DEGRADAR MATERIA ORGÁNICA CONTAMINADA CON ESTOS PESTICIDAS

A) DESCRIPCION

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Dado que el ESTADO DE LA TÉCNICA sobre la investigación científica y aplicación tecnológica enfocados a inducir el crecimiento, repoblación y desarrollo de un consorcio de microorganismos benéficos que toleren trazas químicas que quedan en los suelos y en los residuos orgánicos, y que además resistan a nuevas generaciones de sustancias que van desplazando cada vez más a los agroquímicos convencionales (y que son prohibidos en la agricultura) esta principalmente determinada por la PATENTE No. PA/2006/003777 , otorgada por el IMPI (27 de abril de 2017) donde se aislaron consorcios de microorganismos resistentes a compuestos organoclorados y organofosforados, en esta solicitud se ha desarrollado la ACTIVIDAD INVENTIVA de desarrollar, cultivar y seleccionar consorcios de microorganismos resistentes a compuestos químicos de nueva generación de plaguicidas y de biocontrol como lo son los compuestos piretroides y carbamatos que son en teoría de uso controlado por los efectos secundarios que provocan como contaminación de suelo, mantos acuíferos, y que afectan al crecimiento agrícola. En esta solicitud, parte de la NOVEDAD consiste en desarrollar un consorcio con especies bacterianas específicas, adaptadas para que resistan y mineralicen la materia orgánica contaminada con carbamatos como el tiodicarb y piretroides como la bifentrina, compuestos que son utilizados actualmente en la industria agrícola, pecuaria y presentes cada vez más frecuentemente en la fracción orgánica contenida en los residuos sólidos domiciliarios (basuras). A partir de los procesos biológicos del consorcio, se produce un sustrato orgánico que recupera los suelos del deterioro causado y repuebla los suelos con bacterias benéficas. Es importante anotar que los microorganismos que conforman nuestros consorcios no están genéticamente modificados ni son patógenos para los humanos, ni para animales, ni para las plantas .

Con la prohibición del uso de los compuestos órgano-clorados y órgano-fosforados como insecticidas en la segunda mitad del siglo XX, los compuestos carbamatos y piretroides se consolidan como una alternativa de uso. Los carbamatos son sustancias insecticidas conformadas por un átomo de N unido a un grupo lábil, el ácido carbámico; su característica principal es su alta toxicidad, su baja estabilidad química y su nula acumulación en tejidos; y los piretroides, son moléculas con actividad insecticida, permanecen más tiempo en el medio ambiente ya que la modificación química de su fórmula los hace más estables a la luz solar y al calor. Estos productos se usan en forma indiscriminada en la industria agrícola y pecuaria, generando residualidad .

Esta investigación se enmarca en los lineamientos del Programa 21 de Naciones Unidas (Capítulos 10, 11 ,12 y 14 respectivamente) , sobre la desertificación y la sequía; la agricultura y el desarrollo sostenible. Se estima que la degradación de la tierra a escala mundial se extiende a más de 2000 millones de hectáreas, poniendo en peligro los medios de subsistencia de más de 1000 millones de personas. Se calcula que aproximadamente las 2/5 partes de la superficie de la tierra son terrenos áridos, con un limitado suministro de agua dulce, y un alto porcentaje de éstas se encuentran degradadas. Aproximadamente el 65% de la tierra cultivable ya ha perdido alguna función biológica y/o física.

En Latinoamérica, el uso indiscriminado de agroquímicos utilizados en la agricultura durante décadas, han dejado una residualidad, generando la contaminación de suelos, aguas superficiales y subterráneas. "Los plaguicidas están diseñados para matar, reducir o repeler los insectos , hierbas, roedores, hongos y otros organismos que puedan amenazar la salud pública y las economías de las naciones . Cuando estos productos químicos se manejan o depositan inadecuadamente pueden afectar la salud humana." "Los riesgos principales ligados a la salud humana de la exposición crónica a bajas dosis se relacionan con la aparición de cáncer, defectos de nacimiento, afecciones del sistema nervioso y del funcionamiento del sistema endocrino" . Aseveraciones tomadas de: Childhood Pesticides Poisoning: Information for Advocacy and Action", UNEP Chemicals, May 2004.

