聚乙二醇与纳洛酮的结合物及其药物组合物和 应用 技术领域 本发明涉及亲水性聚合物-纳络酮结合物， 尤其是小分子低聚乙二醇与纳洛酮的结合 物及其药物组合物。 背景技术 阿片类镇痛药物， 如吗啡等， 己广泛应用于临床， 是目前不可替代的强力止痛药物。 数据显示， 仅 2007年一年， 关国共有 2亿 3千力'阿片类药物处方。 阿片类药物主要作用 于阿片受体。 阿片受体包括 μ、 δ、 κ三种受体， 每种受体分别还有不同的亚型， 除中枢神 经系统外， 脊髓， 外周如胃、 小肠、 外分泌腺等都有阿片受体。 所以， 阿片类镇痛药物， 除了其中枢神经系统的强力止痛效果以外， 其作用于外周的阿片受体则产生副作用。 主要 副作用之一是阿片类药物引起的肠功能紊乱及 便秘。 尤其对于慢性疼痛患者， 因为长期使 用阿片类药物缓解疼痛， 这一副作用一直影响着患者的生活质量。 纳洛酮 （结构式如 1 )， 为羟二氢吗啡酮的衍生物， 为阿片受体特异性拮抗剂， 对机 体内各类型阿片受体均有竞争性拮抗作用， 能与体内的阿片受体结合， 以对抗释放过多的 β内啡肽， 在体内吸收迅速、 代谢快、 拮抗作用也强， 易透过血脑屏障， 并取代吗啡样物 质与受体结合， 解除中枢抑制作用， 迅速恢复脑、 心、 肺等脏器的正常功能， 而且不产生 吗啡样物质的依赖性、戒断症状和呼吸抑制作 用。纳洛酮是吗啡类药物过量的特效解毒剂. 也是吗啡、 海洛因依赖者的诊断用药。 近年来， 国内外临床医生也将它试用于急性酒精、 安定中毒， 脑梗塞、 急慢性呼吸衰竭及各种危重症休克的治疗， 己取得了较好的效果。 自 2002年至今， SFDA批准的纳洛酮生产批文有近百条， 2008-2009年期间， 共有 18家生产 企业为北京、 浙江、 吉林、 云南四个地区供应纳洛酮产品， 产量很大。

尽管纳洛酮已是目前临床应用最广的阿片受体 拮抗剂， 但纳洛酮肝脏首过效应大， 片 剂口服基本无效， 目前临床上使用的剂型仅有注射液和舌下片两 种剂型。 同时， 由于纳洛 酮血脑屏障透过率高，在减少慢性疼痛患者长 期使用阿片类药物引起的肠功能紊乱及阿片 类药物引起的便秘的同时， 也抵消了阿片类药物的止痛作用。 聚乙二醇（PEG)修饰技术是近年来迅速发展起� �的一项新型给药技术， 主要应用于 注射给药系统。它是一种将聚乙二醇活化后链 接到药物分子或表面的技术。 药物小分子经 过聚乙二醇修饰后， 主要具有以下优点： 1、 增加药物的水溶性； 2、 降低毒性； 3、 延长 药物循环半衰期， 减少用药次数， 提高病人依从性， 提高生活质量， 降低治疗费用； 4、 减少酶降解作用， 提高生物利用度； 5、 降低血脑屏障透过率， 减少中枢副作用。 与聚乙 二醇链接后， 药物的药代动力学发生了改变， 进而改变药效学。 特别是聚乙二醇能使血药 浓度维持或接近目标浓度的时间延长， 保持药物的药效得以充分地发挥。 目前， 在国际市 场上聚乙二醇修饰的药物产品的代表有： PEG-intron®、 PEGasys®、 Neulasta®, Macugen®, Neulasta®, MICERA。 目前， 聚乙二醇修饰的小分子药物在国际市场还没有 批准上市， 但 是几个产品已经进入二、 三期临床， 代表有 Nektar的 NKTE-102 和 NKTR-118。 本实验组一直致力于聚乙二醇化修饰小分子药 物的研究 （ZL03 8 01109.3， ZL 2004 1 0029615.3 , ZL 2004 8 0005763.X, ZL 2008 1 0093688.7, ZL 02 1 07842.4, ZL 02 1 08778.4)。 主要是采用聚乙二醇与小分子药物进行链接， 得到的产物在增溶减毒方面有很好的改善。 采用聚乙二醇化技术对纳洛酮进行结构改造的 产品（NKTR-118 ) 巳于 2011年 3月进 入三期临床 （参见 http：〃 www.nektar.com/pdf/pipeline/NKTR-l 18/pr_201 10315.pdf )。 在 NKTR-118中， 聚乙二醇只与一个活性基团连接。 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 实现每个聚乙二醇与多个纳洛酮结合的问 题。本发明采用聚乙二醇化技术对纳洛酮进行 结构改造， 利用低分子量的聚乙二醇与纳洛 酮进行链接， 改善药物的药代动力学性质， 增加纳洛酮本身的水溶性， 改善药物在体内的 分布， 减低纳洛酮对中枢系统的毒副作用， 减轻由于长期使用阿片类药物引起的肠功能紊 乱及便秘， 并将其开发成针剂或适合口服的制剂。 本实验组利用自身优势， 合成并筛选出 数个聚乙二醇-纳洛酮衍生物。 与 NKTR-118 不同， 本发明中的化合物每个聚乙二醇结构 与两个或多个活性基团连接。 所以， 这些化合物的阿片受体拮抗活性要优于同等分 子量的

