Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
CONJUGATES AND SMALL MOLECULES WHICH INTERACT WITH THE CD16A RECEPTOR
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/112898
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to the field of medicine, and more particularly to oncology and immunology. Proposed are novel compounds of general formula (1) or (2), which have an affinity for CD16a. Proposed are novel modified proteins, active toward the CD16a receptor, which are selected from an antibody or an autoantigen and are conjugated by a modified compound selected from a compound of general formula (1) or (2), and which enhance and direct antibody-dependent cell cytotoxicity. The novel modified proteins (conjugates) can be used to destroy a specific target group of cells in an organism, such as cancer cells or autoimmune lymphocytes. Also proposed are methods for producing conjugates, and a pharmaceutical composition and a drug containing modified proteins for the treatment of cancer and autoimmune diseases.

Inventors:
DEMIN ALEXANDRE VIKTOROVICH (RU)
TKACHENKO SERGEY EVGENIEVICH (US)
Application Number:
RU2014/000015
Publication Date:
July 24, 2014
Filing Date:
January 15, 2014
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
BIOINTEGRATOR LTD LIABILITY COMPANY OOO BIOINTEGRATOR (RU)
ALLA CHEM LLC (US)
International Classes:
C07D281/16; A61K31/5517; A61K31/554; A61K38/02; A61P35/00; A61P37/00; C07D495/14; C07K14/555; C12P21/08
Domestic Patent References:
WO2007047737A12007-04-26
WO2010081173A22010-07-15
WO2011069074A22011-06-09
WO2005044859A22005-05-19
Foreign References:
EA013015B12010-02-26
RU2281947C12006-08-20
US20090264300A12009-10-22
US20110124599A12011-05-26
US4975278A1990-12-04
US20120003248A12012-01-05
EA015009B12011-04-29
Other References:
DATABASE REGISTRY [online] 1 July 2008 (2008-07-01), XP055263669, accession no. STN Database accession no. 1031967-34-6
DATABASE REGISTRY 29 July 2008 (2008-07-29), accession no. 031571-30-1
See also references of EP 2947074A4
GRILLO-LOPEZ A.-J ET AL., SEMIN. ONCOL., vol. 26, 1999, pages 66 - 73
PAYNE, G., CANCER CELL, vol. 3, 2003, pages 207 - 212
TRAIL ET AL., CANCER IMMUNOL. IMMUNOTHER., vol. 52, 2003, pages 328 - 337
SYRIGOS; EPENETOS, ANTICANCER RESEARCH, vol. 19, 1999, pages 605 - 614
NICULESCU; DUVAZ; SPRINGER, ADV. DRUG DEL. REV., vol. 26, 1997, pages 151 - 172
BERGE S.M. ET AL.: "Pharmaceutical Salts", J.PHARM.SCI., vol. 66, 1977, pages 1 - 19, XP002675560, DOI: doi:10.1002/jps.2600660104
R. L. FERRIS ET AL., J. CLINICAL ONCOLOGY, vol. 28, no. 28, 1 October 2010 (2010-10-01), pages 4390 - 4399
K.-H. HEIDER ET AL., BLOOD, vol. 118, 2011, pages 4159 - 4168
J. A. BOWELS ET AL., BLOOD, vol. 108, 2006, pages 2648 - 2654
Attorney, Agent or Firm:
SHMAKOVA, Nina Mikhailovna (RU)
ШМАКОВА, Нина Михайловна (RU)
Download PDF:
Claims:
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение, обладающее сродством к CD 16а рецептору, предс тавляющее собой 5,5,1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я-дибензо[0! ][1,4]тиазепин общей формулы 1 или 5 ,6,7,8,9, 10-гексагидро-4//-[ 1 ]бсизотиено[3,2:/1пирроло| 1 ,2-а | [ 1 ,4 |диазеиин общей формулы 2, или его фармацевтически приемлемая соль,

в кото ом R1 выбран из группы, представляющей собой (CIl3)2N-,

R2 выбран из группы, представляющей собой

где R3 в качестве концевого заместителя представляет собой, -NII2,

a R4 представляет собой II или Ci-Сзалкил.

2. Соединение общей формулы 1 по п. 1, в котором R1 выбран из группы, включающей в себя:

R2 выбран из группы, включающей в себя:

где R4 = Н или С)-С3алкил.

3. Соединение общей формулы 2 по п.1, в котором

R1 представляет собой (CH3)2N- или

R2 выб ан из группы, включающей в себя:

4. Соединение по п.1, выбранное из группы, включающей в себя

2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (3-хлорбензил)-5,5,11-триоксо-10,11-дигидро-5//- дибензоb,j\ [ 1 ,4 ]тиазепин-7-карбоновой кислоты,

2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (4-{[10-(3-хлорбспзил)-5,5Л 1-1риоксо-10,11- дигидро-5//-дибснзо[6, |[1,4]тиазепин-7-карбонил]-амипо}-фенокси)-уксусной кисло п . 2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир 4-{[10-(3-хлорбснзил)-5,5,11-фиоксо-10.11- дигидро-5^дибснзо[Л,/][1,4|тиазспин-7-карбонил|-амипо}-фенилкарбоиовой кислой,!. 2,5-диоксо-пирролидин-1-иловый эфир 3- [8-(3,4-диметоксифенилкарбамоил)-5,5,11- триоксо-5,11-дигидро- дибензо[ ][1,4]тиазепин-10-илметил]-бензойной кислоты, 2,5-диоксо-пирролидин-1 -иловый эфир (4-{8-[3-(4-бензилпипермдин-1-ил)- пропилкарбамоил] -5,5,11 -триоксо-5 , 1 1 -дигидро-дибензо[6,/] [ 1 ,4]тиазепин- 10-илметил } - фенил)-уксусной кислоты,

10-(3 -хлорбензил)-5,5 , 11 -триоксо- 10,11 - дигидро-5Я- дибензо [b,f] [ 1 ,4]тиазепин-8- карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амид,

10- {4- [(2-амино-этилкарбамоил)-метил] -бензил } -5 ,5 , 1 1 -триоксо- 10, 11 -дигидро-5Я- дибензо [b,f] [ 1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты [3 -(4-бензил-пиперидин- 1 -ил)-пропил] - амид,

2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)-этиловый эфир 10-(3-хлорбензил)-5,5,1 1- триоксо- 10, 11 -дигидро-5Я- дибензо [b,f] [ 1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты,

10-(4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)-этилкарбамоил]-метил}-бензил)- 5,5,11- триоксо-10,11-дигидро-5Я-дибензо[Ь,. [1,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты [3-(4-бензил- пиперидин- 1 -ил)-пропил]-амид,

N-[2-({N-(MeTOKCHKap6oHra)-N-[(l ,5-диметокси- 1 ,5-диоксопентан-2-ил)карбамоил]-р- аланил}амино)этил]-10-(3-хлорбензил)-5,5,1 1 -триоксо- 10,11- дигидродибензо[й ][1,4]тиазепин-7-карбоксамид,

N5-(2- { [(4- { [7- { [[3-(4-бензилпиперидин- 1 -ил)пропил](фенил)амино]-карбонил } -5,5, 11 - триоксо-дибензо [δ J [ 1 ,4]тиазепин- 10( 11 Я)-ил]метил } фенил)ацетил] -амино } этил)-^2- {[(1,3-дикарбоксипропил)амино]карбонил}глутамин,

4-[4-(диметиламино)фенил]-Лг-(4-{[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}фенил)-

7,8,9,10-тетрагидро-4Я-[1]бензотиено[3,2: ]пирроло[1,2- ][1,4]диазепин-5(6Я)- карбоксамид,

4 - [4-(диметиламино)фенил ] -N-(4- { 2- [(2,5 - диоксопиррол и дин- 1 -ил)окси] -2- оксоэтокси } фенил)-7,8 ,9, 10-тетрагидро-4Я-[ 1 ]бензотиено [3 ,2- | пирроло[ 1 ,2- а][1,4]диазепин-5(6Я)-карбоксамид, и

2,5-диоксопирролидин-1-ил Лг-[4-(5-{[(3,4-диметоксифенил)амино]-карбонил}- 5,6,7,8,9,10-гексагидро-4Я-[1] бензотиено[3,2- ]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-4-ил)фенил]- N-метилглицинат.

5. Модифицированный белок, активный в отношении CD 16а рецептора, выбранный из антитела или аутоантигена, конъюгированного модифицирующим соединением, обладающим сродством к CD16a рецеп тору, выбранным из соединения общей формулы 1 или 2 по п. 1.

6. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, ч ю am тело представляет собой ри гуксимаб.

7. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, что антитело представляет собой трастузумаб.

8. Модифицированный белок но п. 5, отличающийся тем. чю ан титело представляет собой цетуксимаб.

9. Модифицированный белок по и. 5, отличающийся тем, что аушантиген представляет собой интерферон альфа.

10. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, что аутоантиген представляет собой главный белок миелина.

11. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, что аутоантиген представляет собой белок комплимента Clq.

12. Способ получения модифицированного белка по п. 5, согласно которому подвергают взаимодействию белок с соединением общей формулы 1 или 2 по п. 1. растворенным в среде органического растворителя, например, диметилсульфоксидс, в интервале молярного соотношения от 1 :3 до 1 : 100 в среде фосфашого солевого буферного раствора (рН 7.4).

