sous forme de fumarate d'ibutilide) par Pfizer. Ce médicament est utilisé pour la réduction rapide de la fibrillation ou du flutter auriculaire en rythme sinusal. Il agit en retardant la repolarisation par activation d'un courant lent entrant essentiellement sodique (EP 0 164 865).

Le Dofétilide est un antiarythmique de classe III commercialisé par Pfizer sous le nom Tikosyn. Il est prescrit pour la prise en charge des fibrillations et flutters auriculaires. Il agit en bloquant les canaux potassium (EP 0 245 997). L'un des buts de l'invention est de fournir des composés efficaces dans le traitement des maladies mitochondriales.

Un autre aspect de l'invention est de fournir des composés efficaces dans le traitement de pathologies résultant de mutations dans le gène POLG.

Un autre aspect de l'invention est de fournir des composés efficaces dans le traitement du syndrome MELAS.

L'un des avantages de l'invention est de fournir des composés efficaces chez l'adulte et chez l'enfant.

Un autre avantage de l'invention est de fournir des composés permettant un traitement curatif des maladies mitochondriales et ne se limitant pas à la gestion des symptômes des maladies mitochondriales.

La présente invention concerne un composé ayant la formule I

dans laquelle

Ri et Rr représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, notamment Cl ou Br, un groupe alcoxy en C1-C4, un gioupe alkyle en C1-C3 ou NHS0 ₂ Rô ₅ sous réserve qu'au moins l'un des deux éléments Ri ou Rr soit différent de H ;

R ₂ représente OH ou H ; R ₃ et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R ₇ représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou

R ₆ et Rg représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4 ;

— =— s ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque—X =— R5 ;

Rs représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4; m = 0 ou 1, sous réserve que m = 1 lorsque—X =— R ₅ et m = 0 lorsque —X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ; n= 0, 1, 2 ou 3 ;

Y ^" est un anion acceptable sur le plan thérapeutique; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

0 représente l'ensemble vide.

L'invention concerne en particulier un composé de formule I

dans laquelle

Rt et Rr représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, notamment Cl ou Br, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHSO2R6, sous réserve qu'au moins l'un des deux éléments Ri ou Rr soit différent de H;

R ₂ représente OH ou H ;

R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R? représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou

Râ et Rg représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4 ;

— X—— 5 ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque— X =— R5 ;

R ₅ représente un groupe alkyle en C1-C4; m = 0 ou 1, sous réserve que m = 1 lorsque— =— R5 et m = 0 lorsque—X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ; n= 0, 1 , 2 ou 3 ;

Y ^" est un anion acceptable sur le plan thérapeutique; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le composé de foi-mule I tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial, comporte un élément Y ^" choisi parmi l'ion tosylate, l'ion carbonate, l'ion phosphate et l'ion chlorure.

Avantageusement, l'invention concerne un composé de formule I tel que défini ci- dessus

formule dans laquelle :

Ri et Rr représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, Cl, Br, ou NHS0 ₂ R6, sous réserve qu'au moins l'un des deux éléments RI ou RI ' soit différent de H;

R2 représente OH ou H ;

R3 et représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R ₇ représente un atome d'halogène ou NHS0 ₂ R ₈ , sous réserve que R3 et R ₄ ne peuvent pas être simultanément

R ₆ et Rg représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4 ;

— X—— R5 ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque—X =— R5 ;

R ₅ représente un groupe alkyle en C1-C4; m = 0 ou 1, sous réserve que m = 1 lorsque — X =— R ₅ et m = 0 lorsque —X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ; n = 0, 1, 2 ou 3 ; Y ^" est choisi parmi l'ion tosylate, l'ion carbonate, l'ion phosphate et l'ion chlorure ; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

La présente invention concerne un composé ayant la formule la :

dans laquelle

Ri représente un atome d'halogène, notamment Cl ou Br, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHSO2R6;

R2 représente OH ou H ;

R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R7 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHS0 ₂ Rs ;

R ₆ et Rs représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4 ;

— X =— R5 ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque— X =— R5 ;

R ₅ représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4; m - 0 ou 1 , sous réserve que m ~ 1 lorsque -— χ =— R ₅ et m = 0 lorsque—X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ; n= 0, 1, 2 ou 3 ;

Y ^" est un anion acceptable sur le plan thérapeutique; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Les inventeurs ont trouvé de façon inattendue que l'application des composés de l'invention à des organismes atteints d'une maladie mitochondriale permettait une amélioration de leur état. Cette invention s'appuie notamment sur des résultats obtenus en appliquant les composés définis ci-dessus à des organismes mimant une maladie mitochondriale ou à des cultures cellulaires de fibroblastes cutanés d'un patient atteint d'une maladie mitochondriale ou à des cultures cellulaires de cybrides neuronaux dérivés d'un patient atteint d'une maladie mitochondriale.

Le terme « groupe alcoxy en Cx-Cy » signifie un groupe alkyle, possédant de x à y atomes de carbone, lié à un atome d'oxygène.

Le terme « groupe alkyle en Cx-Cy » signifie une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire ou branchée, comprenant de x à y atomes de carbone.

Par « X =— R.5 », on entend que l'aminé à laquelle est liée le groupe R ₅ est une aminé quaternaire et que dans ce cas i = + et m = 1, le composé étant alors sous forme de sel.

Par « X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison », on entend que l'aminé correspondante est une aminé tertiaire et que dans ce cas i = 0, m = 0 et (Y ^" )m ⁼ 0■

Par « aminé quaternaire », on entend que l'atome d'azote est chargé positivement, c'est- à-dire qu'il est sous forme de cation, et qu'il est substitué par 4 substituants. Au sens de la présente invention, l'un des substituants peut être l'atome d'hydrogène.

Par « aminé tertiaire », on entend que l'atome d'azote est substitué par 3 substituants.

Par « anion acceptable sur le plan thérapeutique », on entend tout anion non toxique et n'induisant pas une perte de l'effet thérapeutique ou prophylactique du cation auquel il est associé.

Par « instabilité de l'ADN mitochondrial », on entend la présence de toutes mutations, délétions et/ou déplétions de l'ADN mitochondrial par rapport à l'ADN mitochondrial d'un individu sain. Au sens de la présente invention, on entend par « maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial » les maladies liées à l'aspect quantitatif de l'instabilité de l'ADN mitochondnal et les maladies liées à l'aspect qualitatif de l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Par « maladies liées à l'aspect quantitatif de l'instabilité de l'ADN mitochondrial », on entend les maladies liées à une déplétion de l'ADN mitochondrial. Cette déplétion peut notamment être due à une ou des mutations présentes dans le gène POLG, un gène nucléaire codant pour la polymérase POLG spécifique à l'ADN mitochondrial.

Par « déplétion de l'ADN mitochondrial », on entend une réduction du nombre de copies de molécules d'ADN mitochondrial dans les mitochondries d'un organisme par rapport à un organisme sain, Les déplétîons sont tissu spécifiques.

Par « maladies liées à l'aspect qualitatif de l'instabilité de l'ADN mitochondrial », on entend les maladies dont la cause réside en la présence de délétions et/ou de mutations dans l'ADN mitochondrial.

L'expression « délétion de l'ADN mitochondrial» signifie une perte de matériel génétique dans l'ADN mitochondrial par rapport à un ADN mitochondrial sauvage. Une délétion peut concerner un ou plusieurs nucléotides, notamment plusieurs centaines de nucléotides, de l'ADN mitochondrial.

L'expression « mutation de l'ADN mitochondrial » signifie une modification de l'ADN mitochondrial par rapport à un ADN mitochondrial sauvage. Les mutations regroupent les mutations par substitution, les mutations par insertion et les mutations par délétion de petite taille (de 1 à 10 nucléotides). Le terme « mutation par substitution » signifie le remplacement d'un ou plusieurs nucléotides par un nucléotide différent dans la molécule d'ADN mitochondrial. Le terme « mutation par insertion » signifie l'addition d'un ou de plusieurs nucléotides dans la molécule d'ADN mitochondrial.

Les maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial comprennent notamment, sans y être limitées, le syndrome d'Alpers-Huttenlocher les (AHS), le spectre des myo-cérébro- hépatopathies de l'enfant (MCHS), les épilepsies myocloniques avec myopathie et ataxie sensitive MEMSA (Myoclonic epilepsy myopathy sensory ataxia), P ataxie spinocérébelleuse avec épilepsie (SCAE), les ataxies avec neuropathies incluant les syndromes MIRAS et SANDO, l'ophtalmoplégie externe progressive autosomique récessive (arPEO), l'ophtalmoplégie externe progressive autosomique dominante (adPEO), l'encéphalomyopathie mitochondriale neirrogastrointestinale (MNGIE), la myopathie infantile et amyotrophie spinale liées aux mutations de TK2, les insuffisances hépatiques avec déplétion de l'ADNmt, les pathologies associées aux mutations des gènes SUCLA2 et SUCLAGl, RRM2B, AIFl, MPVl 7, la neuropathie optique héréditaire de Leber, le syndrome MELAS, le syndrome MERRF, ainsi que certaines formes du syndrome de Leigh, d'ophtalmoplégie externe progressive chronique, de myopathie, de cardiomyopathie, de diabète-surdité, d'encéphalomyopathie, et de surdité.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le composé de formule la tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial, comporte un élément Y ^" choisi parmi l'ion tosylate, l'ion carbonate, l'ion phosphate et l'ion chlorure.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, de formule la :

dans laquelle

Ri représente Cl, Br, ou NHS0 ₂ R6;

R ₂ représente OH ou H ;

R ₃ et Rit représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R ₇ représente un atome d'halogène ou NHSChRs, sous réserve que R3 et R ₄ ne peuvent pas être simultanément

Re et Rg représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4 ;

— X =— ₅ ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque—X =— R ₅ ;

R ₅ représente un groupe alkyle en C1-C4;

m = 0 ou 1, sous réserve que m = 1 lorsque —X =— R ₅ et m = 0 lorsque —X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ;

n = 0, 1, 2 ou 3 ;

Y ^" est choisi parmi l'ion tosylate, l'ion carbonate, l'ion phosphate et l'ion chlorure ;

pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, de formule Iaa :

dans laquelle

R ₂ représente OH ou H ;

R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R7 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHSO2R* ;

Rg représente un groupe alkyle en C1-C4 ;

— X—— R5 ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque— X—— R ₅ ;

R ₅ représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4; m = 0 ou 1, sous réserve que m = 1 lorsque— X =— R5 et m = 0 lorsque—X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ; n= 0, 1, 2 ou 3 ;

Y ^" est un anion acceptable sur le plan thérapeutique; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, de formule lab :

dans laquelle

R ₂ représente OH ou H ;

R ₃ et R ₄ représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R ₇ représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHSOaRs ;

R ₈ représente un groupe alkyle en C1-C4 ;

— X =— R5 ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque— =— R ₅ ;

R ₅ représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4; m = 0 ou 1, sous réserve que m = 1 lorsque— X =— R ₅ et m = 0 lorsque—X = le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ; n= 0, 1, 2 ou 3 ;

Y ^" est un anion acceptable sur le plan thérapeutique; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule Ib

dans laquelle

Ri représente un atome d'halogène, notamment Cl ou Br, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHS0 ₂ R6;

R2 représente OH ou H ; R.3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R7 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHS0 ₂ Rs ;

R ₆ et Rs représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4 ;

— X =— R ₅ ou le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison, sous réserve que i = + lorsque—X =— R5 ;

R ₅ représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4; m = 0 ou 1, sous réserve que m = 1 lorsque — X =— Rs et m 0 lorsque —X— le doublet électronique de l'azote non engagé dans une liaison ; n = 0, 1 , 2 ou 3 ;

Y ^" est un anion acceptable sur le plan thérapeutique; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de ADN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule le

dans laquelle Ri et Rr représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, notamment Cl ou Br, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHSO2R6, sous réserve qu'au moins l'un des deux éléments Ri ou Rr soit différent de H;

R2 représente OH ou H ;

R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R7 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyle en C1-C3 ou NHSO2R8 ;

R ₆ et Rs représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4 ; n ^™ 0, 1, 2 ou 3 ; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Le groupement aminé supportant les groupes R ₃ et R ₄ du composé de formule le est une aminé tertiaire.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule Id

dans laquelle Ri et Rr représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, notamment Cl ou Br, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyie en C1-C3 ou NHSO ₂ R6, sous réserve qu'au moins l'un des deux éléments Ri ou Rr soit différent de H;

R ₂ représente OH ou H ;

R3 et R représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyie de 1 à 10 atomes de

carbone ou où R ₇ représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alcoxy en C1-C4, un groupe alkyie en C1-C3 ou NHSO2R8 ;

Re et Rs représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyie en C1-C4 ; Rs représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyie en Cs-C ₄ ; n = 0, 1, 2 ou 3 ;

Y ^" est un anion acceptable sur le plan thérapeutique; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Le groupement aminé supportant les groupes R ₃ , R4 et Rs du composé de formule Id est une aminé quaternaire.

