STÉRÉO-ISOMÈRE DE CONFIGURATION DE LA DIFETHIALONE, COMPOSITION ET APPÂT RODONTICIDE LE COMPRENANT ET PROCÉDÉ DE LUTTE CONTRE DES RONGEURS CIBLES NUISIBLES

L'invention concerne un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone comme composé isolé, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention concerne donc le domaine technique de la lutte contre des populations de rongeurs cibles nuisibles.

Il est connu d'utiliser des appâts rodonticides faisant office de poison pour des rongeurs cibles nuisibles. On sait de EP 2 090 164 que la diféthialone est un anticoagulant de deuxième génération agissant à simple dose. US 2005/181003 décrit un appât rodonticide sous forme de gel comprenant de la diféthialone en proportion massique de 25 ppm.

Les appâts de EP 2 090 164 et de US 2005/181003 sont susceptibles d'être consommés par des animaux autres que des rongeurs cibles nuisibles lorsqu'ils sont mis à la disposition de rongeurs cibles nuisibles. Ils peuvent être consommés directement (consommation primaire) par des animaux domestiques ou des animaux de compagnie. Ils peuvent aussi être consommés accidentellement par des humains. Une telle consommation peut produire chez ces animaux domestiques, chez ces animaux de compagnie ou chez des humains un empoisonnement qui peut être létal.

En outre, une fraction de la diféthialone de ces appâts rodonticides peut être ingérée (consommation secondaire) par des animaux -notamment par des oiseaux- prédateurs de rongeurs nuisibles affaiblis ayant consommé un tel appât rodonticide ou par des animaux charognards de rongeurs nuisibles morts d'avoir consommé un tel appât rodonticide. Cette consommation secondaire est susceptible d'entraîner à terme la mort de ces animaux prédateurs ou charognards qui peuvent être des animaux -notamment des oiseaux- appartenant à des espèces protégées.

L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement d'animaux non-cibles - notamment des animaux domestiques ou d'élevage, des animaux de compagnie ou des humains- consommant accidentellement un tel appât rodonticide, mais aussi les risques d'empoisonnement, dit secondaire, d'animaux -par exemple de renards ou d'oiseaux- sauvages prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé de l'appât rodonticide ou d'animaux sauvages charognards de rongeurs cibles nuisibles morts empoisonnés.

L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dont la mise en œuvre respecte les règles de protection de l'environnement -notamment vis à vis de la protection des oiseaux, et en particulier des rapaces-.

L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui ne nécessitent pas, pour contrôler une population de rongeur cibles nuisibles, d'utiliser des doses massives d'un agent rodonticide et qui sont respectueux de l'environnement, de la santé humaine et des animaux non cibles -notamment des oiseaux-.

L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles susceptibles de pouvoir être utilisés pour lutter contre des rongeurs cibles nuisibles résistants à des appâts connus de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles.

L'invention vise donc aussi à proposer une alternative à des appâts rodonticides connus. Pour ce faire, l'invention concerne un énantiomère lévogyre d'un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, dit ho mo- stéréo-isomère, de formule 3-(4'-bromobiphenyl-4-yl)-l-(4-hydroxythiocoumarin-3-yl)- 1,2,3,4- tétrahydronaphtalène, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4- tétrahydronaphtalène sont de même configuration absolue.

Dans tout le texte :

- le terme « diféthialone » désigne le composé 3-(4'bromobiphenyl- 4-yl)- 1 -(4-hydroxythiocoumarin-3-yl)- 1 ,2,3,4-tétrahydronaphtalène ou 3- [3- [4- (4-bromophényl)phenyl]-l-tétralinyl]-2-hydroxy-4-thiochrom énone ou 3-[3-(4'- bromo[ 1 , 1 '-biphényl]-4-yl)- 1 ,2,3,4-tétrahydro- l-naphthalényl]-4-hydroxy-2H- 1- benzothiopyran-2-one de formule I) ci-après :

dans laquelle sont présentés les numéros des carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène ;

- le terme « stéréo-isomères » désigne des isomères de même formule semi-dé veloppée, mais dont la position relative des atomes diffère dans l'espace. L'expression « stéréo-isomères de configuration » désigne les stéréo- isomères dont la conversion de l'un en l'autre de ces stéréo-isomères de configuration nécessite une rupture/reformation d'une liaison covalente interatomique. Ainsi, l'expression « stéréo-isomères de configuration » désigne les stéréo-isomères qui ne sont pas des isomères de conformation (ou "rotamères", dont la conversion de l'un en l'autre des isomères de conformation s'accompagne uniquement d'une rotation d'une partie de la molécule selon l'axe d'une liaison σ (sigma) formée par recouvrement axial d'orbitales) ;

- le terme « homo- stéréo-isomère » de la diféthialone désigne le stéréo-isomère de configuration de la diféthialone de formule 3-(4'- bromobiphenyl-4-yl)- 1 -(4-hydroxythiocoumarin-3-yl)- 1 ,2,3,4- tétrahydronaphtalène, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4- tétrahydronaphtalène sont de même configuration absolue (1S-3S ou 1R-3R), lesdites configurations absolues étant déterminées selon les règles séquentielles de priorité et la nomenclature de Cahn, Ingold et Prelog (CIP) ;

- le terme « hétéro- stéréo-isomère » de la diféthialone désigne le stéréo-isomère de configuration de la diféthialone de formule 3-(4'- bromobiphenyl-4-yl)- 1 -(4-hydroxythiocoumarin-3-yl)- 1 ,2,3,4- tétrahydronaphtalène, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4- tétrahydronaphtalène sont de configurations absolues distinctes (1S-3R ou 1R- 3S) lesdites configurations absolues étant déterminées selon les règles séquentielles de priorité et la nomenclature de Cahn, Ingold et Prelog (CIP) ;

- le terme « quantité » s'entend d'une quantité molaire, d'une quantité massique ou d'une quantité volumique. Les proportions sont donc des proportions d'une quantité molaire rapportée à une quantité molaire, d'une quantité massique rapportée à une quantité massique, ou d'une quantité volumique rapportée à une quantité volumique ;

- le terme « sensiblement » indique, de façon habituelle, qu'une caractéristique structurelle ou fonctionnelle ne doit pas être prise comme marquant une discontinuité abrupte, qui n'aurait pas de sens physique, mais couvre non seulement cette structure ou cette fonction, mais également des variations légères de cette structure ou de cette fonction qui produisent, dans le contexte technique considéré, un effet de même nature, sinon de même degré ;

- les expressions « chromatographie liquide à haute pression » ou « chromatographie liquide à haute performance » (« CLHP ») désignent la chromatographie « HPLC » ou « High Performance Liquid Chromatography », et ;

- l'expression « temps de rétention » désigne la durée, mesurée au sommet du pic de chromatogramme, pendant laquelle un composé est retenu sur une colonne de chromatographie.

L'invention concerne donc l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone à l'état isolé. Elle concerne l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone à l'état séparé de l'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone et des énantiomères dextrogyre et lévogyre d'un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, dit hétéro- stéréo-isomère, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène sont de configurations absolues distinctes.