13. Фармацевтическая композиция, активная по отношению к CD 16а рецепт ору, в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенная в фармацевтически приемлемую упаковку, содержащая модифицированный белок по п. 5 в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

14. Лекарственное средство, активное по отношению к CD 16а рецептору, в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенное в фармаце тически приемлемую упаковку, предназначенное для лечения заболевания, вызванного патологическими кленами, включающее в свой состав модифицированный белок по н. 5 или фармацевтическую композицию по п. 13 в терапевтически эффективном количестве.

15. Способ лечения заболевания, вызванного патологическими клетками, которое можно лечить путем опосредованного воздействия па CD 16а рецептор, согласно которому субъекту вводят терапевтически эффективное количество модифицированного белка по п. 5, или фармацевтической композиции но п. 13, или лекарственного среде та по п. 14.

16. Способ по п. 15 лечения аутоиммунного или онкологического заболевания.

17. Способ по п. 16 лечения лимфомы, лимфатической лейкемии или рака молочной железы.

18. Способ по п. 16 лечения аутоиммунной полиэидокринопатии первого типа.

Description:
КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ

С РЕЦЕПТОРОМ СШ ба

Область техники

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и иммунологии, к новым соединениям, связывающимся с CD16a рецептором, и модифицированным ими белкам (конъюгатам), используемым для индукции ан ги гело- зависимой клеточной цитотоксичности и удаления таким образом из организма определенной целевой i pyrnibi клеток, например, раковых клеток или ауюиммуниых лимфоцитов. Изобретение относится также к способу получения конъюгагов, фармацевтическим композициям и лекарственным средствам. содержащим модифицированные белки (конъюгаты), для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Рецептор Fcyllla (CD 16а) принадлежит к группе рецепторов, отвечающих за связывание Fc-фрагмеита антител. CD16a эксирсссируется на поверхпосги Ν -клеток (киллеров) и макрофагов и отвечает за индукцию антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), взаимодействуя с 1 ; с-фрагментом связанного с клет кой антитела. ADCC, наряду с комплемент-зависимой цитоюксичностыо (CDC) и аноп юзом. является одним из основных механизмов уничтожения раковых клеток из организма. Он же является причиной опосредованных аутоантителами аутоиммунных заболеваний, гаких как аутоиммунная полиэндокринопатия первого типа, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, гемоли тическая болезнь новорождённых и т.н. То есть антитело-зависимая клеточная цито токсичность может играть как положительную, так и отрицательную роль в развитии патологических процессов в организме человека.

Аутоиммунные заболевания - группа заболеваний, развивающихся вследствие выработки иммунного ответа против здоровых тканей организма и приводящих к повреждению этих тканей. В настоящее время для лечения аутоиммунных заболеваний используются иммуносупресанты, подавляющие иммунную систему организма в целом. Избирательное подавление аутоиммунного ответа позволило бы сущее I BCHHO снизить частоту побочных эффектов лечения. Антитела достаточно давно используются для направленного уничтожения раковых клеток. Примерами могут служить ритуксимаб, трастузумаб. цегуксимаб и многие другие антитела, имеющие мишени на поверхности раковых клеток и действующие через комплимент-зависимую цитотоксичиость и антитело-зависимую клеточную питотоксичность. Это позволяет использовать данные неконъюгироваииые моноклональпые антитела в качестве лекарственных средств для лечения рака, например, ритуксимаб - для лечения СО20-позитивной В-клеточной, низкозлокачествеппой или фолликулярной неходжкинской лимфомы, трастузумаб - для лечения развитого рака молочной железы. Успешное применение этих продуктов обусловлено не только их эффективностью, но и их очень хорошими профилями безопасности (Grillo-Lopez A.-J et al. Semin. Oncol., 26, 1999, pp. 66-73).

Все они принесли возможность нового вида терапии. Но, несмотря на ярко выраженную эффективность, примерно половина больных не отвечает на терапию ритуксимабом, а до 60% становятся резистентными при повторном применении. В свете успехов, связанных с этими лекарственными средствами, в настоящее время сущсствусг большая потребность в достижении более высокой специфической активности антител по сравнению с той, которая, как правило, обеспечивается при лечении с использованием неконъюгированных антител.

Это послужило причиной для усиления исследований направленного терапевтического эффекта антител к поверхностным антигенам. Первым направлением модификации антител стала разработка модифицированных белков (конъюгаюв) антитело-лекарственное средство (ADC) для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, то есть лекарственных средств, уже используемых для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4,975,278 ]. Такие конъюгаты обеспечивают направленную доставку лекарственного вещества к опухолям и их накопление внутри клеток, добавляя к цитотоксическому действию антител противоопухолевую активность цитотоксических или цитостатических лекарств. Примерами таких копъюгатов являются трастузумаб-DMl , усиленная версия трастузумаба (Герцептина) (WO 201 169074) и серия копъюгатов с аурис гатииами П (US 20120003248). Альтернативным направлением стало усиление собственной цитотоксичност антител посредством усиления взаимодействия с рецепторами, обуславливающими цитотоксичность. Компания Рош разрабо тала антитело обипутузумаб с усиленным связыванием с рецептором CD16a. Этот эффект достигается за счет инженерии гликозилирования антитела. Обинутузумаб обладает в деся 1 ки раз более сильной антитело-зависимой клеточной цитотоксичностыо (WO 2005044859, НА 01 009).

Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность - один из основных механизмов цитотоксического действия антител, которые связываются с антигеном на поверхности целевой клетки посредством вариабельных доменов, в то время как констан тная част ь связывается с CD16a рецептором на поверхности клеток киллеров. Этот межклеточный контакт приводит к секреции киллерами иерфоринов и гранзимов. Первые образуют поры в клеточной мембране таргетной клетки, а вторые активируют каспазы и другие молекулы апоптоза. CD 16а рецептор является членом большого семейства Fc-рецеторов, связывающихся с константным доменом антитела и различающихся локализацией, функцией и сродством к константному домену.

Раскрытие изобретения

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.

«Алкил» означает алифатическую углеводородную линейную или разветвленную группу с 1-12 атомами углерода в цепи. Разветвленная означает, что алкильиая цепь имеет один или несколько «низших алкильных» заместителей. Алкил может иметь один или несколько одинаковых или различных заместителей («алкильных заместителей») включая галоген, алкенилокси, циклоалкил, арил, гетероарил, тероциклил, ароил, циано, гидрокси, алкокси, карбокси, алкинилокси, аралкокси, арилокси, арилоксикарбнил, алкилтио, гстероарилтио, аралкилтио, арилсульфонил, алкилсульфоиилгетероаралкилокс и, аинелированный гстероарилциклоалкенил, аннелированный гетероарилциклоалкил, аинелированный гетероарилгетероцикленил, аинелированный гетероарилгетероциклил, аннелированный арилциклоалкенил. аннелированный арилциклоалкил, аннелированный арилгегероиикленил, аннелированный арилгетероциклил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбопил, гетероаралкилоксикарбонил или R k a R k f i a N-, R k a R k +i a NC(^0)-. R k a R k +t''NC(-S)-. R k a R k+ i a NS0 2 -, где R k a и R + i d независимо друг от друга представля т собой «замес штели аминогруппы», значение которых определено в данном разделе, например, аюм водорода, алкил, арил, аралкил, гетсроарал ил, гетероциклил или ге1ероарил, или и R k +i a вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют через R^' 1 и R k+ i J 4 - 7 членный гетероциклил или гетероцикленил. Предпоч тительными алкильными группами являются метил, трифторметил, циклопропилметил, циклопентилметил, эгил, н-нропил, изо-иропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, З-пент ил, метоксиэтил, карбоксиметил, метоксикарбонилмстил, этоксикарбонилмсгил, бензилоксикарбонилметил мс юкси- карбонилметил и пиридилметилоксикарбонилметил. Предпочтительными «алкильными заместителями» являются циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, гидрокси, алкокси, алкоксикарбонил, аралкокси, арилокси, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, алкилсульфонил, арилсульфонил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбопил, гетероаралкилоксикарбонил или R^R^+^N-, R k a Rk+i a NC(=0)-, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил.

«Аминоалкил» означает C n H 2 n+iNH- или (C n H 2n+ i)(C n Il 2n+ i)N- группу, в которой алкил определен в данном разделе. Предпочтительными алкиламино группами являются метиламино, этиламино, н-пропиламино, изо-пропиламино и н-бутиламино.

«Аш итело» - белок (иммуноглобулин), синтезируемый В-лимфо итами в организме в ответ на попадание в него чужеродного вещества и обладающий специфическим сродством к этому веществу. Они являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета. Антитела выполняют две функции: антиген-связывающую и эффекторпую (вызывают тот или иной иммунный ответ).

«Аутоантигсны» - свободные молекулы веществ или молекулы в составе клеток, органов и тканей, которые распознаются при определённых условиях иммунной системой как чужеродные и в связи с гим вызывают клеточный или гуморальный иммунный ответ со стороны своего организма. Это, как правило, - нормальные белки или белковые комплексы (а также комплексы белков с ДНК или РНК), которые распознаются иммунной системой у пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Такие антигены в норме не должны узнаваться иммунной системой, но, ввиду генетических факторов или условий окружающей среды, иммунологическая толерантность к таким антигенам может быть утеряна.