发明内容 本发明提供一种如通式 （Π) 的聚乙二醇一纳洛酮结合物或其药学上可接受 的盐：

(II)

其中， n是 1-20的整数； 优选地， n是 1-15的整数； 更优选地， n是 2-15的整数。 更优 选地， n可以是 2-14的整数、 3-13的整数或 4-12的整数。 在一些实施方案中， 结合物的构型为 （α， α) 、 （β， β) 、 （α， β)或它们的混合物; 优选的构型为 （α， α) 或 （β， β) 。 本发明的另一个方面提供一种如通式（U1)的聚 乙二醇一纳洛酮结合物或其药学上可 接受的盐：

(III)

其中， x、 y、 w相同或不同， 分别是 0-20的整数； 优选地， x、 y、 w相同或不同， 分别 是 0-15的整数： 更优选地， x、 y、 w相同， 且是 0-10的整数。 更优选地， x、 y、 w可以 相同或不同， 分别是 0-9、 0-8、 0-7或 0-6的整数。 在一些实施方案中， 其中， 结合物的构型为 （α， α, α) 、 （β， β, β) 、 (α, β， β) 、 (α, α, β) 或者它们的混合物； 优选的构型为 （α， α, α) 或 （β, β, β) 。 本发明的另一个方面提供一种如通式 （IV) 的聚乙二醇-纳洛酮结合物或其药学上可 接受的盐：

( IV )

