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北京市浩天知识产权代理事务所 (CN)
| 权 利 要 求 书 1. 一种用于治疗癌症的医药组合物，其包含 (a)选自于下列组中至少一种 化合物： 口比 p各坑二石 代氨基曱酸按 (Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)、 (E)3-((4-叔丁苯基)硫酰) -2-丙烯腈 (Bay 11-7085)、 （2，Ζ,3Έ)-6-溴靛红 -3'-肟 ( (2'Z,3 'E)-6-Bromoindirubin-3 '-oxime ) (BIO), γ-4-二羟基 -2-(6-羟基 -1-庚烯 基) -4-环戊烷巴豆酸 λ-内酯 (Brefeldin A)、 布他拉莫 ((+)-Butaclamol)、 卡西霉 素 (Calcimycin)、 1- [双 (4-氯苯基）曱基] -3-[2-(2,4-双氯苯基) -2-(2,4-双氯苯氧基) 乙基] -1氢-咪唑盐类 (Calmidazolium chloride), 氯化白屈菜赤碱 (Chelerythrine chloride), 4,5,6,7-四溴苯并咪唑 (CK2 Inhibitor 2)、 N2- (顺 -2-胺基环己基) -N6-(3- 氯苯基 )-9-乙基 -9H-嘌呤 -2,6-二胺盐酸盐 (CGP-74514A hydrochloride)、 7-三氟 曱基—4-(4-曱基 -1- -哌嗪基）吡咯 -[1,2-a]喹喔啉马来酸盐（CGS-12066A meleate)、 地口奎氯按 (Dequalinium dichloride) , 二氩乌本苷 (Dihydroouabain)、 氣 ^匕二笨石典盐 (Diphenyleneiodonium chloride), 二盐酸吐才艮械水合物 (Emetine dihydrochloride hydrate) , Ν-[4-曱氧基 -3-(4-曱基 -1-哌嗪基）苯基] -2'-曱基 -4'-(5-曱基 -1,2,4-噁二唑 -3-基) -Ι,Γ-二苯基 -4-羧基酰胺水合盐酸盐（GR 127935 hydrochloride) , 3,4-二氢 -2,2-二曱基 -2H-萘并 [1,2-B]吡喃 -5,6-二酮 (beta-Lapachone)、氯硝柳胺 (Niclosamide)、硝苯吡啶 (Nifedipine)、 6-亚硝基- 1 ,2- 苯并吡喃酮（6-Nitroso-l,2-benzopyrone)、 棕榈酰 -DL- 肉碱盐酸盐 (Palmitoyl-DL-Carnitine chloride)、 小白菊内酯（Parthenolide)、 4-(4-氟苯 基）—2-(4-硝基苯）-5-(4-吡啶） -1H-咪唑（PD 169316)、 1,10-—水二氮杂菲 (1,10-Phenanthroline monohydrate) 、 4- 苯 基 -3- 氧 化 卩夫 咱 象 腈 (4-Phenyl-3 -furoxancarbonitrile) , 盐酸 ρ坐口秦 (Prazosin hydrochloride) , 原 卜淋 二 ]盐 (Protoporphyrin IX disodium)、 套纳克林二盐酸盐 (Quinacrine dihydrochloride) , 乌本苷 (Quabain)、 维生素 A 酸对-羟基苯胺 (Retinoic acid p-hydroxyanilide) , #大毒素 (Rottlerin)、 血才艮碱盐酸盐 (Sanguinarine chloride) , 二硫化四乙基秋兰姆 (Tetraethylthium disulfide)及 3- [1-(3H-咪唑 -4-基) -亚曱 (Z)-基] -5-曱氧基 -1,3-二氢 -2-吲哚酮 (SU 9516); 和 (b)药学上可接受的载体或 赋形剂至该医药组合物。 2. 如权利要求 1所述的用于治疗癌症的医药组合物， 其包含该化合物在 药学上可接受的盐类、 溶剂合物或在药学上具有药学功能的衍生物。 3. 如权利要求 1所述的用于治疗癌症的医药组合物， 其中上述的癌症系 选自下列组中的一种或其任一组合： 子宫颈癌、 乳癌、 卵巢癌、 结肠癌、 胰 脏癌、 胃癌、 前列腺癌、 急性 T细胞白血病、 血癌、 肝癌、 内膜癌、 肺癌、 大肠癌、 黑色素细胞瘤、 恶性肉瘤或其它恶性肿瘤。 4. 如权利要求 1所述的用于治疗癌症的医药组合物， 其中该赋形剂包含 稀释剂、 填充剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂。 5. 一种用于治疗癌症的医药组合物， 其包含 (a)氯硝柳胺 (Niclosamide) 及其该化合物在药学上可接受的盐类、 溶剂合物或在药学上具有药学功能的 衍生物； 和 (b)药学上可接受的载体或赋形剂至该医药组合物。 6. 如权利要求 5所述的医药组合物， 其中所述的癌症系选自下列组中的 一种或其任一组合： 子宫颈癌、 乳癌、 卵巢癌、 结肠癌、 胰脏癌、 胃癌、 前 列腺癌、 急性 T细胞白血病、 血癌、 肝癌、 内膜癌、 肺癌、 大肠癌、 黑色素 细胞瘤、 恶性肉瘤或其它恶性肿瘤。 7. 如权利要求 5所述的医药组合物， 其中该赋形剂包含稀释剂、填充剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂。 8. 一种用于治疗癌症的医药组合物， 其包含 (a)楸毒素 (Rottlerin)及其该 化合物在药学上可接受的盐类、 溶剂合物或在药学上具有药学功能的衍生 物； 和 (b)药学上可接受的载体或赋形剂至该医药组合物。 9. 如权利要求 8所述的医药组合物， 其中所述的癌症系选自下列组中的 一种或其任一组合： 子宫颈癌、 乳癌、 卵巢癌、 结肠癌、 胰脏癌、 胃癌、 前 列腺癌、 急性 T细胞白血病、 血癌、 肝癌、 内膜癌、 肺癌、 大肠癌、 黑色素 细胞瘤、 恶性肉瘤或其它恶性肿瘤。 10. 如权利要求 8所述的医药组合物， 其中该赋形剂包含稀释剂、 填充 剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂。 11. 一种用于治疗癌症的医药组合物， 其包含（a )布他拉莫 ((+)-Butaclamol)及其该化合物在药学上可接受的盐类、 溶剂合物或在药学上 具有药学功能的衍生物； 和 (b)药学上可接受的载体或赋形剂至该医药组合 物。 12. 如权利要求 11所述的医药组合物， 其中所述的癌症系选自下列组中 的一种或其任一组合： 子宫颈癌、 乳癌、 卵巢癌、 结肠癌、 胰脏癌、 胃癌、 前列腺癌、 急性 T细胞白血病、 血癌、 肝癌、 内膜癌、 肺癌、 大肠癌、 黑色 素细胞瘤、 恶性肉瘤或其它恶性肿瘤。 13. 如权利要求 11所述的医药组合物， 其中该赋形剂可为稀释剂、 填充 剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂等。 |
