SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere á una secuencia del promotor CNH1 (SEQ. ID.

NO:2) derivada de un gen de tomate Solanum lycopersicum con función desconocida, denominado CNH1 -de Constitutive No Hits number 1. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, células de plantas y plantas transgénicas que comprenden el promotor así como a las semillas de las mismas. El promotor es de utilidad cuando se fusiona a secuencias de DNA apropiadas para dirigir Ia expresión génica sentido, miRNA, antisentido o RNAi en todos los órganos de Ia planta y especialmente con niveles altos en el fruto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los promotores son elementos reguladores que dirigen Ia expresión de genes. Tanto los promotores constitutivos como los reguladores se usan para dirigir Ia expresión génica en organismos transgénicos incluyendo plantas.

Los promotores constitutivos dirigen Ia expresión en Ia mayoría o en todos los tejidos, y son de utilidad cuando niveles altos de producción de un producto génico son deseados en toda Ia planta. El promotor 35S de virus del mosaico de Ia coliflor (VMC) es el promotor que se usa más frecuentemente para dirigir niveles altos de expresión constitutiva en plantas.

Los promotores reguladores, tales como promotores inducibles y específicos de tejido, se usan para dirigir Ia expresión espacial o temporalmente específica o Ia expresión en respuesta a factores ambientales.

Con respecto a promotores constitutivos, de lejos el promotor CaMV35S es el promotor usado más frecuentemente en biotecnología de plantas (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition, http://www.cfsan.fda.gov/~lrd/biocon.html). Diferentes versiones derivadas de este promotor (incluyendo las sintéticas) han sido empleadas (Fang, R.X., Nagy, F., Sivasubramaniam, S. y Chua, N. H. 1989. Múltiple cis regulatory elements for maximal expression of the cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenics plants. Plant CeII 1 : 141-150; patente US Patent 6072050; patente US Patent 6555673). Se ha demostrado que este promotor es de utilidad para dirigir buenos niveles de expresión cuando es clonado frente a un gen de interés, en casi todas las plantas dicotiledóneas en las que ha sido testado (incluyendo Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Lycopersicon esculentum, Zea mays y Oryza sativa, etc.) (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition, (http://www.cfsan.fda.gov/~lrd/biocon.html). En monocotiledóneas/gimnospermas este promotor 35S no ha sido ampliamente usado, y Ia preferencia es para el promotor ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA, Quail PH(1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol 18: 675, 689) o el "superpromotor" (Ni M, Cui D, Einstein J, Narasimhulu S, Vergara C, Gelvin S (1995) Strength and Tissue specificity of chimeric promotors derived from octopine and mannopine synthase genes. Plant J 7, 651-676). Se han descrito otros promotores en plantas para conferir niveles moderados de expresión constitutiva, pero no han sido ampliamente usados. Este es el caso del promotor CmYLCV (Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) promoter: a new strong constitutive promoter for heterologous gene expression in a wide variety of crops, Stavolone et al. (2003) Plant molecular biology 53, pp. 663-673) y del promotor constitutivo de tabaco en patente US Patent 5824872, entre otros.

En el género Solanum (incluye tomate, patata, pimiento, tabaco, etc.) casi todas las expresiones llevadas a cabo bajo promotores constitutivos hicieron uso del promotor CaMV35S. En algunos casos puede ser deseable diseñar mediante ingeniería una secuencia de DNA o un gen de interés sometido a un promotor que se expresa en menor nivel en los tejidos vegetativos de modo que no compromete el crecimiento de Ia planta, siendo el promotor capaz de dirigir niveles altos de expresión en el fruto para producir Ia modificación deseada en este órgano (es decir afectando a las características del fruto o acumulación de una proteína extraña). También han sido descritos promotores específicos de fruto de tomate, tal como E8 (Nicholass et al, 1995), PG (Bañaren et al, 1991), 2A11 (Deikman et al, 1992), que dirigen Ia expresión génica en el fruto. Sin embargo funcionan de modo preferencial durante el desarrollo tardío del fruto, especialmente durante Ia maduración, y por tanto no cubren los estadios de desarrollo del fruto restantes en los que dirigir Ia expresión de un gen recombinante podría ser deseable.

Por tanto, Ia identificación de un promotor alternativo que preferentemente confiera altos niveles de expresión en el fruto durante diferentes estadios de desarrollo, pero con un nivel de expresión menor en los tejidos vegetativos es altamente deseable. Casos especiales son los promotores obtenidos a partir de las mismas especies que van a ser modificadas o de especies sexualmente compatibles. Esto resulta particularmente importante cuando se desea un enfoque de "cisgenesis" o "intragenesis" en vez de un enfoque transgénico. Por "Cisgenesis" se entiende una modificación genética (= GM; normalmente mediante técnicas de DNA recombinante) de plantas con una secuencia de DNA o gen de Ia misma planta de cultivo que va a ser transformada o de plantas donadoras sexualmente compatibles que pueden usarse en el cultivo de plantas tradicionales. En Ia práctica, se restringe a genes que codifican para características heredadas de modo dominante. El gen pertenece al conjunto de genes del cultivador. La planta modificada genéticamente con cisgenes es una planta cisgénica {Cisgenic plants are similar to traditionnally bred plants. Schouten, HJ. , Krens, F.A., Jacobsen, E., 2006. EMBO Reports 7: 750-753; "Cisgenic" as a product designation, Schubert D & Williams D. 2006. Nature Biotechnology 24: 1327-1329. A diferencia de un transgén, que se define como un gen o secuencia de DNA de especies no sexualmente compatible o una secuencia de DNA o gen sintético. La planta modificada genéticamente correspondiente que contiene transgenes es una planta transgénica.

Por tanto, Ia identificación de un promotor constitutivo de tomate que preferiblemente funcione en el fruto en diferentes estadios de su desarrollo es altamente deseable ya que facilitaría enfoques cis o intragénicos eficientes. Esto resultaría especialmente interesante cuando se requieren niveles altos de expresión en el fruto en estadios de desarrollo diferentes de Ia maduración.

EI promotor descrito en el presente documento puede ser usado en todas las especies de plantas como alternativa a CaMV35S pero es de especial aplicación en el género Solanum para conferir expresión constitutiva de genes o secuencias de DNA de interés con niveles particularmente altos en el fruto, en todos los estadios de desarrollo. En el caso de cisgenesis o intragenesis, cualquier característica deseada debido a un alelo dominante disponible en el conjunto génico en las especies sexualmente compatibles puede ser aislada, posteriormente sometida al control del promotor CNH y ser introducida en tomate o especies relacionadas para conferir Ia característica de interés.

La presente invención proporciona un promotor que dirige niveles altos de expresión de genes o secuencias de DNA en plantas, especialmente altos en el fruto. Este promotor deriva de un gen de función desconocida de Solanum lycopersicum que se expresa de modo ubicuo en toda Ia planta. Este promotor de tomate puede ser de especial interés para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de interés de especies relacionadas dentro de Solanaceae I Solanum (el tomate pertenece a este género) de modo que pueden lograrse niveles altos de expresión (similares a CaMV35S en el fruto) sin necesidad de usar promotores heterólogos y por tanto es de interés para Ia introducción dirigida de genes" dentro de Solanaceae/Solanum usando una estrategia en Ia que todas las secuencias son de Solanaceae/Solanum" .