En el desarrollo de nuestra investigación científica, hemos encontrado suelos que presentan ausencia de micro carga por el excesivo uso de agroquimicos a los que han sido sometidos. Ejemplo: Cultivo de arroz en zonas de Ibagué (Colombia) . Cultivo de jitomate en Sinaloa (México. Cultivo de Soja en Provincia de Santa Fe (Argentina, entre otros casos .

La conciencia ambiental, el conocimiento ecológico, las actitudes y valores hacia el medio ambiente han ido ganando espacio en nuestras comunidades. El problema de los residuos sólidos municipales, domiciliarios, agrícolas y pecuarios continua aumentando y su producción es excesiva, la falta de separación en la fuente, la mala disposición, la falta de áreas para su manejo y la falta de tratamiento o aprovechamiento. Dentro de los problemas más relevantes que se causan esta la producción de gases contaminantes de la atmósfera, los lixiviados contaminantes de suelos, aguas subterráneas, aguas superficiales y además la generación de focos de enfermedades o vectores transmisores de ellas. Los residuos sólidos orgánicos actuales de cualquier fuente, son muy diferentes a los producidos hace 20 años debido a la acumulación de trazas químicas, esta toxicidad está directamente relacionada con la evolución de los plaguicidas, herbicidas y acaricidas entre otros.

Los Organismos Internacionales, como la FAO (Organización para la Agricultura y Alimentación) y la OMS (Organización Mundial de la Salud, han establecido los niveles máximos admisibles respecto a la ingestión de plaguicidas, sin embargo las autoridades nacionales de cada país son las encargadas de establecer una legislación apropiada y vigilar cuidadosamente el uso de éstos y la cantidad de residuos mediante controles analíticos adecuados.

El presente es un desarrollo científico con bacterias, mineralizadoras de lípidos, almidones y azúcares (hidratos de carbono) del banco de cepas del laboratorio del Dr. Luis Orlando Castro Cabrera, cabe mencionar que los microorganismos utilizados en estas investigaciones fueron inicialmente aislados por el grupo del Dr. Luis Orlando Castro Cabrera conforme lo descrito en la patente 11851 de Colombia, dichas cepas se han trabajado desde 1984. Las cepas se someten a varias etapas de estrés mediante cambios inducidos, adicionando trazas para lograr quimio resistencia al piretroide sintético bifentrina (2- metilbifenil-3-ilmetil (2 ) - ( 1RS, 3RS) -3- ( 2-cloro 3,3,3- trifluroprop-enil) -2 , 2-dimetilciclopropanocarboxilato;

código alfanumérico CA DPR Chem Code 2300. CAS 82657-04-3. CIPAC 415. FMC 54800. PC Code 128825) y al carbamato tiodicarb (C10H18N4O4S3 ) .

Es importante indicar que los consorcios de microorganismos aquí descritos han sido depositados ante el INIFAP en el Centro Nacional de Recursos Genéticos bajo el Número de accesión atribuido por la AUTORIDAD INTERNACIONAL DE DEPOSITO: CM-CNRG TB45 (Se anexan los certificados depósito) . Con la utilización de estos consorcios, en la producción de fertilizantes, estamos poniendo al servicio del agro un producto seguro y efectivo para el control de plagas, como una alternativa al uso de insecticidas y pesticidas de origen químico.

El siguiente protocolo de aislamiento de cepas resistentes y la conformación del consorcio microbiano indica que cada una de las cepas mencionadas fue evolucionada hacia una resistencia adquirida SIN LA MANIPULACION DEL GENOMA de cada organismo. Por otro lado cada cepa fue aislada y seleccionada independientemente mediante cultivos en etapas sucesivas con incrementos en la concentración de piretroides sintéticos como la bifentrina y carbamatos como el tiodicarb.

Los porcentajes de cada microorganismo perteneciente al consorcio oscilan entre 20-30% de UFC de cada una de las cepas. La variabilidad de la cantidad de cada cepa dependerá de las características del sustrato al que se enfrentará el consorcio.

DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO

Se establece la logística para desarrollar cada una de las etapas de la investigación con los dos (2) grupos de ingredientes (tiodicarb y bifentrina) de la siguiente manera :

MATERIALES Y METODOS

Cepas de bacterias, nitrificantes , solubilizadores de fósforo y antagonistas de algunos patógenos: a) Arthrobacter qlobiformis

b) Bacillus subtillis

c) Badilas brevis

d) Bacillus thuringiensis Preparación para desarrollo de etapas

1. Se realiza la esterilización del material de vidrio en autoclave .

2. Se prepara la cantidad requerida del medio de cultivo Agar SPC, Agar Malta (AM) y (PDA) para disponer de colonias viables .

3. Se determina la dosis letal (DL) de aplicación a una hectárea tanto de tiodicarb como de bifentrina, Se preparan 10 cajas de Petri con 0.1 DL de tiodicarb o bifentrina. Las cajas se incuban inicialmente a temperatura de 25 °C por 72 horas y con luz fría.

Metodología a. Mantenemos las variables fisicoquímicas logradas en la investigación con trazas. Las cajas Petri se colocan en la campana de flujo laminar junto con las muestras diluidas, para las siembra de microorganismos en las placas se toma una muestra de las cepas en un mi con la pipeta automatizada y se realizan diluciones 10 ¹ y 10 ^-2 y cada dilución se homogeniza .

b. Teniendo las cajas de Petri con el medio de cultivo estéril y enfriado, se homogeniza mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa incorporación del inoculo en el medio, se deja reposar para que solidifique y se coloca parafilm a cada una de las cajas con agar para evitar contaminación durante el tiempo de incubación .

c. Se mantienen el medio inicial (hábitat) humedad, pH, temperatura, trazabilidad química, iluminación y aireación del consorcio ya adaptado, coloraciones de Gram y verde de malaquita para diferenciación y observación de estructuras celulares .

d. Las cajas con tiodicarb o Biofentrina se llevan a la incubadora a temperatura de 25°C por 72 horas con iluminación a partir de lámpara de luz fría.

e. Las cajas inoculadas se incuban por 12 hrs y se registra el crecimiento bacteriano, se determina el efecto de las concentraciones de los productos sobre el crecimiento en placa (12 horas de incubación) .

f. El efecto residual del producto se evalúa a los 7 días en medio agar malta y Agar PDA.

g. Si no hay un crecimiento por encima del 10% se repite el procedimiento hasta obtener mortalidad menor de 90%. h. Se determina el diámetro de las colonias con regla graduada , los datos se registrarán descontándose el diámetro del disco sembrado, a partir del cual se determinará el efecto sobre el crecimiento micelial con relación al testigo (AM no envenenado, a lo que se le denomina porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) .

i. Diariamente se registra el avance pero a los 7 días se analiza y si existe un cubrimiento aceptable, si aún no se tiene, se repite el procedimiento cuantas veces sea necesario .

j. De las 10 cajas de Petri, de cada microorganismo, la que menor mortalidad nos arroje, es la que continúa para el siguiente ensayo.

k. Realizamos nuevamente el ensayo con este porcentaje hasta tener un recubrimiento superior y así sucesivamente , se va alternando la adición de tiodicarb y bifentrina con las DL en intervalos de 0.1 DL, todos estos experimentos han sido diseñados con las cepas experimentales y un testigo. l. Con los datos obtenidos del crecimiento bacteriano, se calcula el porcentaje de inhibición del crecimiento radial, los datos para su análisis son transformados a través de la expresión 2 are sen. Se aplica un análisis de varianza de clasificación doble y a posteriori se realiza la prueba de Tukey, al 5% de probabilidad.

REGISTROS

Durante todas las etapas se registraron las características de este procedimiento mediante los indicadores: a. Velocidad de crecimiento b. Porcentaje de Inhibición medido en Número de UFC/mm c. Resistencia a envenenamiento en porcentaje

ETAPAS REALIZADAS EN CADA MICROORGANISMO

El inicio de esta investigación con las 4 especies de microorganismos mineralizadores de hidratos de carbono y lípidos, que ya han sido inducidos a un cambio de su hábitat, a través de la exposición continua de más de 20 años a iluminación directa (luz visible) y a condiciones diferentes en donde se incrementó o disminuyo determinado factor o constituyente nutritivo, generando un cambio y adaptación que permite trabajar eficientemente, teniendo como limitantes el tiempo, la temperatura, pH, humedad y concentraciones de materiales orgánicos, trazas de moléculas y metales pesados, presentes en los suelos agrícolas y por tanto en la fracción orgánica contenida en los residuos sólidos domiciliarios (basuras) , residuos pecuarios y agrícolas .