其中， a、 b、 c、 d相同或不同， 分别是 0-20的整数； 优选地， a、 b、 c、 d相同或不同， 分别是 0-15的整数； 更优选地， a、 b、 c、 d相同， 且是 0-10的整数。 更优选地， a、 b、 c、 d可以相同或不同， 分别是 0-8、 0-7、 0-6或 0-5的整数。 在一些实施方案中， 其中， 结合物的构型为 （α， α, α, α ) 、 （β， β， β， β ) 、 (α, β， β， β ) 、 (α, α， β , β ) 、 （α， α， α, β ) 或者它们的混合物； 优选的构型为 （α， a, a, α) 或 （β， β， β， β ) 。 上述药学上可接受的盐， 可以是盐酸盐， 氢溴酸盐、 硫酸盐， 硝酸盐、 磷酸盐、 枸櫞 酸盐、 酒石酸盐、 富马酸盐、 马来酸盐、 乳酸盐、 苯磺酸盐、 泛酸盐、 抗坏血酸盐等， 也 可以是这些盐的组合。 本发明的另一个方面提供包含聚乙二醇-纳洛� �结合物或其药学上可接受的盐的药物 组合物。 所述的药物组合物可以进一歩包括药学上可接 受的载体或赋形剂。 在一些实施方案中， 其中， 药物组合物可以构成片剂、 注射剂、 栓剂、 丸剂、 软和硬 明胶胶囊剂、 散剂、 溶液剂、 混悬剂或气雾剂。 本发明的另一个方面提供聚乙二醇-纳洛酮结� �物或其药学上可接受的盐在制备用于 治疗由于长期使用阿片类药物引起的肠功能紊 乱及便秘的药物中的应用。 本发明的优点是通过亲水性聚合物聚乙二醇的 改性可对纳洛酮提供保护，改善药物吸 收， 改变药物体内分布， 降低血脑屏障透过率及避免毒副作用。 具体实施方式 通过聚乙二醇修饰技术在纳洛酮分子中引入低 分子量聚乙二醇， 增加其亲水性， 改善 药物体内分布， 降低其血脑屏障透过率， 从而降低其毒性的目的。 本发明的结合物按如下方法制备： 对亲水性低聚乙二醇进行改性， 引入卤素或者甲磺 酰基、对苯甲磺酰基等易离去基团，然后碱性 条件下与纳洛酮结合。通过引入低聚乙二醇， 改变药物在体内的分布， 改善血脑屏障透过， 改善由于长期服用阿片受体药物引起的肠功 能紊乱及便秘。 对低聚乙二醇而言， 采 ffl乙二醇聚合单元予以表示， 一般采用含有乙二醇单元的数目 来表示， 乙二醇单元数目范围为 0-20， 优选为 0-10。 本发明的聚乙二醇也包括聚乙二醇的衍生物和 类似物，也可以被下述亲水性聚合物替 换， 所述的亲水性聚合物选自 ώ聚乙二醇、 聚谷氨酸、 聚天门冬氨酸、 聚丙二醇、 聚乙烯 醇、 聚丙烯吗啉、 聚噁唑啉以及它们的共聚物所组成的组。 本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药 物组合物形式进行给药，可采用任何可 接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行 。 因此， 采用的给药方式可选择通过口、 鼻 内、 非肠道、 局部、 透皮或直肠方式， 其形式为固体、 半固体或液体药剂形式给药， 例如， 片剂、 栓剂、 丸剂、 软和硬明胶胶囊剂、 散剂、 溶液剂、 混悬剂或气雾剂等， 优选采用适 用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组 合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活 性成分 （一种或多种） 的本发明的结合物， 此外， 还可包含其它药剂、 载体、 辅剂等。 通常， 根据所需给药方式， 药学上可接受的组合物将包含约 1至约 99 重量％的本发 明结合物、 以及 99至 1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包� �约 5至 75重量％的 本发明结合物， 其余为适宜的药用赋形剂。 可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过 溶解、 分散等手段将本发明的结合物 (约 0.5至约 20% )和选择性存在的药用辅剂溶解、 分散于载体中， 载体的实例为水、 盐 水、 含水葡萄糖、 甘油、 乙醇等， 从而形成溶液剂或混悬剂。 如果需要的话， 本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质 ， 如润湿剂或乳化剂、 pH缓冲剂、 抗氧化剂等， 例如： 柠檬酸、 脱水山梨醇单月桂酸酯、 三乙醇胺油酸酯、 丁 基化羟基甲苯等。 以下实施例用来说明本发明， 但不用来限制本发明。 实施例 实施例中所用的盐酸纳洛酮 ώ北京屹东博杰科技有限责任公司提供， 甲氧基乙氧基甲 基氯（MEMCL)从 alfa Aesar购得， 对甲苯磺酰氯从山东亿龙实业有限公司购得， 氢化钠 从梯希爱 （上海） 化成工业发展有限公司购得， H(OCH2CH2)4-OH、 H(OCH2CH2)6-OH 以及 H(OCH2CH2)12-OH从嘉兴博美生物技术有限公司购得 。本发明实施例中所用的其他 试剂均为商业化学纯试剂。 实施例 1 双端取代的六乙二醇-纳洛酮 (a, O -NAL26和 (β， p)-NAL26(化合物 Ε2和 El， 其 中 f^6)的合成

D1 (β ,β )

D2 (α ,α)

E2 (α , α 化合物 B 的合成: 圆底烧瓶中加入盐酸纳洛酮 A 6g， 溶于二氯甲垸 30mL中， 全部溶解后， 加入二异丙 基乙胺 （DIPEA) 11.7g, 氮气保护下搅拌 15min， 缓慢递加 MEMCL 7.6g, 滴毕后室温 反应 24h。 TLC检测反应完全后， 停止搅拌， 加入水萃取三次（30 mL*3 )， 有机相用饱和 氯化钠溶液洗一次后， 加入无水硫酸钠干燥。 浓缩， 柱层析得到化合物 B 531%, 收率为 87%。 化合物 Cl(a构型)和 C2(p构型)的合成： 圆底烧瓶中加入化合物 B 5.37g，乙醇 180 mL, 0.2N 氢氧化钠溶液 90 mL，搅拌 15min。 分批加入硼氢化钠 2.3g， 室温搅拌过夜。 TLC检测反应完全后， 停止搅拌， 浓缩后， 用二 氯甲垸萃取三次 （100 mL*3 )， 有机相用饱和氯化钠溶液洗一次后， 加入无水硫酸钠干燥 2h。浓缩得粗品 4.7g。柱层析得到化合物 Cl(a构型) 1.66g， 收率为 31%， C2(p构型) 1.80g， 收率为 33%。 化合物 Dl(p, β)和 D2(a, a)的合成：