技术领域
本发明系关于一种治疗癌症细胞及癌症干细胞 的方法， 通过 LOPAC资 料库筛选具有抑制癌干细胞球状体株分化、生 长潜力的化合物， 以期达到治 疗癌症效果的目的。 背景技术
近十年来因为干细胞研究的蓬勃发展， 开始有人推动癌症干细胞的假 说， 是因为 （1)组织中的干细胞或前期细胞在自我更新 （self-renewal)时发生 错误而产生的异常细胞； 同时此类细胞具有干细胞的特性， 包括自我更新及 分化造成肿瘤产生。根据临床的疾病的推论的 实际案例， 1945年 8月美国在 曰本广岛和长崎投下的原子弹造成大量人员伤 亡， 包含许多正值发育期的少 女， 但在 20至 30年的追踪后发现， 这些女性几乎都有乳癌发生， 而在这些 癌症细胞中可以发现突变的存在都是由于放射 线所引起的， 因此推测由于这 些女性在遭受放射线照射时是正值发育期， 而此时的乳腺中具有相当多的干 细胞存在， 因此造成这些干细胞发生突变， 引起了乳癌的发生。 进一步的证 据指出干细胞在癌症的发展中可能扮演重要的 角色的原因是因为正常的干 细胞与癌症细胞间具有许多相似的特质， 其中包含了（1)自我更新的能力； （2) 具有分化的能力； （3)活化端粒酶的表现； （4)可以活化抗细胞凋亡的路径； (5) 增加膜运输的能力及 (6)具有移动与转移的能力。 其中， 研究者便推测干细胞 在自我更新过程中的失调可能是造成肿瘤形成 的早期主要原因之一。 目前已 知有许多路径可以调控干细胞的自我更新， 包含了 Wnt、 Notch和 Hedgehog 路径。 研究指出， 这些途径在肿瘤形成过程中亦扮演重要的角色 ， 如： 在早 期的结肠癌中会发现 Wnt路径的缺失及在皮肤的基底细胞癌中有 Hedgehog 路径的缺失， Notch基因在引发肿瘤生长而最终导致结肠癌过 中所扮演的 角色。 细胞讯号传导确保着前述平衡机制， 而 Notch基因与 Wnt基因正是细 胞讯号传导的关键因子， 确保着肠道的正常发展与组织。 这两种基因随肠道 组织中的干细胞增殖与分化而作用。 APC基因处于 Wnt讯号传导路径的上游 端， 其变异经常被指为引发结肠癌的肇因。 APC这种肿瘤抑制基因的两个对 偶之一若产生突变， 就会导致家族性大肠息肉症（FAP ) 。 此症主要特征在 于患者结肠中会出现数百甚至数千个腺瘤性息 肉。 百分之一的结肠癌便由此 症转变而来。 另外， 在胰脏癌、 胃癌、 前列腺癌及乳癌中亦发现有 Hedgehog 路径的缺失。 而在急性 T细胞白血病、子宫颈癌及乳癌中亦有发现 Notch路 径缺失。 在近几年的研究指出， 在各种癌症中所找出的癌症干细胞中有共同 表现的标志蛋白， 包括 CD44+、 α6 integrin+、 βΐ integrin+、 CD133+ (Prominin) 和 ALDH +。
卵巢癌死亡率却是妇科癌症中最高的。卵巢位 于骨盆腔内，发生了肿瘤， 若非大到可由腹部触摸到， 并不容易发现。 其常有的下腹不适， 恶心、 厌食 又常与胃肠疾病的症状类似。 卵巢癌在美国是一种常见的妇科癌症， 发生率 与死亡率在北美或是西欧国家一直维持稳定的 数量与比例， 同时南欧、 西欧 与亚洲发病率正逐年的增加 (Bray, Loos et al. 2005; Jemal, Siegel et al. 2008)。 同时在治疗卵巢癌非常不容易的主要因素， 在于卵巢癌复发机率非常高， 以 及容易转移， 往往再复发时， 诊断都已经是癌化后期阶段， 因此需要更多的 医疗资源去治愈，但仍维持非常高的死亡率 (Jemal, Siegel et al. 2008)。治疗卵 巢癌上主要使用传统治疗方式包含： 手术摘除癌变组织； 放射线疗法， 使实 心肿瘤萎缩； 化学疗法， 快速阻杀癌细胞， 但是成效有限 (Cannistra 2004)。 卵巢癌个案死亡率在过去十年居高不下也让人 非常的讶异 (Oriel, Hartenbach et al. 1999; Jemal, Siegel et al. 2008)。 缺乏人口造因分析的数据资料辅助、 高 死亡率、 延误治疗、 以及尚无有效的预警机制的情况下， 卵巢癌发生机会、 死亡率及普遍性有逐年攀升的趋势。
针对大部分所获知的肿瘤分析的数据得知， 卵巢癌的发生、 生长与分化 的结果， 在每个检体中呈现出很大的差异， 让科学家思考癌干细胞的作用与 机转，是否为造成癌细胞间差异性的主要原因 （Reya, Morrison et al. 2001 )。 一 般正常的干细胞是可进行无限自身更新的细胞 ， 并且可以进一步分化为许多 种细胞或是组织形式， 胚胎干细胞与成人干细胞具有分化为不同组织 的能 力， 取决于可塑性的差异， 相对的大部份的体细胞自行更新的能力有限， 这 是由于端粒 (telomere)变短的原因。 实验证明， 将未分化的单一白血病细胞转 殖至小鼠体内， 结果使得受转殖的小鼠亦罹患白血病。 癌干细胞是从癌化的 组织或是细胞团中取得， 目前认为癌干细胞 (cancer stem cells , CSCs)与一般 成体干细胞的分子标志和细胞型态上相似， 经过长期的研究， 造血干细胞的 表面抗原表现应该是同时带有 CD34、 CD90、 CD133等表面抗原。利用 CD34 和 CD133表面抗原及三磷酸腺苷结合盒亚家族 G2抗体 (ATP-binding cassette sub-family G member 2： ABCG2) , 来进行确认造血干细胞， 发现 ABCG2的 表现与边缘细胞 (side population)密切相关， 干细胞细胞膜表面会高度表现 ABCG2 , ABCG2能在不同来源的干细胞中表现， 并且和干细胞在分化相关 的原始特性及间叶干细胞在人体可能存在的位 置有极大的相关性。 