Dans un mode de réalisation avantageux, le composé de l'invention tel que défini ci- dessus a pour formule (a) :

Le composé de formule (a) est le clofilium tosylate,

le composé de formule :

étant l'ion tosylate.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, le composé de l'invention tel que défini ci-dessus a pour formule (b) :

Le composé de formule (b) est le Dofétilide.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, le composé de l'invention tel que défini ci-dessus a pour formule (c):

Le composé de formule (c) est l'Ibutilide.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration à une dose de 1 μg kg à 50 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration à une dose de 1 à 50 μg/kg, de 50 à 500 μg/kg, de 500 μg à 5 mg/kg, ou de 5 à 50 mg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 1 à 12 μg/kg, de 12 à 20 μg/kg, de 20 à 50 μg/kg, de 20 à 300 μ^, de 50 à 300 μg/kg, de 300 à 500 μg/kg , de 500 μg/kg à 1 mg/lcg, de 1 à 5 mg/kg, de 5 à 30 mg/kg , ou de 30 à 50 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 30 g à 6000 mg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Au sens de la présente invention, on entend par « dose unitaire » la dose correspondant à la dose totale du composé prise en une seule fois, quel que soit le mode d'administration du composé.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 30 à 500 μg, de 500 μg à 2,5 mg, de 2,5 à 60 mg, de 60 à 150 mg, ou de 150 à 6000 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 30 à 150 g, de 150 à 300 μg, de 300 à 500 μg, de 500 μg à 1 mg, de 1 à 2,5 mg, de 2,5 à 30 mg, de 30 mg à 60 mg, de 150 à 2500 mg, de 2500 à 4500 mg ou de 4500 à 6000 mg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie orale à une dose de 1 μ§/¾¾ à 50 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie orale à une dose de 1 à 50 μg/kg, de 50 à 500 μg kg, de 500 μg/kg à 5 mg/kg, ou de 5 à 50 mg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 1 à 20 g/kg, de 20 à 50 μ^, de 50 à 300 μg/kg _î de 300 à 500 μg/kg, de 500 μg/kg à 1 mg/kg, de 1 à 5 mg/kg, de 5 à 30 mg/kg, ou de 30 à 50 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 30 μg à 6000 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 30 à 500 μg, de 500 μg à 60 mg, ou de 60 mg à 6000 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 30 à 125 μg, de 125 à 300 μg, de 300 à 500 g, de 500 μg à 1,5 mg, de 1,5 à 25 mg, de 25 à 60 mg, de 60 à 500 mg, de 500 à 2000 mg, ou de 2000 à 6000 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 1 g kg à 50 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 1 à 20 μg/kg, de 20 à 500 μg/kg, de 500 g/kg à 5 mg/kg, ou de 5 à 50 mg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 1 à 12 ^, de 12 à 20 de 20 à 50 μg/kg, de 20 à 150 μg/kg ₅ de 50 à 300 μg/kg, de 300 à 500 g/kg, de 500 μg/kg à 1 mg kg, de 1 à 5 mg/kg, de 5 à 30 mg/kg, ou de 30 à 50 mg kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 30 μg à 6000 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 30 à 500 μg, de 500 μ à 30 mg, de 30 à 150 mg, ou de 150 à 6000 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 30 à 150 μg, de 150 à 500 μg, de 500 μg à 1,5 mg, de 1,5 à 30 mg, de 30 à 60 mg, de 60 à 150 mg, de 150 à 1000 mg, de 1000 à 2500 mg, ou de 2500 à 6000 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration à une dose de 0,1 \xgikg à 5 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration à une dose de 0,1 à 5 μg kg, de 5 à 50 μg kg, de 50 μg/kg à 0,5 mg/kg, ou de 0,5 à 5 mg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 0,1 à 1,2 μ%^, de 1,2 à 2 μg/kg _J de 2 à 5 g/kg _î de 2 à 30 μg/kg, de 5 à 30 μg/kg, de 30 à 50 μg/kg , de 50 μg/kg à 100 μg/kg, de 100 à 500 μg/kg, de 500 μg/kg à 3 mg/kg , ou de 3 à 5 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 3 μg à 600 mg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 3 à 50 μg, de 50 μg à 250 μg, de 250 μg à 6 mg, de 6 à 15 mg, ou de 15 à 600 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 3 à 15 μg, de 15 à 30 μg _; de 30 à 50 μg, de 50 μg à 0,1 mg, de 0,1 à 0,25 mg, de 0,25 à 3 mg, de 3 mg à 6 mg, de 15 à 250 mg, de 250 à 450 mg ou de 450 à 600 mg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie orale à une dose de 0,1 μg/kg à 5 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de foi-mule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie orale à une dose de 0, 1 à 5 μg/kg, de 5 à 50 μg kg, de 50 μg/kg à 0,5 mg/kg, ou de 0,5 à 5 mg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 0,1 à 2 μg/kg, de 2 à 5 μg/kg, de 5 à 30 μg kg, de 30 à 50 g/kg, de 50 μg/kg à 100 μg/kg, de 100 μg/kg à 500 μg/kg, de 500 μg/kg à 3 mg/kg, ou de 3 à 5 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 3 μg à 600 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 3 à 50 μg, de 50 μg à 6 mg, ou de 6 mg à 600 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 3 à 12,5 μg, de 12,5 à 30 μg, de 30 à 50 μg, de 50 μg à 150 μg, de 150 μg à 2,5 mg, de 2,5 à 6 mg, de 6 à 50 mg, de 50 à 200 mg, ou de 200 à 600 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 0,1 g/kg à 5 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 0,1 à 2 μg/kg, de 2 à 50 μg/kg, de 50 μg kg à 0,5 mg/kg, ou de 0,5 à 5 mg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 0,1 à 1,2 μg/kg _} de 1,2 à 2 g/kg, de 2 à 5 g/kg, de 2 à 15 μ©¾¾, de 5 à 30 μg kg, de 30 à 50 g/kg, de 50 μg kg à 100 μg/kg, de 100 à 500 μg/kg, de 500 μg/kg à 3 mg/kg, ou de 3 à 5 mg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 3 μg à 600 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 3 à 50 ig, de 50 μg à 3 mg, de 3 à 15 mg, ou de 15 à 600 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 3 à 15 μg, de 15 à 50 g, de 50 g à 0,15 mg, de 0,15 à 3 mg, de 3 à 6 mg, de 6 à 15 mg, de 15 à 100 mg, de 100 à 250 mg, ou de 250 à 600 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation encore plus particulier, l'invention concerne un composé de formule (a) :

pour une administration par voie orale à une dose de 50 à 500 μg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), pour une administration par voie orale à une dose de 50 à 300 g/kg, ou de 300 à 500 encore plus particulièrement à une dose de 50 à 100 ^ kg, de 100 à 200 μg kg, de 200 à 300 μg kg, de 300 à 400 £ 1¾ ou de 400 à 500 §/1¾ pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a) :

se présentant sous forme de dose unitaire de 1,5 mg à 60 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), se présentant sous forme de dose unitaire de 1,5 à 25 mg ou de 25 à 60 mg, encore plus particulièrement de 1,5 à 8 mg, de 8 à 15 mg, de 15 à 25 mg, de 25 à 35 mg, de 35 à 60 mg, de 35 à 45 mg, ou de 45 à 60 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a) :

pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 20 à 250 g kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 20 à 150 μg/kg ou de 150 à 250 μg kg, encore plus particulièrement à une dose de 20 à 50 μg kg _; de 50 à 100 μg kg, de 100 à 150 μg/kg, de 150 à 200 μg kg _î ou de 200 à 250 μg kg _; pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a) :

se présentant sous forme de dose unitaire de 0,5 mg à 30 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), se présentant sous forme de dose unitaire de 0,5 mg à 12 mg ou de 12 à 30 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 0,5 à 4 mg, de 4 à 8 mg, de 8 à 12 mg, de 12 à 16 mg, de 16 à 30 mg, de 16 à 20 mg ou de 20 à 30 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a) :

pour une administration par voie orale à une dose de 5 à 50 g kg _î pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), pour une administration par voie orale à une dose de 5 à 30 μ /kg, ou de 30 à 50 g kg, encore plus particulièrement à une dose de 5 à 10 g/kg, de 10 à 20 μg kg, de 20 à 30 g/kg, de 30 à 40 pg/kg ou de 40 à 50 μg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), se présentant sous forme de dose unitaire de 150 μg à 6 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial. Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), se présentant sous forme de dose unitaire de 150 μg à 2,5 mg ou de 2,5 à 6 mg, encore plus particulièrement de 150 μg à 800 pg, de 800 pg à 1,5 mg, de 1,5 à 2,5 mg, de 2,5 à 3,5 mg, de 3,5 à 6 mg, de 3,5 à 4,5 mg, ou de 4,5 à 6 mg, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 2 à 25 pg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 2 à 15 pg/kg ou de 15 à 25 pg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 2 à 5 pg kg, de 5 à 10 pg/kg, de 10 à 15 pg/kg, de 15 à 20 pg/kg, ou de 20 à 25 pg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), se présentant sous forme de dose unitaire de 50 pg à 3 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (a), se présentant sous forme de dose unitaire de 50 pg à 1,2 mg ou de 1,2 à 3 mg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 50 pg à 400 pg, de 400 à 800 pg, de 800 pg à 1,2 mg, de 1,2 à 1,6 mg, de 1,6 à 3 mg, de 1,6 à 2 mg ou de 2 à 3 mg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (b) :

se présentant sous forme de dose unitaire de 125 à 500 μg deux fois par jour, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (b), se présentant sous forme de dose unitaire de 125 à 300 g ou de 300 à 500 μg deux fois par jour, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 125 à 200 μ&, de 200 à 300 ig, de 300 à 400 μg, ou de 400 à 500 μg deux fois par jour, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (b) :

se présentant sous forme de dose unitaire de 12,5 à 50 g, pour une administration par voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (b), se présentant sous forme de dose unitaire de 12,5 à 30 μg ou de 30 à 50 g, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 12,5 à 20 μg, de 20 à 30 μg, de 30 à 40 μg, ou de 40 à 50 μg ₃ pour une administration par- voie orale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (c) :

pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 5 μg kg à 20 μg kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (c), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 5 à 12 μg kg ou de 12 à 20 μg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 5 à 8 μg/kg, de 8 à 12 μg kg _; de 12 à 16 μg/kg _t ou de 16 à 20 μg/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (c) :

se présentant sous forme de dose unitaire de 150 x à 2500 μg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial. Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (c), se présentant sous forme de dose unitaire dé 150 à 1000 μg ou de 1000 à 2500 μg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 150 à 650 μg, de 650 à 1000 de 1000 à 1500 ig, de 1500 à 2500 ig, de 1500 à 2000 μ& ou de 2000 à 2500 ¾ pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un composé de formule (c) :

pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 0,5 μg/kg à 2 pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (c), pour une administration par voie intraveineuse à une dose de 0,5 à 1,2 μg/l g ou de 1,2 à 2 μg/kg, encore plus particulièrement à une dose de 0,5 à 0,8 μg kg _; de 0,8 à 1,2 μg kg, de 1,2 à 1,6 μg/kg, ou de 1,6 à 2 g/kg, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 15 μg à 250 μg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Plus particulièrement, l'invention concerne un composé de formule (c), se présentant sous forme de dose unitaire de 15 à 100 μg ou de 100 à 250 μg, encore plus particulièrement se présentant sous forme de dose unitaire de 15 à 65 μg, de 65 à 100 μg, de 100 à 150 μg, de 150 à 250 μg, de 150 à 200 g, ou de 200 à 250 μg, pour une administration par voie intraveineuse, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial. Avantageusement, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), se présentant sous forme de solution injectable, sirop, suspension, poudre, gélule, comprimé, pastille, granule, pilule ou suppositoire, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ÀDN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé de formule (a), (b) ou (c), pour une administration par voie orale, se présentant sous forme de sirop, suspension, poudre, gélule, comprimé, pastille, granule ou pilule, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial.

Avantageusement, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à au moins une mutation, ou à au moins une délétion ou à au moins une insertion, ou à une combinaison de ces éléments, dans le gène POLG.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un composé tel que défini ci- dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à l'instabilité de l'ADN mitochondrial non liées aux mutations du gène POLG.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à une déplétion ou une délétion de l'ADN mitochondrial.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à une mutation ponctuelle de l'ADN mitochondrial.

Dans un mode de réalisation encore plus particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention

- de maladies associées à des anomalies quantitatives ou qualitatives de l'ADN mitochondrial telles que la maladie d'Alpers (AHS), le spectre des myo-cérébro-hépatopathies de l'enfant (MCHS), les épilepsies myocloniques avec myopathie et ataxie sensitive MEMSA (Myoclonic epilepsy myopathy sensory ataxia), P ataxie spinocérébelleuse avec épilepsie (SCAE), les ataxies avec neuropathies incluant les syndromes MIRAS et SANDO, l'ophtalmoplégie externe progressive autosomique récessive (arPEO), Pophtalmoplégie externe progressive autosomique dominante (adPEO), l'encéphalo myopathie mitochondriale neurogastrointestinale (MNGIE), le syndrome de Pearson, le syndrome de Keams-Sayre, la myopathie infantile et l'amyotrophie spinale liées au mutations de TK2, les insuffisances hépatiques avec dépiétion de PADNmt, les pathologies associées aux mutations des gènes SUCLA2 et SUCLAGI, RRM2B, AIFI, MPV17, ou

- des maladies associées à des mutations ponctuelles de l'ADN mitochondrial telles que la neuropathie optique héréditaire de Leber, du syndrome MELAS, du syndrome MER P, et certaines formes de syndrome de Leigh, d'ophtalmoplégie externe progressive chronique, de myopathie, de cardiomyopathie, de diabète-surdité, d'encéphalomyopathie et de surdité.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à au moins une mutation, ou à au moins une délétion ou à au moins une insertion, ou à une combinaison de ces éléments, dans le gène POLG, lesdites maladies comprenant la maladie d'Alpers (AHS), le spectre des myo-cérébro-hépatopathies de l'enfant (MCHS), les épilepsies myocloniques avec myopathie et ataxie sensitive MEMSA (Myoclonic epilepsy myopathy sensoryataxia), les ataxies spinocérébelleuses avec épilepsie (SCAE), les ataxies avec neuropathies incluant les syndromes MIRAS et SANDO, l'ophtalmoplégie externe progressive autosomique récessive (arPEO) et l'ophtalmoplégie externe progressive autosomique dominante (adPEO).

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à une dépiétion ou une délétion de l'ADN mitochondrial, lesdites maladies comprenant l'ophtalmoplégie externe progressive autosomique récessive, Pencéphalomyopathie mitochondriale neurogastiOintestinaie, le syndrome de Pearson, le syndrome de Keams-Sayre, la myopathie infantile et l'amyotrophie spinale liées aux mutations de TK2, les insuffisances hépatiques avec dépiétion de l'ADNmt, les pathologies associées aux mutations des gènes SUCLA2 et SUCLAGI, RRM2B, AIFI, MPV17 et l'ophtalmoplégie externe progressive autosomique dominante.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies liées à une mutation ponctuelle de l'ADN mitochondrial, lesdites maladies comprenant la neuropathie optique de Leber, le syndrome MELAS, le syndrome MERRF, et certaines formes de syndrome de Leigh, d'ophtalmoplégie externe progressive chronique, de myopathie, de cardiomyopathie, de diabète-surdité, d'encéphalomyopathie et de surdité.

Dans un mode de réalisation encore plus particulier, l'invention concerne un composé tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du syndrome MELAS.

Le syndrome MELAS (Mitochondrial Encephalopathy Lactic Acidosis Stroke) est une mitochondropathie due le plus fréquemment à une mutation A3243 G dans TARNt ^Leu de l'ADN mitochondrial. La maladie débute le plus souvent dans l'enfance ou chez les jeunes adultes. Chez les sujets atteints de ce syndrome, il existe souvent des symptômes chroniques comme une myocardiopathie, une surdité, un diabète, une petite taille, une faiblesse musculaire, un retard mental, des troubles de l'apprentissage, de la mémoire ou de l'attention. Pour les formes MELAS les plus sévères, des accidents vasculaires à répétition sont également responsables d'atteintes neurologiques graves. Les patients atteints du syndrome MELAS présentent une hyperlactacidémie dans leur sang, c'est-à-dire une augmentation du lactate, dû au dysfonctionnement mitochondrial et au déficit énergétique qui en découle. On observe également chez les individus atteints du syndrome MELAS une réduction significative de l'activité du complexe I, qui est la première enzyme de la chaîne respiratoire mitochondriale. Il est ainsi attendu qu'un médicament efficace pour le traitement du syndrome MELAS augmente l'activité du complexe I et réduise la production de lactate (par augmentation de la production énergétique) chez le patient.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : La figure 1 représente la densité optique (D0 ₆ oo) d'une culture cellulaire de levure Saccharomyces cerevisiae mutante dans le gène MIP1 (mipî ^G65IS ) après 24 heures de culture en fonction de la concentration de clofilium tosylate ajoutée au milieu de culture.

Figure 2 : La figure 2 représente la fréquence, en pourcentage, de production de colonies petite de la souche de levure mipl ^G65ls en présence (CLOF) et absence (DMSO) de clofilium tosylate 32 μΜ dans le milieu de culture. Figure 3 : La partie A représente la fréquence, en pourcentage, de production de colonies petite des mutants mipl récessifs.

La partie B représente la réduction du nombre de colonies petite en présence de clofilium tosylate 32 μΜ comparée au nombre de cellules non traitées (cellules en présence de DMSO) chez les mutants mipl récessifs.

La pattie C représente la fréquence, en pourcentage, de production de colonies petite des mutants mipl dominants.

La partie D représente la réduction du nombre de colonies petite en présence de clofilium tosylate 32 μΜ comparée au nombre de cellules non traitées (cellules en présence de DMSO) chez les mutants mipl dominants.

Figure 4 : La figure 4 représente le nombre de colonies résistantes à l'é ythromycine (Ery ^R ) sur le nombre total de colonies (fréquence des cellules résistantes à l'érythromycine) des mutants mipl récessifs en absence (DMSO) et en présence (CLOF) de clofilium tosylate 32 μΜ.

Figure 5 : La figure 5 représente la fréquence, en pourcentage, de production de colonies petite, chez les souches de levures mipl ^G65ls , mipl ^G651s Asmll, mipl ^A692T et mipl ^Â692T Asmll, en présence de clofilium tosylate 32 μΜ (gris foncé) ou en absence de clofilium tosylate (présence de DMSO, gris clair).

Figure 6 : La figure 6 représente la vitesse de consommation de dioxygène (V0 ₂ ) en nmol/2xl0 ⁶ cellules/min chez des levures exprimant le gène sauvage MIPl ou le gène muté mipl ^G65ÎS , en présence (CLOF) ou en absence (DMSO) de clofilium tosylate 32 μΜ.

Figure 7 : La figure 7 représente l'analyse par électrophorèse sur gel SDS/PAGE des fractions protéiques mitochondriales des cellules de levure cultivées en présence (CLOF, +) ou en absence (DMSO, -) de clofilium tosylate 32 μΜ. Les protéines étudiées sont la protéine Mipl- HA, la protéine Mipl G651S-HA (analyse sur gel SDS/PAGE 6%), la protéine mitochondriale Cox2 et la porine (analyse sur gel SDS/PAGE 10%). Les protéines après séparation sont transférées sur membrane de nitrocellulose puis révélées par détection de l'activité peroxydase ECL ^Pil,s à l'aide d'anticorps primaires et d'anticorps secondaires couplés à la horseradish peroxydase (HRP). La bande marquée d'une * est une réaction non spécifique de l'anticorps anti-HA. Figure 8 : La figure 8 représente le pourcentage de nématode Caenorhabditis elegans aux stades Ll à L3 et au stade L4- Adulte par rapport au nombre total de nématodes chez une lignée sauvage (N2) et chez une lignée mutée TB2143 (polg-1 (okl548A/+)) portant une délétion hétérozygote de 2149 bp dans la séquence codante du gène polg-1, en fonction de la concentration en clofilium tosylate contenue dans le milieu de culture des nématodes (boîtes NGM).

Figure 9 : La figure 9 représente le pourcentage de larves de nématode TB2143 (polg- l(okl548A/+)) haploinsuffisants élevées sur des boîtes NGM contenant 30 μg/mL de bromure d'éthidium dont le développement s'est arrêté au stade L3 selon l'absence (DMSO) ou la présence (CLOF) de clofilium tosylate 50 μΜ dans les boîtes.

Figure 10 : La figure 10 représente la courbe dose-réponse du clofilium tosylate sur la résistance des nématodes TB2143 haploinsuffisants (polg-l(okl 548A/+)) au bromure d'éthidium : le pourcentage de larves L3 (arrêt du développement) est représenté en fonction de la concentration de clofilium tosylate contenue dans les boîtes NGM des nématodes comprenant 30 μg/mL de bromure d'éthidium.

Figure 11 : La figure 11 représente la courbe dose-réponse de la quinidine sur la résistance des nématodes TB2143 haploinsuffisants (polg-l(okl548A/+)) au bromure d'éthidium : le pourcentage de larves L3 (arrêt du développement) est représenté en fonction de la concentration de quinidine contenue dans les boîtes NGM des nématodes comprenant 30 μg/mL de bromure d'éthidium.