500mL 三口瓶中加入 22.9g 对甲苯磺酰氯， 80mL 吡啶， 冷却至 0。C。 将 14.1g H-(OCH ₂ C¾) ₆ -OH与 40mL吡啶混匀， 滴加到三口瓶中， 控制温度为 0-10°C。继续在此温 度下搅拌反应两小时。 TLC监测反应完全。向反应液中加入 300mL冷水及 120mL浓盐酸， 缓慢搅拌半小时， 将反应液转移入 lOOOmL 分液漏斗中， 加入乙酸乙酯萃取两次 ( 300mL+200mL 有机层合并， 用水洗至中性， 无水硫酸钠干燥两小时。 旋转蒸发仪蒸 出溶剂。 得到粘稠状液体 （Ms-(OCH ₂ CH ₂ ) ₆ -OMs ) 共 28.7g， 直接用于下一歩反应。 取柱层析得到的化合物 C I 801mg置于圆底烧瓶中，加入二甲基甲酰胺（DMF ) 3 mL 全部溶解后， 加入 Ms-(OCH2CH2)6-OMs 421mg,分批加入氢化钠 384mg， 30°C反应过夜。 TLC检测反应完全后， 停止搅拌， 加入 lOOmL水， 用二氯甲烷萃取三次（ 100 mL*3 )， 有 机相用饱和氯化钠溶液洗一次后， 加入无水硫酸钠干燥。 浓缩得粗品， 经柱层析得到化合 物 Dl(P，P) 335mg， 收率为 23.2%。 化合物 D2(a, a)的合成同 Dl。 化合物 ΕΙ (β, β)和 E2(a，a)的合成： 将化合物 Dl(p, p)150mg溶解在 5ml无水甲醇中， 通入氯化氢气体， TLC监测反应完 成后，停止搅拌，浓缩后，缓慢加入碳酸钾水 溶液调节 pH为 9，用乙酸乙酯萃取三次（100 mL*3 ) , 有机相用饱和氯化钠溶液洗一次后， 加入无水硫酸钠干燥 2h。 浓缩得粗品， 经柱 层析得到化合物 Ε1 (β, β) 98mg, 收率为 91%。 m/z [MH]+907.2。 Ή-NMR (DMSO-d6): 1.25-1.35(m, 4H)， 1.45(d, 2H), 1.55- 1.60(m, 2H), 1.75-1.88(m, 4H)， 2.1-2.2(m, 4H),

2.49- 2.59(m, 4H)， 2.88(d, 2H), 3.00-3.10(m, 6H), 3.22(m, 2H), 3.62-3.77(m, 24H), 4.52(d, 2H), 5.12-5.20(m, 4H), 5.77(m, 2H), 6.53(d, J-8.16 Hz, 2H), 6.70(d, J=8.1 Hz,2H)。 化合物 E2(a, a)的合成同 Ε1 (β， β)。^/ζ [MH] ⁺ 907.2。1H-NMR (CDC13): 1. 15-1.25(m, 4H)，