Les inventeurs ont découvert qu'il est possible de séparer les énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone et dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone par chromatographie liquide à haute pression en mode isocratique et dans des conditions particulières en utilisant une colonne de chromatographie comprenant une phase stationnaire chirale. Il n'était en effet pas connu au jour de l'invention de pouvoir séparer l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone et l'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

Les inventeurs ont réussi à réaliser cette séparation en choisissant une colonne pour chromatographie particulière HPLC LUX ^® Cellulose-3 (phenomenex, Le Pecq, France) de dimension 150 x 2 mm et comprenant une phase stationnaire chirale constituée de particules poreuses de cellulose tris(4-méthylbenzoate), d'une granulométrie de 3 μπι et d'une porosité de 1000 A. Ils ont utilisé, à titre de phase mobile, un éluant formé d'un mélange d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant de l'acide formique en proportion volumique de 0,1% dans l'eau (B) avec un rapport volumique A/B de 80/20. Le débit de la phase mobile dans la colonne est maintenu à une valeur de 0,25 mL/min et la séparation est réalisée à température ambiante. La composition à analyser est à une concentration de 1 μg de diféthialone par millilitre dans l'acétonitrile et le volume injecté sur la colonne est de 1 μL·. La détection peut être effectuée par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). La détection peut aussi être effectuée par photométrie ou par spectrophotométrie en ajustant la concentration en diféthialone et le volume d'injection aux fins d'obtenir une détection optimale et en mesurant la valeur de l'aire sous le pic de chaque énantiomère.

Dans ces conditions expérimentales, la valeur du temps de rétention (ti) de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère selon l'invention peut varier selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne- et être comprise entre 7,8 min et 8,2 min. La valeur du temps de rétention (t ₄ ) de l'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère peut varier selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne- et être comprise entre 14,0 min et 14,4 min, de sorte que les énantio mères dextrogyre et lévogyre dudit homo-stéréo-isomère peuvent être séparés par chromatographie liquide à haute pression sur une colonne chirale.

Dans ces mêmes conditions expérimentales, la valeur du temps de rétention (t ₃ ) de l'énantiomère dextrogyre dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone peut varier selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne- et être comprise entre 11,3 min et 11,8 min. La valeur du temps de rétention (t ₂ ) de l'énantiomère lévogyre dudit hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone peut varier selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne- et être comprise entre 9,0 min et 9,5 min.

Ainsi, dans ces conditions expérimentales, l'ordre d'élution des stéréo-isomères de configuration de la diféthialone est tel que ti < t ₂ < t ₃ < t ₄ . Les valeurs des temps de rétention t _l5 t ₂ , t ₃ et t sont susceptibles de varier, notamment avec la température de la colonne de chromatographie. Cependant, dans ces conditions chromatographiques, l'ordre d'élution des stéréo-isomères de configuration de la diféthialone reste inchangé.

L'invention concerne donc l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone à l'état isolé et présentant la propriété de pouvoir être élué, dans les conditions de chromatographie décrites ci-dessus, le premier parmi les quatre stéréo-isomères de configuration de la diféthialone. L'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone isolé à l'état pur selon l'invention, mis en solution dans du méthanol à une concentration de 0,81 g/L et placé dans une cuve en quartz pour spectrophotomètre, présente un spectre de dichroïsme circulaire réalisé à 25°C de valeurs de dichroïsme circulaire négatives entre 210 nm et 320 nm.

L'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone isolé à l'état pur selon l'invention, en solution dans le chloroforme (CHCt ₃ ) présente un pouvoir rotatoire spécifique [a] ^{25 C} 589 _nm mesuré à 25°C et sur la raie D du sodium (589 nm) d'une valeur de -14,8°.

L'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone isolé à l'état pur selon l'invention présente en spectroscopie par résonnance magnétique (1H-RMN) du proton à 500 MHz dans CDCt ₃ un multiplet présentant un déplacement chimique (δ) compris entre 4,9 ppm et 5,1 ppm correspondant au proton porté par le carbone 1 du groupement 1,2,3,4- tétrahydronaphtalène dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

On distingue ledit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone et ledit homo-stéréo-isomère de la diféthialone par leurs spectres RMN du proton. Sur le spectre RMN du proton réalisé dans CDCt ₃ , le déplacement chimique du proton porté par le carbone 1 du groupement 1,2,3,4- tétrahydronaphtalène dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone est compris entre 5,2 ppm et 5,4 ppm, notamment de l'ordre de 5,3 ppm.

L'invention concerne aussi une composition comprenant de l'énantiomère lévogyre selon l'invention, à l'exclusion d'un mélange racémique d'énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone, c'est-à-dire à l'exclusion d'une composition dans laquelle l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone est en mélange optiquement inactif avec l'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone.

L'invention concerne donc aussi une composition comprenant de l'énantiomère lévogyre du stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, dit homo-stéréo-isomère, de formule 3-(4'-bromobiphenyl-4-yl)-l- (4-hydroxythiocoumarin-3-yl)-l,2,3,4-tétrahydronaphtalène, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène sont de même configuration absolue, à l'exclusion d'un mélange dans lequel l'énantiomère lévogyre et l'énantiomère dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone sont en quantités égales. L'invention concerne donc une telle composition dans laquelle l'énantiomère lévogyre et l'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone sont en quantités distinctes.

Avantageusement et selon l'invention, ledit homo-stéréo- isomère est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre. Avantageusement, une composition selon l'invention comprend dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre.

Dans tout le texte, l'expression « ledit homo-stéréo-isomère est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre » signifie que la quantité (massique, molaire ou volumique) d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone est majoritaire -supérieure à 50 %- dans la quantité totale dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone présent dans la composition (sous toutes ses formes énantiomères, dextrogyre et lévogyre).

Avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone dans la composition est supérieur à 50% -notamment supérieur à 60%, en particulier supérieur à 70%, plus particulièrement supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%, plus préférentiellement supérieur à 95%, particulièrement préférentiellement supérieur à 98%, encore plus préférentiellement supérieur à 99% ou de l'ordre de 100%-. Avantageusement, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans la composition est supérieur à 75 %, de préférence compris entre 85 % et 100 %, plus préférentiellement compris entre 90 % et 99 %. Avantageusement, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone est compris entre 96 % et 100 %.

Dans une composition selon l'invention :

- la quantité d'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone rapportée à la somme des quantités de chacun des énantiomères (lévogyre et dextrogyre) dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone est supérieure à 0,5 (supérieur à 50 %) ;

- la concentration d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone rapportée à la somme des concentrations de chacun des énantiomères (lévogyre et dextrogyre) dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone est supérieure à 0,5 (supérieur à 50 ), et ;

- la proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans la composition est supérieure à la proportion de l'autre énantiomère (dextrogyre) dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. Dans une composition selon l'invention, la proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone dans la composition est de plus de 50 % par rapport audit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

Avantageusement, la composition peut comprendre une proportion d'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone, ladite proportion étant inférieure à 50 % -notamment inférieure à 25 , préférentiellement comprise entre 0 % et 25 , en particulier inférieure à 10 %- par rapport à la quantité dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

Avantageusement et selon l'invention, la diféthialone est majoritairement sous forme de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone. La composition comprend de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone avec une proportion supérieure à chacune des proportions de chacun des autres énantiomères de la diféthialone par rapport à la diféthialone.