Figure 12 : La partie A représente le nombre d'œufs pondus par des nématodes homozygotes TB2143 (polg-1 (Δ/Δ)) en absence (DMSO) ou en présence (CLOF) de clofilium tosylate 50 μΜ dans les boîtes NGM des nématodes.

La partie B représente le nombre de larves, donc d'éclosions des œufs pondus, par 5 nématodes homozygotes TB2143 (polg-1 (Δ/Δ)) en absence (DMSO) ou en présence (CLOF) de clofilium tosylate 50 μΜ dans les boîtes NGM des nématodes. Figure 13 : La figure 13 représente le pourcentage de nématodes TB2143 homozygotes (polg- 1 (okl 548Δ/Δ)) morts et présentant une extrusion de l'intestin et/ou des gonades au 7 ^ème jour de l'adulte en absence (DMSO) et en présence (CLOF) de clofilium tosylate 50 μΜ.

Figure 14 : La figure 14 représente le pourcentage d'ADNmt des nématodes TB2143 homozygotes (polg-l(okl548A/A)) par rapport à la souche de référence N2 en présence de DMSO et en présence de clofilium tosylate 50 μΜ.

Figure 15 : La figure 15 représente l'index cellulaire, représentatif de la viabilité des cellules, de fibroblastes humains cultivés avec différentes concentrations de clofilium tosylate en fonction du temps.

La paitie A représente l'index cellulaire des fibroblastes contrôles.

La partie B représente l'index cellulaire de fibroblastes d'un patient ayant une mutation sur chaque allèle du gène POLG.

Figure 16 : La figure 16 représente le ratio de la quantité d'ADNmt sur la quantité d'ADN nucléaire (ADNnu) chez les fibroblastes contrôles et les fibroblastes d'un patient présentant une mutation sur chaque allèle du gène POLG cultivés en absence (DMSO) et en présence (CLOF) de clofilium tosylate 2,5 μΜ.

Figure 17 : La figure 17 représente le pourcentage de déplétion de l'ADNmt de fibroblastes cutanés d'un patient présentant une mutation sur chaque allèle du gène POLG comparé à la quantité d'ADNmt de fibroblastes cutanés contrôles, cultivés en milieu quiescent en absence de tout traitement (NT) ou en présence de DMSO (DMSO) ou présence de clofilium tosylate 1 μΜ (CLOF) en fonction du temps.

Figure 18 : La figure 18 représente le pourcentage de nématodes haploinsuffisants TB2143 (po!g-l(okl548A/+)) au stade adulte et au stade de développement L4 après 4 jours d'élevage sur des boîtes NGM supplémentées avec 30 μg/mL de bromure d'éthidium et différentes concentrations de clofilium tosylate ou du DMSO.

Figure 19 : La figure 19 représente le pourcentage de nématodes haploinsuffisants TB2143 (polg-l(okl548A/+)) au stade adulte et au stade de développement L4 après 4 jours d'élevage sur des boîtes NGM supplémentées avec 30 μ§/ιχ)Ι, de bromure d'éthidium et différentes concentrations d'Ibutilide hemifuramate ou du DMSO.

Figure 20 : La figure 20 représente le pourcentage de nématodes haploinsuffisants TB2143 (polg-l(okl548A/+)) au stade adulte et au stade de développement L4 après 4 jours d'élevage sur des boîtes NGM supplémentées avec 30 μξ/ητΐ, de bromure d'éthidium et du clofilium tosylate 50 μΜ, ou différentes concentrations de Dofétilide ou du DMSO.

Figure 21 : La partie A représente la fréquence du nombre de colonies petite en présence de clofilium tosylate 32 μΜ (gris foncé) comparée à la fréquence du nombre de colonies petite de cellules non traitées (DMSO, gris clair) chez le mutant Âfisl.

La partie B représente la fréquence du nombre de colonies petite en présence de clofilium tosylate 32 μΜ (gris foncé) comparée à la fréquence du nombre de colonies petite de cellules non traitées (DMSO, gris clair) chez le mutant mipl ^G807R ainsi que la fréquence calculée (attendu) et celle observée chez le double mutant mipl ^G807R Âfisl.

La partie C représente la fréquence du nombre de colonies petite en présence de clofilium tosylate 32 μΜ (gris foncé) comparée à la fréquence du nombre de colonies petite de cellules non traitées (DMSO, gris clair) chez le mutant mipl ^G651s ainsi que la fréquence calculée (attendu) et celle observée chez le double mutant mipl ^G651s Âfisl.

Figure 22 : La figure 22 représente l'effet du clofilium tosylate sur le ratio des activités du complexe I / citrate synthase et la production de lactate de cybrides neuronaux dérivés d'un patient MELAS (m.3243 A>G tRNA ^Ieu mutation).

La partie A représente le ratio des activités complexe I /citrate synthase, en pourcentage par rapport au contrôle, après traitement des cybrides neuronaux avec du DMSO (contrôle) ou 300 nM (CT 300nM) de clofilium tosylate, après 48 heures de traitement. N= 4. CS = citrate synthase,

La partie B représente la production de lactate, en pourcentage par rapport au contrôle, par les cybrides neuronaux après traitement des cybrides neuronaux avec du DMSO (contrôle) ou 300 nM (CT 300nM) de clofilium tosylate pendant 48 heures. N= 4. Figure 23 : La figure 23 représente l'effet dose de l'ibutilide sur le ratio des activités du complexe I / citrate synthase et la production de lactate des cybrides neuronaux dérivés d'un patient MELAS (m.3243A>G tRNA ^leu mutation).

La partie A représente le ratio des activités complexe I /citrate synthase, en pourcentage par rapport au témoin, après traitement des cybrides neuronaux avec du DMSO (Témoin), ou 1 μΜ (ibu luM) ou 300 nM (ibu 300 nM) d'ibutilide pendant 48 heures. 1S 4. CS = citrate synthase. La partie B représente la production de lactate, en pourcentage par rapport au témoin, par les cybrides neuronaux après traitement des cybrides neuronaux avec du DMSO (Témoin) ou 1 μΜ (ibu 1 μΜ) ou 300 nM (ibu 300nM) d'ibutilide pendant 48 heures. N= 4.

Figure 24 : La figure 24 représente l'analyse par électrophorèse sur gel SDS/PAGE des fractions protéiques d'extraits totaux de fibroblastes contrôles (contrôle) et de fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG (patient) en condition de prolifération cellulaire. Les fibroblastes sont cultivés en présence de DMSO 0,1% (D) ou avec 0,5 μΜ ou 1,0 μΜ de clofilium tosylate (CLO). Les protéines étudiées sont la protéine POLG (analyse sur gel SDS/PAGE 6%), les protéines mitochondriales ATP5B et TFAM ainsi que la protéine cytosolique TUB3A comme contrôle de charge.

Figure 25 : La figure 25 représente le pourcentage d'augmentation du nombre de copies d'ADNmt de fibroblastes cutanés d'un patient présentant une mutation sur chaque allèle du gène POLG comparé au nombre de copies d'ADNmt des fibroblastes du patient non traités (DMSO), cultivés en milieu quiescent en présence de DMSO (DMSO) ou en présence de différentes concentrations de clofilium tosylate : 0,5 μΜ (CLO 0.5), 1 μΜ (CLO 1), 2,5 μΜ (CLO 2.5), en fonction du nombre de jours de traitement (traitement de 18 jours).

EXEMPLES

Les exemples 1 à 14, 17 à 22 et 24 à 25 concernent le clofilium tosylate: les exemples 1 à 6 et 17 concernent la levure Saccharomyces cerevisiae, les exemples 7 à 11 et 20 concernent le nématode Caenorhabditis elegans, les exemples 12 à 14, 18, 19, 24 et 25 concernent les fibroblastes humains et l'exemple 22 concerne les cybrides neuronaux dérivés d'un patient MELAS (m.3243A>G tRNA ^îeti mutation). L'exemple 21 concerne la combinaison du clofilium tosylate avec le resvératrol et les fibroblastes humains. L'exemple 15 concerne l'Ibutilide et le nématode, l'exemple 23 concerne l'Ibutilide et les cybrides neuronaux dérivés d'un patient MELAS (m.3243A>G tRNA ^lcu mutation), l'exemple 16 concerne le Dofétilide et le nématode.

Matériel et méthodes

Les levures S. cerevisiae utilisées dans les exemples 1 à 6 et 17 sont des levures de fond génétique DWM-5A : Mat a ade2-l leiû-3, 112 ura3-l trpl-1 his3-ll, 15 canl-100 Amipl::KanR transformées par un plasmide mono-copie (ARS-CEN) pFL39 (TRP1) permettant l'expression des différents allèles de MIP1 (Baruffini, E., Lodi, T., Dallabona, C, Puglisi, A., Zeviani, M. and Ferrero, I. (2006) Genetic and Chemical rescue of the Saccharomyces cerevisiae phenotype induced by mitochondrial DNA polymerase mutations associated with progressive external ophtalmoplegia in humans. Hum. Mol. Genêt., 15, 2846 - 2855).

Les nématodes C. eîegans utilisés dans les exemples 7 à 11 et 15, 16 et 20 sont la lignée BRISTOL N2 sauvage, la lignée VC1224 (polg-l(okl548)/mTl II; +/mTl [dpy-10(el28)] II) du consortium Caenorhabditis Genetics Center (CGC), la lignée TB2143 (polg-l(okl548)/+ II; +/ min [dpy-10(el28) mlsl4] II) (A. Trifunovic, Allemagne) et la lignée DA631 (eat-3(ad426) II ; him-8(el489) IV) ( CGC).

Exemple 1 : Détermination de la concentration maximale de clofilium tosylate tolérée par la souche de levure Saccharomyces cerevisiae mipl ^G651s .

L'inhibition de croissance (MIC, Minimum Inhibitory Concentration) du clofilium tosylate sur la souche mipl ^G65]S est testée pour des concentrations de clofilium tosylate de 512 μΜ, 256 μΜ, 128 μΜ, 64 μΜ, 32 μΜ, 16 μΜ, 8 μΜ, 4μΜ, 2 μΜ, et 1 μΜ.

A partir d'une préculture o/n en milieu sélectif (SC-URA, 2% éthanol (v/v)), 50 mL de milieu riche YPD (1% Yeast Extract, 0,5% Bacto Peptone, 2% Glucose) sont ensemencés à une D0 ₆ oo de 0,05/mL. Ces 50 mL de culture sont répartis dans une série de dix tubes, à raison de 2 mL de culture / tube ₄ et 4 mL de culture sont déposés dans un dernier tube. Dans ce dernier tube (tube 1) est ajouté le clofilium tosylate à la concentration maximale : 512 μΜ (solubilité maximale). De ce tube 1, 2 mL de culture sont mis dans le tube 2. Le tube 2 contient 4 mL de culture et le clofilium tosylate à une concentration de 256 μΜ. 2 mL du tube 2 sont ajoutés au tube 3 et ainsi de suite. Chaque tube contient la drogue à une concentration égale à la moitié de celle du tube précédent. Deux contrôles sont effectués, sans clofilium tosylate et avec du DMSO (le volume étant le même que celui qui a servi à diluer le clofilium tosylate). Les cultures sont incubées à 28°C avec agitation pendant 24 heures et la densité optique (D(½o) est mésurée.

Les résultats sont présentés en Figure 1.

La concentration choisie de clofilium tosylate pour l'étude de son effet chez la levure S. cerevisiae est de 32 μΜ.