Свойствами аутоан гигенов могут обладать так называемые естественные аутоантигсны (секвестированные). К ним относят белки, синтез которых начинайся после созревания иммунной системы (сперма, молоко); макромолекулы органов, отделенных от иммунной системы гистогсматическим барьером; макромолекулы, входящие в сосшв ядер и цитоплазмы клеток; макромолекулы с наличием новых чужеродных детермииаитньгх i pynn вследствие действия эндогенных (иммунные комплексы, некроз, воспаление) или экзогенных (температура, химические вещества, в том числе лекарственные, микробы и их токсины, вирусы и др.) факторов; эмбриональные белки с возобновляющимся при определенных состояниях синтезом (напимер, при опухолях). Они могу г индуцировать иммунный ответ, приводящий к образованию аутоантител или сенсибилизированных Т- лимфоцитов и развитию аутоиммунных болезней. В результате начинается разви тие аутоиммунной реакции. Они могут приводить к развитию самых разнообразных аутоиммунных заболеваний. К ним в частности относятся аутоиммунная полиэндокринопатия первого типа, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, гемолитическая болезнь новорождённых рассеянный склероз, аутоиммунный тиреоидит и др.

Аутоиммунитет - процесс и связанные с ним заболевания, обусловленные приобретением иммунной системой способности распознавать собственные антигены (аутоантигены) организма и реагировать на них образованием аутоантител или аутоиммунных Т-лимфоцитов. Аутоиммунный процесс— процесс и связанные с ними заболевания, основой которых является поражение тканей, обусловленное последствиями взаимодействия аутоантител или аутоиммунных Т-лимфоцитов с аутоантигенами.

« онъюгаг» - это модифицированный химическими соединениями белок, аш иген или антитело. Образование конъюгата - один из важных этапов проведения имунпо- ферментного анализа (ИФА). При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения химического соединения, чтобы компонент конъюгата, антиген или антитело, сохранял свою биологическую активность - ат игеиность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Способность чужеродных соединений и метаболитов вступать в реакции конъюгации зависит от наличия в их молекулах определенных функциональных групп.

«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. гоювых форм предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилакшки болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. «Рецепторы» (от латинского recipere - получать, узнавать) предс тавляют собой биологические макромолекулы, расположенные на цитоплазма гической мембране клс ки или внутриклеточно, способные специфически взаимодействовать с ограниченным набором физиологически активных веществ (лигандов) и трансформировать сш нал об этом взаимодействии в определенный клеточный ответ.

«Сольна 1 ы» - продукты присоединения растворителя к растворенным веществам; частный случай сольватов - гидраты (растворитель - вода). Обычно сольвагы образуются в растворе, но нередко (при охлаждении раствора, испарении раствори 1 еля и др.) могут быть получены в виде кристаллических фаз - кристаллосольватов.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя активный компонент (модифицированный белок) и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсласти ι ели, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентони т, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как, парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включат ь также изоюнические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностсарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носи телей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как тилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цшрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являю 1 ся крахмал. алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются c i eapaT магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтилепгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевт ическая композиция для пероралыюго, сублингвального, транедермального, внутримышечного, внутривенного, нодкожпою, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблс 1 ки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и траисбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, транедермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальпые или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения. Фармацевтические композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного соединения с жидким или тонко измельченным твердым носителем.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе сиш еза. выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валсриаты, олеаты, иальмитаты. стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малсагы, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропиона1 ы, этансульфонагы, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные (Подробное описание свойсм! таких солей дано в Bcrgc S.M., ct al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1 -1 .). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезирован ы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли нафия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из ко торых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид нафия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид мапшя, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быгь получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие дос 1 атомной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, три метиламин, ') гидами н, диэтиламии, триэтиламин, бепзиламин, дибепзиламип, дициклогсксиламни, иииеразии, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминомеган и подобные им. Кроме ют, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как, холин, тстраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитии и аргинин.

Цель настоящего изобретения заключается в создании новых соединений и модифицированных ими белков (конъюгатов), способных взаимодейст овать с рецептором CD16a, используемым для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и удаления таким образом из организма определенной целевой группы клеток, например, раковых клеток или аутоиммунных лимфоцитов.

Поставленная цель достигается обнаруженными авторами новыми соединениями, обладающими сродством к CD16a рецептору, содержащими активированную группу способную присоединяться к аминогруппе белка, а именно новыми замещенными 5.5, 1 1 - триоксо-10,1 1-дигидро-5//-дибензо[0/][1,4]тиазепин ами общей формулы 1 или 5,6, 7,8,9,10-гексагидро-4Я-[1]бензотиено[3, 2-/|пирроло[ 1 ,2-а][1,4]диазсшшами общей формулы 2, или их фармацевтически приемлемыми солями или сольвагами,

в которых R1 представляет собой (CH 3 ) 2 N-,

R2 представляет собой

где R3 в качестве концевого заместителя представляет собой незамещенный амииоалкил,

-NH 2 , О ~ , ~ или R4

a R4 представляет собой Н или СгС 3 алкил.

Предпочтительными являются соединения общей формулы 1, в коюрых R1 представляют собой:

Предпочтительными являются также соединения общей о мулы 2, в которых

R1 представляет собой (СИз) 2 М- или

a R2 п едставляет собой

Более предпочтительными соединениями являются:

2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (3-хлорбензил)-5,5,1 1-триоксо-10,1 1-дигидро-5Я- дибензо[6, ][1,4]тиазепин-7-карбоновой кислоты 1(1),

2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (4-{[ 10-(3-хлорбспзил)-5,5,1 1-триоксо- 10, 1 1 - дигидро-5Я-дибензо[6, |[1,4]тиазепин-7-карбопил]-амино}-фе окси)-уксусной кислоты 1(2),

2, 5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир 4-{[10-(3-хлорбензил)-5.5, 1 1-триоксо-10.1 1- дигидро-5Я-дибснзо[п, ][1,4]тиазепии-7-карбонил]-амино}-фе илкарбоновой кислоты ЦЗ),

2,5-диоксо-пирролидин-1 -иловый эфир 3-[8-(3,4-диметоксифенилкарбамоил)-5, 5,1 1- триоксо-5,1 1-дигидро-дибензо[ 7, ][1 ,4]тиазепин- 10-илметил|-бензойной кислоты 1(4). 2,5-диоксо-пирролидин-1 -иловый эфир (4-{8-[3-(4-бснзилпипермдин-1-ил)- иропилкарбамоил]-5,5,1 1 -триоксо-5, 1 1 -дигидро-дибензо[6,/] [ 1 ,4]тиазспи н- 10-илме ι ил } - фенил)-уксусной кислоты 1 (5),

10-(3-хлорбензил)-5,5, 11 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//-дибензо[Ь,1] f 1 ,4]тиазспин-8- карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амид 1(6),

10-{4-[(2-амино-этилкарбамоил)-метил] -бензил }-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я- дибензо[Ь,1 " ][1,4|тиазепин-8-карбоновой кислоты [3-(4-бе1пил-пиперидин-1-ил)-иронил 1- амид 1(7),

2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)- этиловый эфир 10-(3-хлорбснзил)-5.5Л 1 - триоксо-10,1 1 -дигидро-5Я-дибензо[Ь,{][1,4]тиазспи -8-карбоиовой кислоты 1 (8), 10-(4-{ [2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол- 1 -ил)-этилкарбамоил]-мегил}-бс1пил)- 5.5, 1 1 - Ί риокео- 10, 1 1 -дигидро-5#-дибензо[Ь ] f 1 ,4 |Ί иазешш-8-карбоновой кислоты f 3-(4-беизил- пиперидии- 1 -ил)-пропил ]-а ид 1 (9),

N-[2-( {Л г -(метоксикарбоиил)-Л^-[( 1 ,5-диметокси- 1 ,5-диоксопентан-2-ил)карбамоил |-β- аланил }амино)этил]- 10-(3-хлорбензил)-5,5, 1 1 - гриоксо- 10, 1 1 - дигидродибензо[6. | [ 1 ,4 |тиазеиин-7-карбоксамид 1(10),

/V 5 -(2- { [(4-{ [7- { [[3-(4-бензилпиперидин- 1 -ил)пропил ](фенил )амино |-карбоиил } -5.5, 1 1 - триоксо-дибензо[/?, ][1 ,4 ]тиазеиин- 10(1 1 Я)-ил]метил} фенил)ацетил]-амипо } :н 1)- ' 2 - { [( 1 ,3-дикарбоксипропил)амино]карбон л}глутамин 1 (11),

4-[4-(диметилами11о)фенил]-Л^(4-{[(2,5-ди оксопирролидии-1 -ил)окси]карбонил} фенил)- 7,8,9,10-тетрагидро-4Я-[1]бензотиено[3, 2-/]пирроло[ 1 ,2-а][ 1 ,4]диазепин-5(6Я)- карбоксамид 2(1),

4-[4-(диметиламино)фенил]-Л -(4-{2-[(2,5- диоксопирродидии- 1 -ил)окси |-2- оксоэтокси }фенил)-7,8,9, 10-тет рагидро-4Я-[1]бензотиепо[3,2-/]пирро о[ 1 ,2- а][1 ,4]диазепин-5(6Я)-карбоксамид 2(2),

2,5-диоксопирролидин-1 -ил Л г -[4-(5-{ [(3,4-диметоксифснил)амино]-карбои л}- 5,6,7,8,9, 10-гексагидро-4Я-[ 1 ] бензотиено[ 3,2- ]пирроло[ 1 ,2-а] [ 1 ,4 ]диазе11ин-4-ил)фенил |- N-метилглицинат 2(3).