此腺膘呤 会将赫斯特染色 (Hoechst 33342)由核内排除在外， 因此可透过流式细胞仪 (Flow Cytometry)来界定干细胞， 赫斯特染料 (Hoechst 33342)染色定量法可得 知 DNA的浓度， 此染色属于荧光染色中的一种， 使用在荧光显微观察下标 示 DNA, 辨识内含 DNA的细胞核及粒腺体的位置。 观察与比对 DNA染色 的数据之后， 可以从一般细胞中分离具有干细胞潜力的细胞 。 而细胞之间并 不会彼此造成癌化的现象， 但是具有致癌性 (Tumorigenic)的细胞则会造成周 围细胞癌化的发生。 癌干细胞有别于癌细胞与人体一般的干细胞， 亦具有分 化、 增生及自我更新的能力。 癌干细胞的发现与概念在 1960年时就被提出， 指出癌干细胞在实验室培养的环境中， 具有可不断的分化与增生的能力， 同 时在体内形成肿瘤。 之后的研究中， 已经成功从急性髓球性白血病（acute myeloid leukemia)中分析出具有干细胞特征的癌干细胞。 更进一步在 2003年， 科学家从乳癌肿瘤中成功分离出具有干细胞特 性的癌干细胞。 自此之后， 越 来越多具有癌干细胞特性的边缘细胞 (side population), 如： 脑瘤、 黑色素瘤、 肺癌、 前列腺癌、 胰脏癌、 头颈癌、 结肠癌、 肝癌以及晚期的卵巢癌。 癌干 细胞造成化疗与放射线治疗失效的主要因素之 一。 因此了解癌干细胞转移与 机转将会影响癌症诊疗的判断与治疗。
在组织或是细胞中的癌干细胞数量是非常稀少 的， 同时又缺乏一般癌症 所周知的型态， 因此界定癌干细胞的功能特性是重要且不易的 。 通过赫斯特 (Hoechst)染色， 成为干细胞探针去辨识干细胞膜上的通透孔， 如 ABC运输 蛋白 (ATP-binding cassette), 多重抗药性蛋白 (Multidrug resistance; MDR1)、 乳癌细胞抵抗蛋白 1 (Breast Cancer Resistance Protein 1 , BCRP1)、 ABC运输 蛋白亚家族 G2抗体（ ATP binding cassette, sub-family G、 member 2 )(ABCG2) 这些因子已被证实表现于干细胞上。 Bcrpl/ABCG的表现更突显出具有癌干 细胞特性的关键。 赫斯特 (Hoechst)染色技术去辨识边缘细胞中具有癌干细 胞 活性在本发明具有代表性意义。
除了利用上述标记之外，利用选择性无筛选标 示基因（marker-free)研究法 来探讨球状细胞系（cell spheres)的分化方式，可以帮助我们更进一步了 尚未 分化具有多种能力的干细胞 (sphere stem cells)分化的方式与路径， 一般而言 这样的球状干细胞团含有 4-20%的干细胞处在 "静止状态"的未分化阶段， 但 是却具有高分化的特性。 类似的研究表现在从乳房组织及人类癌症组织 分离 出， 具有干细胞特性的非沾黏性球状体。 这些具有分化能力的癌干细胞团， 在习知特定癌干细胞分子标志： ABCG2、 CD117、 CD133亦多呈现阳性反应。
在卵巢癌研究的领域中， 利用卵巢癌病人身上所抽取的腹水所挑选出 的亚克隆 (subclone)球状体干细胞的实验， 亦可利用 OCT4、 胚胎干细胞调控 蛋白 (NANOG)、CD133基因特征及蛋白质表现来侦测癌干 细胞的表现， OCT4 为哺乳动物胚胎早期发育重要转录因子之一， 只会表现在具有分化能力的全 能细胞中， 故 OCT4会参与细胞分化的过程。 在部分癌症细胞中， 可以找到 CD133 基因标记的癌症干细胞， 以及 OCT4 与胚胎干细胞调控蛋白 (NANOG), 可藉此判断癌症病患癌症或增殖是转移来判断 存活期。 与在哺乳 类动物边缘细胞染色排除筛选癌干细胞中， 从卵巢癌球状体细胞团的形成团 中， 利用 CD44/CD117标记成功分离出卵巢癌初始细胞。 这样的技术更有利 于培养更有效的新型治疗药物。 结合染色排除技术与以及球状体形成模式分 析可增加卵巢癌初始细胞分离出。藉由高通量 药物筛选技术 (High Throughput Drug Screening)亦可找出针对卵巢癌初始细胞、 或其它癌症初始细胞 (癌干细 胞)最具疗效的药物。
据悉， 癌干细胞活动为癌细胞复发与扩散的主要因素 ， 传统治疗癌细胞 系利用临床摘除、 化学药剂、 放射线毒杀方式， 以期达到减少癌细胞数量， 但若无法抑制癌干细胞活性， 则癌症扩散与复发机率非常高。 传统上治疗癌 症已知的方法仍有诸多缺失， 且转移复发率高， 实非一良善的设计， 而亟待 加以改良， 找寻更直接的治疗方式， 以期达到及早预防、 及早治疗之效。 本案发明人鉴于上述已知的治疗癌症方法各项 缺点， 乃亟思加以改良创 新，寻觅各种可以治疗癌干细胞与药物配方， 并经多年苦心孤诣潜心研究后， 终于成功研发完成本件用于治疗癌症的化合物 及其应用。 发明内容
本发明的目的即在于提供一种已发现的化合物 做为抑制癌干细胞的药 物， 藉以影响癌干细胞的分化与增生。 其抑制癌干细胞作用与机制系分别藉 由 投 入 化 合 物 吡 咯 烷 二 疏 代 氨 基 曱 酸 铵 (Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)、 （E)3-((4-叔丁苯基)硫酰) -2-丙烯腈 (Bay 11 -7085)、 (2，Ζ,3Έ)-6-溴散红 -3'-肟 ((2，Z,3，E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO)), γ-4-二 羟基 -2-(6-羟基 -1-庚烯基 )-4-环戊烷巴豆酸 λ-内酯 (Brefeldin A)、 布他拉莫 ((+)-Butaclamol)、卡西霉素 (Calcimycin)、 1- [双 ( 4 -氯苯基）曱基] -3-[ 2 -( 2 , 4 -双氯 苯基) -2-(2,4-双氯苯氧基）乙基] -1氢-咪唑盐类 (Calmidazolium chloride), 氯化 白屈菜赤碱 (Chelerythrine chloride)、 4,5,6,7-四溴苯并咪唑 (CK2 Inhibitor 2)、 N 2 - (顺 -2-胺基环己基) -N 6 -(3-氯苯基）-9-乙基 -9H-嘌呤 -2,6-二胺盐酸盐 (CGP-74514A hydrochloride), 7-三氟曱基 -4-(4-曱基 -1—哌嗪基)吡咯 -[1,2-a]喹 喔啉马来酸盐 (CGS-12066A meleate)、 地喹氯铵 (Dequalinium dichloride) , 二 氩乌本苷 (Dihydroouabain)、 氯化二苯換盐 (Diphenyleneiodonium chloride)、二 盐酸吐根碱水合物 (Emetine dihydrochloride hydrate) , N-[4-曱氧基 -3-(4-曱基 -1-哌嗪基)苯基] -2'-曱基 -4'-(5-曱基 -1,2,4-噁二唑 -3-基) -Ι,Γ-二苯基 -4-羧基酰 胺水合盐酸盐 (GR 127935 hydrochloride), 3,4-二氢 -2,2-二曱基 -2H-并 [1,2-B] 吡喃 -5,6-二酮（beta-Lapachone)、 氯硝柳胺（Niclosamide)、 硝苯吡啶 (Nifedipine)、 6-亚硝基 -1,2-苯并吡喃酮（6-Nitroso-l,2-benzopyrone)、 棕榈酰 -DL-肉碱盐酸盐 (Palmitoyl-DL-Carnitine chloride), 小白菊内酯 (Parthenolide)、 4-(4-氟苯基 )-2-(4-硝基苯 )-5-(4-吡啶) - 1H-咪唑 (PD 169316), 1,10-—水二氮杂 菲 (1,10-Phenanthroline monohydrate) 、 4- 苯基 -3- 氧化 夫咱 象腈 (4-Phenyl-3 -furoxancarbonitrile) , 盐酸 ρ 坐口秦 (Prazosin hydrochloride) , 原 卜淋 二 ]盐 (Protoporphyrin IX disodium)、 套纳克林二盐酸盐 (Quinacrine dihydrochloride) , 乌本苷 (Quabain)、 维生素 A 酸对-羟基苯胺 (Retinoic acid p-hydroxyanilide)、 #大毒素 (Rottlerin)、 血才艮碱盐酸盐 (Sanguinarine chloride)、 二硫化四乙基秋兰姆 (Tetraethylthium disulfide)及 3-[1-(3Η-咪唑 -4-基) -亚曱 (Z)-基] -5-曱氧基 -1,3-二氢 -2-吲哚酮 (SU 9516)进行试验，藉以抑制癌干细胞的 分化与增生。 其可作为单一试剂或与其它抗癌治疗法组合。
尤其， 上述化合物药物会诱发癌干细胞的凋亡； 且经由赫斯特 (Hoechst 33342)染色法、 流式细胞仪检测 (Flow Cytometry) , 生长分化区域分析 (area analysis) ,分化动力学分析 (proliferation dynamics) ,影像分析对比 (image-based screen assay),细包生长抑杀试验 (MTS assay),临床动物实验 (preclinical animal study)等方法， 发现当癌干细胞株加入上述化合物， 会导致癌干细胞凋亡。
本发明的目的即在于使用上述的化合物在药学 上可接受的盐类、 溶剂合 物或在药学上具有药学功能的衍生物， 以抑制其癌细胞及其癌干细胞， 其癌 症的种类指下列中的一种： 子宫颈癌、 乳癌、 结肠癌、 胰脏癌、 胃癌、 前列 腺癌、 急性 T细胞白血病、 血癌、 肝癌、 内膜癌、 肺癌、 大肠癌、 黑色素细 胞瘤或恶性肉瘤。
本发明的抑制癌症生长的医药组合物中， 可加入药学上可接受的赋形剂 中的稀释剂、 填充剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂等作为临床医学上可使用于 治疗癌症的剂型。 附图说明
图 1A系利用 Hoechst 33342(赫斯特染料)显示四种不同的癌症细胞株 图 1B投以 ABCG2抑制剂至癌干细胞株，发现施以 ABCG2抑制剂之后细胞 数有明显下降。 图 1C为癌干细胞株大小的分析， 图 1D将癌干细胞殖于培养 中培养， 形成球状结构。
图 2A 系利用蛋白质标记分析癌干细胞是否具有 NANOG, OCT4 及
NESTIN表现， 经过流式细胞仪分析。 图 2B进一步区分卵巢癌细胞 (CP70) 及卵巢癌干细胞 (CP70 SPS)细胞表面具有 (CD34, CD44, CD133)表现差异。
图 3A系利用 Hoechst 33342显示， 投以 ABCG2抑制剂至乳癌干细胞 (MCF-7 sps), 发现施以 ABCG2抑制剂之后细胞数有明显下降。 图 3B系进 一步区分乳癌干细胞 (MCF-7 sps), 细胞表面具有 (CD24及 CD44)表现差异。 图 3C系利用蛋白质标记分析癌干细胞是否具有 NANOG, OCT4, NESTIN及 ABCG2表现， 经过流式细胞仪分析的结果。 。 图 3D将癌干细胞殖于培养亚 中培养， 形成球状结构。
图 4A系乳癌干细胞 (MCF-7 sps)注射入大鼠体内诱发癌肿瘤的发生。 图
4B系为投以抗癌药物紫杉醇 (Paclitaxol), 对乳癌干细胞 (MCF-7 sps)、 人类乳 腺上皮细胞癌 (MDA-MB 231)及人类乳腺上皮细胞癌干细胞 (MDA-MB 231 sps)毒杀情形。
图 5A系投以浓度 2.1mg/cc DK , 30μΜ GSI与 30μΜ cyclopamide (环巴 胺）等讯息抑制剂， 3天后观察 Wnt, NOTCH及 shh抑制的发生情形。 图 5B系投以 NOTCH抑制剂 3(^M GSI后， 发现癌干细胞会聚集， 进而造成肿 瘤球状体的形成。
图 6A系投以氯硝柳胺 (Niclosamide)对于乳癌干细胞 (MCF-7 sps)具有明 显的抑制效果。 图 6B系投以氯硝柳胺 (Niclosamide)于乳癌细胞 (MCF-7)及人 类乳腺上皮细胞癌 (MDA-MB 231)的抑制情形。
图 7A系投以氯硝柳胺 (Niclosamide)实验中，观察与乳癌密切相关的结 蛋白（Cyclin Dl)、 子宫颈癌密切相关的结合蛋白（Hes-1)及与胰腺 癌密切相关 的结合蛋白（PTCH)的抑制效果。 图 7B 系投以氯硝柳胺 (Niclosamide)于乳癌 细胞 (MCF-7)、乳癌干细胞 (MCF-7 sps)、人类乳腺上皮细胞癌 (MDA-MB 231) 及人类乳腺上皮细胞癌干细胞 (MDA-MB 231 sps)的细胞存活率。