Avantageusement, dans une composition selon l'invention : - le rapport de la quantité d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone sur la somme des quantités de chacun des énantiomères dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone et dudit hétéro- stéréo- isomère de la diféthialone est supérieure à 0,25 (supérieur à 25 %) ;

- le rapport de la concentration d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone sur la somme des concentrations de chacun des énantiomères dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone et dudit hétéro- stéréo- isomère de la diféthialone est supérieure à 0,25 (supérieur à 25 %), et ;

- la proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans la composition est supérieure à la proportion de chacun des énantiomères dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone et dudit hétéro- stéréo- isomère de la diféthialone. Dans une composition selon l'invention, la proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans la composition est de plus de 25 % par rapport à la diféthialone.

Avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de diféthialone est supérieur à 25% -notamment supérieur à 50%, en particulier supérieur à 70%, plus particulièrement supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%, particulièrement préférentiellement supérieur à 95%, plus préférentiellement supérieur à 98%, encore plus préférentiellement supérieur à 99% ou de l'ordre de 100%-. Une composition selon l'invention, comprend donc de la diféthialone majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

Avantageusement, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de diféthialone est supérieur à 70 %, de préférence compris entre 80 % et 100 %, plus préférentiellement compris entre 90 % et 100 %- par rapport à la quantité de diféthialone. Avantageusement, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de diféthialone est compris entre 95 % et 99 %. Avantageusement, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de diféthialone est compris entre 96% et 100 %. Avantageusement, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de diféthialone est sensiblement de l'ordre de 100 %.

Avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité de l'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de diféthialone est supérieur à 95%.

Une composition selon l'invention peut être sensiblement exempte d'énantiomère dextrogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone, c'est à dire que l'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone peut être présent dans la composition mais uniquement à l'état de traces. Elle peut aussi être sensiblement exempte dudit hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone c'est à dire que ledit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone peut être présent dans la composition mais uniquement à l'état de traces.

Avantageusement et selon l'invention, la composition est à l'état liquide et comprend un solvant liquide de la diféthialone. Il peut s'agir d'une solution de diféthialone dans un solvant de la diféthialone, à l'exclusion d'un mélange racémique desdits énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. Il peut aussi s'agir d'une solution comprenant de la diféthialone dans un solvant de la diféthialone et dans laquelle ledit homo-stéréo-isomère de la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre. Il peut aussi s'agir d'une solution comprenant de la diféthialone dans un solvant de la diféthialone et dans laquelle la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. Il peut aussi s'agir d'une suspension ou d'une émulsion de diféthialone dans un milieu liquide.

Avantageusement et selon l'invention, la composition est à l'état solide. Il peut aussi s'agir d'un solide comprenant de la diféthialone, à l'exclusion d'un mélange racémique des énantiomères dextrogyre et lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone. Il peut aussi s'agir d'un solide comprenant de la diféthialone et dans lequel ledit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre. Il peut aussi s'agir d'un solide comprenant de la diféthialone et dans lequel la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone.

L'invention concerne donc aussi une composition comprenant de la diféthialone, la diféthialone de la composition étant optiquement active. Il n'est cependant pas exclu que la diféthialone de la composition selon l'invention soit optiquement inactive.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un appât rodonticide pour des rongeurs cibles nuisibles.

L'invention concerne aussi un appât rodonticide comprenant une composition selon l'invention, et au moins un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles.

Un appât rodonticide selon l'invention comprend :

- au moins un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles,

- de l'énantiomère lévogyre du stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, dit ho mo- stéréo-isomère, de formule 3-(4'-bromobiphenyl-4-yl)-l- (4-hydroxythiocoumarin-3-yl)-l,2,3,4-tétrahydronaphtalène, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène dudit homo-stéréo- isomère sont de même configuration absolue, à l'exclusion d'un mélange racémique d' énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone. Dans un appât selon l'invention, l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone et l'énantiomère dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone sont en quantités distinctes.

Avantageusement, un appât rodonticide selon l'invention comprend un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles, et dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre.

Les inventeurs qui sont parvenus à séparer l'énantiomère lévogyre et l'énantiomère dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone et les énantiomères dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone et à obtenir l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone à l'état isolé, ont découvert que ledit homo- stéréo-isomère de la diféthialone est en fait le stéréo-isomère de configuration de la diféthialone qui est de plus faible rémanence hépatique chez des rongeurs cibles nuisibles. Ils ont aussi observé que l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone est l'énantiomère -parmi les deux énantiomères (lévogyre et dextrogyre) dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone- qui est le plus rémanent dans le foie de rongeurs cibles nuisibles. Mais ils ont aussi découvert que cet énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone présente une rémanence dans le foie de rongeurs cibles nuisibles plus élevée que celle dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone.

L'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone permet en fait de lutter efficacement contre des rongeurs cibles nuisibles et en particulier avec des doses réduites de diféthialone. L'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone constitue une alternative de choix pour la réalisation d'un appât rodonticide présentant une efficacité rodonticide -notamment à faible dose- et une écotoxicité acceptables. Il constitue aussi une alternative pour la réalisation d'appâts rodonticides en vue de pouvoir lutter contre des rongeurs cibles nuisibles susceptibles d'être résistants à des appâts rodonticides connus.

Avantageusement et selon l'invention, l'appât rodonticide comprend une quantité massique de diféthialone telle que le rapport (proportion massique) de cette quantité massique de diféthialone sur la quantité massique d'appât rodonticide est inférieur à 200 ppm -c'est-à-dire inférieur à 200 mg de diféthialone par kilogramme d'appât rodonticide-. Avantageusement, la proportion massique de la diféthialone dans l'appât rodonticide est comprise entre 1 ppm et 100 ppm (1 mg à 100 mg de diféthialone par kilogramme d'appât rodonticide), notamment comprise entre 5 ppm et 100 ppm (5 mg à 100 mg de diféthialone par kilogramme d'appât rodonticide), de préférence comprise entre 5 ppm et 50 ppm (5 mg à 50 mg de diféthialone par kilogramme d'appât rodonticide), plus préférentiellement comprise entre 10 ppm et 50 ppm (10 mg à 50 mg de diféthialone par kilogramme d'appât rodonticide), encore plus préférentiellement comprise entre 15 ppm et 50 ppm (15 mg à 50 mg de diféthialone par kilogramme d'appât rodonticide).

Avantageusement et selon l'invention, l'excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles est choisi pour permettre une consommation de l'appât par des rongeurs cibles nuisibles. Avantageusement et selon l'invention, chaque excipient comestible est non létal pour des rongeurs cibles nuisibles. L'excipient comestible n'est pas rodonticide en lui-même.

Avantageusement et selon l'invention, l'excipient comestible comprend au moins un aliment choisi dans le groupe formé des graines de céréale -notamment des graines de céréale décortiquées-, des moutures de graines de céréale, des farines de graines de céréale, des flocons de graines de céréale, du son de céréales et des graines non céréalières, par exemple des graines de luzerne -notamment sous forme décortiquée, sous forme de mouture, sous forme de farine, sous forme de flocons ou de son-. L'excipient comestible peut comprendre tout support susceptible d'être consommé par des rongeurs cibles nuisibles.