Авторы впервые обнаружили модифицированный белок (коныогат), активный в отношении CD 16а рецептора. Поэтому предметом данного изобретения являе г ся модифицированный белок, активный в отношении CD16a рецептора, коныогированный модифицирующим соединением, обладающим сродством к CD16a рецептору, выбранным из соединения общей формулы 1 или 2.

Более предпочтительным являе гся модифицированный белок (коныогат) активный по отношению к CD16a рецептору, полученный взаимодействием белка с модифицирующим соединением общей формулы 1 или 2.

Более предпочтительным является модифицированный белок (коныогат) полученный из антитела и соединения общей формулы 1 или 2, в ко тором антитело представляет собой ритуксимаб, трастузумаб, или цетуксимаб.

Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой ритуксимаб, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2. Более предпочштельным является также модифицированный белок (Koin.iora i ), представляющий собой трастузумао, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.

Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой цетуксимаб, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.

Более предпочтительным является также модифицированный белок (коиыога! ) полученный из аутоантигена и соединения общей формулы 1 или 2, в котором аутоантиген представляет собой интерферон альфа или главный белок миелина, или белок комплимента Clq.

Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой интерферон альфа, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.

Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой главный белок миелина, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.

Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой белок комплимента Clq, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.

Исследование сравнительной эффективности белков и их конъюгаюв по отношению к CD 16а рецептору показало, что коныогаты на 1-3 порядка активнее своих немодифицированных белков.

Предметом данного изобретения является также способ получения модифицированного белка (конъюгата) согласно которому подвергают взаимодействию белок с соединением общей формулы 1 или 2, растворенным в среде органического растворителя, например, диметилсульфоксиде, в интервале молярного сотпошения от 1 :3 до 1 : 100 в среде фосфатного солевого буферного раствора (рН 7.4) при комнатной температуре при постоянном перемешивании.

Предметом данного изобретения является также фармацевтическая композиция, активная но отношению к CD16a рецептору, содержащая модифицированного белок (коныогат) в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель или эксципиент. Фармацевтические композиции могут включать фармацевтически приемлемые жсциписнты. Под фармацевтически приемлемыми эксципиеитами подразумеваю тся применяемые в сфере фармацевтики разбави тели, вспомогательные агент ы и/или носители. Фармацев тическая композиция наряду с модифицированным белком (конъюгатом), полученным взаимодействием белка с модифицирующим соединением общей формулы 1 или 2, или его фармацевтически приемлемой солью или сольватм, по настоящему изобретению, может включать и другие активные субстанции, в том числе обладающие противогриппозной активностью, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов.

При необходимости использования фармацевтической композиции но настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.

Носители, используемые в фармацевтических композиций по нас тоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: пероральных, форм для инъекций, местных форм.

Предметом данного изобретения является также лекарственное средство, активное по отношению к CD 16а рецептору, в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, предназначенное для лечения заболеваний, вызванных патологическими клетками, включающее в свой состав новый модифицированного белок (конъюгат), или новую фармацевтическую композицию в терапевтически эффективном количестве.

Поскольку при формировании конъюгага его компонент, антиген или ант и тело, сохраняют свою биологическую активность — антигенность и аитигенсвязывающую активность, соответственно, то конъюгаты по настоящему изобретению могут использоваться для лечения тех же заболеваний, для ко торых используются иеконъюгированные мопоклональпые антитела в качестве лекарственных средств таких как, низкозлокачественная или фолликулярная неходжкинская лимфома, рак молочной железы. Также известно, что активность антител по отношению к CD 16а рецептору используется для лечения аутоиммунных или онкологических заболеваний (R. L. Ferris, et al. J. Clinical Oncology, 2010, Oct 1 , Vol. 28, No 28: 4390-4399), в том числе таких как лимфома (К.-Н. Heider, et al. Blood, 201 1 , 1 18: 4159-4168) или лимфат ическая лейкемия (J. Λ. Bowels, et al. Blood, 2006, 108: 2648-2654). Предметом данного изобретения является способ лечения заболевания, вызванного патологическими клетками, которое можно лечить путем опосредованного воздействия на CD 16а рецептор, согласно которому субъекту вводят терапевт ически эффективное количество модифицированного белка (конъюгата), или фармацевтической композиции, или лекарственного средство, активных по отношению к CD 16а рецептору.

Предпочтительным является способ лечения аутоиммунных или онкологических заболеваний, определенных выше в данном разделе, в том числе таких, как лимфома. лимфатическая лейкемия или рак молочной железы.

Предпочтительным является также способ лечения аутоиммунной полиэндокринопатии первого типа.

Лекарственные средства могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшиино или местно). Клиническая дозировка модифицированного белка (конъюгата), или фармацевтической композиции, или лекарственного средства, активных по отношению к CD 16а рецептору, у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективное i n и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 300 ~ 1200 мг, предпоч тительно - 500 ~ 1000 мг в случае, когда белок в конъюгатс представляет собой аш итело, и 0.01 ~ 100 мг, предпочтительно - 0,1 ~ 10 мг в случае, когда белок в конъюгате предешвляет собой аутоантиген. Поэтому во время приготовления фармацевтических композиций по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку препарата. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно - от одного до шести раз). Лучший вариант осущес тлении изобрет ения

Изобретение поясняе 1 Ся следующими чертежами:

Фиг. 1. Спектр протонного матич ного резонанса (ПМР спектр) 2.5- диоксопирролидин- 1 -илового эфира (3-хлорбспзил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//- дибензо[0,/|[1 ,4|тиазенин-7-карбоновой кислот ы 1(1).

Фиг. 2. ПМР спектр 2,5-диоксопирролидин-1 -илового эфира (4-{ | 10-(3- хлорбензил)-5,5,1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я-дибензо[6,/] [1 ,4 |тиазепин-7-карбонил]- амшю}-фенокси)-уксусной кислоты 1(2).

Фиг. 3. ПМР спектр 2,5-диоксопирролидин-1 -илового эфира 4-{[10-(3- хлорбензил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10,1 1 -дигидро-5Я-дибензо[/>,/] [ 1 ,4]тиазепип-7-карбонил ] - амино}-фенилкарбоновой кислоты 1(3).

Фиг. 4. LCMS спектр 2,5-диоксо-пирролидип-1 -илового эфира 3-[8-(3,4- диметоксифенилкарбамоил)-5,5,1 1 -триоксо-5,1 1 -дигидро-5Я-дибензо[6,/|[ 1 ,4]тиазспин- 10-илметил]-бензойной кислоты 1(4).

Фиг 5. ПМР спектр 2,5-диоксо-пирролидин- 1 -илового эфира (4-{8-[3-(4- бснзилпипермдин-1-ил)-пропилкарб моил]-5,5,1 1-триоксо-5, 1 1-дигидро- дибензо[&, |[1 ,4]тиазепин-10-илметил}-фенил)-уксу ной кислоты 1(5).

Фиг. 6. ПМР спектр 10-(3-хлорбензил)-5,5 ,1 1 -триоксо- 10, 1 1-дигидро-5//- дибензо[Ь,^[1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амида 1(6).

Фиг. 7. ПМР спектр 10-{4-[(2-амипо-эгилкарбамоил)-метил] -бензил} -5,5, 1 1- триоксо-10,1 1-дигидро-5//-дибензо[Ь,1][1,4]тиазепи 11-8-карбоновой кислоты [3-(4-бснзил- 11 и п ери дин- 1 -ил)-проп ил ] -амида 1 (7) .

Фиг. 8. ПМР спектр 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)- тилового эфира 10- (3-хлорбензил)-5,5,1 1 -триоксо- 10,1 1-дигидро-5//-дибензо[Ь,1][1 ,4]тиазспин-8-карбоновой кислоты 1(8).

Фиг. 9. ПМР спектр 10-(4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол- 1 -ил)- этилкарбамоил]-метил}-бснзил)- 5,5,1 1 -триоксо- 10,1 1-дигидро-5Я- дибензо[Ь,1][1,4]тиазепин-8-карбонов ой кислоты [3-(4-бензил-пиперидии-1 -ил)-пропил|- амида 1(9).

Фиг. 10. ПМР спектр соединения Л г -[2-({Л-(Ме1 оксикарбонил)-Л^-[( 1 ,5-димсгокси- 1 ,5-диоксопентан-2-ил)карбамоил]-Р-а ланил}амино)этил]- 10-(3-хлорбензил)-5,5, 1 1 - I риоксо- 10,1 1 -дигидродибензо[6 | [ 1 ,4 ]тиазепин-7-карбоксамида 1(10). Фиг. 11. I1MP спектр ^ 5 -(2-{ 1(4-{[7-{ [[3-(4-Вензил1 шперидин- 1 - ил)пропил](фенил)амино]карбонил}-5 ,5,1 1-триоксо-дибензо[0./1[1 ,4]тиазепии-10( 1 1 //)- ил]метил}фенил)аце1 ил]амиио}э 1ил)-Л г2 -{[( 1 ,3-дикарбоксипропил)ами1ю |- карбонил}глутамина 1(11).