Exemple 2 : Effet du clofilium tosylate sur la production de colonies petite chez des souches mipl mutées de levure

Le taux de cellules petite dans une population représente les cellules ne respirant pas du fait de remaniements de l'ADNmt et/ou ayant perdu leur ADNmt.

2.1. Mode opératoire

A partir d'une préculture en milieu sélectif (SC-TRP, 2% éthanol (v/v)) de la souche mipl mutée, 2.10 ⁵ cellules/mL sont ensemencées dans 2 mL de milieu riche YPD (1% Yeast Extract, 0,5% Bacto Peptone, 2% Glucose) en présence de clofilium tosylate 32 μΜ ou de DMSO. Puis les cellules sont incubées à 28°C pendant deux cycles de 24 heures. Les cellules sont ensuite diluées pour avoir environ 200 à 250 cellules par boîte et étalées sur milieu synthétique différentiel (SC-TRP, 0,3% glucose, 2% éthanol). Le nombre de colonies petite est calculé après 6 jours d'incubation à 28°C (Baruffini, E., Lodi, T., Dallabona, C, Puglisi, A., Zeviani, M. and Ferrero, I. (2006) Genetic and Chemical i-escue of the Saccharomyces cerevisiae phenotype induced by mitochondrial DNA polymerase mutations associated with progressive external ophtalmoplegia in humans. Hum. Mol. Genêt., 15, 2846 - 2855).

2.2. Effet du clofilium tosylate sur la production de colonies petite de la souche de levure mutante mipl ^G651s

L'effet du clofilium tosylate sur la production de colonies petite est mesuré chez la levure mutante mipl ^G651s . Les résultats sont présentés en Figure 2.

Le clofîlium tosylate réduit la production de colonies petite de la souche de levure mutante mipl ^G65!S .

2.3. Effet de clofilium tosylate sur la production de colonies petite sur différents mutants récessifs et dominants de mipl chez la levure

L'effet du clofilium tosylate sur la production de colonies petite est mesuré chez 8 mutants récessifs mipl :

- H734Y (domaine muté: polymérase) A692T (domaine muté: polymérase)

- G259R (domaine muté: exonuclease) G651 S (domaine muté: polymérase)

- C261R (domaine muté: exonuclease) R467W (domaine muté: linker)

- P829L (domaine muté: polymérase) G807R (domaine muté: polymérase) et chez 3 mutants dominants mipl :

- Y757C (domaine muté: polymérase)

- K749R (domaine muté: polymérase)

- E698G (domaine muté: polymérase)

Les résultats sont présentés en Figure 3,

Le clofîlium tosylate réduit la production de cellules ne respirant pas quel que soit le domaine de MIP1 muté (exonucléase, polymérase ou linker) à l'exception des mutations produisant plus de 90% de colonies petite.

Exemple 3 : Effet du clofilium tosylate sur la fidélité des différents mutants àc MIPl chez la levure

Une perturbation de la fidélité de la polymérase mitochondriale Mipl peut être évaluée en mesurant la fréquence des cellules résistantes à l'érythromycine (Ery ^R ). Les mutations Ery ^R sont causées par des mutations dans l'ARN ribosomique mitochondrial 21 S codé par l'ADNmt qui peuvent se produire après incorporation d'un mauvais nucléotide (Baruffini, E., Lodi, T., Dallabona, C. _; Puglisi, A., Zeviani, M. and Ferrero, I. (2006) Genetic and Chemical rescue of the Saccharomyces cerevisiae phenotype induced by mitochondrial DNA polymerase mutations associated with progressive extemal ophtalmoplegia in humans. Hum. Mol Genet., 15, 2846 - 2855). Une mesure de la résistance à l'érythromycine est un moyen de mesurer directement les mutations ponctuelles de l'ADNmt.

Des colonies indépendantes sont ensemencées dans 10 mL de milieu minimum (SC-TRP, 2% glucose) en présence de clofilium tosylate 32 μΜ ou de DMSO jusqu'à la phase stationnaire. Pour déterminer le nombre total de cellules capables de respirer, un aliquot de chaque culture est étalé sur milieu riche YPE (1% Yeast Extract, 0,5% Bacto Peptone, 2% Ethanol). Le reste des cultures est étalé sur milieu NI contenant 2,5 mg/mL d'erytliromycine (2% peptone, 1% yeast extract, 40 mg/L adenine, 3% éthanol, 3 % glycerol dans 25 mM de tampon phosphate pH 6,5 et supplémenté avec 2,5 g/L d'erythromycine (SIGMA)) et incubé à 28°C pendant 8 jours. L'expérience est réalisée en duplicat. La fréquence des mutations est calculée comme le nombre de colonies Ery ^R sur le nombre total de colonies (Baruffini, E., Lodi, T., Dallabona, C, Puglisi, A., Zeviani, M. and Ferrero, I. (2006) Genetic and Chemical rescue of the Saccharomyces cerevisiae phenotype induced by mitochondrial DNA polymerase mutations associated witli progressive external ophtalmoplegia in humans. Hum. Mol. Genêt., 15, 2846 - 2855).

Les résultats sont présentés en Figure 4.

Le clofilium tosylate n'a aucun effet sur la fidélité des différents mutants de levure de MIP1.

Exemple 4 : Effet du clofilium tosylate et de la disponibilité des dNTl* sur la stabilité de l'ADNmt des mutants de levure mipl ^G6sls et mipl ^A692T

La délétion du gène SML1 codant l'inhibiteur de RNR1 (ribonucleotide-diphosphate reductase,, enzyme limitante de la voie de synthèse des dNTP) est connue pour être un suppresseur génétique de l'instabilité de l'ADNmt due à des mutations dans le gène MJP1 (Wang PJ, Chabes A, Casagrande R, Tian XC, Theiander L and Huffaker TC. (1997) Rnr4p anovel ribonucleotide reductase small-subunit protein. Mol Cell Biol, 17, 6114-6121). La fréquence de colonies petite est déterminée pour les souches mipl ^G651s t mip 1 ^A692T àélété s ou non du gène SMLl et en présence de clofilium tosylate 32 μΜ ou de DMSO.

A partir de précultures en milieu sélectif (SC-TRP, 2% éthanol (v/v)) des souches mipl mutées, 2.10 ⁵ cellules/mL sont ensemencées dans 2 mL de milieu riche YPD en présence de clofilium tosylate 32 μΜ ou de DMSO puis incubées à 28°C pendant 24 heures. Les cellules sont ensuite diluées pour avoir environ 200 à 250 cellules par boîte et étalées sur milieu synthétique différentiel (SC-TRP, 0,3% glucose, 2% éthanol). Le nombre de colonies petite est calculé après 5 jours d'incubation à 28°C.

Les résultats sont présentés en Figure 5.

Le clofilium tosylate et la disponibilité des dNTP (due à la délétion du gène SMLl) ont un effet additif sur la stabilité de l'ADNmt des mutants de levure mipl ^G65iS et mipl ^A692T .

Exemple 5 : Effet du clofilium tosylate sur la respiration des cellules de levure

L'intensité respiratoire est la quantité d'oxygène consommée par unité de temps et de matière biologique. Elle reflète l'activité du métabolisme oxydatif des cellules.

La consommation d'oxygène sur cellules entières est mesurée à l'aide d'une électrode HANSATECH. Les cellules de levure exprimant le gène sauvage MIPl ou le gène muté mipl ^G651s sont cultivées pendant 7-8 générations dans un milieu YPE (1% Yeast Extract, 0,5% Bacto Peptone, 2% Ethanol) supplémenté avec du DMSO ou du clofilium tosylate 32 μΜ à 28°C avec agitation. Un volume correspondant à un total de 60 unités de D0 ₆ oo de chaque culture est centrifugé pendant 5 min à 3000 g. Le culot est resuspendu en YPE afin d'avoir 6.10 ⁵ soit 3.10 ⁷ cellules, sont introduits dans la chambre de mesure de l'électrode HANSATECH qui est maintenue à 28°C. La consommation d'02 est observée et enregistrée en temps réel. La vitesse de consommation d'0 ₂ est calculée à partir de la partie linéaire de la courbe de consommation d'02.

Les résultats sont présentés en Figure 6.

Les cellules de levure traitées par le clofilium tosylate respirent mieux. Exemple 6 : Effet du clofilium tosylate sur la quantité de protéines Mipl sauvages ou MiplG651S mutées de levure

L'analyse de l'effet du clofilium tosylate sur la quantité de protéines Mi l sauvages ou mutées est réalisée sur des extraits cellulaires enrichis en mitochondries. Afin de visualiser l'expression des protéines Mi l et Mi lG651S, la séquence codant trois épitopes HA a été clonée en 3' et en phase avec la séquence codante de Mipl et MiplG651S.

Les cellules de levure sont mises en culture en milieu sélectif (SC-T P, 2% Ethanol) pendant une nuit. Puis les cellules sont ensemencées à une densité optique (D0 ₆ oo) initiale de 0,05 dans 100 mL de YPE (1% Yeast Extract, 0,5% Bacto Peptone, 2% Ethanol) supplémenté soit par du DMSO ou par du clofilium tosylate 32 μΜ à 28°C avec agitation jusqu'à une D0 ₆ oo comprise entre 3 et 4. Les cellules sont centrifugées à 3000 g pendant 5 min et lavées à l'eau. L'isolation de la fraction enrichie en mitochondries et l'extraction protéique de cette fraction sont réalisées selon le protocole décrit par Hoffman et al., 2009 (Hofmann, L., Saunier, R., Cossard, R., Esposito, M., Rinaldi, T. and Delahodde, A. (2009) A non-proteolytic proteasome activity controls organelle fission in yeast. J Cell Sri., 122, 3673 - 3682).

Les extraits protéiques des fractions enrichies en mitochondries sont analysés par électrophorèse sur gel SDS PAGE 6% pour l'analyse des protémes Mipl -HA et MiplG651S- HA et 10% pour l'analyse des protéines mitochondriales Cox2 (codée par l'ADNmt) et de la porine. Après séparation sur gel de polyacrylamide les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose. Après saturation des membranes par la solution de lait écrémé à 5 % (p/v), les membranes sont incubées pendant une heure sous agitation en présence des anticorps primaires correspondants (la protéine Mipl : anti-HA dilués au l/5000 ^ème , la protéine Cox2 : anti-Cox2 dilués au l/500 ^ème , la porine : anti-porine dilués au l/25000 ^èrae ). Après lavage en tampon TBS, les membranes sont incubées pendant une heure en présence des anticorps secondaires couplés à la horseradish peroxydase (HRP) dilués au l/5000 ^eme . Puis les membranes sont relavées en tampon TBS. Les protéines sont ensuite révélées à l'aide du Kit de détection de l'activité peroxydase ECL ^P! " ^S de GE Healthcare.

Les résultats sont présentés en Figure 7. La quantité de protéine Mipl sauvage ou MiplG651S mutée de levure est augmentée en présence de clofilium tosyiate.

Exemple 7 : Détermination de la concentration non-toxique de clofilium tosyiate (MIC, Minimum Inhibitoty Concentration) chez le nématode Caenorhabditis elegans

Une série de boîtes NOM contenant du clofilium tosyiate aux concentrations de 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 50 μΜ, 100 μΜ ou 200 μΜ est préparée (trois boîtes pour chaque concentration). Entre 30 et 40 larves Ll synchronisées des lignées sauvage N2 BRISTOL ou mutée VC1224 (polg- l(okl548A/+)/mTl II; +/mTl [dpy-10(el28)] II), nématodes portant une délétion hétérozygote de 2149 bp dans la séquence codante du gène polg-1, sont déposées sur chacune de ces boîtes. Leur développement est observé pendant 4 jours.