1.45-1.59(m, 8H), 2.1 -2.26(m, 4H), 2.52-2.6 l (m， 4H), 2.88(d, 2H), 3.00-3.10(m, 6H), 3.55-3.77(m, 24H), 3.86-3.88(m, 2H), 4.7 l (d, 2H), 5.14-5.22(m, 4H)， 5.76-5.84(m， 2H), 6.49(d, J=8.16 Hz, 2H), 6.70(d， J=8.1 Hz, 2H)。 实施例 2双端取代的四乙二醇-纳洛酮 (a, a)-NAL24(化合物 E2， 其中 ί^4)的合成 用四乙二醇代替六乙二醇， 重复实施例 1 的歩骤得到双端取代的四乙二醇-纳洛酮 (a, a)-NAL24。 m/z [MH]+817。 1H-NMR (CDC13)： 1. 14-1.24(m, 4H)， 1.46-1.58(m, 8H), 2.1-2.23(m, 4H), 2.52-2.62(m, 4H), 2.89(d, 2H)， 3.00-3. l l(m, 6H)， 3.55-3.78(m, 16H), 3.86-3.89(m, 2H), 4.72(d, 2H), 5.15-5.21(m, 4H)， 5.77-5.85(m, 2H), 6.50(d， J=8.16 Hz, 2H), 6.71(d，J=8.1 Hz, 2H)。 实施例 3 双端取代的十二乙二醇-纳洛酮 (a， a)-NAL212(化合物 E2, 其中 f=12)的合成 用 H(OCH ₂ CH ₂ ) ₁₂ -OH代替六乙二醇， 重复实施例 1的歩骤得到双端取代的十二乙二 醇-纳洛酮（a， a)-NAL212。 mlz [MH]+1169。 1H-NMR (CDC13)： 1. 12-1.24(m, 4H)， 1.45-1.589(m, 8H)， 2.11-2.24(m, 4H)， 2.50-2.61(m, 4H), 2.89(d, 2H), 3.02-3. l l (m, 6H),

3.50- 3.78(m, 48H), 3.86-3.90(m, 2H), 4.7 l(d, 2H), 5.14-5.20(m, 411), 5.75-5.85(m, 2H), 6.5 l(d, J=8.17 Hz, 2H), 6.70(d, J=8.1 Hz, 2H)。

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01

991000/C10ZN3/X3d

实施例 5 三分支的乙二醇-纳洛酮结合物 (NAL37)(化合物 N)的合成

化合物 L的合成： 参考文献： J Org.Cfew. 2006， 71 , 9884-9886. 化合物 M的合成与实施例 4中化合物 I的合成相似， 其中用化合物 L代替化合物 H。 化合物 N(NAL37)的合成： 用化合物 L代替化合物 H， 重复实施例 4的歩骤得到三分支取代的乙二醇-纳洛酮 (α， α,α)- NAL37。 m/z [ΜΗ] 963.6 ₀ Ή-NMR (DMSO-d6) : 1.22-1.35(m, 6H)， 1.47(d, 3H), 1.57-1.64(m, 3H)， 1.74-1.88(m, 6H)， 2.0-2.22(m, 6H), 2.50-2.57(m, 6H)， 2.68(m, 1H)， 2.88(d, 3H), 3.01-3.08(m, 9H), 3.24(m, 3H), 3.55-3.78(m, 90H), 4.52(d, 3H), 5.1 1-5.18(m, 6H), 5.77(m, 3H), 6.54(d, J=8.16 Hz, 3H), 6.71 (d, J=8.1 Hz，3H)。 实施例 6 四分支乙二醇与纳洛酮结合物 (NAL41)(化合物 Q)的合成 四分支乙二醇 (M,)的合成： 参考 Bulletin of Academy of Sciences of the USSR, Division of Chemical Science (English Translation); vol. 38; nb. 10; (1989); p. 2207。 化合物 ^的合成： 250mL三口瓶中加入 19.06g对甲苯磺酰氯， 40mL吡啶， 冷却至 0°C。 将 7.8g化合 物 ^l _l 与20mL吡啶混匀， 滴加到三口瓶中， 控制温度为 0-10°C。 继续在此温度下搅拌反 应两小时。 TLC监测反应完全。 向反应液中加入 lOOmL冷水及 60mL浓盐酸， 缓慢搅拌 半小时， 将反应液转移入 lOOOmL分液漏斗中， 加入乙酸乙酯萃取两次（300mL+200mL)。 有机层合并， 用水洗至中性， 无水硫酸钠干燥两小时。 旋转蒸发仪蒸出溶剂。 得到粘稠状 液体共 14.7g， 直接用于下一步反应。 化合物 P的合成： 取柱层析得到的化合物 CI 834mg置于圆底烧瓶中， 加入 DMF 3 mL全部溶解后， 加 入化合物 N^ Umg, 分批加入氢化钠 389mg， 30Γ反应过夜。 TLC检测反应完全后， 停 止搅拌， 加入 lOOmL水， 用二氯甲垸萃取三次（100 mL*3 )， 有机相用饱和氯化钠溶液洗 一次后，加入无水硫酸钠干燥。浓縮得粗品， 经柱层析得到化合物 P 136mg,收率为 16.3%。 化合物 Q 的合成： 将化合物 P 136mg溶解在 5ml无水甲醇中， 通入氯化氢气体， TLC监测反应完成后， 停止搅拌，浓缩后，缓慢加入碳酸钾水溶液调 节 pH为 9，用乙酸乙酯萃取三次（ 100 mL*3 ), 有机相用饱和氯化钠溶液洗一次后， 加入无水硫酸钠干燥。 浓缩得粗品. 经柱层析得到化 合物 Q 85mg, 收率为 76.6%。 [MH]+1556.7。 Ή-NMR (DMSO-d6): 1.24-1.33(m, 8H), 1.47(d, 4H)， 1.55-1.60(m, 4H)， 1.74-1.89(m, 8H), 2.1-2.22(m, 8H), 2.47-2.61(m, 8H), 2.89(d, 4H), 3.01-3. l l(m, 12H), 3.23(m, 4H)， 3.61-3.79(m, 24H), 4.54(d, 4H), 5.11-5.18(m, 8H)， 5.79(m, 4H), 6.54(d, J=8.16 Hz, 4H), 6.70(d, J=8.1 Hz，4H)。