Avantageusement, l'excipient comestible comprend au moins un aliment choisi dans le groupe formé des aliments d'origine végétale et des aliments d'origine animale. Avantageusement, l'excipient comestible comprend au moins un aliment choisi pour stimuler l'appétit des rongeurs cibles nuisibles. En particulier, cet aliment est choisi dans le groupe formé de graines d'une ou de plusieurs céréales, de graines décortiquées d'une ou de plusieurs céréales, des moutures de graines d'une ou de plusieurs céréales, des flocons de graines d'une ou de plusieurs céréales, du son d'une ou de plusieurs céréales et des farines de graines d'une ou de plusieurs céréales. À titre d'exemple, on choisit les céréales dans le groupe formé de l'avoine, du blé, de l'orge, du maïs, du soja et du riz.

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des aliments sucrés. Par exemple, il peut s'agir d'aliments comprenant au moins un sucre choisi dans le groupe formé du saccharose, du lactose, du fructose et du glucose. Il peut s'agir d'un sirop de sucre -par exemple, d'un sirop de sucre obtenu par hydrolyse de l'amidon- ou d'un sirop de sucre obtenu par hydrolyse de saccharose (sirop de sucre inverti), ou d'un sirop de sucre de betterave, ou d'un sirop d'érable ou d'un sirop de canne à sucre, ou d'un sirop obtenu à partir d'une plante du genre stevia.

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des flocons et de la farine de l'albumen de noix de coco (coprah). Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des noix, des noisettes et des amandes -râpées et/ou en poudre-.

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des graisses végétales, des huiles végétales (par exemple huile de colza, graisse de soja, huile de tournesol, beurre de cacao, huile d'arachides, beurre d'arachides, huile de maïs, huile de palme), des graisses animales et des huiles animales (beurre, saindoux, huile de poisson).

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des protéines d'origine végétale et des protéines d'origine animale. À titre d'exemple, on peut citer par exemple le lait en poudre -notamment le lait écrémé en poudre-, les œufs -notamment les œufs en poudre-, les hydrolysats de protéines d'origine animale et les hydrolysats de protéines d'origine végétale.

Avantageusement et selon l'invention, l'appât rodonticide est choisi dans le groupe formé des appâts solides comprenant de la diféthialone et un excipient comestible solide. Avantageusement, l'appât rodonticide est un solide à l'état divisé, par exemple sous forme de boulettes ou de granulés. Avantageusement, l'appât rodonticide peut être un solide sous forme de bloc ou de pâte susceptibles d'être consommés par les rongeurs cibles nuisibles ou d'un matériau solide susceptible d'être rongé par les rongeurs cibles nuisibles. Avantageusement, l'appât rodonticide solide selon l'invention peut se présenter sous forme d'un bloc rigide, d'un bloc semi-rigide, d'une mousse, d'une poudre ou d'un gel.

Avantageusement, l'appât rodonticide se présentant sous forme d'une poudre, sous forme d'une mousse ou sous forme d'un gel est adapté pour pouvoir souiller la fourrure du(de) rongeur(s) cible(s) nuisible(s) et pour pouvoir être ingérée par celui(ceux)-ci lors de son(leur) toilettage.

Il peut s'agir d'un appât rodonticide solide comprenant de la diféthialone, à l'exclusion d'un mélange racémique d'énantiomères dextrogyre et lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. Il peut aussi s'agir d'un appât rodonticide solide comprenant de la diféthialone et dans lequel ledit homo- stéréo-isomère de la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre. Il peut aussi s'agir d'un appât rodonticide solide comprenant de la diféthialone dans lequel la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

Avantageusement et selon l'invention, l'appât rodonticide est choisi dans le groupe formé des appâts liquides comprenant de la diféthialone et un excipient comestible liquide. L'appât rodonticide est alors une boisson pour des rongeurs cibles nuisibles.

Avantageusement et selon l'invention, l'appât rodonticide est choisi dans le groupe formé des appâts liquides comprenant de la diféthialone et un excipient comestible liquide. L'appât rodonticide est alors une boisson pour des rongeurs cibles nuisibles. Il peut s'agir d'une solution de diféthialone dans un solvant de la diféthialone, à l'exclusion d'un mélange racémique d'énantiomères dextrogyre et lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. Il peut aussi s'agir d'une solution de diféthialone dans un solvant de la diféthialone et dans laquelle ledit homo-stéréo-isomère de la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre. Il peut aussi s'agir d'une solution de diféthialone dans un solvant de la diféthialone et dans laquelle la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. L'invention concerne donc aussi un appât rodonticide dans lequel la diféthialone est optiquement active. Il n'est cependant pas exclu que la diféthialone de l'appât rodonticide selon l'invention soit optiquement inactive.

Avantageusement, l'appât rodonticide comprend au moins un colorant. Un tel colorant permet en particulier de donner audit appât rodonticide une couleur aisément détectable et identifiable par une personne manipulant l'appât rodonticide.

Avantageusement, l'appât rodonticide comprend au moins un conservateur apte à assurer sa conservation lors de son stockage. Avantageusement, l'appât rodonticide comprend au moins un composé amérisant de type benzoate de dénatonium, aussi connu sous le nom de « Bitrex ^® » destiné à réduire les risques de consommation accidentelle par des organismes non cibles.

Avantageusement, dans une variante particulière, la composition et l'appât rodonticide selon l'invention comprennent exclusivement de la diféthialone à titre de substance rodonticide. En particulier, la composition et l'appât rodonticide selon l'invention sont exempts de toute autre substance anticoagulante à usage rodonticide. Cependant, dans cette variante selon l'invention, la composition et l'appât rodonticide peuvent comprendre toute substance anti-nuisible autre qu'un rodonticide, telle qu'une substance insecticide et/ou acaricide.

Avantageusement, dans une autre variante particulière, la composition et l'appât rodonticide selon l'invention comprennent de la diféthialone à l'exclusion d'un mélange racémique d'énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère et au moins une autre substance distincte de la diféthialone à titre de substance rodonticide. Cette autre substance rodonticide distincte de la diféthialone peut être une autre substance anticoagulante -notamment du type anti-vitamine K ou non- ou une autre substance rodonticide non anticoagulante.

L'invention concerne aussi un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dans lequel on dissémine une quantité d'appât rodonticide comprenant :

- au moins un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles, et ;

- de l'énantiomère lévogyre du stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, dit ho mo- stéréo-isomère, de formule 3-(4'-bromobiphenyl-4-yl)-l-

(4-hydroxythiocoumarin-3-yl)-l,2,3,4-tétrahydronaphtalè ne, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène sont de même configuration absolue ;

à l'exclusion d'un mélange racémique d'énantio mères lévogyre et dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

L'invention concerne aussi un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dans lequel on dissémine une quantité d'appât rodonticide selon l'invention, ladite quantité d'appât étant suffisante pour être rodonticide.

On dissémine donc une quantité d'appât rodonticide comprenant dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre, présentant une efficacité rodonticide acceptable même à faible dose de diféthialone. Le procédé selon l'invention permet donc de limiter l'empoisonnement secondaire de mammifères non-rongeurs et d'oiseaux susceptibles de s'alimenter avec des rongeurs morts ou vifs empoisonnés mais comprenant une quantité réduite -et notamment une quantité non létale- de diféthialone. Le procédé selon l'invention permet aussi de limiter un tel empoisonnement secondaire de mammifères non-rongeurs et d'oiseaux susceptibles de consommer préférentiellement les viscères -en particulier le foie- desdits rongeurs empoisonnés morts ou vifs.

Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, ledit homo-stéréo-isomère de la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre. Avantageusement, la diféthialone est majoritairement sous forme d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

Avantageusement et en variante selon l'invention, on choisit en combinaison : - l'excipient comestible ;

- une proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone par rapport audit homo- stéréo-isomère de la diféthialone ;

- une proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone par rapport à la diféthialone ;

- une proportion massique de diféthialone par rapport à l'appât rodonticide, et ;

- une quantité d'appât disséminé ;

de façon que des rongeurs cibles nuisibles consomment une quantité de diféthialone suffisante pour être létale pour lesdits rongeurs cibles nuisibles consommant dudit appât au cours d'une période unique de 24 heures consécutives.

Un appât rodonticide selon cette variante de l'invention est un appât mortel en une seule prise ou « one-shot » en anglais. Avantageusement et selon cette variante de l'invention, la proportion massique de diféthialone dans l'appât est comprise entre 5 ppm et 200 ppm, notamment comprise entre 5 ppm et 100 ppm, de préférence comprise entre 5 ppm et 50 ppm, plus préférentiellement comprise entre 15 ppm et 50 ppm.

Avantageusement et dans une autre variante selon l'invention, on choisit en combinaison :

- l'excipient comestible ;

- une proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone par rapport audit homo- stéréo-isomère de la diféthialone ;

- une proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone par rapport à la diféthialone ;

- une proportion massique de diféthialone par rapport à l'appât rodonticide, et ;

- une quantité d'appât disséminé ;

de façon que des rongeurs cibles nuisibles consomment une quantité de diféthialone ; o non létale pour des rongeurs cibles nuisibles, c'est-à-dire généralement non létale pour les rongeurs cibles nuisibles, consommant dudit appât pendant une période de 24 heures consécutives, et ;

o suffisante pour être létale pour des rongeurs cibles nuisibles consommant dudit appât pendant plusieurs périodes de 24 heures, lesdites périodes étant consécutives.

Cette autre variante de l'invention vise donc un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dans lequel on dissémine une quantité d'appât rodonticide létale pour les rongeurs cibles nuisibles consommant durablement cet appât rodonticide et non létale pour des rongeurs ou des animaux non cibles consommant accidentellement cet appât rodonticide. On parle alors d'un procédé de lutte « multi-doses » ou, en anglais, « multi-feeding ». Dans un tel procédé selon l'invention, la consommation d'appât rodonticide par un rongeur cible nuisible pendant une durée de 24 heures est insuffisante pour entraîner la mort dudit rongeur, alors qu'une consommation répétée d'appât rodonticide pendant au moins deux jours consécutifs permet d'entraîner la mort du rongeur cible nuisible. En outre, la consommation accidentelle d'appât rodonticide par un animal ou un humain non cible pendant une durée de 24 heures est le plus souvent insuffisante pour entraîner la mort dudit animal ou d'un humain.

L'invention vise donc un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dans lequel on met à disposition des rongeurs cibles nuisibles une quantité d'appât rodonticide susceptible d'être ingérée par les rongeurs cibles nuisibles, ladite quantité d'appât rodonticide étant suffisante pour tuer des rongeurs cibles nuisibles consommant ledit appât rodonticide pendant plusieurs jours.

Avantageusement, on adapte la quantité d'appât rodonticide disséminé, la proportion massique de diféthialone par rapport à l'appât rodonticide et la proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone par rapport à la diféthialone pour que la consommation de l'appât rodonticide soit létale pour des rongeurs cibles nuisibles consommant quotidiennement de l'appât pendant au moins deux périodes de 24 heures

-notamment de 3 à 7 périodes-.

Avantageusement, dans cette autre variante de l'invention, on dissémine une quantité d'appât rodonticide de façon que des rongeurs cibles nuisibles consomment une quantité de diféthialone suffisante pour être létale pour lesdits rongeurs cibles nuisibles consommant dudit appât pendant plusieurs périodes de 24 heures, lesdites périodes étant consécutives.

Avantageusement, dans cette autre variante d'un procédé selon l'invention, la quantité d'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone est telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de diféthialone étant supérieur à 95% -notamment de l'ordre de 100%-, la proportion massique de diféthialone par rapport à l'appât rodonticide est comprise entre 5 ppm et 50 ppm -notamment comprise entre 10 ppm et 15 ppm-.

Dans un procédé selon l'invention, on met à disposition des rongeurs cibles nuisibles une quantité d'appât rodonticide suffisante pour satisfaire quotidiennement l'appétit des rongeurs cibles nuisibles, ledit appât rodonticide comprenant une proportion majoritaire d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone.

Dans un procédé selon l'invention, on adapte la quantité d'appât rodonticide disséminé, la proportion de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone par rapport à la diféthialone et la proportion massique de diféthialone par rapport à l'appât rodonticide de façon à permettre une consommation d'appât rodonticide pendant plusieurs jours par des rongeurs cibles nuisibles, tout en limitant :

- les risques d'intoxication primaire de mammifères et oiseaux non cibles susceptibles de ne consommer qu'occasionnellement et accidentellement un tel appât rodonticide ;

- les risques d'intoxication secondaire, par exemple des prédateurs des rongeurs cibles, susceptibles de consommer des rongeurs -morts ou vifs- cibles ayant ingéré une quantité dudit appât. Avantageusement et selon l'invention, on adapte la quantité d'appât disséminé, le rapport de la masse de diféthialone sur la masse de l'appât rodonticide, le rapport de la quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone sur la quantité dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone et le rapport de la quantité de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone sur la quantité de la diféthialone pour minimiser la quantité de diféthialone (totale) dans le foie des rongeurs cibles nuisibles.

L'invention concerne aussi un procédé chromatographique d'obtention d'un énantiomère lévogyre d'un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, dit homo-stéréo-isomère, de formule 3-(4'-bromobiphenyl-4-yl)- l-(4-hydroxythiocoumarin-3-yl)-l,2,3,4-tétrahydronaphtalèn e, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène dudit homo-stéréo- isomère sont de même configuration absolue, procédé dans lequel :

- on choisit une colonne pour chromatographie liquide à haute pression de dimensions 150 x 2 mm, et comprenant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(4-méthylbenzoate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 μπι et présentant une taille moyenne de pores de 1000 À ;

- on choisit, à titre de phase mobile liquide, un mélange formé d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0,1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 et avec un débit de la phase mobile liquide dans la colonne de chromatographie de 0,25 mL/min ;

- on réalise une séparation des stéréo-isomères de configuration de la diféthialone à température ambiante lors de laquelle ;

- on introduit en tête de la colonne pour chromatographie une composition liquide comprenant dudit énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone, puis ;

- on entraîne la composition liquide avec la phase mobile dans la colonne pour chromatographie dans des conditions propres à séparer les stéréo-isomères de configuration de la diféthialone, et ; - on collecte une fraction de la phase mobile comprenant ledit énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone avec un temps de rétention ti de valeur telle que ti < t ₂ < t ₃ < t ₄ ; t ₂ , t ₃ et t ₄ représentant les temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la diféthialone distincts de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone, séparément d'un énantiomère dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone de temps de rétention t et séparément des énantiomères lévogyre et dextrogyre d'un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, dit hétéro- stéréo-isomère, dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 1,2,3,4- tétrahydronaphtalène dudit hétéro- stéréo-isomère sont de configurations absolues distinctes, et de temps de rétention t ₂ et t ₃ , puis ;

- on élimine la phase mobile liquide de ladite fraction de façon à obtenir ledit énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone.