Les résultats sont présentés en Figure 8.

Pour la lignée sauvage, un arrêt de développement au stade L3 ou un ralentissement de développement est observé à 100 μΜ de clofilium tosyiate indiquant que la concentration maximaie à utiliser est de 50 μΜ. Pour la souche polg-1 (okl548A/+), les larves se développent de manière similaire pour des concentrations allant de 1 μΜ à 50 μΜ de clofilium tosyiate, La concentration en clofilium tosyiate choisie pour les futures expériences chez le nématode est de 50 μΜ.

Exemple 8 : Effet du clofilium tosyiate sur la résistance des nématodes polg-1 haploinsuffisant poIg-l(okl548A/+) au bromure d'éthidium

Le bromure d'éthidium est un agent intercalant de l'ADN, et plus spécialement de PADNmt, riche en adénine et thymidine. A forte concentration il induit un arrêt de développement au stade L3 des vers (Addo, M. G., Cossard, R., Pichard, D., Obiri-Danso, K., Rôtig, A. and Delahodde, A. (2010) Caenorhabditis elegans, a pluiicellular model organism to screen new gènes involved in mitochondrial génome maintenance. BBA-Mol Basis Dis., 1802, 765 - 773). Les nématodes TB2143 polg-1 (okl548A/+) haploinsuffisants sont fortement sensibles à de faibles doses de bromure d'éthidium (30 μg mL) avec 90% des larves arrêtées au stade L3. 8.1. Test de résistance au bromure d'éthidium

Une trentaine de larves synchronisées au stade Ll sauvages ou mutées dans polg-1 (lignée TB2143 polg-l(okl548A/+)) est déposée sur des boîtes NGM contenant 30 μg mL de bromure d'éthidium et soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ (expérience faite en triplicat). Le développement larvaire est examiné après 4 jours de traitement.

Les résultats sont présentés en Figure 9.

Le clofilium tosylate entraîne une résistance accrue des nématodes haploinsuffisants polg- l(okl548A/+) au bromure d'éthidium.

8.2. Dose réponse du clofilium tosylate sur la résistance des nématodes haploinsuffisants polg-l(okl548A/+) au bromure d'éthidium

Une trentaine de larves synchronisées au stade Ll mutées dans polg-1, lignée TB2143 polg- l(okl548A/+), est déposée sur des boîtes NGM contenant 30 μg/mL de bromure d'éthidium et soit du DMSO soit différentes concentrations de clofilium tosylate : 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ et 50 μΜ (expérience faite en triplicat). Le développement larvaire est examiné après 4 jours de traitement.

La courbe dose-réponse est donnée en Figure 10.

La dose-réponse du clofilium tosylate est déterminée une nouvelle fois selon le même mode opératoire, avec des concentrations de clofilium tosylate de 0,1 μΜ, 0,5 μΜ, 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ et 50 μΜ.

Les résultats sont présentés en Figure 18.

8.3. Dose réponse de la quinidine (contrôle négatif), sur la résistance des nématodes haploinsuffisants polg-l(okl548A/+) au bromure d'éthidium

Une trentaine de larves synchronisées au stade Ll mutées dans polg-1, lignée TB2143 polg- l(okl548Â/+) ₅ est déposée sur des boîtes NGM contenant 30 μg mL de bromure d'éthidium et soit du DMSO soit différentes concentrations de quinidine, un antiarythmique de classe 1 : 10 μΜ, 30 μΜ, 100 μΜ et 300 μΜ (expérience faite en triplicat). Le développement larvaire est examiné après 4 jours de traitement.

La courbe dose-réponse est donnée en Figure 11.

Exemple 9 : Effet du clofilium tosylate sur le nombre d'œufs pondus et éclos des nématodes homozygotes TB2143 polg-l(A/A)

Quatre larves au stade L4 TB2143 polg-l(okl548A/A) homozygotes sont déposées sur chaque boîte NGM contenant soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ (trois boîtes pour chaque groupe de traitement). Elles sont incubées à 20°C jusqu'au stade adulte. Toutes les 9 à 12 heures et ce pendant 6 à 7 jours, jusqu'à absence d'œuf dans l'utérus, les adultes sont déplacés sur de nouvelles boîtes contenant du DMSO ou du clofilium tosylate 50 μΜ, et le nombre d'œufs pondus est compté. Chaque ponte est suivie jusqu'au lendemain pour le dénombrement de l'éclosion.

Les résultats sont présentés en Figure 12.

Le clofilium tosylate augmente le nombre d'œufs pondus et l'éclosion des embryons des nématodes homozygotes TB2143 polg-l(A/A).

Exemple 10 : Effet du clofilium tosylate sur l'extrusion des gonades et/ou de l'intestin des nématodes homozygotes

Dix larves au stade L4 TB2143 polg-l(okl548A/A) homozygotes sont déposées sur chaque boîte NGM contenant soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ (trois boîtes pour chaque groupe de traitement) et sont incubées à 20°C. Leur survie est suivie jusqu'au 7 ^eme jour de l'adulte. Le nombre d'animaux morts, ne répondant à aucune stimulation, et présentant une extrusion de l'intestin et/ou des gonades est compté. Les rares animaux morts de déshydratation sur le bord des boîtes de pétri sont exclus de l'analyse.

Les résultats sont présentés en Figure 13. Le clofilium tosylate réduit la mort prématurée des nématodes homozygotes par extrusion des gonades et/ou de l'intestin.

Exemple 11 : Effet du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt des nématodes homozygotes TB2143 polg-l(okl548A/A) dépiétés en ADNmt

Dix larves au stade L4 TB2143 polg-l(okl548A/A) homozygotes ou sauvages sont déposées sur chaque boîte NGM contenant soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ (trois boîtes pour chaque groupe de ti'aitement). Elles sont incubées à 20°C jusqu'au 6 ^ème jour de l'adulte. L'extraction des ADN totaux des nématodes est réalisée avec le kit Nucleospin Kit Tissue (Macherey Nagel). Les quantifications de ADNmt et de l'ADN nucléaire sont réalisées comme décrit dans Addo et al., 2010 (Addo, M. G,, Cossard, R. _; Pichard, D., Obiri-Danso, K., Rôtig, A. and Delahodde, A. (2010) Caenorhabditis elegans, a pluricellular model organism to screen new gènes involved in mitochondrial génome maintenance. BBA-Mol Basis Dis., 1802, 765 - 773).

Les résultats sont présentés en Figure 14 et en Table 1.

Table 1 : Rapport de la quantité d'ADNmt à la quantité d'ADN nucléaire par nématode sauvage N2 BRISTOL traité au DMSO et par nématode homozygote TB2143 polg-l(okl548A/A) traité soit au DMSO soit avec du clofilium tosylate 50 μΜ (CLOF). génotype traitement ADNmt/ADNnu

wîld-type (N2) DMSO 488 9

poig-l(okl548A/A) DMSO 11,2

poig-l(okl548A/A) CLOF 69,2

Le clofilium tosylate augmente la quantité d'ADNmt des nématodes homozygotes TB2143 polg-l(okl548A/A) dépiétés en ADNmt.

Exemple 12 : Détermination de la concentration maximale non toxique du clofilium tosylate sur des cultures de fibroblastes contrôles et de fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG Les fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés en DMEM Galactose (DMEM dépourvu de glucose (Life Technologies) complémenté avec 10 mM de galactose, 10% de sérum de veau fœtal, 200 U/mL de pénicilline, 200 U/mL de streptomycine). De l'uridine (50 μg/mL·) et du pyruvate de sodium (2,5 mM) sont ajoutés au milieu de culture afin de maintenir les cellules exprimant un déficit de la chaîne respiratoire. Les cellules sont incubées en atmosphère contrôlée à 37°C et 5% de C0 ₂ .

La prolifération cellulaire des fibroblastes du patient et du contrôle est mesurée en continu pendant 140 h par utilisation d'un automate xCELLigence (ACEA Biosciences) dans des plaques 96 puits. Le signal du bruit de fond est mesuré avec 50 μΕ de milieu de culture par puits. 50 μΕ de milieu contenant 1350 fibroblastes sont ensuite ajoutés dans chaque puits. La mesure d'impédance est réalisée toutes les minutes pendant 9 h puis toutes les 15 minutes jusqu'à la fin de l'analyse.

Le clofilium tosylate est dilué dans du DMSO 0,1% et utilisé à différentes concentrations (2,5 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ) dans un volume total de 50 μL·. La détermination des concentrations toxiques du clofilium tosylate est réalisée en ajoutant la drogue dès l'ensemencement des cellules. Pour chaque concentration de drogue et chaque contrôle, l'analyse est réalisée en triplicat sur plaques de 96 puits. Un algorithme mathématique permet de convertir le signal d'impédance en index cellulaire (IC). Cet index est proportionnel au nombre de cellules adhérant au fond du puits ainsi qu'à leur forme.

Les résultats sont présentés en Figure 15.

La concentration maximale de clofilium tosylate autorisée sur les cultures de fibroblastes contrôles et de patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG est de 2,5 μΜ.

Exemple 13 : Effet du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt chez les fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG cultivés en condition de prolifération cellulaire

Des fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés jusqu'à 100% de confluence dans un milieu Dulbecco 's Modified Eagle Médium (DMEM) haut glucose complet (4,5 g/L de D-gîucose, 110 mg/L de sodium pyruvate, 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine à partir de la solution mère pénicilline 10000 IU et streptomycine 10000 μg/mL·) à 37°C sous C0 ₂ 5%. A confluence, les cultures sont traitées à la trypsine et remises en culture à 30% de confluence dans un milieu DMEM haut glucose complet supplémenté soit avec du DMSO 0,1% soit avec 2,5 μΜ de clofîlium tosylate. Elles sont incubées à 37°C sous C0 ₂ 5% et sont récoltées à 100% de confluence. Les ADN totaux des fibroblastes sont extraits par la méthode de phénol-chloroforme et la quantification des ADNmt et ADN nucléaire est réalisée par qPCR comme décrite dans Sarzi et al., 2007 (Sarzi, E., Bourdon, A., Chrétien, D., Zarhrate, M., Corcos, J., Slama, A., Cormier-Daire, V., De Lonlay, P., Munniclî, A. and Rotig, A. (2007) Mitochondrial DNA Depletion is a Prévalent Cause of Multiple Respiratory Chain Deficiency in Childhood. JPedialr, 105, 531 - 534).

Les résultats sont présentés en Figure 16.

En condition de prolifération cellulaire, le clofîlium tosylate augmente légèrement la quantité d'ADNmt chez les fibroblastes du patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG.