Фиг 12. LCMS спектр 4-[4-(диметиламино)фенил|-Л г -(4-{ 1(2,5-диоксопирролидин- 1-ил)окси]карбонил}фенил)-7, 8,9,10-тетрагидро-4//-[1]бензотиено[3,2- /1пирроло[ 1.2- я][ 1,4]диазепин-5(6Я)-карбоксамида 2(1).

Фиг. 13. ПМР спектр 4-[4-(диметиламино)фенил]-Л г -(4-{2-[(2,5- диоксопирролидин- 1 -ил)окси ]-2-оксоэтокси } фенил)-7,8,9, 10-тетрагидро-4//- [1]бе113отиено[3,2- ]пирроло[1 ,2-а][1 ,4]диазепин-5(6//)-карбоксамида 2(2).

Фиг. 14. LCMS спектр 2,5-диоксопирролидин-1 -ил N-[4-(5-{ [(3,4- диметоксифенил)-амино]карбонил}-5 ,6,7,8,9,10-гексагидро-4//-[1 ] бензотиено[3.2- /]11ирроло[1,2-а][1,4]диазепин-4-ил)фен л]-Л г -метилглицината 2(3).

Фиг. 15. Хроматограмма конъюгата Р1(1), на колонке TSK GEL SUPER SW3000.

Фиг 16. Имунно-ферментный анализ (ИФА) связывания конъюгатов ритуксимаба с CD 16a рецептором. Зависимость оптической плотности на длине волны 450 им от концентрации введенного в ИФА конъюгата.

Фиг 17. Имуиио-ферментный анализ (ИФА) связывания интерферона (И) и конъюгата КИ1(1) с CD 16а рецептором. Зависимость оптической плотности на длине волны 450 нм от концентрации введенного в ИФА конъюгата.

Фиг. 18. Сравнение эффективности ритуксимаба (Р) и конъюгата КР1(1) в честе антитело-зависимой цитотоксичности.

Фиг. 19. Сравнение эффективности ритуксимаба (Р) и конъюгата Р1 (2) в iccic антитело-зависимой цитотоксичности.

Фиг 20. Имунно-ферментный анализ (ИФА) связывания ритуксимаба (Р). трастузумаба (Т) и их конъюгатов КР1(7), КТ1(7) по огношепию к CD 16а рецептору.

Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают, данное изобретение.

Пример 1. 2,5-Диоксопирролидин-1 -иловый эфир (3-хлорбепзил)-5,5,1 1- фиоксо- 10,1 1-дигидро-5//-либензо[0,/Ц1 ,4] гиазепии-7-карбоновой кислоты 1 (1 ) получают по нижеследующей Схеме 1 . К раствору 31.8 г КОН в 170 мл воды присыпают порциями 25 г соединения 4, после его растворения добавляют 30 г соединения 3 и перемешивают при 60° С в течение 15 ч. Затем реакционную смесь охлаждают, подкисляют 1 % соляной кисло той до рП=3, фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 5 с выходом 70%. Растворяют 50 г соединения 5 в 500 мл водного аммиака растворяют и порциями присыпают 80 г дитионита, после чего реакционную смесь кипятят с обрашым холодильником 1 ч. Затем реакционную смесь охлаждают, упаривают па ро торном испарителе аммиак, а водный раствор подкисляют конц. соляной кисло юй до pi I— 1 , перемешивают 1 ч, фильтруют осадок, промывают водой, сушат. Получают соединение 6 с выходом 60%. Добавляют порциями 45г соединения 6 к 200 мл полифосфорпой кислоты при 50°С, после чего перемешивают 10 ч при 90 °С. Выливают на 500 мл льда, фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 7 с выходом 60%. Растворяют 30 г соединения 7 в 500 мл уксусной кислоты, добавляют 70 мл 33% перекиси водорода, перемешивают ночь при 70°С. Затем охлаждают, уксусную кислоту упаривают на роторном испарителе, к остатку добавляют 600 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 8 с выходом 70%. К раствору 22 г соединения 8 в 300 мл этанола прикапывают 8 мл хлористого тионила при 10°С, после чего смесь кипя тят 5 часов. Охлаждают, упаривают метанол па ро юрном испарителе, добавляют 300 мл воды. Выпавший осадок фильтрую т, промывают водой, сушат. Получают соединение 9 с выходом 90%. Растворяют 8.2 г соединения 9 в 80 мл ДМФА, добавляют 7 г поташа и после этого 5.2 г .к-хлорбен лхлорида. Смесь перемешивают при 50°С ночь, упаривают ДМФА на роторном испарителе, к остат ку добавляют 200 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промываю т водой, сушат. Получают соединение 10 с выходом 90%. Растворяют И г соединения 10 в 150 мл 50% водном этаноле, добавляют 2.7 г КОН и перемешивают ночь при комнатой leMncpaiype. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 11 с выходом 80%. Растворяют 1.8 г соединения 1 1 в 50мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 0.48г Ν-гидроксисукцинимида и 0.87г дициклогексилкарбо-диимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистя т флэш- хроматографией на силикагсле ( люент этилацет ат). Получают соединение 1 (1 ) с выходом 50%. Спекгр протонного магнитного резонанса (ПМР спектр) соединения 1(1) представлен на Фиг.1.

Пример 2. 2,5-Диоксопирролидин-1 -иловый эфир (4-{[10-(3-хлорбензил)-5,5,11- триоксо- 10, 11 -дигидро-5Я-дибензо|Д/] [ 1 ,4 |т иазеиин-7-карбонил]-амино } -феиокси)- уксусиой кислоты 1(2) получают по нижеследующей Схеме 2.

Схема 2. К суспензии 30 г no iaina в 200 мл ацетонитрила добавляют 15 г п-нитрофенола 12, перемешивают 1 ч, после чего прикапывают 19,8 г этилового эфира бромуксусной кислоты. Перемешивают ночь при 60°С, фильтруют, упаривают на роторном испарит еле. Полученный продукт 13 используют дальше без очистки. Растворяю ! 14.3 г соединения 13 в 200 мл 50% водной уксусной кислоты, нагревают до 70°С, после чего присыпаю т небольшими порциями 10 г железа так, чтобы смесь кипела. После э того перемешивают еще 15 мин, охлаждают, добавляют 500 мл воды. Экстрагируют 3x 150 мл эгилацетага. объединенные экстракты промывают концентрированным раствором Nal IC0 3 , сушат, растворитель упаривают на роторном испарителе. Получают продукт 14 с выходом 75%. Смешивают в 50 мл диоксана 1.9 г соединения 11 и 0.87 г соединения 14. Перемешивают 1 ч, после чего добавляют 1.2 мл триэтиламина и 0.89 г хлорокиси фосфора. Перемешивают 3 ч при 50°С, добавляют 150 мл воды, выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 15 с выходом 60%. Растворяют 2.7 г соединения 15 в 20мл 50% водного этанола, добавляют 0.93 г LiOH и перемешиваю г ночь при комнатной температуре. После этого этанол упаривают па роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН^З. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Продукт очищают колоночной хроматографией в системе хророформ-метанол-триэтиламин 10- 1- 1. Получают продук ! 16 с выходом 1 1%. Растворяют 290 мг соединения 16 в 50 мл ТГФ. в атмосфере аргона при перемешивании добавляю т 58 г N-гидроксисукцинимида и 104 мг дициклогексилкарбо-диимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш- хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат). Получаю т продукт 1 (2) с выходом 50%. ПМР спектр соединения 1 (2) представлен на Фиг. 2.

Пример 3. 2,5-Диоксопирролидин- 1 -иловый эфир 4-{ [10-(3-хлорбепзил)-5,5.1 1 - триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я-дибензо [/),/] [ 1 ,4 |тиазепин-7-карбонил ] -амино } - фенилкарбоновой кислоты 1(3) получают по нижеследующей Схеме 3.

Схема 3.

Растворяют 1 экв я-аминобснзойной кисло ты в трет-бу ι иловом спирт е и добавляют 1.1 экв HDC . Кипятят реакционную смесь 18 ч. Охлаждаем до 0°С, добавляют воду и экстрагируют диэтиловым эфиром. Упаренный органический слой пускаем следующую стадию без очистки. Получают продукт 17 с выходом 60%. Смешивают в 50 мл диоксапа 2.2 г соединения 11 и 0.85 г от/?е/и-бутилового эфира и-аминобспзойиой кислоты 17. Перемешивают 1 ч, после чего добавляют 1.4 мл триэтиламипа и 1.0 г хлорокиси фосфора. Перемешивают 3 ч при 50°С, добавляют 150 мл воды, выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 18 с выходом 60%. Соединение 18 растворяют в трифторуксусной кисло те и перемешиваю т ночь при 50°С. Реакционную массу упаривают досуха. Получаю т продукт 19 с выходом 88%, ко юрый использую т в следующую стадию без очистки. Растворяют 760 мг соединения 19 в 50 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 1 60 мг Ν-ι идроксисукцииимида и 287 мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре, выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш- хроматографией на силикагеле (элюент - этилацетат). Получают проду 1(4) с выходом 50%. ПМР спектр соединения 1(4) представлен на Фиг. 3.

Пример 4. 2,5-Диоксо-иирролидин-1 -иловый эфир 3-[8-(3,4- димстоксифенилкарбамоил)-5,5,1 1 -триоксо-5,1 1-дигидро- дибе1по16,/][1.4]тиазешш- 10- илметил|-бензойной кислоты 1(4) получают по нижеследующей Схеме 4.