L'invention concerne également un stéréo-isomère de configuration de la diféthialone, un procédé d'obtention d'un tel stéréo-isomère de configuration, une composition comprenant un tel stéréo-isomère de configuration, un appât rodonticide et un procédé de lutte contre les rongeurs cibles nuisibles caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre uniquement non limitatif et qui se réfèrent aux figures annexées, dans lesquelles :

- la figure 1 est un chromatogramme d'analyse par chromatographie liquide à haute pression sur une colonne chirale de la diféthialone (haut) et de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone purifié (bas) ;

- la figure 2 est un spectre de RMN du proton à 300 MHz dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone ;

- la figure 3 est un spectre de RMN du proton à 300 MHz dudit hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone ;

- la figure 4 est un spectre de RMN du proton à 500 MHz de l'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone ;

- la figure 5 est un spectre de RMN du carbone ¹³ C à 500 MHz de l'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère de la diféthialone ;

- la figure 6 est une analyse par spectroscopie de corrélation en RMN du proton (1H-RMN) à 500 MHz de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone ;

- la figure 7 est un spectre de dichroïsme circulaire de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone ;

- la figure 8 est une représentation graphique de l'évolution temporelle de la concentration hépatique chez des rats (mâles et femelles) de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone (·) et dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone (O), et ;

- la figure 9 est une représentation graphique de l'évolution temporelle de la concentration hépatique chez des rats (mâles et femelles) de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone (·) et de la diféthialone totale (Δ).

A. Purification de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone isolé

A.l. Identification dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone

On identifie Γ homo- stéréo-isomère de la diféthialone par spectroscopie par résonnance magnétique (1H-RMN) du proton. L'homo-stéréo- isomère de la diféthialone en solution dans CDCt ₃ présente un multiplet à un déplacement chimique (δ) compris entre 4,9 ppm et 5,1 ppm et correspondant au proton porté par le carbone 1 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène de la diféthialone comme illustré en figure 2.

On distingue l'hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone et Γ homo- stéréo-isomère de la diféthialone par leurs spectres RMN du proton. Sur le spectre RMN du proton réalisé dans CDCt ₃ , le déplacement chimique du proton porté par le carbone 1 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène dudit hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone (figure 3) est compris entre 5,2 ppm et 5,4 ppm. A.2. Séparation des énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone par chromato graphie liquide à haute pression

Les inventeurs ont résolu le problème complexe et non résolu à ce jour de la séparation des énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone à partir d'une préparation commerciale de diféthialone. Ils sont parvenus à réaliser une séparation analytique des énantiomères dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone par chromatographie liquide à haute pression (haute performance) sur une colonne chirale LUX ^® Cellulose-3 (Phenomenex, Le Pecq, France) de dimension 150 x 2 mm et comprenant une phase stationnaire chirale constituée de particules poreuses de cellulose tris(4-méthylbenzoate), d'une granulométrie de 3 μπι et d'une porosité de 1000 A et en utilisant, à titre de phase mobile, un éluant formé d'un mélange d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant de l'acide formique en proportion volumique de 0,1% dans l'eau (B) avec un rapport volumique A/B de 80/20. Le débit de la phase mobile dans la colonne est de 0,25 mL/min et la séparation est réalisée à la température de 23,2°C. La solution contenant l'échantillon à analyser est à une concentration de 1 μg de diféthialone par millilitre dans l'acétonitrile et est filtrée sur une membrane de cellulose régénérée de seuil de coupure de 0,2 μπι. Le volume de solution contenant l'échantillon à analyser injecté sur la colonne est de 1 μL·.

Dans un procédé de séparation des énantiomères dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone, il est possible de détecter lesdits énantiomères en sortie de colonne par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) en mode d'ionisation négative par électronébulisation (ESI, « ElectroSpray Ionization »). La température du gaz porteur est de 350°C et son débit est de 8 L/min. La pression du nébuliseur est portée à 2700 hPa. En particulier, on analyse les transitions MRM (« Multiple Reaction Monitoring » m/z 537,1 → 151,0 et m/z 537,1 → 78,9 correspondants aux signaux de la diféthialone. La figure 1 représente les chromatogrammes de la diféthialone (haut) et de l'énantiomère lévogyre de Γ homo- stéréo-isomère de la diféthialone (bas) isolé. Dans ces conditions expérimentales, la valeur du temps de rétention (ti) de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère selon l'invention est de l'ordre de 8, 1 min comme décrit figure 1. À titre de comparaison, la valeur du temps de rétention (t ₄ ) dudit énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère selon l'invention est de l'ordre de 14,4 min, de sorte que les énantio mères dextrogyre et lévogyre dudit homo-stéréo-isomère peuvent être efficacement séparés par chromatographie liquide à haute pression sur une colonne chirale.

La valeur du temps de rétention (t ₃ ) de l'énantiomère dextrogyre dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone est de l'ordre de 11,7 min et la valeur du temps de rétention (t ₂ ) de l'énantiomère lévogyre dudit hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone est de l'ordre de 9,4 min. Ainsi, dans ces conditions expérimentales, l'ordre d'élution des énantio mères de la diféthialone est tel que < t ₂ < t ₃ < t .

II est possible de réaliser dans ces conditions expérimentales (phase stationnaire, phase mobile, température) une séparation préparative des énantiomères lévogyre et dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone en utilisant une phase stationnaire similaire et de granulométrie supérieure à 3 μπι, et une colonne chromatographique de plus grandes dimensions, notamment d'un diamètre de 20 mm.

B. Caractérisation structurelle

B. l . Spectroscopie UV

Le spectre UV de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone en solution dans le chloroforme (CHCt ₃ ) présente des pics d'absorbance à 238,2 nm et 259,5 nm.

B.2. Pouvoir rotatoire

Les inventeurs ont caractérisé l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone à l'état isolé par son pouvoir rotatoire (aussi appelé activité optique ou biréfringence circulaire), c'est-à-dire par sa propriété à dévier le plan de polarisation d'une lumière polarisée. Une déviation du plan de polarisation de la lumière polarisée dans le sens horaire de rotation en faisant face au faisceau de lumière polarisée caractérise une solution et un composé optiquement actif et dextrogyre, et une déviation du plan de polarisation de la lumière polarisée dans le sens antihoraire de rotation en faisant face au faisceau de lumière polarisée caractérise une solution et un composé optiquement actif et lévogyre.