Adicionalmente, según Ia presente invención, el promotor de Ia invención, derivado de CNH1, puede dirigir niveles altos de expresión constitutiva de secuencias de DNA o genes heterólogos en plantas, especialmente cuando los niveles más altos son deseados en el fruto. El promotor de Ia presente invención es de utilidad cuando niveles de expresión similares a los obtenidos por el promotor CaMV 35S son deseados en el fruto durante diferentes estadios de su desarrollo, pero no de forma tan elevada en el resto de Ia planta.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un promotor aislado derivado de un gen de tomate Solanum lycopersicum con función desconocida. En una realización particular este gen es el gen CNH. En otra realización particular, el promotor presenta al menos el 70% de identidad con Ia secuencia de SEQ. ID. NO:2. Este promotor es de especial utilidad fusionado a secuencias de DNA apropiadas, para dirigir Ia expresión génica constitutiva sentido, miRNA, antisentido o RNAi en Ia mayoría de los tejidos de plantas principales durante todos sus ciclos de vida, pero con niveles especialmente altos en el fruto.

Este promotor de tomate puede ser de especial interés para dirigir Ia expresión de genes o secuencias de DNA de interés de especies relacionadas dentro de Ia especie Solanaceae / Solanum a Ia que pertenece el tomate, pudiendo obtenerse altos niveles de expresión (similares a los obtenidos en el fruto a través del promotor CaMV35S, pero menores a los obtenidos a través del mismo en el resto de tejidos de Ia planta), sin Ia necesidad de emplear promotores heterólogos. Es decir, el promotor de Ia invención presenta interés en Ia- producción de "targeted introgression of genes" en Solanaceae/Solanum empleando "the all Solanaceae/Solanum strategy".

Adicionalmente, el promotor de Ia invención derivado de CN1H, permite Ia expresión en plantas, con preferencia en el fruto, no sólo de genes o secuencias de DNA endógenas sino también de genes heterólogos o secuencias de DNA, en orientación sentido o antisentido, para conseguir sobreexpresión o silencianniento de Ia expresión de dichos genes. Estos genes pueden ser genes o secuencias de DNA de plantas, específicos del fruto, o genes o secuencias hetorólogas cuya expresión se desea en el fruto.

El promotor CNH 1 de Ia invención es efectivo en Ia planta Tomato lycopersicum de Ia cual deriva, en otras especies del género Solanaceae I Solanum, así como en otras plantas que presentan frutos.

Así, el promotor de Ia invención es ideal para aplicaciones en las que una expresión ubicua de un gen o una secuencia de DNA (endógenos o heterólogos) es deseada en Ia planta, pero con niveles más altos en el fruto, cuando niveles de expresión similares a los obtenidos por el promotor CaMV35S son deseados en el fruto pero no de forma tan elevada en el resto de Ia planta, y cuando más de un promotor constitutivo es necesario para expresar dos o más proteínas recombinantes en una planta de forma concertada y preferentemente en el fruto

El promotor de Ia invención es útil en estrategias del tipo "plantas biofactoría" en las que el fruto se utiliza como plataforma para Ia producción recombinante de proteínas que albergan por sí mismas actividad biológica o terapéutica al ser administradas por vía oral, o que regulan o catalizan Ia producción de otros compuestos metabólicos con actividad biológica o terapéutica por vía oral (vacunas orales, tolerógenos, biocidas, anticuerpos neutralizantes, adyuvantes, compuestos antioxidantes, vitaminas, aromas, suplementos dietéticos); en Ia producción de complejos multiproteicos que requieran expresar de forma concertada dos o más genes con distintos promotores constitutivos para evitar reordenaciones génicas y/o procesos de silenciamiento génico; en Ia adquisición de fenotipos de resistencia a patógenos, para Ia modificación de Ia arquitectura del fruto otorgando a Ia planta y al fruto distintas propiedades en función del gen o secuencia nucleotídica que se exprese bajo su control.

1. Promotor es un elemento regulador que dirige Ia expresión de genes.

2. Promotor constitutivo se refiere a aquellos promotores que dirigen expresión en Ia mayoría o todos los tejidos y son de utilidad cuando niveles altos de producción de un producto génico son deseados en toda Ia planta. 3. Promotores regulados, promotores específicos de tejido e inducibles, son aquellos empleados para dirigir Ia expresión específica espacial o temporalmente, o Ia expresión en respuesta a factores ambientales.

4. Genes y secuencias de DNA de interés se refiere a aquellos genes y secuencias que codifican para péptidos de interés que pueden ser usados junto con el promotor CNH1 de Ia invención. Se refieren a secuencias y genes de plantas de Solanum lycopersicum, de plantas del género Solanum o cualquier gen o secuencia heterólogos, o sintéticos. Dichos genes y secuencias incluyen, pero no se limitan a genes implicados en Ia modificación de Ia maduración; genes implicados en conferir resistencia a hongos; genes relacionados con patogénesis de plantas; genes implicados en conferir resistencia frente a insectos; genes que son efectivos en Ia modulación de Ia floración, aroma, modificación de color, enzimas u otros productos catalíticos (tales como: ribozimas o anticuerpos catalíticos que modifican procesos celulares en plantas), producción de etileno (tal como: moléculas antisentido, enzimas que degradan precursores de Ia biosíntesis de etileno, productos catalíticos o moléculas de silenciamiento), genes para el control de hongos, producción o niveles de hormonas de planta, el ciclo celular o Ia división celular, y acumulación de sacarosa (tal como el gen de Ia sacarosa fosfato sintasa). Genes y secuencias de interés se refiere también a aquellos genes y secuencias que codifican para péptidos o proteínas que pueden ser usados en "molecular pharming" para Ia producción recombinante de proteínas que albergan por sí mismas actividad biológica o terapéutica o que regulan o catalizan Ia producción de otros compuestos metabólicos con actividad biológica o terapéutica (vacunas orales, tolerógenos, biocidas, anticuerpos neutralizantes, adyuvantes, compuestos antioxidantes, vitaminas, aromas, suplementos dietéticos).

5. Gen o Secuencia Heteróloga: Gen o secuencia nucleotídica de origen sintético u obtenido del genoma de animales o vegetales de género distinto a Solanum.

6. Gen o Secuencia Endógena: Gen o secuencia nucleotídica contenida originalmente en todo o en parte en el genoma de una o más especies del Género Solanum

7. Planta transformada genéticamente se refiere a aquellas plantas de Solanum lycopersicum, del género Solanum, o cualquier planta de fruto que haya sido transformada con una construcción génica que comprenda el promotor de Ia invención fusionado al gen o secuencia de DNA de interés. 8. Molecular pharming (Plantas Biofactorías) se refiere a Ia modificación, mediante técnicas de ingeniería genética, del contenido substancial de las plantas con objeto de enriquecerlo en uno o más compuestos que les confieran valor añadido. Entre las secuencias de DNA cuya expresión puede estar dirigida por el promotor de Ia invención, para su posterior empleo en molecular pharming se incluyen subunidades vacunales de origen vírico o bacteriano, péptidos o proteínas con actividad tolerogénica, péptidos, proteínas con actividad adyuvante o inmunomoduladora, biocidas, inmunoglobulinas, enzimas o proteínas reguladoras que catalicen o potencien Ia producción de metabolitos con actividad biológica o terapéutica, etc.