О

\

с н з 1 (4)

Схема 4.

Кипятят 10 г 2,4-диметоксибензальдсгида и 9.2 г 3,4-диметоксианнлина в 150 мл толуола с насадкой дина-старка до прекращения выделения воды. После этго смесь охлаждают, упаривают толуол на роторном испарителе, полученный продукт 20 используют дальше без очистки. Растворяют соединение 20 в 100 мл метанола и при перемешивании присыпают 2.8 г боргидрида натрия, перемешивают при комнатной температуре еще 1ч, упаривают метанол на роторном испарителе, добавляют 100 мл воды, подщелачивают 10% раствором КОН до рН=9, экстрагируют хлористым метиленом, сушат, упаривают. Получают продукт 21 с выходом 80%. Смешивают в 50 мл диоксана 2.2 г соединения 9 и 3.0 г соединения 21. Перемешивают 1ч, после чего добавляют 5.5 мл триэтиламина и 2.0 г хлорокиси фосфора. Перемешивают 3 ч при 50°С, добавляют 150 мл воды, выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 22 с выходом 60%. Растворяют 3.0 г соединения 22 в 30 мл ДМФЛ. добавляют 1.7 г погаша и 1.3 г этил 3-бромметилбензоата. Смесь перемешиваю! при 50°С ночь, упаривают ДМФА в вакууме, к остатку добавляют 70 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 23 с выходом 90%. Растворяют 3.0 г соединения 23 в 40 мл хлористого метилена, добавляют 1.4 г трифторуксусной кислоты и кипятят с обратным холодильником ночь. После этого смесь промывают конц. раствором NaHC0 3 , сушат, упаривают хлористый мешлен. Чистят продукт колоночной хроматографией, элюсит хлороформ / метанол 40 / 1. Выход продукта 24 составляет 30%. Растворяют 0.9 г соединения 24 в 20 мл 50% водного этанола, добавляют 0.25 г LiOH и перемешивают ночь при комнатной l e iiepa i ype. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Продукт очищают колоночной хроматографией в системе хророформ-метанол- триэгиламип 10-1-1. Получают продукт 25 с выходом 20%. Растворяют 140мг соединения 25 в 20мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 42мг N- гидроксисукцинимида и 76мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш-хроматографией на силикагеле (элюент этилапстат). Получают продукт 1(4) с выходом 50%. LCMS спектр соединения 1(4): (М+1 = 670) представлен на Фиг. 4.

Пример 5. 2,5-Диоксо-пирролидии-1 -иловый эфир (4-{8-[3-(4-бснзилпипермдин- 1 -ил)-пропилкарбамоил]-5,5,1 1-триоксо-5,1 1-дигидро-дибензо[6,/|[ 1 ,4]тиазспин-10- илметил}-фенил)-уксусной кислоты 1(5) получают по нижеследующей Схеме 5.

Кипятят 3.8 г 2,4-диметоксибензальдегида и 5.3 г соединения 26 в 100 мл толуола с насадкой дина-старка до прекращения выделения воды. После этого смесь охлаждают, упаривают толуол на роторном испарителе. Полученный продукт 27 используют дальше без очистки. Растворяют соединение 27 в 50 мл метанола и при перемешивании присыпают 1.3 г боргидрида натрия, перемешивают при комнатной температуре еще 1 ч, упаривают метанол на роторном испарителе, добавляют 50 мл воды, подщелачивают 10% раствором КОН до рН=9, экстрагируют хлорист ым метиленом, сушат, упаривают. Получают соединение 28 с выходом 80%. Растворяют 2.4 г соединения 9 в 100 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 1.0 г Ν-гидроксисукцинимида и 1.1 г дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого добавляют 3 г соединения 28 и перемешивают 6 ч при 60°С. Выпавший осадок отфильтровывают, магочный раствор упаривают на роторном испарителе. Остаток чистят колоночной хроматографией, элюент хлороформ:мс'1анол 19: 1. Получают соединение 29 с выходом 70%. Смесь 10.0 г п-толилуксусиой кислоты, 13.0 г N- бромсукцинимида и 0.1 г 2,2'-азабисизобутиронитрила в 60 мл четыреххлорисгого углерода кипятят с обратным холодильником 4 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры, выливают на 100 мл воды, выпавший осадок отфильтровывают, сушаг. Растворяют в 50 мл этанола, добавляют при 0°С 3.7 мл тионилхлорида, перемешивают ночь при комнатной температуре, упаривают растворитель.

Схема 5.

Получают соединение 30 с выходом 50%. Полученный продукт используют дальше без очистки. Растворяют 4.5 г соединения 29 в 50 мл ДМФА, добавляют 2.2 г поташа и после этого 2.0 г этилового эфира п-бромметилфенилуксусиой кислоты 30. Смесь перемешивают при 50°С ночь, упаривают ДМФЛ на роторном испарителе, к остатку добавляют 100 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, суша . Получают соединение 31 с выходом 80%. Растворяют 3.5г соединения 31 в 40 мл хлористого метилена, добавляют 2.0 г трифторуксуспой кислоты и кипятят с обратным холодильником ночь. После этого смесь встряхивают несколько раз с коиц. раствором ЫаПСОз, сушат, упаривают хлористый метилен на роторном испари теле. Чистя т продукт колоночной хроматографией, элюент хлороформ / метанол 40 / 1. Получают соединение 32 с выходом 55%. Растворяют 1.6 г соединения 32 в 20 мл 50% водного эшнола, добавляют 0.29 г LiOII и перемешивают ночь при комнатной температуре. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Продукт очищают колоночной хроматографией в системе хророформ-метанол-триэтиламин 10-1 - 1. Получают соединение 33 с выходом 15%. Растворяют 180 мг соединения 33 в 20 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 47 мг Ν-гидроксисукиинимида и 84 мг дипиклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, \ia i очный рас ι вор упаривают, чистят флэш - хроматографией на силикагсле (элюсит этилацетат). Получают соединение 1(5) с выходом 50%. ПМР спектр соединения 1 (5) представлен на Фиг. 5.

Пример 6. 10-(3-Хлорбензил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//- дибензо[Ь,1Ц 1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амид 1 (6) получаю т по нижеслед ющей Схеме 6.

1 (6)

Схема 6.

Соединение 11 растворяют в хлороформе, добавляют 1.1 экв КДИ и перемешивают при комнатной температуре час, затем прибавляют бок-этилендиамин и перемешивают ночь при комнатной температуре. Промывают водой и органический слой упаривают. Чистим на колонке в элюен ге хлороформ-метанол 20: 1. Получают соединение 34 с выходом 70%.

Соединение 34 перемешивают в диоксане, насыщенном ПС1, при комнатой температуре 1 ч, осадок отфильтровывают. Получают соединение 1 (6) с выходом 78%. ПМР спектр соединения 1(6) представлен на Фиг. 6.

Пример 7. 10-{4-[(2-Амино-этилкарбамоил)-метил] -бензил } -5.5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 - дигидро-5Я- дибензо[Ь,1] [ 1 ,4 ]тиазепин-8-карбоповой кисло ι ы [ 3-(4-бснзил-пипсриди н- 1 - ил)-пропил]-амид 1(7) получают по нижеследующей Схеме 7.

1 (7)

Схема 7.

Соединение 35 растворяют в хлороформе, добавляю т 1 .1 зкв КДИ и перемешивают при комнатной температуре 1 ч, затем прибавляют бок-эгилендиамин и перемешивают ночь при комнатной температуре. Промывают водой и органический слой упариваем. Хроматографируют на силикагеле смесью хлороформа с метанолом (20: 1 ). Получают соединение 36 с выходом 70%. Соединение 36 перемешивают в диоксане насыщенном НС1 при комнатной температуре 1 ч, осадок отфильтровываем. Получают соединение 1(7) с выходом 78%. ПМР спектр соединения 1(7) представлен на Фиг. 7. Пример 8. 2-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)- эгилопый эфир 10-(3- хлорбензил)-5,5,1 l-ipiioKco-Ι ϋ,1 1-дигидро-5Я-дибс1по[Ь,1][1 ,4]тиазегшн-8-карбоновой кислоты 1 8) получают но нижеследующей Схеме 8.

Схема 8.

Соединения 37 и 11 растворяют в ТГФ в соотношении 1 : 1 и при перемешивании добавляют 1 э в дициклогексилкарбодиимида и 1 экв Et 3 N. Перемешивают ночь при 50°С. Охлаждают, выпавший осадок фильтруют, а маточник упаривают и чистят па HPLC. Получают соединение 1(8) с выходом 10%. ПМР спектр соединения 1(8) представлен на Фиг. 8.

Пример 9. 10-(4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол- 1 -ил)- гилкарбамоил]- метил } -бензил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//-дибензо[Ь,1] [ 1 ,41 гиазепин-8- карбоновой кислоты [3-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-пропил]- амид 1(9) получают по нижеследующей Схеме 9.

Соединения 35 и 37 растворяют в ТГФ в соотношении 1 : 1 и при перемешивании добавляют 1 экв дициклогексилкарбодиимида и 1 экв Et 3 N. Перемешивают ночь при 50°С. Охлаждают, выпавший осадок фильтруют, а маточник упаривают и чистят па I 1PLC. Получают соединение 1 (9) с выходом 10%. ПМР спектр соединения 1 (9) представлен на Фиг. 9.