图 8A系将已诱发乳癌的大鼠， 投以化合物氯硝柳胺 (Niclosamide)观察， 有处理的乳癌大鼠其肿瘤有明显变化。 图 8B 系将已诱发乳癌的大鼠， 投以 化合物氯硝柳胺 (Niclosamide)观察， 有处理的乳癌大鼠其重量有明显变化。
图 9系针对不同的癌细胞进行 ALDH-1表现分析。
图 10A系卵巢癌干细胞与卵巢癌细胞活性存活测试 。图 10B系投以抗癌 药物顺氯氨铂（Cisplatin ) (CDDP), 观察卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干细胞 (CP70 SPS)存活数量上差异。 图 10C系为投以抗癌药物顺氯氨铂（Cisplatin ) (CDDP), 对不同分化程度的卵巢癌细胞 (CP70)存活率。
图 11A系卵巢癌干细胞 (CP70 sps)注射入大鼠体内诱发癌肿瘤的发生。 图 11B系卵巢癌细胞 (CP70)入大鼠体内诱发癌肿瘤的发生情形。
图 12 系对于卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干细胞 (CP70 SPS)投以化合物 氯硝柳胺 (Niclosamide)、 楸毒素（Rottlerin)、 盐酸布他拉莫（(+)-Butaclamol hydrochloride)观察癌干细胞抑制与细胞存活率。
图 13A系将已诱发卵巢癌的大鼠， 投以化合物氯硝柳胺 (Niclosamide)观 察， 有处理的卵巢癌大鼠其肿瘤有明显变化。 图 13B将卵巢取下观察， 投以 化合物氯硝柳胺 (Niclosamide)的罹癌大鼠其卵巢癌细胞数被抑制
图 14 将化合物氯硝柳胺 (Niclosamide)在体外共同培养于人类卵巢癌干 细胞的培养基中， 卵巢癌干细胞数受到抑制。
图 15 将化合物布他拉莫 ((+)-Butaclamol)在体外共同培养于人类卵巢癌 的干细胞培养基中， 卵巢癌干细胞数受到抑制。 具体实施方式
实施例一
一、 试验材料
试验材料包含卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干细胞 (CP70 sps) , 利用 Hoechst dye 33342 (赫斯特染料 )对 CP70卵巢癌细胞， 进行 side population (边缘细胞） 的筛选， 再将筛选到的细胞， 置于癌干细胞的培养液中， 使其 形成卵巢癌干细胞（CP70 sps ) ； 为了进一步验证经上述步骤所培养出的卵 巢癌干细胞的状态， 将经培养获得的卵巢癌干细胞 (CP70 sps)标记后确认 NANOG, OCT4及 NESTIN胚胎干细胞标记及 ABCG2、 CD34、 CD44、 CD 133 及 ALDHl癌症干细胞标记等已知与干细胞有关的标 ， 亦都呈现增加的现 象 (如图 1A、 1B、 1C及 2A、 2B所示）， 且卵巢癌干细胞 (Cp70 sps)呈现球状 结构 (如图 1D所示）。
确定卵巢癌干细胞 CP70 sps的干细胞分化特性
取卵巢癌干细胞 (CP70 sps)继代第 0代 (ρθ)的细胞， 将卵巢癌干细胞利用 腹膜内（intraperitoneally)注射至免疫不全模式鼠 NOD/SCID体内。 经过 70日 的体内所取得的肿瘤细胞为继代第一代 (p 1 )。 为比较不同分化能力的癌干细 胞在体内所产生的不同分化情形， 使用不同的 CP70、 CP70 spsPO及 CP70 spsPl细胞株， 再进行腹膜注射至免疫不全模式鼠 NOD/SCID体内， 观察并 纪录免疫不全模式鼠不同时期的变化， 当免疫不全模式鼠腹部产生硬块时， 给予牺牲解剖观察免疫不全模式鼠体内腹水及 肿瘤型态， 观察其肿瘤大小、 重量、 形态， 予以记录。 二、 活性生物药物试剂筛选
准备卵巢癌干细胞 (CP70 sps) 1000单位于 96孔盘各培养板中， 经过 24 小时稳定培养后，使用 LOPAC公司的资料库中各形式活性药物，投以 30μΜ 于各培养板内， 观察三日， 再利用冷光细胞活性检测试剂盒进行细胞活性 检 测癌干细胞的结构。 三、 侦测具抑制癌干细胞分化能力的各形式活性药 物
从 LOPAC公司挑选出 61种具有抑制卵巢癌干细胞 (CP70 sps)分化、 生 长潜力的化合物 (见表一)。 于 96孔盘培养板中各栽植 5000单位卵巢癌干细 胞 (CP70 sps),静置 24hr,再投以挑选出的 61种具抑制卵巢癌干细胞 (CP70 sps) 化合物， 以低浓度 3μΜ投药于各培养板中， 进而观察与测试卵巢癌干细胞 (CP70 sps)生长受到抑制结果。 使用非放射线活性检测试剂盒经过细胞生长 抑杀试验 (MTS assay)测定卵巢癌干细胞 (CP70 sps)存活率。 发现三种化合物 氯硝柳胺 (Niclosamide)、 楸毒素（Rottlerin)及盐酸布他拉莫（(+)-Butaclamol hydrochloride)具有显著的抑制效果。 表一、 LOPAC公司的资料库中各形式活性药物 选择试剂
总试剂
种类 （Class ) ( Selective
编号
agent )
细胞毒素剂 ( Cytotoxic agent ) 91 10
生化 ( Biochemistry ) 43 4 腺苷 ( Adenosine ) 53 1 肾上腺素受体 ( Adrenoceptor ) 102 2
荷尔蒙 ( Hormone ) 31 1 选择试剂
总试剂
种类 （Class ) ( Selective
编号
agent )
胆碱能药 （Cholinergic ) 77 1
Somatostain 2 1
神经递质 ( Neurotransmitter ) 423 14
细胞内 4丐 ( Intracellular Calcium ) 7 3
离子泉和离子通道 ( Ion pump 72 7
and ion channel )
多 药 耐 药 （Multi-Drug 12 2
Resistance)
氮氧化物 ( Nitric Oxide ) 36 3
騎酸化 ( Phosphorylation ) 92 8
速激肽（ Tachykinin ) 5 1
1258 61
四、 氯硝柳胺 (Niclosamide)对卵巢癌干细胞 (CP70 sps)的抑制模式