EI objeto de Ia presente Invención se refiere al promotor del gen CNH1 , que comprende Ia secuencia SEQ. ID. NO: 2 o al menos una secuencia que presenta el 70% de identidad con SEQ. ID. NO: 2, que dirige Ia expresión de secuencias o genes de interés en altos niveles en todos los tejidos de Ia planta, especialmente en el fruto, durante los distintos estadios de desarrollo. En una realización particular, Ia expresión dirigida por este promotor en el fruto es similar a Ia proporcionada por el promotor constitutivo CaMV35S, y ál menos un orden de magnitud inferior, preferentemente de 3 a 6 veces menor, en el resto de Ia planta.

Otro objeto de invención se refiere a construcciones nucieotídicas que comprenden el promotor de Ia invención operativamente fusionado a un gen o secuencia de DNA que codifica para un péptido de interés.

En una realización particular dicho péptido de interés tiene aplicación en "molecular pharming". En otra realización particular el péptido de interés tiene aplicación en Ia producción de un medicamento. En otra realización particular, dicho gen o secuencia de DNA codifica proteínas o péptidos endógenos de Ia especie Solanum. En otra realización particular, dicho gen o secuencia de DNA codifica para proteínas o péptidos heterólogos a Ia especie Solanum (proteínas vegetales, animales o sintéticas). En otra realización particular, dicho gen o secuencia de DNA codifica para inmunoglobulinas, concretamente para Ia lnmunoglobulina A.

Otro objeto de invención se refiere a los vectores que contienen Ia secuencia nucleotídica de Ia invención.

Otro objeto de invención está dirigido a las células de plantas que contienen Ia construcción nucleotídica de Ia invención. Otro objeto de invención se refiere a las plantas modificadas genéticamente que comprenden Ia construcción de Ia invención.

En una realización particular dichas plantas son plantas de Solanum lycopersicum, o plantas del género Solanum.

En otra realización particular, dichas plantas comprenden cualquier planta de fruto.

Otro objeto de invención se refiere a las semillas de las plantas modificadas genéticamente.

Otro objeto de invención se refiere al fruto de las plantas modificadas genéticamente.

Otro objeto de Ia invención se refiere al uso del promotor para dirigir Ia expresión de genes de interés en plantas caracterizado porque dicha expresión se produce en altos niveles en toda Ia planta, con niveles mayores en el fruto durante los distintos estadios de desarrollo.

Otro objeto de invención se refiere al uso del promotor para dirigir Ia expresión de genes o secuencias de DNA de interés en plantas cuando más de un promotor constitutivo es necesario para expresar dos o más proteínas recombinantes de forma concertada y preferentemente en el fruto.

Otro objeto de invención se refiere al uso del promotor en estrategias de tipo "plantas biofactoría".

Otro objeto de invención se refiere a SEQ. ID. NO: 2.

La invención proporciona los métodos para obtener las plantas transgénicas y Ia progenie de las mismas que comprenden Ia construcción y partes de tales plantas,

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra los valores de expresión relativos del mRNA de CNH1 en diferentes tejidos de Ia planta de tomate, calculados mediante PCR cuantitativa. En esta representación, a los niveles de mRNA observados en ovarios en el estadio de antesis se les asignó arbitrariamente un valor igual a uno. Figura 2. Representa el vector de expresión pCNH1::GFPGUS. El vector de expresión incluye el promotor CNH1 en sentido 5' de las secuencias fusionadas GFP-

GUS y resistencia a kanamicina para selección de semilla entre los bordes derecho e izquierdo (RB y LB respectivamente). La resistencia a Ia espectinomicina es para Ia selección de cultivos.

Figura 3 Muestra los valores resultantes de Ia cuantificación de Ia actividad específica glucuronidasa (GUS) conferida por Ia construcción pCNH1: GFPGUS en diferentes órganos de Ia planta de tomate. Se comparan estos valores con Ia actividad específica conferida por Ia construcción 35S::GFPGUS en otra planta de Ia misma especie. La actividad específica de Ia glucuronidasa (GUS) presente en los extractos crudos de tejido vegetal se representa como nanomoles del producto metil-umbeliferona generadas por el enzima GUS por minuto y por miligramo de proteína total presente en el extracto.

Figura 4. Muestra una tinción histoquímica de actividad GUS en secciones de tomates en diferentes estadios de desarrollo. De izda a dcha se muestran frutos en expansión (15 días post- antesis), frutos en estadio verde-maduro (35 días post antesis), frutos en estadio pintón y frutos rojos respectivamente. En el apartado A se muestran frutos transformados con Ia construcción pCNH1 ::GFPGUS. En el apartado B se muestran frutos transformados con Ia construcción CaMV35S::GFPGUS.

Figura 5. Muestra en valores relativos y mediante experimentos de expresión transitoria en fruto, Ia potencia del promotor CNH 1 para dirigir Ia acumulación de Ia proteína fluorescente verde (GFP) en fruto verde y maduro y Ia compara con Ia actividad del promotor 35S en los mismos órganos y estadios fisiológicos. Se agroinyectaron los frutos o bien con una mezcla (1:1) de las construcciones CaMV35S:GFP/GUS y CaMV35S:DsRed (muestras etiquetadas 35S) o bien con una mezcla (1:1) de las construcciones pCNH1:GFPGUS y CaMV35S:DsRed (muestras etiquetadas CNH1). (Figura 5A) Imagen de escaneo de muestras de frutos 35S y NH que presentan fluorescencia verde como resultado de una transformación transitoria. (Figura 5B) Ratio de fluorescencia verde/roja de muestras diferentes como medida de Ia fuerza relativa del promotor en cada estadio fisiológico. (MG) frutos recogidos en el estadio verde-maduro; (Br) frutos recogidos en el estadio pintón.