Схема 9.

Пример 10. ^У-[2-({Л^-(Метоксикарбоиил)-Л г -[(1 ,5-диметокси-1 ,5-диоксопснтан- ил)карбамоил]-Р-аланил } амино)этил]-10-(3-хлорбензил)-5.5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1- дигидродибензо[0. ][1,4]тиазепин-7-карбоксамид 1(10) получают по нижеследующей Схеме 10.

38 39 40

1(10)*HCI

Схема 10. К суспензии трифосгена (4.2 г, 0014 моль) в СН 2 С1 2 при 0°С медленно прикапывают раствор, состоящий из 1 1 г (0.038 моль) соединения 38 и 12.6 г (0.098 моль) DIPEA в СН 2 С1 2 . Перемешивают смесь 30 минут при 0°С, затем добавляют одной порцией раствор 8.1 г (0.038 моль) соединения 39 и 10.8 г (0.084 моль) DIPEA в С1 СЬ. Затем перемешивают еще 15 мин, органический слой отделили, промыли водой и хроматографируюг на силикагеле CHCbj/McOH (98:2). Получают соединение 40 с выходом, 53%. Растворяют 6 г соединения 40 в этилацетате, добавляют 0.6 г Pd/C ( 10%). Смесь гидрируют в автоклаве при 2 атм 17 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упарили. Получают 5 г соединения 41 , которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору 4.8 г (0.013 моль) соединения 41 в СН 2 С1 2 при комнатной температуре присыпали 2.6 г КДИ (0.016 моль). Через 2 часа добавляют 2.2 г (0.013 моль) бок-этилендиамина. Смесь перемешивают около 18 часов, разбавляют водой, продукт экстрагируют СН С1 2 и хроматографируют на силикагеле смесью СНС1 3 /МеОН (99:1). Получают 4.4 г (66%) соединения 42. К раствору 4.4 г соединения 42 в диоксане добавляют 5 экв 3N НС1 в диоксане. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре, затем упаривают досуха. Получают соединение 43 с выходом 90%. Смешивают 0.8 г (0.002 моль) соединения 43, 0.85 г (0.002 моль) соединения 11. 0.4 г NEt 3 (0.004 моль) и 0.4 г (0.002 моль) Л^-(димстиламинопропил)-Л^ '-этилкарбодиимида гидрохлорид в THF. Реакционную массу перемешивают при 60°С два дня. 3ai cM добавляют 0.5 г (0.012 моль) LiOH H 2 0 и 2 мл воды. Через 24 часа добавляют 0.72 г (0.012 моль) уксусной кислоты. Реакционную массу упариваю i и очистили HPLC. Получают соединение 44 с выходом 7%. ПМР спектр соединения 1(10) представлен на Фиг. 10. Гидрохлорид 1(10)*НС1 получают добавлением к соединению 1(10) растворением в этилацетате, насыщенном ПО. Полученный в осадке гидрохлорид фильтруют, сушат, очищают перекристаллизацией. Аналогичным образом получают гидрохлориды соединений, полученных в примерах 1-9 и 1 1 -14.

Пример 11. N 3 -(2-{ [(4- { [7- { [ [3-(4-Беизилпиперидин- 1 -ил)пропил |(фенил )амино|- карбонил } -5,5, 1 1 -триоксо-дибензо[й ] [ 1 ,4]тиазепин- 10( 1 1 Я)-ил ]метил } фснил)ацетил |- амшю}этил)-Л^-{[(1 ,3-дикарбоксипропил)амино|карбон л}глутамин 1(11) получают по нижеследующей Схеме 1 1.

Смешивают 1.6 г (0.0024 моль) кислоты 35, 1 г (0.0024 моль) эфира 43, 0.5 г NEt 3 (0.0048 моль) и 0.45 г (0.0024 моль) -(димстиламинопропил)-./У * Э1 илкарбодиимида гидрохлорид в THE. Реакционную массу перемешивают при 60°С два дня. Заюм, не выделяя продукт 45, добавляют 0.0144 моль, 0.6 г LiOH H 2 0 и 2 мл воды. Через 24 ч добавляют 0.86 г (0.014 моль) уксусной кислоты. Реакционную массу упаривают и очистили HPLC. Получают соединение 1(11) с выходом 10%. П Р спектр соединения 1(11) представлен на Фиг.11.

Схема 11. Пример 12. 4-[4-(Диметиламшю)феш1л]- -(4-{ [(2,5-диоксоиирролидии-1 - ил)окси]карбонил}фенил)-7,8,9Л0-тетр агидро-4#-[1 ]бенз иено[3,2-/]пирроло[1.2- а|[ 1 ,4]диазепин-5(6#)-карбоксамид 2(1) получают по нижеследующей Схеме 12.

2(1 )

Схема 12.

Смесь 3.0 г соединения 46 и 1.7 г 4-диметиламинобен альдсгида в 40 мл этанола кипятят с обратным холодильником 10 ч, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют выпавший осадок. Осадок растворяют в 50 мл воды и подщелачивают 10% КОН до рН 10. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 47 с выходом 35%. Растворяют 0.6 г соединения 47 и 0.32 г этил 4- изоииапатобензоата в 30 мл диоксапа и перемешивают ночь при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют. Получают соединение 48 с выходом 30%. Растворяют 140 мг соединения 48 в 5 мл 50% водного этанола, добавляют 32 мг LiOH и перемешивают ночь при комнатной температуре. Этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 49 с выходом 60%. Рас пюряют 80 мг соединения 49 в 10 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляю т 22 мг N- гидроксисукцинимида и 39 мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш - хроматографией на силикагсле ( люент этилапетат). Получают соединение 2(1) с выходом 50%. LCMS спектр соединения 1(12) представлен на Фиг. 12 (М+1 ) = 624.

Пример 13. 4-[4-(Димстиламино)фенил]-. У-(4-{2-[(2,5- диоксопирролидин- 1 - ил)окси]-2-оксоэтокси}фенил)-7,8,9,10- етрагидро-4Я-[1 ]бензотиено[3,2- : ]пирроло[ 1.2- а|[1 ,4]диа епин-5(6Я)-карбоксамид 2(2) получают по нижеследующей Схеме 13.

Схема 13, Растворяют в 30 мл диоксана 0.8 г соединения 50 и 0.5 г соединения 47 и перемешивают ночь при комнат ной температуре. Раствори тель упариваю т, ос таток чистят колоночной хроматографией. Элюент хлороформ - метанол 39: 1. Получаю т соединение 51 с выходом 5%. Растворяют 6 мг соединения 51 в 5 мл 50% водного этанола, добавляют 14 мг LiOH и перемешивают ночь при комнатной температуре. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10%> соляной кислотой до рН 3. Выпавший осадок фильтруют, промываю т водой, сушат. Получают соединение 52 с выходом 60%. Растворяют 50 мг соединения 52 в К) мл ТГФ. в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 10 мг N-гидроксисукцинимида и 19 мг дипиклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистя т флэш - хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат). Получают соединение 1 (13) с выходом 50%. ПМР спектр соединения соединения 2(2) представлен на Фиг. 13.

Пример 14. 2,5-Диоксопирролидин-1 -ил Л-[4-(5-{ [(3,4-димстоксифенил)амино]- карбонил}-5,6,7,8,9, 10-гексагидро-4Я-[1 ] бензотиено[3,2-/]пирроло[1.2-«|[ 1 ,4 |диазепин- 4-ил)фенил]-/У-метилглицинат 2(3) получают по нижеследующей Схеме 14.

Смесь 1.68 г соединения 46 и 1.45 г соединения 53 в 25мл этанола кипятят с обратным холодильником 10 ч, охлаждают до комнатной температуры, филырую г выпавший осадок растворяют в 50 мл воды и подщелачивают 10% КОН до рП 10. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 54 с выходом 19%. Растворяют в 10 мл диоксана 0.54 г соединения 54 и 0.29 г диметоксианилина и перемешивают ночь при комнатной температуре. Рас пюритель упаривают, остаток чистят колоночной хроматографией. Элюент - хлороформ : метанол 39: 1. Получают соединение 55 с выходом 65%. Растворяют 500 мг соединения 55 в 5 мл 50% водного этанола, добавляют 32 мг LiOH и перемешивают ночь при комнатной температуре. Э танол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляю 10% соляной кислотой до рН 3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 56 с выходом 60%. Растворяют 360 мг соединения 56 в 10 мл ТГФ. в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 71 мг N-гидроксисукцинимида и 127 мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтрую т, маточный раствор упариваю т, чистят флэш - хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат). Получают соединение 2(3) с выходом 50%. LCMS спектр соединения 2(3) представлен на Фиг. 14 (М+1 ) - 684.

Пример 15. Общий способ получение модифицированных белков (конъюгатов). Белок модифицируют веществом общей формулы 1 или 2 в молярном соотношениии ο ι 1 : 1 до 1 : 100. Навеску вещества общей формулы 1 или 2 растворяю т в 50 мкл ДМСО, чатем медленно добавляют фосфатный солевой буферный раствор (ФСБ, рН 7,4) и добавляют раствор белка в ФСБ. Конечная концентрация белка в реакционных смесях составляла 1 мг/мл. Реакцию ведут при комнатой температуре в течение 20 ч при постоянном перемешивании. Реакционную массу центрифугируют, фильтрат наносят па гель Superdex 75 (GE, США); высота столба носителя - 23 см; подвижная фаза - ФСБ; скорость потока— 57,3 см/час; обьем инжекции— 2,2% от объёма носителя. Чис т коныогата определяют с использованием ВЭЖХ на аффинной колонке Bio-Monolith Protein A (Agilent, США).