于 96孔盘培养板中各栽植 5000单位卵巢癌干细胞 (CP70 sps) ,于不同培 养板中投以不同浓度的化合物氯硝柳胺 (Niclosamide) , 从 2.25μΜ至 18μΜ, 同一药剂量给予 2组重复观察，观察 3天，经过细胞生长抑杀试验 (MTS assay) 测定卵巢癌干细胞 (CP70 sps)存活率。 同时进行临床测试， 将两组各五只小 鼠注射 Ι χ ΙΟ 4 单位的卵巢癌干细胞 (CP70 sps)于小鼠体内，其中一组给予每天 每公斤 10mg的化合物氯硝柳胺 (Niclosamide)投药， 进行 1至 47天。 实验进 行后第 36天， 两组的小鼠每三天纪录其体重的变化至第 48天， 牺牲小鼠观 察小鼠体内腹腔肿瘤发生结点。 五、 氯硝柳胺 (Niclosamide)对卵巢癌细胞 (pdOVCICs)抑制效果试验
将由病人身上取得的卵巢癌细胞 (pdOVCICs) , 于 96孔盘培养板中各栽 植 5000单位卵巢癌细胞 (pdOVCICs) , 于不同培养板中投以不同浓度的化合 物氯硝柳胺 (Niclosamide) , 同一药剂量给予 2组重复观察， 观察 3天， 经过 细胞生长抑杀试验 (MTS assay)测定卵巢癌细胞 (pdOVCICs)存活率。 实施例二、 乳癌细胞 (MCF-7)分化成乳癌干细胞 (MCF-7 sps)与氯硝柳胺 (Niclosamide)抑制性
试验材料包含乳癌细胞 (MCF-7)及乳癌干细胞 (MCF-7 sps),利用 Hoechst dye 33342对乳癌细胞 (MCF-7), 进行 side population (边缘细胞）的筛选， 再 将筛选到的细胞， 置于癌干细胞的培养液中， 使其形成乳癌干细胞 (MCF-7 sps);为了进一步确认经上述步骤所培养出的乳 干细胞 (MCF-7 sps)的状态， 将经培养获得的乳癌干细胞 (MCF-7 sps)标记后确认 NANOG, OCT4 及 NESTIN胚胎干细胞标记及 ABCG2、 CD24及 CD44癌症干细胞标记等已知 与干细胞有关的标记， 亦都呈现增加的现象 (如图 3A、 3B及 3C所示）， 且卵 巢癌干细胞 (Cp70 sps)呈现球状结构 (如图 3D所示）。
比较乳癌细胞 (MCF-7)、 乳癌干细胞 (MCF-7 sps), 将乳癌干细胞经由皮 下注射至免疫不全模式鼠 NOD/SCID体内。观察并纪录免疫不全模式鼠不同 时期的变化， 当免疫不全模式鼠产生硬块时， 给予牺牲解剖观察免疫不全模 式鼠体内肿瘤型态， 观察其肿瘤大小、 重量、 形态， 予以记录， 可以发现注 射乳癌干细胞 (MCF-7 sps)的免疫不全模式鼠产生硬块， 但注射乳癌细胞 (MCF-7)的免疫不全模式鼠则没有发现硬块 (如图 4A所示）。
为比较投抗癌药物紫杉醇 (Paclitaxol), 对于乳癌细胞 (MCF-7)、乳癌干细 胞 (MCF-7 SPS)、人类乳腺上皮细胞癌 (MDA-MB 231)及人类乳腺上皮细胞癌 干细胞 (MDA-MB 231 SPS)毒杀情形， 可以发现抗癌药物紫杉醇 (Paclitaxol) 可以对乳癌细胞 (MCF-7)产生有效的抑制作用，但对于乳癌干细 (MCF-7 sps) 并没有明显的抑制 (如图 4B所示)。
于乳癌干细胞 (MCF-7 SPS)投以浓度 2.1mg/cc DK , 30μΜ GSI与 30μΜ 环巴胺（ cyclopamide )等讯息抑制剂， 3天后观察 Wnt, NOTCH及 shh抑制 的发生 (如图 5A 所示）。 经过染色观察发现乳癌干细胞 (MCF-7 SPS)会受到 Wnt, NOTCH及 shh的影响， 产生形态的改变。 另外在投以 NOTCH抑制剂 30μΜ GSI后， 发现癌干细胞会聚集， 进而造成肿瘤球状体的形成。 从以上 的实验过程中， 我们得知乳癌干细胞 (MCF-7 SPS)是含有可分化的癌干细胞 (如图 5B所示）。
从 LOPAC公司挑选具有抑制乳癌干细胞 (MCF-7 SPS)分化、 生长潜力 的化合物 1258项， 进行抑制癌分化的实验。 经过筛选后发现， 以 30种化合 物，包含 各坑二石 代氨基曱酸按 (Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate) , (Ε) 3-((4-叔丁苯基)硫酰) -2-丙烯腈 ((E)3-((4-t-Butylphenyl) sulfonyl)-2-propenenitr ile)(Bay 11-7085)、 （2，Ζ,3Έ)-6-溴靛红 -3'-肟 ((2，Z,3，E)-6-Bromoindirubin-3'-ox ime)(BIO)、 γ-4-二羟基 -2-(6-羟基 -1-庚烯基 )-4-环戊烷巴豆酸 λ-内酯 (γ-4-Dihy droxy-2-(6-hydroxy- 1 -heptenyl)-4-cyclopentanecro tonic acid λ- lactone) (Brefe ldin A)、 布他拉莫 ((+)-Butaclamol)、 卡西霉素 (Calcimycin)、 1-[双( 4 -氯苯基） 曱基] -3-[2-(2,4-双氯苯基) -2-(2,4-双氯苯氧基） 乙基] -1 氢-咪唑盐类（l-[bis(4- Chlorophenyl) methyl]-3-[2-(2,4- dichlorophenyl)-2-(2,4- dichlorobenzyloxy)et hyl]-lH-imidazolium chloride) (Calmidazolium chloride) ,氯 4匕白屈菜赤碱 (Ch elerythrine chloride), 4,5,6,7-四溴苯并咪唑 (CK2 Inhibitor 2)、 N 2 - (顺 -2-胺 基环己基) -N 6 -(3- 氯苯基 )-9-乙基 -9H-嘌呤 -2,6-二胺盐酸盐 (N 2 -(cis-2-Aminoc yclohexyl)-N 6 -(3-chlorophenyl)-9-ethyl-9H-purine-2,6-diamine hydrochloride) (C GP-74514A hydrochloride), 7-三氟曱基 -4-(4-曱基 -1-哌嗪基)吡咯 -[1,2-a]喹喔 淋马来酸盐 (7-Trif uoromethyl-4-(4-methyl- 1 -piperazinyl)pyrrolo- [ 1 ,2-a]quinoxa line maleate salt)(CGS-12066A