Figura 6. Representa una construcción nucleotídica en Ia que se emplea el promotor CNH1 para Ia producción recombinante en tomate, preferentemente en frutos y en estadios previos a Ia maduración, de una inmunoglobulina A con actividad de unión frente al péptido VP8* de rotavirus. La ¡nmunoglobulina A consta de dos cadenas polipeptídicas, ligera y pesada. La cadena pesada se sitúa bajo el control de un promotor constitutivo derivado de CaMV35S, mientras que el promotor CNH 1 dirige Ia expresión de Ia cadena ligera. La construcción consta de un vector derivado de pK7GW con resistencia a Spectinomicina (Sm/SpR) y que incluye los siguientes elementos: RB: borde derecho; LB: borde izquierdo; KanR: gen de resistencia a kanamicina como marcador de selección en el proceso de transformación; attB1, attB4, attB3 y attB2: pequeñas secuencias de recombinación subproducto del mecanismo de clonación empleado en Ia construcción del fragmento (recombinación homologa mediada por clonasa LR); 35S: doble promotor constitutivo derivado de CaMV35S; SP: péptido señal para dirigir Ia entrada de Ia proteína subsiguiente en el sistema de endomembrana celular, donde resultan más estables las inmunoglobulinas; IgH: secuencia nucleotídica de una cadena pesada de una ¡nmunoglobulina humana con afinidad frente a VP8*, NosT: terminador de Ia trascripción del gen de Ia nopalina sintasa; CNH1: el promotor de Ia presente invención; IgL: Ia secuencia nucleotídica de una cadena ligera de inmunoglobulina A humana. Las flechas indican marcos de lectura abiertos.

Figura 7. Western blot en condiciones desnaturalizantes, no reductoras de extractos crudos de frutos de tomate agroinfectados con el fragmento de T-DNA de Ia figura 6 (carril 1); frutos agroinfectados con una construcción no relacionada (carril 2); hojas agroinfectadas con el fragmento de T-DNA descrito (carril 3)

Figura 8. Actividad Anti-VP8* extractos crudos de tomates agroinyectados con el fragmento de T-DNA de Ia figura 6. Se incubaron placas de ELISA cubiertas con VP8 con diluciones de extractos crudos y se desarrollaron con anticuerpo anti-lgA-HRP humano.

Barras blancas: CNH1 que contiene construcción de T-DNA. Barras negras: construcción de T-DNA no relacionada.

Figura 9. Secuencia del fragmento del promotor CNH1 empleado para Ia construcción de pCNH1-GUS/GFP (SEQ. ID. NO: 2). La figura muestra como Ia secuencia del cebador GSP3 usada para Ia amplificación sin el fragmento de recombinación está destacada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los avances en ingeniería genética han proporcionado las herramientas necesarias para trasformar plantas que contengan genes extraños. Ahora es posible producir plantas que tienen características únicas de importancia en el procesamiento agronómico y Ia cosecha. La capacidad de elegir los tejidos en los que se expresan tales genes extraños y el tiempo durante el crecimiento de Ia planta para obtener expresión resulta posible mediante Ia elección del promotor, Ia secuencia reguladora que activa el gen.

Para seleccionar el gen putativo a partir del cual obtener el promotor constitutivo de Ia invención, se construyó una biblioteca de cDNA de fruto de tomate usando el kit de construcción de biblioteca de cDNA lambda ZAPII (Stratagene, LaJoIIa, Calif.). Se convirtió Ia biblioteca de cDNA en una biblioteca de plásmido mediante escisión en masa, y se sembraron en placa clones bacterianos y réplicas de esta biblioteca correspondientes a alrededor de 5.000 clones se obtuvieron sobre filtros (siguiendo Maniatis, Sambrook y Fritsch 1982).

Cada filtro de réplica se hibridó entonces con sondas de cDNA preparadas a partir de dos muestras que representaban frutos reunidos en diferentes estadios de desarrollo y tejidos vegetativos reunidos de Solanum lycopersicum. Se usó Ia técnica de cebador de secuencia aleatoria PCR (RP-PCR - random primed PCR) descrita por Li Z y Thomas TL. (PEH, an Embryo-Specific Zinc Finger Protein Gene Required for Heart-Stage Embryo Formation in Arabidopsis ,1998, Plant CeII 10:383) para marcar las sondas de cDNA. Se usó Ia hibridación de cada colonia a cada sonda para determinar las colonias que representan genes constitutivos o específicos de tejido putativos. Se identificaron los clones constitutivos putativos y se sometieron a caracterización adicional. Se determinó Ia identidad de cada clon mediante secuenciación de DNA y búsquedas en bases de datos.

El clon denominado CNH 1 fue seleccionado entre los clones constitutivos putativos elegidos para caracterización adicional basándose en sus altos niveles de expresión, revelados mediante el análisis RNA dot blot. El análisis Northern blot mostró que CNH1 se expresa en altos niveles en el conjunto de muestras tanto vegetativas como de fruto. La RT-PCR cuantitativa confirmó que CNH1 se expresó en todos los tejidos analizados, pero especialmente en el fruto (figura 1). La figura 1 muestra los niveles de expresión relativos de CNH 1 en distintos tejidos, tomando como referencia los niveles de expresión en ovarios en antesis. Se observan niveles de expresión similares en raíces, hojas, plántulas, y "ovarios a 5 días post-antesis (5dpa), y fruto rojo, mientras que los niveles son especialmente altos en el fruto verde, similares a los que se obtienen con el promotor Ca35S (entre 3 y 6 veces más altos que en los tejidos vegetativos). El análisis de secuencia indicó que CNH1 codificó para un gen de función desconocida, y que CNH1 corresponde a un gen identificado como no positivo en un proyecto de secuenciación de cDNA denominado SGN-U212704.

Con el fin de aislar el promotor CNH1, fue necesario emplear un método simple para clonar secuencias de DNA genómico desconocidas adyacentes a una secuencia conocida, y en este caso se llevó a cabo una aproximación de "paseo genómico", usando el kit universal GenomeWalker™ (Clontech). Usando los fragmentos de DNA genómico,

Ia primera etapa fue construir conjuntos de fragmentos de DNA genómico ligado a adaptador, no clonado, denominadas "bibliotecas Genome Walker". Para ello, el DNA de partida debe estar bien limpio y presentar un peso molecular promedio alto, dado que se consideró como el método más adecuado para obtener este DNA a partir de tejidos jóvenes como los presentes en plántulas de tomate.

Alícuotas separadas de DNA fueron completamente digeridas con enzimas de restricción diferentes que dejaron extremos romos y posteriormente, cada lote de DNA genómico digerido se ligó por separado a un adaptador diseñado. En este caso, los adaptadores fueron proporcionados por el kit.