По данному способу получены, в частности, конъюгаты:

КР1(1) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,

Р1(2) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(2), в соотношении 1 : 100,

КР1(3) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(3), в соотношении 1 : 100,

Р1(4) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(4), в соотношении 1 : 100,

Р1(5) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(5), в соотношении 1 : 10,

Р2(1) - ритуксимаба (Р) с соединением 2(1), в соотношении 1 : 100,

КЦ1(1) - цетуксимаба (Ц) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,

И1(1) - интерферона альфа (И) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,

КМ1(1) - белка миелина (Р) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,

С1(1) - белка комплимента Clq (С) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10. На Фиг. 15 приведена для примера хроматограмма коныогата Р1(1), свидетельствующая о содержании основного вещества более 98 %.

Пример 16. Определение активности конъюгатов по о ι ношению к CD 16а рецептору. В эксперименте используют стандартные материалы и оборудование для иммуно- ферментного анализа. В лунки 96-и луночного планшета сорбируют CD16a из раствора 3,3 мкг/мл в фосфатпо-солевом буфере в объёме 75 мкл/лунку. Сорбцию вели при 4°С в течение 16 часов. Раствор CD 16а удаляют из планшета, лупки заполняли 2%-иым раствором БСА в ФСБ-П (150 мкл/лунку). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 2 часов и трижды отмывали буфером ФСБ-П (каждый раз по 300 мкл/лунку). 3ai CM лупки планшета заполняли растворами коныогатми в ФСБ-П по 50 мкл/лунку, в разведениях от 0,25 до 256 мкг/мл. Каждому разведению одного коныогата в планшс1е соответствовало три лунки. Для контроля над неспецифической сорбцией образцов часть лунок заполняли 2%-пым раствором БСА. Планшет инкубируют один час при 37°С в шейкере для ИФА (скорость вращения 180 оборотов/мин). Планшет отмывали пять раз по 300 мкл/лунку ФСБ-П и заполняли раствором белка, модифицированного пероксидазой хрена (по 75 мкл/лунку, в рабочем разведении, которое указано в описании к иммуноконъюгату). Планшет инкубируют 30 минут, отмывали ия п, раз по 300 мкл/луику ФСБ-П и заполняли раствором ' ГМБ ( 100 мкл/луику). Визуально оценивали глубину протекания фермента1 ивпой реакции и останавливали последнюю добавкой 50 мкл/лунку 500 мМ раствора серной кисло . Измеряют оптическую илошость в лунках планшета при комнатной температуре на длине волны 450 нм. Для oopaoo i Kn результатов эксперимента используют программу GraphPad Prism 5.0.

На Фиг. 16 представлены зависимости связывания некоторых кон огагов по отношению к CD 16а рецептору, из которых рассчитаны (Таблица 1 ) константы диссоциации комплексов конъюгатов с CD 16а рецептором (активность коныогагов по отношению к CD 16а рецептору - Kj). Как видно из таблицы активность конъюгатов ритуксимаба в 10-100 раз выше активности неконъюгировашюго ритуксимаба.

Таблица 1. Активность (Ка) ритуксимаба и его конъюгатов по отношению к CD 16а рецептору.

На Фиг. 17 представлены зависимости связывания интерферона альфа и конъюгата интерферона альфа с соединением 1(1) с CD16a рецептором. Зависимосп, оптической плотности на длине волны 450 нм от концентрации введенного в ИФА конъюгата. Как видно из таблицы 2, активность конъюгата интерферона выше активности неконъюгировашюго интерферона альфа.

Таблица 2. Активность (Ка) интерферона альфа (И), и его конъюгата КИ1(1) по отношению к CD 16а рецептору.

Пример 17. Эффективность конъюгатов в тесте на антитело-зависимую (ритуксимаб-зависимую) клеточную цитотоксичность. Эффективность коныогагов ритуксимаба в сравнении с неконъюгированным ритуксимаба была оценены в TCC I C на антитело-зависимую клеточную токсичность. В качестве клеток-мишеней были использованы СО20-положительные клетки линии Daudi (В-клеточиая лимфома Беркита). В качестве эффекторных клеток используют пулироваиные периферические мононуклеарные клетки крови из 5 здоровых доноров, выделенные по стандартному протоколу.

Разведения исследуемых конъюгатов и ритуксимаба были приготовлены в среде RPMI 1640. 50 мкл растворов исследуемых конъюгатов и ритуксимаба были помещены в лунки 96-луиочного круглодонного планшета. Клетки линии Daudi ресусиеидирую г в среде RPMI 1640 до концентрации 8x10 5 клеток/мл. 75 мкл полученной клеточной суспензии добавляют к приготовленным растворам ритуксимаба в планшете. Планшет инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 50 минут. Добавляют 75 мкл суспензии клеток РВМС (размороженных непосредственно перед экспериментом) в лунки к клеткам Daudi в соотношении 50:1 (РВМС : клетки Daudi). В качес те контрольных растворов, добавляют среду RPMI 1640 (негативный контроль, содержавший только эффекторные клетки), а также 4% раствор Тритона Х-100 (положительный контроль, содержавший только клетки-мишени). Планшеты центрифугируют 3 минуты со скоростью 500 об/мин. Инкубирую т планшеты в термостате в течение 8 часов при 37°С.

После инкубации полученные образцы были осаждены центрифугированием при 1200 об/мин в течение 10 минут. 50 мкл супернатанта были перенесены в новый планшет, где были смешаны с 50 мкл реакционной смеси (набор для де!екции лактат дегидрогеназы, Promega (США), каталожный номер G1780). Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 25 минут, после чего реакцию останавливали. Измеряют поглощение па плашечном спектрофотометре при длине волны 490 им.

Цитотоксичность рассчитывалась по формуле (все величины в единицах оптической плотности):

цитотоксичность, % = 100*(А - (S E -S T ))/(Hr-S T ),

где А - уровень сигнала в смеси эффекторных клеток и клеток-мишеней;

SE - уровень сигнала эффекторных клеток;

ST - уровень сигнала клеток-мишеней;

НЕ - сигнал, соответствующий максимальному лизису клеток-мишеней. Результат измерения эффективности полученных кон огатов показан на примере коныогата КР1 (1) (Фиг. 18) CON 4564. Полученный конъюгат обладал усиленным ни готоксическим действием на клетки-мишени (Daudi). В частности, ~35%-иый лизис клеток достигается при концентрации ритуксимаба ~1 мкг/мл. в то же время, сходный цитотоксический эффект коныогата Р1(1) CON 4564 достигается при концсш рации -0,001 мкг/мл. Аналогичная зависимость наблюдается и в случае коныогата Р1 (2) (Фиг. 19). Таким образом, активность у копъюгатов ритуксимаба на 2-3 порядка выше, чем у ритуксимаба.

Пример 18. Получение коныогата ритуксимаба КР1(7) и трас.утумаба КТ1(7). К 1,5 г сахарной части антитела в растворе 100 мМ ацетата натрия, 200 мМ хлорида натрия, рН 5,5 добавляют 2,0 г периодата натрия инкубируют 30 мин при комнатной температуре в темноте при перемешивании. Растворяют 1200 мг соединения 1(7) в 4 мл DMSO. К раствору антитела добавляют 8,4 г гидрокарбоната натрия, затем по каплям добавляют 1230 мкл растворенного в DMSO соединения 1(7) и инкубируют 2 часа.

Очистку проводили на SP-Sepharose (колонка ХК26 GE) ступенчатым градиентом NaCl (буфер 1 : 25 мМ цитрат натрия, рН 4,5. Буфер 2: 25 мМ ц рат натрия, рН ~ 10, 270 мМ). Конъюгат антитела концентрируют в ячейке Amicon через мембрану Milliporc ( MWL 30000, cat. # PLTK07610) до конечной концен трации коныогата 10 мг/мл. После фильтрации в конъюгат добавляют полисорбат-80 до конечной концентрации коныогата КР1(7) или Т1 (7) 0,01%.

Пример 19. Сравнительная активность ритуксимаба (Р) и трастузумаба (Т) и их копъюгатов Р1(7), КТ1(7) по отношению к CD 16а рецептору. Изучение связывания полученных копъюгатов трастузумаба и ритуксимаба с рецептором CD 16а проводили идентично примеру 17.

Сравненительная эффективность и активность (Ка) по отношению к CD 16а рецептору ритуксимаба (Р), трастузумаба (Т) и их коныогатов КР1(7), Т1(7) в тесте антитело-зависимой цитотоксичности представлена на Фиг. 20.

Как видно из полученных данных активность коныогатов КР1(7), Т1(7) по отношению к CD16a рецептору на 1 -2 порядка выше активности нсмодифицированпых ритуксимаба (Р), трастузумаба (Т) (Таблица 3). Таблица 3. Активность (Ка) ритуксимаба (Р), трастузумаба (Т) и их коныогатов КР1 (7), КТ1(7) по отношению к CD 16а рецептору.

Промышленная применимость

Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, биохимии.