Para cada especie se realizaron etapas analizando los tiempos que requería para el cubrimiento total del campo. Una vez determinado este tiempo, se dejaron en reposo por un periodo de 10 días y posteriormente se someten al siguiente protocolo: Arthrobacter globiformis

Es una bacteria Gram positiva, no patógeno, esporógeno, aerobio, su tamaño inicial es de 1.2 pm de ancho x 2.5 pm de largo en promedio, la temperatura óptima de crecimiento oscila entre 20 y 30°C. Su actividad se desarrolla en un pH de 6.5 a 7.0 y con una humedad del 90%. Las células de Arthrobacter sp. en medios complejos, sufren un marcado cambio de su forma a lo largo del ciclo de crecimiento. Los cultivos más viejos constan de células cocoides, en otros estadios son bacilares. Las células son inmóviles o móviles mediante un flagelo polar o varios flagelos laterales. No forma endosporas. Quimiorganotrofo . Forman poco o no forman ácido a partir de glucosa. Bacterias típicamente del suelo.

Se mantienen las condiciones de hábitat logradas en la adaptación a compuestos de organofosforados , organoclorados y mercuriales del microorganismo pH: 7.0, humedad: 35%, Temperatura: Termo resistente. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a los nuevos contaminantes: tiodicarb (carbamato) y bifentrina (piretroide) . En la adaptación de este microorganismo se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el día 45 de incubación se tiene una mortalidad del 86%. El 14% restante se mantiene por 10 días en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 80%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 152 días.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 84 (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades de 75%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación .llega a 359 días . En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 74%. (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 71%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 530 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 70% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidades de 62%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 690 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 63% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Para la etapa E-19 y E- 20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 58%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 843 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 56% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 48%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 982 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 48% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 40%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1110 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 40% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de 36%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1239 dias de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 32% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 25%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1362 dias de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad del 25% en las 2 etapas, (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Las E- 39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) presentando una mortalidad del 18%. Al finalizar la 40 etapa llevamos 1479 dias de trabajo.

Durante el desarrollo de esta investigación, realizada por un periodo superior los 4 años, las cepas se someten a un cambio del medio físico, adaptándola y haciéndola resistente, soportando gradualmente un envenenamiento con bifentrina y tiodicarb. En estos ensayos se presenta una mortalidad inicial cercana al 82%.

Teniendo el microorganismo ya adaptado al medio con las características antes anotadas, se comprueba la pureza de la cepa, tomando el 0.1 mL de la suspensión bacteriana y se inocula en una placa de Agar Triptona Soya (tsa) la cual se incuba a 52°C +/- 2°C, se comprueba su movilidad mediante tinción con Gram y verde de malaquita. Determinada la pureza de la cepa a trabajar, se procede a realizar una suspensión de este microorganismo en una placa de TSA y se incuba de 36 a 48 h a 52°C + o - 2°C, posteriormente, con un hisopo estéril se toma una muestra y se inoculan en un matraz Erlenmeyer con 100 mi de medio al cual previamente se ha adicionando 0.01% de trazas de tiodicarb y bifentrina, se coloca en agitación a 170 rpm a 37°C durante 4 horas; posteriormente la biomasa se resuspende en 50 mi de las diferentes disoluciones lioprotectoras homogenizando el medio, se procede a determinar el recuento de UFC /mi. Este inoculo se lleva a la incubadora previamente protegido y periódicamente se resiembra en un nuevo medio de cultivo procedimiento que se realiza en periodos de tiempo que van desde 72 horas hasta 120 horas. El tiempo de mantenimiento de las mismas condiciones se utiliza para realizar observaciones generales. Estas cepas se mantienen en medio de cultivo activo, adicionando un aceite mineral previamente esterilizado, de esta manera se garantiza la humedad requerida .