Después de que se construyeran las bibliotecas, se realizaron dos amplificaciones mediante PCR. La primera o PCR primaria requirió un cebador de adaptador externo (AP1 , SEQ. ID. NO: 4) que se proporcionó en el kit, y un cebador específico de gen externo (GSP1 , SEQ. ID. NO: 5) diseñado a partir de Ia secuencia de gen conocida 5'UTR. Entonces se diluyó Ia mezcla de PCR primaria y se usó como molde para una PCR secundaria o "anidada" con el cebador adaptador anidado (AP2, SEQ. ID. NO: 6) también proporcionado en el kit, y un cebador específico para gen "anidado" (GSP2, SEQ. ID. NO: 7), que se diseñó tomando una parte de secuencia GSP1 (SEQ. ID. NO.: 5) y yendo en el sentido 5' a través del gen 5 ¹ UTR. El producto más grande (en tamaño) de esta PCR secundaria, que comprende una secuencia conocida en el extremo 5' de GSP2 (SEQ. ID. NO: 7) y que se extiende en el DNA genómico desconocido adyacente, se clonó en el vector pCR 2.1 -TOPO. Como sistema de clonaje, se propuso el empleo de un sistema clásico usando enzimas de restricción para colocar el fragmento de promotor aislado en el sentido 5' de o bien el gen indicador GUS o bien GFP Io que hubiera permitido comprobar Ia actividad del promotor. En lugar de esto, se usó el sistema Gateway que permite transferir fácilmente el fragmento de promotor en una variedad de diferentes sistemas de análisis a través de reacciones de recombinación de alta eficiencia. Los sistemas de clonaje Gateway, basados en recombinación homologa, se han vuelto una alternativa popular a los métodos tradicionales de clonaje basados en ligasa T4 para Ia construcción de casetes de expresión de planta ("GATEWAY vectors for Agrobacteríum-mediated plant transformation", Karimi M ₁ Inzé D y Depicker A., Trends Plant Sci, 2002, 7: 192-195). En este caso, se realizó una reacción PCR usando dos cebadores altamente purificados y largos (attB1-GSP3 (SEQ. ID. NO: 8, 10) y attB2- GSP2 (SEQ; ID. NO: 9, 7)) conteniendo cada uno de ellos una secuencia de recombinación especifica. Tras una primera reacción de recombinación denominada "reacción BP" usando el vector pDONR221 , se formó un vector que contiene Ia secuencia de promotor flanqueada por los sitios de recombinación attl_1 y attl_2, y denominado "vector pEntry". En este momento una segunda reacción de recombinación denominada "reacción LR" se realizó entre el vector pEntry y el vector pKGWFS7,0 (Plant Systems Biology, Ghent University), dando lugar al vector que se denominó vector "pDestination" y que contiene los sitios de recombinación específicos attR1 y attR2.

Tras esta segunda reacción, se logró un vector denominado vector "pExpression" que contiene el fragmento de promotor en el sentido 5' de una secuencia GFP-GUS.

Usando como vector de destinación pKGWFS7,0 que contiene un fragmento fusionado de GFP-GUS SEQ. ID. NO: 11 pudo comprobarse Ia actividad tanto de GFP como de

GUS usando el mismo vector pExpression, Io cual también permitió seleccionar plantas de tomate transformadas debido a su resistencia a kanamicina de Ia semilla. Finalmente, se introdujo el vector pExpression (pCNH1 "GFPGUS, SEQ. ID. NO: 12) en A. tumefaciens LBA4404 para Ia transformación estable de Ia planta de tomate (EIIuI P,

Garcia-Sogo B, Pineda B, Ríos G, Roig LA, Moreno V. (2003), The ploidy level of transgenics plants in Agrobacteríum-mediated transformation of tomato cotyledons

(Lycopersicon esculentum Mili.) is genotype and procedure dependent, Theor Appl Genet. 2003 Jan; 106(2):231-8.

EI ensayo fluorométrico de GUS confirmó el patrón de expresión de este promotor, demostrando Ia expresión de GUS, en todos los tejidos de plantas, pero especialmente en tejidos de fruto.

En paralelo, para acortar el tiempo para el análisis de Ia actividad del promotor en frutos, se eligió Ia expresión génica transitoria mediada por Agrobacteríum mediante agroinyección en frutos de tomate (Orzaez D, Mirabel S, Wieland WH, Granell A. (2006), Agroinjection of tomato fruits. A tool for rapid funtional analysis of transgenes directly in fruit, Plant Physiol. 2006 Jan;140(1):3-1 l). Con este fin se introdujo pCNH1::GFPGUS en A. tumefaciens C58 para estos ensayos de expresión transitoria y se inyectó conjuntamente con disolución de pBIN 35S: DsRed transformada por Agrobacteríum. Se exploraron pedazos de diferentes frutos para obtener valores relativos de fluorescencia GFP/DsRed.

Este ensayo de agroinyección de pCNH1-GUS/GFP confirmó de nuevo el patrón de expresión mediado por el promotor CNH1 , mediante Ia detección de fluorescencia de GFP, en todos los tejidos de plantas, pero especialmente en tejidos de fruto.

Estos ejemplos demuestran Ia capacidad del promotor CNH1 para dirigir Ia expresión de genes o secuencias de DNA de interés en plantas.

Para Ia transformación de Ia planta, un DNA de doble cadena que contenga el promotor de Ia invención puede ser introducido en el genoma de Ia planta por cualquier metodología adecuada. Ello incluye Ia infección de tejido vegetal con cultivos de

Agrobacteríum transformados con plásmidos derivados de Agrobacteríum tumefaciens.

También incluye el uso de liposomas, electroporación, tratamientos químicos, bombardeo de partículas u otros métodos alternativos para introducir DNA en el interior de las células, o Ia transformación mediada por virus o polen.

Un vector especialmente útil es pKGWO (Karamini eí al, 2002), derivado de pPZP200 (Hajdukiewicz eí al, 1994), que incluye un marcador de resistencia a Kanamicina (Hellens eí al, 2000) y un cassette gateway (Invitrogen life technologies) para facilitar el clonaje por recombinación homologa, todo ello comprendido entre las secuencias conocidas como right border y left border y que delimitan el fragmento de integración en el genoma de Ia planta. Otros vectores conocidos en el estado de Ia técnica podrían ser empleados.

Cuando se obtiene un número suficiente de células que han integrado un gen de interés dirigido por el promotor de Ia presente invención, las células son regeneradas en plantas enteras usando un protocolo de regeneración apropiado a Ia planta huésped.

El promotor de Ia invención es de utilidad en aplicaciones en las que Ia expresión constitutiva fuerte de un gen o una secuencia de DNA (endógenos o heterólogos) es deseada en todos los tejidos de Ia planta, especialmente en el fruto en diferentes estadios de desarrollo, cuando niveles de expresión similares a los obtenidos por el promotor 35 S son deseados en el fruto pero no de forma tan elevada en el resto de Ia planta.

En función del gen o secuencia de DNA de interés cuya expresión sea dirigida a través del promotor CNH1 , dicho promotor puede ser útil en "molecular pharming approaches" para inmunización oral, como factoría de proteínas que albergan por sí mismas actividad biológica o terapéutica por vía oral o que regulan o catalizan Ia producción de otros compuestos metabólicos con actividad biológica o terapéutica por vía oral (vacunas orales, tolerógenos, biocidas, anticuerpos neutralizantes, adyuvantes, compuestos antioxidantes, vitaminas, aromas, suplementos dietéticos); en Ia producción de complejos multiproteicos que requieran expresar de forma concertada dos o más genes con distintos promotores constitutivos para evitar reordenaciones génicas y/o procesos de silenciamiento génico; en Ia adquisición de fenotipos de resistencia a patógenos, para Ia modificación de Ia arquitectura del fruto otorgando a Ia planta y al fruto distintas propiedades en función del gen o secuencia nucleotídica que se exprese bajo su control.

EXPOSICIÓN DETALLADA DE UN MODO DE REALIZACIÓN

EJEMPLO 1

Tal como se indicó, el procedimiento se inició aislando DNA genómico de plántulas de tomate crecidas en Ia oscuridad. Se llevó a cabo Ia extracción de DNA genómico usando el minikit Dneasy Plant (Qiagen) y siguiendo el protocolo del fabricante.