On mesure le pouvoir rotatoire d'une solution d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans le chloroforme (CHCt ₃ ) à une concentration de 11,05 g/L. On mesure le pouvoir rotatoire de cette solution au moyen d'un polarimètre digital P 2000 (JASCO, Bouguenais, France) opérant avec une lumière excitatrice de longueur d'onde de 589 nm. Le pouvoir rotatoire a moyen obtenu sur 2 séries de 10 mesures est de -1,635°. Le pouvoir rotatoire spécifique à 25°C [oc] ^{25 c} ₅₈ 9nm de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone en solution dans le chloroforme, mesuré sur la raie D du sodium (589 nm) est de -14,8°.

B.3. Dichroïsme circulaire

Le spectre de dichroïsme circulaire de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone isolé traduit la différence d'absorbance (AA=A _G -A _D ) des deux ondes de polarisation circulaire gauche (PCG) d'intensité A _G et de polarisation circulaire droite (PCD) d'intensité A _D . Il permet de distinguer les énantiomères dextrogyre et lévogyre dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone. On mesure cette différence d'absorbance des deux ondes de polarisation circulaire dans un spectromètre de dichroïsme circulaire J- 815 (JASCO, Bouguenais, France). On prépare 2 mL de solution d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans du méthanol (CH ₃ - OH) à une concentration de 0,81 mg/mL. On transfère la solution dans une cuve en quartz pour spectrophotomètre. On mesure à 25°C le spectre de dichroïsme circulaire de la solution entre 200 nm et 400 nm. Le spectre de dichroïsme circulaire de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone mesuré dans ces conditions est représenté en figure 7. La valeur de dichroïsme circulaire est négative entre les longueurs d'onde comprises entre 220 nm et 300 nm. B.4. Résonnance Magnétique Nucléaire

Les figures 2 et 3 représentent respectivement un spectre de résonnance magnétique nucléaire du proton (1H-RMN) à 300 MHz de l'homo- stéréo-isomère de la diféthialone dans CDCC ₃ (figure 2) et un spectre de résonnance magnétique nucléaire du proton à 300 MHz dans CDCC ₃ de l'hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone dans CDCC ₃ (figure 3). Ledit homo-stéréo- isomère de la diféthialone présente (figure 2) un multiplet dont le déplacement chimique (δ) est compris entre 4,9 ppm et 5,1 ppm correspondant au carbone 1 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. Ledit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone présente (figure 3) un multiplet dont le déplacement chimique (δ) est compris entre 5,2 ppm et 5,4 ppm.

La figure 4 représente un spectre de RMN du proton à 500 MHz de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans CDCC ₃ . Les spectres RMN du proton des énantiomères dextrogyre et lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone ne sont pas distinguables l'un de l'autre.

La figure 5 est un spectre RMN du ¹³ C de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone en solution dans CDCt ₃ à une concentration de 40 mg/mL réalisé sur un spectromètre Bruker AVANCE III HD (500 MHz) équipé d'une cryosonde directe multi-noyaux motorisée PRODIGY. Il permet une identification des 31 atomes de carbone de la diféthialone. Le spectre en ¹³ C-RMN de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone ne se distingue pas du spectre en ¹³ C-RMN de l'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone. Ledit homo-stéréo-isomère de la diféthialone présente un signal compris entre 34 ppm et 38 ppm caractéristique et distinctif dudit hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone.

La figure 6 est un spectre (1H-RMN 2D) RMN du proton en deux dimensions obtenu par spectroscopie de corrélation de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone en solution dans CDCt ₃ à une concentration de 40 mg/mL réalisé sur un spectromètre Bruker AVANCE III HD (500 MHz) équipé d'une cryosonde directe multi-noyaux motorisée PRODIGY. Il permet une identification du couplage du proton porté par le carbone 1 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène dudit homo-stéréo- isomère de la diféthialone avec les protons portés par le carbone 2 du groupement 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène à 2,27 ppm.

C. Extraction de la diféthialone de foies de rats traités à la diféthialone en vue de l'analyse des différents énantiomères de la diféthialone

Cl. Homogénéisation de l'échantillon de foie

On pèse avec précision de l'ordre de 0,525 g (±0,025 g) de foie de rat que l'on place dans un tube en polypropylène de 50 mL. On ajoute 10 mL d'acétone et on soumet la suspension à une homogénéisation au moyen d'un homogénéisateur/disperseur Ultra- Turrax ^® pendant une durée de l'ordre de 30 sec. On rince la tige de l'homogénéisateur/disperseur à l'eau chaude puis 2 fois avec 20 mL d'acétone dans un tube en polypropylène. On centrifuge l'homogénat pendant 5 min à une vitesse de centrifugation de 3000 rpm (rotation par minute). On collecte et on transvase le surnageant dans un tube à essai. On soumet l'échantillon à une évaporation sous un flux d'azote (N ₂ ) à la température de 40° C de façon à former un extrait sec.

C.2. Élimination des lipides

Dans le tube contenant l'extrait sec, on ajoute 1 mL d'acétonitrile de façon à solubiliser l'extrait sec. On lave la solution d'acétonitrile 2 fois successivement avec 1 mL d'hexane. L'extrait débarrassé des lipides est séché sous un flux d'azote (N ₂ ) à la température de 40°C, puis repris avec 0,5 mL de méthanol et solubilisé par agitation sous vortex. On ajoute ensuite 0,5 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q). L'échantillon est homogénéisé sous vortex.

C.3. Extraction de la diféthialone sur phase solide (« SPE, Solid Phase Extraction »)

On fait passer 1 mL de dichlorométhane (CH ₂ C ₂ ), puis 1 mL de méthanol (CH ₃ OH), puis 1 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) sur une cartouche Oasis HLB lcc (WAT094225, Waters). On dépose ensuite l'extrait de foie débarrassé des lipides (lmL MeOH/H ₂ O Milli-Q) et contenant la diféthialone en tête de la cartouche préalablement conditionnée. L'extrait de foie pénètre dans la cartouche par gravité au contact de la phase solide de la cartouche. On dépose en tête de cartouche 1 mL de solution de lavage formée de méthanol (CH ₃ OH) et d'eau ultra-pure (H ₂ O) en proportion volumique de 90/10. On sèche la cartouche par aspiration sous vide connectée en partie basse de la cartouche. On dépose ensuite en tête de cartouche 1 mL de solution d'élution formée de dichlorométhane (CH ₂ Ct ₂ ) et de méthanol (CH ₃ OH) en proportion volumique de 90/10 et on collecte en bas de cartouche un éluat comprenant la diféthialone. On évapore le solvant de Γ éluat sous un flux d'azote (N ₂ ) à la température de 40°C. On reprend l'échantillon dans 0,5 mL d'acétonitrile (NC- CH ₃ ) et on filtre la solution d'acétonitrile contenant la diféthialone sur filtre 0,2 μιη.