Bacillus subtillis

Es un bacilo Gram positivo, esporógeno, aerobio estricto, con una capa gruesa de mureina, su tamaño inicial es en promedio de 0.75 pm de grosor x 0.9 pm de largo; su temperatura ambiente de crecimiento oscila entre 15 a 55°C, dado que el hábitat natural de B. subtilis es el suelo, el cual está sometido a grandes fluctuaciones de temperatura. Sin embargo las células de este microorganismo sufren un cambio fenotipico cuando se modifica la temperatura de 30°C a 45°C o a 80°C. Su actividad se desarrolla dentro de un pH de 4.7 a 5.5, una humedad de 70 a 80% y acepta unos niveles de concentración tóxica mínima, representadas en trazas.

Es utilizado para la producción de un antibiótico denominado bacitracina, que actúa contra Gram negativas deteriorando su membrana celular e inhibiendo la formación de la pared. Además en la producción de enzimas como la amilasa bacteriana útil en la industria del papel y textil, y enzima aplicada para curtir pieles, quitar manchas y ablandar carne. Para el aislamiento de los microorganismos se utilizó el Modelo Microcosmos (Kabir y cois, 1995) . Las cepas se clasificaron mediante métodos tradicionales (Taxonomía numérica) e inmunoquímicos (inmunofluorescencia indirecta- IFI, según Llewot y Stead, 1991) . Se utilizaron cepas puras procedentes de diferentes sectores. El medio de cultivo que se utiliza para el B. subtillis es un medio nutritivo, con 5% de agar-soya manteniendo los parámetros de pH, niveles mínimos de oxígeno, humedad y temperatura de su estado original.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON B. subtillis

Se inicia con las condiciones de hábitat logradas en la adaptación a compuestos de organofosforados, órgano clorados y mercuriales del microorganismo en la E-38 pH: 7.2, Humedad: 36%, termoresistente y aerobio. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el día 68 de incubación se tiene una mortalidad de 82% y en la E-2 del 80%. El 20% restante se mantiene por 10 días en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes). Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E—3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 75 a 72%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 294 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 72 a 71% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades entre 70 a 68%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 570 días. En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 66 a 63% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 64 a 62%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 827 dias de proceso de selección. En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 63 y en la siguiente etapa aumenta a 65% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 64 a 60%.

Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1071 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 59 a 54% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E- 20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 52 a 50%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1283 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 47 a 45% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando menor mortalidad de 40 a 35%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1458 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 35 a 30% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 28 a 25%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1581 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 25 a 23% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 20 a 18%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1704 dias de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 18 a 15% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando disminución de mortalidad de 12 a 9%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1805 dias de adaptación. Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 10 a 8% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad del 6% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1882 dias de trabajo; 5.6 años de investigación. Tabla No.3 Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Al finalizar el proceso de adaptación, el microorganismo presenta una actividad normal en dicho medio encontrándose en su membrana celular trazas de fósforo (P ₂ O ₅ ) .

Se observa además que el material orgánico constituido en un 80% de hidratos de carbono se estabiliza en un periodo de 35 días en promedio a diferencia del microorganismo silvestre con el cual el tiempo fue de 120 días. Bacillus brevis

Es un bacilo Gram positivo, no patógeno, esporógeno, anaerobio facultativo; su tamaño inicial es de 0.85 pm de ancho x 1.2 pm de largo en promedio, su temperatura óptima de crecimiento oscila entre 21 a 37°C y en ausencia total de oxigeno. Su actividad se desarrolla dentro de un pH de 2.0 a 4.5, a una humedad promedio de 80%. Este microorganismo se obtiene del rumen. Las células de B. brevis producen gramicidina, un antibiótico utilizado contra bacterias Gram positivas. El medio de cultivo que se utiliza para el B. brevis es convencional, se mantiene oxigenación y radiación directa, humedad y temperatura para desarrollo logrado en anterior desarrollo.