L'effet du clofîlium tosylate sur la quantité d'ADNmt chez les fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG en condition de prolifération cellulaire cultivés dans un milieu DMEM glucose complet ou galactose complet est mesuré une seconde fois. Des fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés jusqu'à 100% de confluence dans un milieu DMEM glucose complet ou galactose complet (4,5 g/L de D-glucose ou 4,5 g/L de D- galactose, 110 mg/L de sodium pyruvate, 10%» de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine à partir de la solution mère pénicilline 10000 IU et streptomycine 10000 g/mL) à 37°C sous C0 ₂ 5%. A confluence, les cultures sont traitées à la trypsine et remises en culture à 30% de confluence dans un milieu DMEM glucose complet ou galactose complet supplémenté soit avec du DMSO 0,1 % soit avec du clofîlium tosylate 2,5 μΜ. Elles sont incubées à 37°C sous C0 ₂ 5% et sont récoltées à 100% de confluence. Les ADN totaux des fibroblastes sont extraits par la méthode de phénol-chloroforme et la quantification des ADNmt et ADN nucléaire est réalisée par qPCR comme décrite dans Sarzi et al., 2007 (Sarzi, E., Bourdon, A., Chrétien, D., Zarhrate, M., Corcos, J., Slama, A., Cormier-Daire, V., De Lonlay, P., Munnich, A. and Rôtig, A. (2007) Mitochondrial DNA Depletion is a Prévalent Cause of Multiple Respiratory Chain Deficiency in Childhood. JPediatr, 105, 531 - 534). Exemple 14 : Effet du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt des fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG cultivés en condition de quiescence

Des fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés jusqu'à 100% de confluence dans du DMEM à 37°C sous C0 ₂ 5%. A 100% de confluence, les fibroblastes sont lavés au PBS et le milieu quiescent est ajouté (4,5 g/L de D-glucose, 110 mg/L de sodium pyruvate, 0,1% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine à partir de la solution mère pénicilline 10000 IU et streptomycine 10000 μ£/ηιΙ,). Après quatre jours en milieu quiescent, le clofilium tosylate 1 μΜ ou le DMSO (0,1%) sont ajoutés au milieu de culture. Le traitement est réalisé pendant 18 jours en changeant le milieu de culture avec ou sans clofilium tosylate tous les trois jours. Les fibroblastes sont récoltés tous les 6 jours et l'ADN total est extrait au phénol-chloroforme. L'ADNmt et l'ADN nucléaire sont quantifiés par qPCR (Sarzi, E., Bourdon, A., Chrétien, D., Zarhrate, M., Corcos, J., Slama, A., Cormier-Daire, V., De Lonlay, P., Munnich, A. and Rôtig, A. (2007) Mitochondrial DNA Depletion is a Prévalent Cause of Multiple Respiratory Chain Deficiency in Cliildhood. J Pediatr, 105, 531 - 534).

Les résultats sont présentés en Figure 17.

Le clofilium tosylate augmente la quantité d'ADNmt des fibroblastes du patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG en condition de quiescence.

L'effet du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt de fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG en condition de quiescence est mesiué une deuxième fois selon le même mode opératoire.

Exemple 15 : Dose-réponse de l'Ibutilide sur la résistance des nématodes haploinsuffisants polg-l(okl548A/+) au bromure d'éthidium

Des boîtes NGM supplémentées avec 30μg mL de bromure d'éthidium et du DMSO ou 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ ou 50 μΜ d'Ibutilide Hemifumarate sont préparées (trois boîtes pour chaque groupe de traitement). Entre 30 et 40 larves de la souche TB2143 polg-l(okl548A/+) synchronisées au stade Ll sont déposées sur chacune de ces boîtes. Leur développement est observé pendant 4 jours. Les résultats sont présentés en Figure 19.

Exemple 16 : Dose-réponse du Dofétilide sur la résistance des nématodes haploinsuffisants po!g-l(okl548A/+) au bromure d'éthidium

Des boîtes NGM supplémentées avec 30 g/mL de bromure d'éthidium et du DMSO ou 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 50 μΜ, 100 μΜ ou 200 μΜ de Dofétilide ou 50 μΜ de clofilium tosylate sont préparées (trois boîtes pour chaque groupe de traitement). Entre 30 et 40 larves de la souche TB2143 polg- 1 (okî 548Δ/+) synchronisées au stade Ll sont déposées sur chacune de ces boîtes. Leur développement est observé pendant 4 jours.

Les résultats sont présentés en Figure 20.

Exemple 17 : Effet du clofilium tosylate sur la production de colonies petite de la souche de levure mutante Âfisl

L'ef et du clofilium est évalué selon le même mode opératoire que pour l'Exemple 2 avec des levures mutantes Âfisl.

Les résultats sont présentés en Figure 21.

Le produit du gène FIS1, impliqué dans le processus de fission des mitochondries, intervient dans le mécanisme d'action du clofilium tosylate.

Exemple 18 : Elargissement de la dose-réponse du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt de fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG cultivés en condition de quiescence

Des fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés jusqu'à 100% de confluence dans du DMEM à 37°C sous C0 ₂ 5%. A 100% de confluence, les fibroblastes sont lavés au PBS et le milieu quiescent est ajouté (4,5 g/L de D-glucose, 110 mg/L de sodium pyruvate, 0,1% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine à partir de la solution mère pénicilline 10000 IU et streptomycine 10000 μ^Γη ,). Après quatre jours en milieu quiescent, le clofilium tosylate 30 nM, 100 nM, 300 nM ou 1 μΜ ou le DMSO (0,1%) sont ajoutés au milieu de culture. Le traitement est réalisé pendant 18 jours en changeant le milieu de culture avec ou sans clofilium tosylate tous les trois jours. Les fibroblastes sont récoltés tous les 6 jours et FADN total est extrait au phénol-chloroforme. L'ADNmt et l'ADN nucléaire sont quantifiés par qPCR (Sarzi, E., Bourdon, A., Chrétien, D., Zarhrate, M., Corcos, J., Slama, A., Cormier- Daire, V., De Lonlay, P., Munnich, A. and Rôtig, A. (2007) Mitochondrial DNA Depletion is a Prévalent Cause of Multiple Respiratory Chain Deficiency in Childhood. JPediatr, 105, 531 - 534).

Exemple 19 : Effet du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt de fibroblastes d'un autre patient avec mutations différentes sur chaque allèle du gène POLG cultivés en condition de quiesccnce

Des fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés jusqu'à 100% de confluence dans du DMEM à 37°C sous C0 ₂ 5%. A 100% de confluence, les fibroblastes sont lavés au PBS et le milieu quiescent est ajouté (4,5 g/L de D-glucose, 110 mg/L de sodium pyruvate, 0,1% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine à partir de la solution mère pénicilline 10000 IU et streptomycine 10000 igl L). Après quatre jours en milieu quiescent, le clofilium tosylate 1 μΜ ou le DMSO (0,1%) sont ajoutés au milieu de culture. Le traitement est réalisé pendant 18 jours en changeant le milieu de culture avec ou sans clofilium tosylate tous les trois jours. Les fibroblastes sont récoltés tous les 6 jours et l'ADN total est extrait au phénol-chloroforme. L'ADNmt et l'ADN nucléaire sont quantifiés par qPCR (Sarzi, E., Bourdon, A., Chrétien, D., Zarhrate, M., Corcos, J., Slama, A., Cormier-Daire, V., De Lonlay, P., Munnich, A. and Rôtig, A. (2007) Mitochondrial DNA Depletion is a Prévalent Cause of Multiple Respiratory Chain Deficiency in Childhood. JPediatr, 105, 531 - 534).

Exemple 20 : Effet du clofilium tosylate sur un modèle de déplétion de l'ADNmt (non due à une mutation dans le gène POLG) avec mutation dans le gène orthologue d'OPAl (eat-3) chez Caenorhabditis elegans. 20.1. Effet du clofilium tosylate sur les phénotypes du ver homozygote muté dans le gène eat-3 (eat-3(ad426) II ; him-8(el489) IV) : Test de résistance au bromure d'ethidium

Une trentaine de larves synchronisées au stade Ll sauvages ou mutées dans eat-3 (lignée DA631 eat-3(ad426)) est déposée sur des boîtes NGM contenant différentes concentrations de bromure d'éthidium (10, 20, 30, 40, 50 μg/mL) et soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ (expérience en triplicat). Le développement larvaire est examiné après 4 jours de traitement.

20.2. Effet du clofilium tosylate sur le nombre d'oeufs pondus et éclos des nématodes DA631 et sur leur développement

Quatre larves au stade L4 DA631 (eat-3(ad426)) sont déposées sur chaque boîte NGM contenant soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ (trois boîtes pour chaque groupe de traitement). Elles sont incubées à 20°C jusqu'au stade adulte. Toutes les 9 à 12 heures et ce pendant 6 à 7 jours jusqu'à absence d'œuf dans l'utérus, les adultes sont déplacés sur de nouvelles boîtes contenant du DMSO ou du clofilium tosylate 50 μΜ, et le nombre d'œufs pondus est compté. Chaque ponte est suivie pour le dénombrement de l'éclosion et le développement larvaire.

20.3. Effet du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt des nématodes DÀ631

Dix larves DA631 (eat-3 (ad426)) au stade L4 ou sauvages sont déposées sur chaque boîte NGM contenant soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ (trois boîtes pour chaque groupe de traitement). Elles sont incubées à 20°C jusqu'au 6 ^eme jour de l'adulte. L'extraction des ADN totaux des nématodes est réalisée avec le kit Nucleospin Kit Tissue (Macherey Nagel). Les quantifications de l'ADNmt et de l'ADN nucléaire sont réalisées comme décrit dans Addo et al., 2010 (Addo, M. G., Cossard, R., Pichard, D., Obiri-Danso, K., Rôtig, A. and Delahodde, A. (2010) Caenorhabditis elegans, a pluricellular model organism to screen new gènes involved in mitochondrial génome maintenance. B 'A-Mol, Basis Dis., 1802, 765 - 773).

20.4. Effet du clofilium tosylate sur la morphologie mitochondriale des nématodes DA631 Dix larves DA631 au stade L4 ou sauvages, exprimant la GFP adressée aux mitochondries dans les muscles locomoteurs, sont déposées sur boîte NGM contenant soit du DMSO soit du clofilium tosylate 50 μΜ. Elles sont incubées à 20°C jusqu'au 3 ^ème jour de l'adulte. Les adultes sont alors anesthésiés et mis entre lame et lamelle pour examen de la morphologie mitochondriale en microscopie à fluorescence.

Exemple 21 : Effet de la combinaison d'administration de resveratrol (antioxydant) et de clofilium tosylate sur les fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG

21.1 : Effet sur la prolifération cellulaire

Les fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés en milieu DMEM Galactose (DMEM dépourvu de glucose (Life Technologies) complémenté avec 10 mM de galactose, 10% de sérum de veau fœtal, 200 U/mL de pénicilline, 200 U/mL de streptomycine). De l'uridine (50 μg/mL) et du pyruvate de sodium (2,5 mM) sont ajoutés au milieu de culture afin de maintenir les cellules exprimant un déficit de la chaîne respiratoire. Les cellules sont incubées en atmosphère contrôlée à 37°C et 5% de C0 ₂ . La prolifération cellulaire des fibroblastes du patient et du contrôle est mesurée en continu pendant 140 h par utilisation d'un automate xCELLigence (ACEA Biosciences) dans des plaques 96 puits. Le signal du bruit de fond est mesuré avec 50 \xL de milieu de culture par puits. 50 xL de milieu contenant 1350 fibroblastes sont ensuite ajoutés dans chaque puits. La mesure d'impédance est réalisée toutes les minutes pendant 9 h puis toutes les 15 minutes jusqu'à la fin de l'analyse. Dès l'ensemencement des cellules, du clofilium tosylate (< 2 μΜ) ou du resveratrol (< 50 μΜ) ou une combinaison de clofilium tosylate (< 2 μΜ) et de resveratrol (< 50 uM) ou du DMSO sont ajoutés. Pour chaque drogue ou combinaison de drogues et chaque contrôle, l'analyse est réalisée en triplicat sur plaques de 96 puits. Un algorithme mathématique permet de convertir le signal d'impédance en index cellulaire (IC). Cet index est proportionnel au nombre de cellules adhérant au fond du puits ainsi qu'à leur forme.