C.4. Analyse

On analyse la solution d'acétonitrile contenant la diféthialone par chromatographie liquide à haute pression sur une colonne chirale (150 x 2 mm, granulométrie de 3 μπι) LUX ^® Cellulose-3 (phenomenex, Le Pecq, France) comme décrit au point A2) ci-dessus. La valeur du temps de rétention ( ) de l'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère de la diféthialone selon l'invention est comprise entre 7,8 min et 8,4 min (la valeur maximale du pic correspondant à l'énantiomère dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère étant de l'ordre de 8,1 min, comme décrit en figure 1), selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne-. La valeur du temps de rétention (t ₄ ) de l'énantiomère dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère est comprise entre 13,3 min et 15,1 min (la valeur maximale du pic correspondant à l'énantiomère dextrogyre dudit homo- stéréo-isomère étant de l'ordre de 14,4 min), selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne-. La valeur du temps de rétention (t ₃ ) de l'énantiomère dextrogyre dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone est comprise entre 11,2 min et 12,3 min (la valeur maximale du pic correspondant à l'énantiomère dextrogyre dudit hétéro- stéréo-isomère étant de l'ordre de 11,7 min), selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne-. La valeur du temps de rétention (t ₂ ) de l'énantiomère lévogyre dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone est comprise entre 9,0 min et 9,8 min (la valeur maximale du pic correspondant à l'énantiomère lévogyre dudit hétéro- stéréo-isomère étant de l'ordre de 9,4 min), selon les conditions opératoires -notamment selon les conditions de température de la colonne-. On analyse la composition de l'échantillon par chromatographie liquide à haute pression comme décrit au point A2) ci-dessus.

D. Étude de la rémanence hépatique des stéréo-isomères de configuration de la diféthialone chez le rat

On administre par gavage ("per os") à des rats (Rattus norvegicus) mâles et femelles sensibles au coumafène, une solution d'un mélange dudit ho mo- stéréo-isomère et dudit hétéro- stéréo-isomère de la diféthialone dans un mélange d'huile végétale et de DMSO à 5 . Le rapport molaire de la quantité dudit homo-stéréo-isomère sur la quantité dudit hétéro- stéréo-isomère est de 4/6. Chaque diastéréoisomère de la diféthialone est formé d'un mélange racémique des deux énantiomères du diastéréoisomère correspondant.

On administre (à J0) la solution de gavage de façon que la quantité de diféthialone ingérée par chaque rat soit de l'ordre de 3,4 mg par kilogramme de rat.

Pour éviter l'hémorragie, les rats gavés sont traités quotidiennement par administration par voie sous cutanée d'une dose de vitamine Kl (à titre d'antidote vis-à-vis de l'hémorragie) à raison de 0,1U pour 200g de poids de rat vif.

À 4 heures (H+4), 9 heures (H+9), 24 heures (H+24), 120 heures (H+120), 168 heures (H+168) et 216 heures (H+216) après le gavage, on euthanasie 3 rats mâles et 3 rats femelles préalablement anesthésiés à l'isoflurane, on prélève le foie des rats euthanasiés puis on extrait la diféthialone du foie et on dose la quantité de chacun des stéréo-isomères de configuration de la diféthialone par analyse par chromatographie liquide à haute pression sur une colonne chirale selon le procédé décrit ci-dessus, mesure de l'aire sous les pics du chromatogramme obtenu et quantification de chaque énantiomère par comparaison avec une courbe d'étalonnage. On dose :

l'énantiomère dextrogyre dudit ho mo- stéréo-isomère ;

- l'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère selon l'invention ;

l'énantiomère dextrogyre dudit hétéro-stéréo-isomère ;

l'énantiomère lévogyre dudit hétéro- stéréo-isomère ; présents dans le foie des rats gavés.

En figures 8 et 9, les concentrations de diféthialone relevées (moyenne des valeurs mesurées sur 6 rats et exprimées en nano-gramme d'énantiomère par gramme de foie (ng/g) dans le foie des rats gavés sont données en fonction du temps (en heures) après le gavage. En figure 8, la concentration de l'énantiomère lévogyre dudit ho mo- stéréo-isomère selon l'invention dans le foie est représentée par des cercles pleins (·) sur l'échelle de gauche et la concentration dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans le foie est représentée par des cercles ouverts (O) sur l'échelle de droite.

L'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère selon l'invention présente une rémanence hépatique inexplicablement élevée par rapport à la rémanence de Γ homo-stéréo-isomère de la diféthialone.

En figure 9, la concentration de l'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère selon l'invention dans le foie est représentée par des cercles pleins (·) sur l'échelle de gauche et la concentration de la diféthialone totale dans le foie est représentée par des triangles ouverts (Δ) sur l'échelle de droite. Les valeurs correspondantes sont données au tableau 1 suivant. Teneur hépatique, ng/g

Délai

Diféthialone totale

après

Homo- stéréo-isomère Hétéro- stéréo-isomère gavage,

DFN-Homo- DFN-Homo- DFN-Hétéro- DFN-Hétéro- heures

dextro lévo dextro lévo

4 4566 5692,5 10589,5 5380,5

9 4692,5 7141 12155,5 5869,5

24 1243,5 4403,5 8102 3613,5

48 720,5 3874 7974,5 2804

120 192,5 2087 5431,5 1211

168 129 878,5 3011 392,5

216 77,5 1224 4030,5 545

Tableau 1

L'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère selon l'invention présente une rémanence hépatique élevée par rapport à la rémanence de la diféthialone.

Appât rodonticide comprenant une proportion de 13,7 ppm de diféthialone

On réalise un appât rodonticide pâteux selon l'invention par dispersion d'une quantité d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone dans un excipent comestible comprenant de la graisse végétale et de la farine de céréale. La proportion mesurée de diféthialone par rapport à l'appât est de 13,7 ppm et la proportion d'énantiomère lévogyre dudit homo- stéréo-isomère par rapport à la diféthialone est de 95,4% (13,1 mg d'énantiomère lévogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone par kilogramme d'appât). L'appât comprend en outre une proportion massique de 3,3 % d'énantiomère dextrogyre dudit homo-stéréo-isomère de la diféthialone par rapport à la diféthialone et une proportion massique de 1,4 % d'énantiomère dextrogyre dudit hétéro-stéréo-isomère de la diféthialone par rapport à la diféthialone.

À J0, on place 10 rats Sprague Dawley (SD), 5 rats mâles et 5 rats femelles) sensibles au coumafène dans des cages individuelles avec une alimentation de référence exempte de rodonticide. À J3, on réalise une pesée de chaque rat puis on place à disposition de chaque rat 50 g d'appât rodonticide tel que décrit ci-dessus. On renouvelle quotidiennement cette mise à disposition de 50 g d'appât rodonticide. L'appât consommé par les rats est complété à 50 g d'appât à J4, J5 et J6. On mesure également quotidiennement la prise de poids de chacun des rats. À compter de J7, on élimine les appâts rodonticides résiduels et on fournit une alimentation exempte de rodonticide à tous les rats. On prévoit une surveillance des rats pendant 3 semaines.

Les quantités moyennes d'appât consommé quotidiennement par un rat à J4, J5, J6 et J7 exprimées en gramme par jour sont données au tableau 2 ci-après.

Tableau 2

Il est à noter qu'aucun rat n'a consommé une quantité quotidienne d'appât inférieure à 1 g/jour. Tous les rats (100%) meurent entre J9 et J 10. La mortalité est de 100% à J 10.

L'appât faiblement dosé à 13,7 ppm de diféthialone permet l'obtention d'un taux de mortalité de 100% tout en minimisant les risques d'intoxication d'animaux -notamment d'oiseaux- prédateurs ou charognards de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé un appât rodonticide selon l'invention.

Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un appât rodonticide et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles sont sujets à des infinités de variantes tant dans la formulation de l'appât que dans les modes de mise en œuvre du procédé.