ENSAYOS REALIZADOS EN EL LABORATORIO CON Bacillus brevis Se inicia con las condiciones de hábitat logradas en la adaptación a compuestos de organofosforados, órgano clorados y mercuriales del microorganismo en la E-38 pH: 7.2, Humedad: 36%, ter oresistente y anaerobio facultativo. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 51 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa

2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el día 68 de incubación se tiene una mortalidad de 82% y en la E-2 del 78%. El 20% restante se mantiene por 10 días en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 72%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 186 días.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 73% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades entre 70 a 68%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 430 dias. En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 68% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 67%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 648 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 67% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 60%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 853 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 59 a 54% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E- 20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 55%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1057 dias de selección. Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 55% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando menor mortalidad de 51%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1245 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 50% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 46%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1409 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 44% (al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 42%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1568 dias de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 38% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando disminución de mortalidad de 28%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1702 días de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 26% (al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad del 20% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1828 dias de trabajo; 5.6 años de investigación.

En las etapas E-41 y E-42 el 1.1 DL (0.00020 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 28% (Al igual que en las etapas anteriores la E-42 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-43 y E- 44 se les adiciona 1.2 DL (0.00022 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad en las 2 etapas de 22%. Al finalizar la E-44 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1962 días de adaptación. En las etapas E-45 y E-46 el 1.1 DL (0.00000054 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 20% (Al igual que en las etapas anteriores la E-46 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-47 y E- 48 se les adiciona 1.2 DL (0.00000060 gr) de Biofentrina, presentando mortalidad de 12%. Al finalizar la E-48 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 2056 días de adaptación.

En las etapas E-49 y E-50 el 1.3 DL (0.00024 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 10% (Al igual que en las etapas anteriores la E-50 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). La etapa E-51 es la etapa final de mantenimiento para la selección de cepas resistentes a 1.3 DL (0.00024 gr) de tiodicarb, al final del proceso se cumplen 2112 días de adaptación.

Teniendo el microorganismo ya adaptado al medio con las características antes anotadas, se comprueba la pureza de la cepa, tomando el 0.1 mi de la suspensión bacteriana y se inocula en una placa de Agar Triptona Soya (tsa) la cual se incuba a 52°C +- 2°C, se comprueba su movilidad mediante tinción con Gram verde de malaquita. Determinada la pureza de la cepa a trabajar, se procede a realizar una suspensión de este microorganismo en una placa de TSA se incuba de 48 a 72 h a 52°C + o - 2°C, posteriormente, con un hisopo estéril se toma una muestra y se inoculan en un matraz Erlenmeyer conteniendo 100 mi de medio al cual previamente se ha adicionando 0.01% de bifentrina y tiodicarb, se incuba a 37°C y 170 rpm durante 4 h; posteriormente la biomasa se re-suspende en 50 mi de las diferentes soluciones lioprotectoras homogenizando el medio, se procede a determinar el recuento de UFC /mi. Este inoculo se lleva a la incubadora previamente protegido y periódicamente se resiembra en un nuevo medio de cultivo. Este procedimiento de mantenimiento se realiza en periodos de tiempo que van desde 72 hasta 120 h. Estas cepas se mantienen en medio de cultivo activo, adicionando un aceite mineral previamente esterilizado, de esta manera se garantiza la humedad requerida . Tabla No .3. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Al finalizar el proceso de adaptación, el microorganismo presenta una actividad normal en dicho medio encontrándose en su membrana celular trazas de fósforo (P ₂ 0 ₅ ). Se observa además que el material orgánico constituido en un 80% de hidratos de Carbono se estabiliza en un periodo de 35 dias en promedio a diferencia del microorganismo silvestre (testigo) con el cual el tiempo fue de 120 dias.

Bacíllus thuringiensis

Es un bacilo Gram positivo, no patógeno, esporógeno, anaerobio facultativo, su tamaño inicial es en promedio de 1.2 pm de ancho x 4.8 pm de largo en promedio, su temperatura óptima ambiente de crecimiento oscila entre 10 a 45°C, su membrana celular es completamente lisa y su actividad se desarrolla dentro de un pH de 6.5 a 7.2 con una humedad de 60%.