A partir de este DNA genómico, se hicieron varios grupos de DNA unidos a adaptadores y denominados "bibliotecas". Con este fin se realizaron cuatros digestiones de DNA separadas usando cuatro enzimas de restricción diferentes, EcoRV, Dral, Pvull y Sspl. Se realizó Ia digestión de DNA a 37 ⁰ C durante Ia noche usando 80 unidades de cada enzima de restricción, 2,5 μg de DNA genómico, 1x tampón de enzima de restricción en un volumen total de 100 μl. Se purificaron los fragmentos digeridos usando un volumen igual de fenol, transfiriendo Ia fase acuosa a un tubo nuevo y aplicando un volumen igual de cloroformo. Se aisló Ia fase acuosa resultante y dos volúmenes de etanol al 95% frío, 1/10 volumen de NaOAc 3 M (pH 4,5) y se añadieron 20 μg de glicógeno. Tras centrifugar a 14000 rpm durante 15 minutos, se lavó el sedimento obtenido usando etanol al 80% helado y tras el secado al aire, se disolvió el sedimento en 20 μl de TE (10/0,1 , pH 7,5). Se ligaron los fragmentos de DNA de cada grupo de digestión a adaptadores de 48 pb (SEQ. ID. NO: 3) a ambos lados. Se llevaron a cabo las ligaciones de DNA usando una ligasa T4 en una reacción durante Ia noche a 16 ⁰ C y se pararon las reacciones a 7O ⁰ C durante 5 minutos.

Tras Ia construcción de las bibliotecas, se realizaron dos reacciones de PCR para cada biblioteca usando dos cebadores diseñados a partir del adaptador, un primer cebador denominado AP1 (SEQ. ID. NO: 4) y un segundo cebador anidado denominado AP2 (SEQ. ID. NO: 6). La primera reacción de PCR requirió el cebador AP1 y un primer cebador específico de gen (GSP1) (SEQ. ID. NO: 5) que se diseñó de modo que su secuencia empezó en Ia posición -4 y contenía el codón ATG de CNH1.

Se diluyó el producto de PCR 1 :50 y se usó para una segunda reacción de PCR usando el cebador adaptador anidado (AP2) (SEQ. ID. NO: 6) y un segundo cebador específico para gen (GSP2) diseñado a partir de Ia posición -37 (SEQ. ID. NO: 7).

Se usó Ia mezcla Advantage Genomic Polymerase (Clontech) para reacciones de PCR. Primera serie de reacciones de PCR: (94 ⁰ C, 25 s/ 72 ⁰ C, 3 min.) x 5 ciclos, (94 ⁰ C, 25 s/ 67 ⁰ C ₁ 3 min.) x 32 ciclos, (67 ⁰ C, 7 min.) x 1 ciclo. Tras esta serie, se usaron 5 μl para comprobar fragmentos haciendo pasar un gel de agarosa al 1 ,5% TAEIx, y sólo en aquellos casos sin producto de PCR se realizaron 5 ciclos adicionales (94 ⁰ C, 25 s/ 67 ⁰ C, 3 min.). Se diluyó este primer producto de PCR 1:50 y una segunda serie de reacciones de PCR siguieron: (94 ⁰ C, 25 s/ 72 ⁰ C, 3 min.) x 5 ciclos, (94 ⁰ C, 25 s/ 67 ⁰ C, 3 min.) x 20 ciclos, (67 ⁰ C, 7 min.) x 1 ciclo.

Como resultado de esta reacción de PCR secundaria usando el cebador AP2 (SEQ. ID. NO: 6) y el cebador GSP2 (SEQ. ID. NO: 7), se observó el mayor producto de PCR (3,7 kb) en Ia biblioteca EcoRV, que se comprobó haciendo pasar en un gel de agarosa al 1 ,2 % TAEIx y se extrajo. Se llevó a cabo Ia purificación de Ia banda resultante usando el kit de extracción en gel MinElute (Qiagen) y siguiendo el protocolo del fabricante, así se obtuvo un volumen final eluido de 10 μl. Se clonó el fragmento en un TOPO TA vector de clonaje pCR 2.1-TOPO (Invitrogen) y se usó el cebador AP2 (SEQ. ID. NO: 6) para Ia secuenciación de Ia región 5' del fragmento clonado. Se obtuvo un fragmento genómico de 3,7 kb y tras Ia secuenciación se encontró que presenta 97 pares de bases de Ia región transcrita en sentido 5' SGN-U212704 así como sus secuencias promotoras novedosas. Esto confirmó que de hecho, se ha aislado una secuencia de DNA en sentido 5' del gen CHN1. SEQ. ID. NO: 1 muestra un fragmento de 3711 pb que oscila desde Ia posición -7 (esto es, a 7 pares de bases en sentido 5') del sitio de inicio de traducción putativo de CNH1. La secuencia que corresponde al adaptador Genome Walker también se ha destacado en Ia secuencia.

Para facilitar el clonaje de un fragmento de promotor necesario para ser usado posteriormente para dirigir Ia expresión de genes endógenos o heterólogos o secuencias de DNA se siguió una estrategia de clonaje Gateway. Para esto se diseñó un oligocebador GSP3 adicional en el sentido de 3' de Ia secuencia de adaptador para añadir Ia secuencia de recombinación attB1 (SEQ. ID. NO: 8) a Ia secuencia autentica en el sentido 5'. SEQ. ID. NO: 2 muestra Ia secuencia resultante de 3657 pb del fragmento de promotor usado en Ia construcción de pCNH1-GUS/GFP para dirigir Ia expresión de genes endógenos o heterólogos o secuencias de DNA en plantas tal como sigue.

Se amplificó el fragmento de promotor de 3657 pb mediante PCR usando una parte del cebador GSP2 unido a una secuencia de recombinación attB2 (SEQ. ID. NO: 9) y GSP3 (SEQ. ID. NO: 10). La secuencia de cebador GSP3 usada para amplificación sin el fragmento de recombinación está destacada en Ia Figura 9. Se recombinó el fragmento así obtenido en una reacción BP con el vector pDONR221 para proporcionar un vector pEntry. Para hacer esto, se realizó una reacción a 25 ⁰ C según las instrucciones del fabricante (Invitrogen), usando entre 15 y 150 ng del producto de PCR, 1 μl de pDONR221, tampón TE y 1X mezcla de reacción BP Clonasell. Tras una hora, se añadió 1 μ] de proteinasa K y se incubó Ia reacción a 37 ⁰ C durante 10 minutos. Se trasformaron células competentes de E. coli TOP 10 y se sembraron en placa en un medio de agar más Kanamicina LB y tras una incubación durante Ia noche a 37 ⁰ C se observaron colonias. Tras controlar varias minipreparaciones de las colonias candidatas obtenidas, se obtuvo el vector pEntry y las positivas se comprobaron posteriormente mediante análisis de restricción de endonucleasa, y secuenciación.