meleate)、 地口奎氯按 (Dequalinium dichloride) , 二氩乌本苷 (Dihydroouabain)、 氯化二苯換盐 (Diphenyleneiodonium chloride) , 二盐酸吐根碱水合物 (Emetine dihydrochloride hydrate), N-[4-曱氧基 -3-(4-曱 基- 1 -哌嗪基)苯基] -2 '-曱基 -4 '-(5-曱基 - 1 ,2,4-噁二唑 -3-基)- 1 , 1 '-二苯基 -4-羧基 酰胺水合盐酸盐 (N- [4-Methoxy-3-(4-methyl- 1 -piperazinyl)phenyl]-2 '-methyl-4 ' - (5-methyl- 1 ,2,4-oxadiazol-3-yl)- 1 , 1 '-biphenyl-4-carboxamide hydro chloride hydrate)(GR 127935 hydrochloride), 3,4-二氢 -2,2-二曱基 -2H-萘并 [1,2-B]吡喃 -5,6-二酮（3,4-Dihydro-2,2- Dimethyl-2H- Naphtho[ 1,2-B] Pyran-5,6-Dione)(be ta-Lapachone), 氯硝柳胺 (Niclosamide), 硝苯吡啶 (Nifedipine), 6-亚硝基 -1,2- 苯并吡喃酮（6-Nitroso- 1 ,2-benzopyrone)、 棕榈酰 -DL-肉碱盐酸盐 (Palmitoyl-D L-Carnitine chloride), 小白菊内酯 (Parthenolide)、 4-(4-氟苯基 )-2-(4-硝基苯) - 5-(4-¾b¾-lH-^^(4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-5-(4-p yridyl)-lH-imid azole)(PD 169316)、 1,10-—水二氮杂菲（1,10-Phenanthroline monohydrate)、 4 -苯基 -3-氧^ p 夫咱象腈 (4-Phenyl-3-furoxancarbonitrile)、 盐酸 坐。秦 (Prazosin hydrochloride) , 原 卜啉二 ] (Protoporphyrin IX disodium)、 套纳克林二盐酸 盐 (Quinacrine dihydrochloride)、乌本苷 (Quabain)、维生素 A酸对 -羟基苯胺 (R etinoic acid p-hydroxyanilide) , #大毒素 (Rottlerin)、 血才艮械盐酸盐 (Sanguinarin e chloride),二石克化四乙基秋兰姆 (Tetraethylthium disulfide)及 3-[1-(3Η-咪唑- 4-基)- 亚曱 (Z)-基] -5-曱氧基 -1,3-二氢 -2-吲哚酮 (3-[l-(3H-Imidazol-4-yl)-meth- (Z)-ylidene]-5-methoxy-l,3-dihydro-indol-2-one)(SU 9516)加入乳癌干细包 (； M CF-7 SPS)及卵巢癌干细胞 (CP70 sps)中结果如表二及表三所示，其中化合物 氯硝柳胺 (Niclosamide)可以抑制乳癌干细胞 (MCF-7 SPS)的形成。 观察与比 较乳癌干细胞 (MCF-7 SPS), 体外培养 2天后， 分别投以 3μΜ及 30μΜ化合 物氯硝柳胺 (Niclosamide)静置 48小时， 结果发现化合物氯硝柳胺 (Niclosami de)可有效抑制球状体增生与分化。利用软件 image pro plus软件分析其形态 与数量。进一步在乳癌干细胞 (MCF-7 sps)及人类乳腺上皮细胞癌 (MDA-MB 231)投以 3μΜ化合物氯硝柳胺 (Niclosamide),发现皆有明显抑制的现象 (如表 二所示)。
表二、 抑制乳癌干细胞的化合物
Penicillium brefeldianum )
1,10-—水二氮杂菲 7
二盐酸吐根碱水合物 7.3
小白菊内酯 7.3
(s)-(+)-喜树碱 8.2
CK2 Inhibitor 2 8.3
PD 169316 8.8
5肖^ ^比 1 ^ 8.8
二氢乌本苷 9.1
宗榈酰 -DL-肉碱盐酸盐 9.7
氯化白屈菜赤碱 9.9
CGP-74514A hydrochloride 10
二石克化四乙基秋兰姆 10.18
SU 9516 10.7
维生素 A酸对 -羟基苯胺 13
CGS-12066A maleate 16.3
根据实验的结果发现， 氯硝柳胺 (Niclosamide)对于乳癌干细胞 (MCF-7 SPS)具有明显的抑制效果。 根据前述， 利用分化动力学分析 (proliferation dynamics)观察氯硝柳胺 (Niclosamide)表现在乳癌干细胞 (MCF-7 SPS)反应上， 可得证当氯硝柳胺 (Niclosamide)浓度越高， 或是置留时间越长， 对于乳癌干 细胞 (MCF-7 SPS)毒杀、 抑制效果亦随之提升 (如图 6A所示）。
氯硝柳胺 (Niclosamide)对于人类乳腺上皮细胞癌干细胞 (MDA-MB231 SPS)与人类乳腺上皮细胞癌细胞 (MDA-MB231)的抑制反应中，发现氯硝柳胺 (Niclosamide)对于人类乳腺上皮细胞癌细胞 (MDA-MB231)有显著的抑制产 生 (如图 6B所示）。 同时随着氯硝柳胺 (Niclosamide)投以人类乳腺上皮细胞癌 干细胞 (MDA-MB231 SPS)的实验中得知， 人类乳腺上皮细胞癌干细胞 (MDA-MB231 SPS)存活率与氯硝柳胺 (Niclosamide)置放产生显著的负相关 (如图 7B所示）。
此外， 分别比较乳癌干细胞 (MCF-7 sps)在投以氯硝柳胺 (Niclosamide)实 验中， 观察与乳癌密切相关的结合蛋白（Cyclin D1)抑制率为 57.4%、 与子宫 颈癌密切相关的结合蛋白（Hes- 1 )抑制率为 33.1 %及与胰腺癌密切相关的结合 蛋白（PTCH)抑制率为 79.2%都有明显被抑制的效果 (如图 7A所示）。经过流式 细胞仪检测 (flow cytometry), OCT4在施以 5 μΜ氯硝柳胺 (Niclosamide)于乳 癌干细胞 (MCF-7 sps)上的表现中发现， 投以氯硝柳胺 (Niclosamide)的乳癌干 细胞 (MCF-7 sps) OCT4浓度较高。投以 5μΜ氯硝柳胺 (Niclosamide)的免疫不 全模式鼠 NOD/SCID上乳癌干细胞 (MCF-7 sps)上的表现，可以观察到投以氯 硝柳胺 (Niclosamide)的小鼠其体内肿瘤的大小与重量皆 未投药的小鼠小且 轻 (如图 8A及 8B所示）。