Effet sur la quantité d'ADNmt Les fïbroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés en milieu DMEM Galactose (DMEM dépourvu de glucose (Life Technologies) complémenté avec 10 mM de galactose, 10% de sérum de veau fœtal, 200 U/mL de pénicilline, 200 U/mL de streptomycine). De l'uridine (50 g/mL) et du yruvate de sodium (2,5 mM) sont ajoutés au milieu de culture. Les cellules sont incubées en atmosphère contrôlée à 37°C et 5% de C0 ₂ . A confluence, les cultures sont traitées à la trypsine et remises en culture à 30% de confluence dans un milieu DMEM galactose complet supplémenté soit avec du DMSO 0,1% soit avec du ciofilium tosylate (< 2 μΜ), soit avec du resveratrol (< 50 μΜ), soit avec une combinaison de ciofilium tosylate (< 2 μΜ) et de resveratrol (< 50 μΜ). Elles sont incubées à 37°C sous C0 ₂ 5% puis sont récoltées à 100% de confluence. Les ADN totaux des fibroblastes sont extraits par la méthode de phénol- chloroforme et la quantification des ADNmt et ADN nucléaire est réalisée par qPCR comme décrite dans Sarzi et al., 2007 (Sarzi, E., Bourdon, A., Chrétien, D., Zarhrate, M., Corcos, J., Slama, A., Cormier-Daire, V., De Lonlay, P., Munnich, A. and Rôtig, A. (2007) Mitochondrial DNA Depletion is a Prévalent Cause of Multiple Respiratory Chain Deficiency in Childhood. JPediatr, 105, 531 - 534).

Exemple 22 : Effet du ciofilium tosylate sur le ratio des activités du complexe I / citrate synthase et la production de Iactate de cybrides neuronaux dérivés d'un patient MELAS (m.3243A>G tRNA ^le " mutation)

L'augmentation de la production de Iactate est le reflet d'une toxicité de la drogue utilisée mais également d'un dysfonctionnement mitochondrial (déficit énergétique) présent dans le syndrome MELAS.

L'activité de la citrate synthase est un marqueur de masse mitochondriale et permet de normaliser l'activité du complexe I, qui est la première enzyme de la chaîne respiratoire mitochondriale, qui est significativement réduite dans le syndrome MELAS.

La lignée transmitochondriale neuronale mutante MELAS, résultat de la fusion de la lignée parentale neuroblastome immortalisée SHSY-5Y avec des fibroblastes portant la mutation m.3243A>G a été créé dans le laboratoire du Pr Procaccio.

Les lignées neuronales cybrides porteuses de la mutation MELAS et la lignée parentale contrôle sont cultivées dans des flasques de culture stériles et mises à Pétuve à 37°C avec 5% de CC% dans un milieu composé de DMEM avec 1,5 g L de glucose, 2 mM de L-glutamine et supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal ainsi que d'uridine (5 g mL) et de pyruvate (10 μg/mL). Les cellules sont récoltées par trypsination en phase exponentielle et utilisées pour les analyses biochimiques ou moléculaires mitochondiïales ultérieures.

La lignée neuronale cybride MELAS porteuse de la mutation en apparence à l'état homoplasmique (c'est-à-dire atteignant presque 100% de mutation MELAS) et la lignée parentale SHSY-5Y contrôle ont été utilisées pour les mesures d'activités enzymatiques. Les cybrides neuronaux en culture à confluence environ 50% ont été traités avec le véhicule (DMSO) ou à la concentration de 300 nM (CT 300nM) de clofilium tosylate. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C sous C0 ₂ 5% et récoltées après 48 heures de traitement. Après traitement à la trypsine, les cellules cybrides sont centrifugées et congelées dans des tubes conservés à -80°C sous forme de culots cellulaires. Ces culots cellulaires sont ensuite analysés par spectrophotométrie avec la mesure des différentes activités biochimiques mitochondriales, en particulier l'activité de la citrate synthase et l'activité du complexe I de la chaîne respiratoire. La citrate synthase localisée dans la matrice mitochondilale catalyse la première réaction du cycle de Krebs. Le dosage de son activité est utilisé comme un témoin de la quantité de mitochondries.

Les activités enzymatiques du complexe I et de la citrate synthase ont été mesurées selon le protocole décrit dans Medjda et al, 2009 (Medja F, Allouche S, Frachon P, Jardel C, Malgat M, Mousson de Camaret B, Slama A, Lunardi J, Mazat JP, Lombès A. Development and implementation of standardized respiratory chain spectrophotométrie assays for clinical diagnosis. Mitochondrion. 2009 Sep;9(5):331-9).

La concentration en lactate du milieu de culture des cellules neuronales cybrides et parentales a été déterminée par spectrophotornétrie à l'aide d'un kit enzymatique (Bohi'inger) sur un appareil Hitachi-Roche (Roche Diagnostics GmbH). La production de lactate a été mesurée selon le protocole décrit dans Desquiret et al, 2012 (Desquiret-Dumas V, Gueguen N, BarthM, Chevrollier A, Hancock S, Wallace DC, Amati-Bonneau P, HenrionD, Bonneau D, Reynier P, Procaccio V. Metabolically induced heteroplasmy shifting and L-arginine treatment reduce the energetic defect in a neuronal-like model of MELAS (2012) Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1822(6): 1019-29).

Les résultats sont présentés en Figure 22. Le clofîlium tosylate augmente l'activité du complexe I sans augmenter la production de lactate pour une lignée cellulaire cybride porteuse de la mutation m.3243A>G pour le tRNA ^leu responsable du syndrome MELAS.

Exemple 23 : Effet dose de l'ibutilide sur le ratio des activités du complexe I / citrate synthase et la production de lactate de cybrides neuronaux dérivés d'un patient MELAS (m.3243A>G tRNA' ^cu mutation)

La lignée neuronale cybride MELAS porteuse de la mutation en apparence à l'état homoplasmique (c'est-à-dire atteignant presque 100% de mutation MELAS) et la lignée parentale SHSY-5Y contrôle ont été utilisées pour les mesures d'activités enzymatiques. Les cybrides neuronaux en culture à confluence environ 50% ont été traités avec le témoin (DMSO) ou aux concentrations de 1 μΜ (ibu 1 μΜ) ou 300 nM (ibu 300 nM) d'ibutiiide. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C sous C0 ₂ 5% et récoltées après 48 heures de traitement. Après traitement à la trypsine, les cellules cybrides sont centrifugées et congelées dans des tubes conservés à -80°C sous forme de culots cellulaires. Ces culots cellulaires sont ensuite analysés par spectrophotométrie avec la mesure des différentes activités biochimiques mitochondriales, en particulier l'activité de la citrate synthase et l'activité du complexe I de la chaîne respiratoire. La citrate synthase localisée dans la matrice mitochondriale catalyse la première réaction du cycle de rebs. Le dosage de son activité est utilisé comme un témoin de la quantité de mitochondries,

Les activités enzymatiques ont été mesurées selon le protocole décrit dans Medjda et al, 2009 (Medja F, Allouche S, Fraction P, Jardel C, Malgat M, Mousson de Camaret B, Slama A, Lunardi J, Mazat JP, Lombes A. Development and implementation of standardized respiratory chain spectrophotométrie assays for clinical diagnosis. Mitochondrion. 2009 Sep;9(5):331-9). La production de lactate a été mesurée selon le protocole décrit dans Desquiret et al, 2012 (Desquiret-Dumas V, Gueguen N, Barth M, Chevrollier A, Hancock S, Wallace DC, Amati- Bonneau P, Henrion D, Bonneau D, Reynier P, Procaccio V. Metabolically induced heteroplasmy shifting and L-arginine treatment reduce the energetic defect in a neuronal-like model of MELAS (2012) Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1822(6): 1019-29).

Les résultats sont présentés en Figure 23. L'ibutilide augmente l'activité du complexe I et diminue la production de lactate pour une lignée cellulaire cybride porteuse de la mutation m.3243A>G pour le tRNA ^leu responsable du syndrome MELAS.

Exemple 24 : Effet du clofilium tosylate sur la quantité de protéine POLG dans des fibroblastes contrôles et des fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèïe du gène POLG en condition de prolifération cellulaire.

Des fractions protéiques d'extraits totaux de fibroblastes contrôles et de fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG cultivés en présence de DMSO 0,1% ou avec 0,5 μΜ ou 1,0 μΜ de clofilium tosylate sont analysées par électrophorèse.

Les fibroblastes cutanés du contrôle et du patient sont cultivés jusqu'à 100% de confluence dans un milieu Dulbecco 's Modified Eagle Médium (DMEM) haut glucose complet (4,5 g/L de D-glucose, 110 mg/L de sodium pyruvate, 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine à partir de la solution mère pénicilline 10000 IU et streptomycine 10000 g/mL) à 37°C sous C0 ₂ 5%. A confluence, les cultures sont traitées à la trypsine et remises en culture à 30% de confluence dans un milieu DMEM haut glucose complet supplémenté soit avec du DMSO 0,1% soit avec 0,5 μΜ ou 1,0 μΜ de clofilium tosylate. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C sous C0 ₂ 5% et récoltées à 100% de confluence. Après traitement à la trypsine, les protéines totales des fibroblastes sont extraites et analysées par western blot. Les protéines étudiées sont la protéine POLG (analyse sur gel SDS/PAGE 6%), les protéines mitochondriaies ATP5B et TFAM ainsi que la protéine cytosolique TUB3A comme contrôle de charge. 45 μg de protéines sont déposées et après séparation, les protéines sont transférées sur membrane PVDF puis révélées par détection de l'activité peroxydase ECL ^Flus à l'aide d'anticorps primaires et d'anticorps secondaires couplés à la horseradish peroxydase (HRP).

Les résultats sont présentés en figure 24.

Le clofilium tosylate augmente la quantité des protéines mitochondriaies POLG, TFAM et ATP5B. Exemple 25 : Dose réponse du clofilium tosylate sur la quantité d'ADNmt des fibroblastes d'un patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG cultivés en condition de quiescence

Des fibroblastes cutanés du patient sont cultivés jusqu'à 100% de confluence dans du DMEM à 37°C sous C0 ₂ 5%. A 100% de confluence, les fibroblastes sont lavés au PBS et le milieu quiescent est ajouté (4,5 g/L de D-glucose, 110 mg/L de sodium pyruvate, 0,1% de sérum de veau f tal, 1% de pénicilline/streptomycine à partir de la solution mère pénicilline 10000 TU et streptomycine 10000 μg mL). Après quatre jours en milieu quiescent, le clofilium tosylate à 0,5 μΜ, 1 μΜ, 2,5 μΜ ou le DMSO (0,1 %) sont ajoutés au milieu de culture. Le traitement est réalisé pendant 18 jours en changeant le milieu de culture avec ou sans clofilium tosylate tous les trois j ours . Les fibroblastes sont récoltés tous les 6 j ours et 1 ' ADN total est extrait au phénol- chloroforme. L'ADNmt et l'ADN nucléaire sont quantifiés par qPCR (Sarzi, E., Bourdon, A., Chrétien, D., Zarhrate, M., Corcos, J., Slama, À., Cormier-Daire, V., De Lonlay, P., Munnich, A. and Rôtig, A. (2007) Mitochondrial DNA Depletion is a Prévalent Cause of Multiple Respiratory Chain Deficiency in Childhood. J Pediatr, 105, 531 - 534).

Les résultats sont présentés en Figure 25.

Le clofilium tosylate augmente la quantité d'ADNmt des fibroblastes du patient avec une mutation sur chaque allèle du gène POLG en condition de quiescence pour des concentrations de clofilium tosylate de 0,5 μΜ et 1 μΜ.