Se realizó Ia reacción LR según el fabricante a 25 ⁰ C, usando 200 ng del vector pEntry y 300 ng del vector pDestination, tampón TE y 1X mezcla de reacción LR

Clonasell. Se usó el vector binario pKGWFS7,0 (Karimi et al, 2002) como vector pDestination, que se consideró más adecuado para un ensayo de actividad de promotor debido al GFP-GUS dual (SEQ. ID. NO:11) que se fusionó en el sentido de 3' del sitio de recombinación attR2. Se realizó Ia selección de los clones transformados en un medio de agar más espetinomicina LB selectivo. La construcción de expresión resultante pCNH1 ::

GFP-GUS se muestra en Ia figura 2.

EJEMPLO 2

EI plásmido pCNH1::GUS/GFP tal como se describió en el ejemplo 1, se usó para transferir el cásete CNH1 ::GUS/GFP (SEQ. ID. NO: 13) en un genoma de tomate de tipo natural Solanum lycopersicum mediante el método de transformación de disco de hoja (Horsch, y modificado tal como en EIIuI et al. 1993.). Se recogieron las plantas transgénicas y se sometieron a ensayo para expresión GUS según Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6:390. La figura 3 muestra los niveles de actividad enzimática GUS obtenidos en diferentes órganos de una planta transformada con el T-DNA CNH1 ::GUS/GFP y donde por tanto el gen GUS se encuentra regulado por el promotor de Ia invención

(barras blancas). Estos niveles se comparan con los conferidos por un promotor constitutivo de referencia CaMV35S, fusionado de forma similar frente al gen GUS e introducido en Ia planta como cásete de expresión 35S::GUS/GFP (SEQ. ID. NO: 14) (barras negras). Como se puede observar en Ia figura 3, CNH1 confiere expresión a GUS en todos los órganos de Ia planta, sin embargo esta expresión es mucho más fuerte en el fruto a Io largo de su desarrollo, siendo en este órgano sus niveles de expresión muy similares a los que confiere el promotor de referencia CaMV 35S. Los niveles máximos de actividad GUS conferidos por CNH1 son de 24 nanomoles de metilumbeliferona producida por minuto y miligramo de proteína total en los extractos crudos de fruto de tomate en estadio verde-maduro. Se puede concluir que los promotores CaMV 35S y CNH1 difieren en su capacidad de discriminación entre el fruto y el resto de tejidos de Ia planta. Por tanto se concluye que el promotor CNH 1 es útil para conseguir Ia expresión de genes de forma ubicua en toda Ia planta pero especialmente alta (similar a CaMV35S) en el fruto.

EJEMPLO 3

En este ejemplo, el cásete CNH1 ::GUS/GFP (SEQ. ID. NO: 13) introducido en plantas de tomate tal y como se describe en el ejemplo 1 , es detectado mediante tinción histoquímica en el fruto siguiendo el protocolo descrito por Jefferson ef al., id., con el objetivo de determinar Ia distribución de Ia actividad GUS conferida por CNH1 en los distintos tejidos del fruto. De izda a dcha, Ia figura muestra un fruto en expansión (15 días post- antesis), un fruto en estadio verde-maduro (35 días post antesis), un fruto en estadio pintón y un fruto rojo respectivamente. En Ia figura 4a se aprecia que Ia distribución de Ia tinción GUS dirigida por CNH 1 se extiende a todos los tejidos y todos los estadios de desarrollo estudiados. En Ia figura 4b se muestra, en una imagen similar, Ia actividad GUS conferida por el promotor constitutivo CaMV35S en el fruto incluido en Ia construcción 35S::GUS/GFP (SEQ. ID. NO: 14). La comparación de ambas imágenes prueba que CNH1 puede ser utilizado de forma análoga a CaMV35S como promotor constitutivo en el fruto de tomate. De Io expuesto en Ia figura 4 se concluye que el promotor CNH 1 resulta ideal como promotor endógeno para Ia expresión de proteínas recombinantes en el fruto cuando se pretende una expresión ubicua y constitutiva en este órgano, ya que su expresión incluye a todos los tejidos y a los diferentes estadios de desarrollo, de forma análoga a Io que se observa con el uso de un promotor constitutivo de referencia como CaMV35S. El uso del promotor CNH1 resulta por tanto muy conveniente cuando se requiere un promotor que facilite una acumulación continuada y a altos niveles de un producto génico en el fruto, especialmente si este promotor ha de ser un promotor endógeno.

EJEMPLO 4

El promotor CNH 1 es útil para dirigir Ia expresión de proteínas recombinantes, y en particular de Ia proteína fluorescente verde (GFP), en ensayos de expresión transitoria en fruto. Los ensayos de expresión transitoria, descritos por Orzáez et al (2006), son útiles para determinar Ia viabilidad de una determinada construcción génica para su expresión en fruto. Los ensayos de expresión transitoria tienen una eficiencia de transformación limitada y por tanto requieren construcciones con promotores que confieran fuerte expresión en los distintos tejidos del fruto, dado que de otra forma no se podrá detectar el producto del gen recombinante. Una prueba de Ia idoneidad de un promotor para su uso en ensayos de expresión transitoria en fruto consiste en determinar su capacidad para dirigir niveles de expresión detectables y cuantificables de Ia proteína fluorescente verde. La capacidad para dirigir Ia expresión de otra proteína indicadora, Ia proteína fluorescente verde (GFP), de Ia nueva secuencia de promotor, se demostró en tejidos de fruto usando el ensayo de agroinyección transitoria en el modo que se describe en Orzaez et al. (2006). Se cultivó una suspensión de agrobacterias que llevaba Ia construcción CNH1-GUS/GFP en LB hasta DO 0,5 y luego se diluyó en MS hasta DO 0,05. Se inyectaron doscientos microlitros de Ia suspensión de bacterias en frutos de tomate en desarrollo a través del pedúnculo del fruto. Se cosecharon los frutos cuatro días tras Ia agroinyección y se siguió Ia expresión de Ia GFP indicadora dirigida por el CNH1 detectando Ia fluorescencia de pedazos de frutos usando un escáner Typhon (figura 5a). La expresión transitoria de GFP conferida por CNH1 fue detectada en un escáner de fluorescencia (figura 5a izda), y comparada con Ia conferida por CaMV35 en Ia construcción CaMV35-GUS/GFP (figura 5a dcha). Para corregir las variaciones debidas a Ia eficiencia de cada transformación, se utilizó como estándard interno Ia construcción CaMV35:DsRed, que dirige Ia expresión constitutiva de una proteína fluorescente roja. Esta construcción se usó como estándar interno para normalizar las variaciones en fluorescencia verde debidas a Ia eficiencia de Ia transformación transitoria. La fluorescencia emitida por los frutos agroinyectados se midió a los cuatro días post inyección (verde-maduro) u ocho días post inyección (representando estadios de pintón). Para ello, secciones ecuatoriales de frutos se escanearon en un escáner de fluorescencia usando dos canales de excitación diferentes de 488 nm (para detección de GFP) y de 532 nm (para detector DsRed), calculándose los ratios verde/rojo de intensidad entre ambos canales medidos en 4 posiciones diferentes de cada fruto. Para cada promotor ensayado, los valores absolutos detectados en el canal de fluorescencia verde se dividieron frente a los valores absolutos detectados en el canal rojo, obteniéndose así una estimación de Ia actividad relativa de cada promotor. En la figura 5b se muestran los resultados de dicha comparación: el promotor CNH1 rindió niveles cuantificables de GFP, el rango de los obtenidos con CaMV35S en estadio verde (etiqueta MG), aunque inferiores en estadio pintón (etiqueta Br). Este ejemplo permite concluir que el promotor endógeno CNH1 confiere niveles de expresión de GFP detectables en fruto y que dichos niveles son suficientes para realizar en ensayos de expresión transitoria en fruto.