Las células de B. thuringiensis forman inclusiones cristalinas visibles al microscopio óptico durante la esporulación . Estas inclusiones cristalinas están compuestas por protoxinas, que contienen d-endotoxinas, de actividad insecticida especifica contra insectos. Algunas variedades de Bacillus thuringiensis pueden además producir otra toxina, la b-exotoxina. Es una toxina que se produce durante el crecimiento vegetativo, y es un derivado nucleotidico de la adenina que funciona como inhibidor de la ARN-polimerasa . Pero la utilización de esta toxina está prohibida en algunos países, pues es tóxica también para mamíferos.

El medio de cultivo para mantener el B. thuringiensis es un medio nutritivo, con 5% de agar-soya manteniendo los parámetros de pH, niveles mínimos de oxígeno, humedad y temperatura de su estado original.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON B. thuringiensis

Se inicia con las condiciones de hábitat logradas en la adaptación a compuestos de organofosforados, órgano clorados y mercuriales del microorganismo en la E-38 pH: 7.2, Humedad: 52%, termoresistente (74°C), pH 7.0 y anaerobio facultativo. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina. Durante todas las etapas estamos utilizando lámpara de luz fría para ir adaptando al microorganismo a luz solar.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 48 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb

(0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el dia 45 de incubación se tiene una mortalidad del 72 a 70%. El 30% restante se mantiene por 10 dias en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 70 a 68%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 282 dias. Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 68 a 65% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes). Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidad de 64 a 63%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 565 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 65 a 61% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 57 a 55%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 822 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 57 a 55% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 52 a 50%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1064 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 52 a 50% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E- 20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 50 a 45%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1280 días de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 50 a 45% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 44 a 42%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1467 días de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 44 a 40% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 36 a 35%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1633 dias de adaptación. Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 36 a 33% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 30 a 28%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1777 dias de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 30% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 25%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1909 días de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 30 a 28% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad en 18 a 17% Al finalizar la 40 etapa llevamos 2015 dias de trabajo. En las etapas E-41 y E-42 el 1.1 DL (0.00020 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 18 a 17% (Al igual que en las etapas anteriores la E-42 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-43 y E- 44 se les adiciona 1.2 DL (0.00022 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad en las 2 etapas de 14%. Al finalizar la E-44 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 2106 días de adaptación.

En las etapas E-45 y E-46 el 1.1 DL (0.00000054 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 15 a 12% (Al igual que en las etapas anteriores la E-46 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-47 y E- 48 se les adiciona 1.2 DL (0.00000060 gr) de Biofentrina, presentando mortalidad de 10 a 7%. Al finalizar la E-48 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 2182 días de adaptación. Tabla No.4. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Como característica importante el B. thuringiensis mantenemos su condición de aerotolerante, bajo condiciones de aerobiosis. Se observa además que los hidratos de carbono del material orgánico se mineraliza y estabiliza en un periodo de 35 dias en promedio a diferencia del microorganismo silvestre con el cual el tiempo fue de 120 dias. FINALIZACIÓN DE TRABAJO DE ADAPTACIÓN AL CONSORCIO DE MICROORGANISMOS MINERALIZADORES DE HIDRATOS DE CARBONO A PRESENCIA DE CARBAMATOS Y PIRETROIDES SINTETICOS

PRODUCCIÓN INOCULO Al finalizar el trabajo de adaptación de los microorganismos a presencia de Tiodicarb y Bifentrina, ésta mezcla se pone a crecimiento en medio de cultivo Agar Malta, Agar Soya y Agar SPC. Posteriormente se siembra y se evalúa el crecimiento y desarrollo de cada cultivo para determinar cuantitativamente el crecimiento. Este valor se toma para determinar el inoculo a producir y aplicar en la fracción orgánica de residuos sólidos domiciliarios, residuos pecuarios o residuos agrícolas.

Por lo anterior y teniendo en cuenta las características finales del consorcio de los microorganismos resistentes a tiodicarb (carbamato) y bifentrina (piretroide) , se adicionan a dicho medio de cultivo en cantidades tales que estén comprendidas dentro de los siguientes rangos:

Luego de obtenerse la mezcla anterior con los microorganismos en el laboratorio, es transportada en medio de cultivo liquido convencional en recipientes adecuados que permitan el mantenimiento de sus características y propiedades· La concentración de microorganismos es 2.5 - 3 x 10 ⁹ UFC/ml.