实施例三、 卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干細胞 (CP70 sps)与氯硝柳胺
(Niclosamide)抑制性
从 LOPAC公司筛选出 1200种以上具有抑制卵巢癌细胞 (OVCA)及卵巢 癌干细胞 (OVCA sps)分化、生长潜力的化合物，利用细胞生长 杀试验 (MTS assay)与腺苷三磷酸活性检测 (ATP-based assay)比较细胞存活率， 如表三所示 为筛选过的化合物对于卵巢癌干细胞 (OVCA sps)的抑制效果。
表三、 抑制卵巢癌细胞的化合物
从 LOPAC公司挑选出 60种具有抑制癌干细胞分化、 生长潜力的化合 物， 分别投以低浓度 3μΜ化合物以检视卵巢癌细胞 (OVCA)及卵巢癌干细胞 (OVCA sps)细胞毒杀性。 最后发现三种最具毒杀癌细胞能力的化合物： 盐酸 布他拉莫（(+)-Butaclamol hydrochloride)、 氯硝'柳胺 (Niclosamide)及楸毒素 (Rottlerin)。氯硝柳胺 (Niclosamide)与楸毒素 (Rottlerin)对卵巢癌干细胞 (OVCA sps)最具毒杀能力。盐酸布他拉莫 ((+)-Butaclamol hydrochloride)则是同时对卵 巢癌细胞 (OVCA)及卵巢癌干细胞 (OVCA sps)具有细胞毒杀能力。 在临床动 物卵巢癌实验中， 氯硝柳胺 (Niclosamide)表现出亦可成功抑制癌干细胞。
利用流式细胞仪检测 (flow cytometry)标示，使用抗体如人类 OCT4抗体、 NANOG、 NESTIN等蛋白质标志。 OCT4为哺乳动物胚胎早期发育重要转录 因子之一， 只会表现在具有分化能力的全能细胞中， 其中 OCT4 与 NANOG 参与胚胎干细胞 (embryonic stem cells , ES cells)分化重要调控因子， NESTIN 是胚胎时期表现的中间丝蛋白质， 主要出现于移行及进行细胞分裂中的细 胞， 包括神经干细胞、 星形胶细胞， 以及未成熟的月几细胞。 NESTIN常用以 标定不同时期的分化细胞， 以及发育阶段的细胞。 实验结果得知， 比较癌干 细胞边缘细胞群 (side population CP70sps cells)与癌干细胞株 (CP70sp)，癌干细 胞边缘细胞群 (side population CP70sps cells) NANOG, NESTIN有显著的增 加。
以及利用干细胞探针去辨识干细胞膜上的通透 孔， 以表示该细胞具有干 细胞特征， 包括 ABCG2及 ALDH-1。 结果显示， ABCG2与 ALDH-1表现在 卵巢癌干细胞 (CP70 sps)比卵巢癌细胞 (CP70)高出许多（如图 9所示）。 利用流 式细胞仪检测 (flow cytometry)标示， 蛋白质 CD34、 CD44或 CD133的表现， 在卵巢癌干细胞 (CP70 sps)表现量皆比卵巢癌细胞 (CP70)高。
卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干细胞 (CP70 sps)由亲源细胞株 A2780s分 化而得。 使用抗癌药物顺氯氨铂 (Cisplatin)在亲源细胞株 A2780s上， 比较从 LOPAC公司挑选出 60种具有抑制癌干细胞分化、 生长潜力的化合物， 观察 到卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干细胞 (CP70 sps)成功被抑制。同时随着投药时 间的延长， 癌细胞的存活率呈现显著的下降 (如图 10A、 10B及 10C所示）。
卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干细胞 (CP70 sps)腹腔注射入免疫不全模式 鼠 NOD/SCID上， 诱发肿瘤发生 (如图 11A及 11B所示）。投以三种最具毒杀 癌细胞能力的化合物： 氯硝柳胺 (Niclosamide)、 楸毒素 (Rottlerin)及盐酸布他 拉莫 ((+)-Butaclamol hydrochloride) , 投药在卵巢癌细胞 (CP70)及卵巢癌干细 胞 (CP70 sps),发现三种化合物氯硝柳胺 (Niclosamide),楸毒素 (Rottlerin)及盐 酸布他拉莫 ((+)-Butaclamol hydrochloride)对卵巢癌干细胞 (CP70 sps)有显著 的抑制效果。盐酸布他拉莫 ((+)-Butaclamol hydrochloride)对卵巢癌細胞 (CP70) 亦有毒杀作用（如图 12所示）。
投以 5μΜ 氯硝柳胺（Niclosamide)在卵巢癌干细胞 (side population CP70sps cells)免疫不全模式鼠 NOD/SCID上， 比较卵巢肿瘤差异上的表现， 可以观察到投以氯硝柳胺 (Niclosamide)的小鼠其体内肿瘤的大小与重量皆 未投药的小鼠小且轻 (如图 13A及 13B所示）。
从人类卵巢癌病患体中取得卵巢癌干细胞 (OVCICs sps), 在体外施以氯 硝柳胺 (Niclosamide)进行毒杀观察。同时亦可证实氯硝 胺 (Niclosamide)可以 成功抑制卵巢肿瘤的分生与增长 (如图 14所示)。
从人类卵巢癌病患体中取得卵巢癌干细胞 (OVCICs sps), 在体外施以盐 酸布他拉莫 ((+)-Butaclamol hydrochloride)进行毒杀观察。 同时亦可证实盐酸 布他拉莫 ((+)-Butaclamol hydrochloride)可以成功抑制卵巢肿瘤的分生与增 (如图 15所示）。
Next Patent: METHOD AND SYSTEM FOR TRANSMITTING SHORT MESSAGES BETWEEN DIFFERENT COMMUNICATION NETWORKS