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实施例 8 聚乙二醇-纳洛酮结合物对 MOR受体的拮抗作用。 受试物： 双端取代的六乙二醇-纳洛酮 (a, a)-NAL26和 (β, p)-NAL26)、 双端取代的四乙二醇-纳 洛酮 (a, a)-NAL24、 单端取代的五乙二醇-纳洛酮 a-m-NAL5和 P_m-NAL5 (北京键凯科技 有限公司提供） 及纳洛酮共六个样品作为受试物。 阳性对照物： Beta-FNA, 是由国家新药筛选中心提供， 临用时用钙缓冲液配制成所需浓度。

盐酸纳洛酮 ώ北京屹东博杰科技有限责任公司提供，临用� ��用钙缓冲液配制成所需浓 度。 实验原理： 通过建立了共转 MOR和 Gal6的细胞系， 使得受体被激活后能引起 Gal6蛋白的活 化， 进而激活磷脂酶 C (PLC)产生 IP3和 DAG, IP3可与细胞内内质网和线粒体上的 IP3 受体结合， 从而引起胞内钙的释放。 因此， 测定胞内钙的变化可以作为检测 MOR活化状 态的方法。 Fluo-4/AM是一种钙荧光探针指示剂用来测量钙离 子， 作为非极性脂溶性的化 合物， 进入细胞后在细胞脂解酶的作用下， AM基团解离， 释出 Fluo-4; 由于 Fluo-4是极 性分子， 不易通过脂质双分子膜， 它可使 Fluo-4长时问保留在细胞内。最终可以通过测量 被激发的荧光强度来反映 Get蛋白被激活的水平。如果筛选的化合物能够 拮抗 MOR受体， 则可以使钙流反应大大降低。 实验歩骤：

1. 将稳定表达 MOR/Gal6的 CHO细胞种于 96孔板， 培养过夜。

2. 吸去种有细胞的孔内的培液， 加入新鲜配制的染料 40 μΐ/孔， 37°C培养箱内恒温孵育 40 分钟。

3. 用钙缓冲液将待测的药物稀释并混匀。

4. 将染料吸尽弃去， 用新鲜配制的钙缓冲液洗一遍后， 换上 50 μΐ溶解有待测药物的钙缓 冲液。

5. 用 FlexStation II仪检测， 第 15秒幵始由仪器自动加入 25 μΐ溶解有 MOR受体己知激动剂 的钙缓冲液， 最终读取 525 nm处荧光值。

6. 数据处理：

% response = (D-B)/(S-B)* 100%;

其中 D为待测药物引起的钙流峰值， B为空白的钙缓冲液引起的钙流峰值， S为已知激动剂 DAMGO引起的钙流峰值。 实验结果: 六个受试物在 MOR受体上都有拮抗效应； 化合物 Mw IC ₅₀ (M) 95 %可信限 （M)

Beta-FNA 2.619e-009 1.370e-009 至 5.008e-009

NAL 365.85 1.524e-008 8.488e-009 至 2.737e-008

(a, a)-NAL26 905.08 9.555e-009 4.225e-009 至 2.161e-008

(β, p)-NAL26 905.08 2.344e-008 1.289e-008 至 4.186e-008

(a, a)-NAL24 816.98 7.156e-009 3.799e-009 至 1.348e-008 a-m-NAL5 579.72 3.369e-009 8.702e-009 至 1.305e-007 p-m-NAL5 579.72 7.814e-008 3.140e-008 至 1.945e-007