EJEMPLO 5

Este ejemplo muestra el uso conjunto de los promotores 35S y el promotor de Ia invención CNH1 para Ia expresión conjunta en el mismo T-DNA de una immunoglobulina A (IgA) humana frente a rotavirus. La IgA realiza una función de inmunoprotección pasiva en las mucosas. Los frutos comestibles pueden ser una excelente plataforma para Ia producción de IgAs recombinantes frente a virus enteropatogénicos, reduciendo los costes tanto de producción como de purificación. Las IgAs están formadas por dos cadenas polipeptídicas, ligera y pesada, y por tanto su producción en fruto requiere Ia expresión concertada de ambos genes en el fruto a altos niveles. La inclusión de secuencias repetitivas en las construcciones génicas destinadas a Ia producción recombinante de proteínas en plantas da lugar a pérdidas de eficiencia debido a procesos de recombinación, deleción y silenciamiento génico. Por tanto, para producir complejos multiproteicos como IgA en fruto, resulta importante disponer de más de un promotor constitutivo con actividad en el fruto. En este ejemplo se describe Ia construcción y expresión transitoria en fruto de un T-DNA para Ia expresión de IgA humana frente a rotavirus en fruto de tomate. En esta construcción se utiliza promotor de Ia invención CNH1 para dirigir Ia expresión de Ia cadena ligera, mientras que Ia expresión de Ia cadena pesada es dirigida por el promotor CamV35S.

El T-DNA del presente ejemplo se construye incorporando secuencialmente las construcciones de Ia cadena pesada y ligera al vector de expresión pK7GW (Karimi et al 2002). En primer lugar las secuencias nucleotídicas de Ia región constante de Ia cadena pesada de Ia immunoglobulina A humana isotipo alpha 1 (SEQ. ID. NO: 15) (IgHalphai) y de Ia región constante de Ia cadena ligera humana isotipo lambda (Iglambdal) (SEQ. ID. NO: 16) se introducen por recombinación homologa en el vector pDNOR221 (Invitrogen), generando los vectores pENTRIgHalpha y pENTRIgLambda respectivamente. Sobre este vector se injertan por digestión con enzimas de restricción y posterior ligación las secuencias variables pesada (SEQ. ID. NO: 17) y ligera (SEQ. ID. NO: 18) del anticuerpo de cadena sencilla 2A1 frente a rotavirus descrito por Monedero et al (2004), generando los vectores pENTRIgHalpha2A1 y pENTRIgl_ambda2A1 respectivamente. Por recombinación homologa entre pENTRIgHalpha2A1 y el vector de destino pK2GW7,0 (Karimi et al 2002) se generó en vector de expresión pK235S_ lgHalpha2A1_NosT. En paralelo, y mediante triple recombinación homologa entre un vector de entrada conteniendo al promotor CNH1, el vector pENTRIgl_ambda2A1 y un tercer vector de entrada conteniendo el terminador T-Nos y el vector de destino pKGW.O (Karimi et al 2002) se generó el vector de expresión pKNH_ lgl_lambda2A1_NosT que contiene un cassette de expresión con el promotor CNH1 , Ia cadena ligera Llambda2A1 y el terminador T-Nos. Finalmente, dicho cassette de expresión se incorporó en el vector pK235S_ lgHalpha2A1_NosT por digestión con enzimas de restricción y posterior ligación. El vector resultante contiene un T-DNA que se muestra en Ia Figura 6 (SEQ. ID. NO: 19) y que incorpora los elementos necesarios para Ia expresión en fruto de una IgA humana frente a rotavirus: Se construyó un fragmento de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens que contenía los siguientes elementos desde 5' hasta 3': (1) el left border integrativo (SEQ. ID. NO: 20); (2) un cásete completo para resistencia a kanamicina en plantas (SEQ.ID.NO: 21); (3) un sitio de recombinación attB1 como subproducto de recombinación LR (SEQ. ID. NO: 22); (4) un promotor 35S doble (SEQ. ID. NO: 23); (5) un sitio de recombinación attB4 como subproducto de recombinación LR (SEQ. ID. NO: 24); (6) el péptido señal pectato liasa de tomate para dirigir Ia expresión de inmunoglobulina para el sistema de endomembrana de estabilización (SEQ. ID. NO: 25); (7) una región variable de inmunoglobulina humana de cadena pesada con afinidad frente al péptido VP8* de Ia cepa de rotavirus SA11 (SEQ. ID. NO: 17); (8) el dominio constante de inmunoglobulina alfa humana de cadena pesada; (SEQ. ID. NO: 15); (9) un sitio de recombinación attB3; (SEQ. ID. NO: 26); (10) el terminador nopalina sintasa para terminación de trascripción eficiente; (SEQ. ID. NO: 27) (11) y un sitio de recombinación attB1 (SEQ. ID. NO: 22); (12) el promotor CNH1 (SEQ. ID. NO: 2); (13) un sitio de recombinación attB4 (SEQ. ID. NO: 24); (14) el péptido señal pectato liasa de tomate (SEQ. ID. NO: 25); (15) una región variable de inmunoglobulina humana de cadena ligera con afinidad frente al péptido VP8* de Ia cepa de rotavirus SA11 (SEQ. ID. NO: 18); (16) Ia región constante de inmunoglobulina lambda humana de cadena ligera (SEQ. ID. NO: 10); (17) un sitio de recombinación attB3 (SEQ. ID. NO: 26) (18) el terminador nopalina sintasa (SEQ. ID. NO: 27); (19) y un sitio de recombinación attB2 (SEQ.ID.NO: 28). (20) el right border de T-DNA (SEQ. ID. NO: 29) (figura 7). La presencia de promotor CNH 1 dirigiendo Ia expresión de ¡nmunoglobulina humana de cadena ligera actúa como factor limitante, garantizando que se produzcan niveles altos de IgA humana recombinante funcional anti rotavirus sólo en tejidos en el que CNH1 es activo (es decir principalmente en el fruto).

Se transfirió de manera transitoria el T-DNA descrito anteriormente a células de fruto de tomate usando el procedimiento de agroinyección (Orzaéz et al 2006). Se detectó Ia presencia de IgA humana recombinante frente a rotavirus en extractos brutos de frutos de tomate en Western blot y ELISA. La figura 8a muestra Ia detección en fruto (línea 1) mediante Western blot de las cadenas pesada y ligera de IgA. No se detectó IgA en frutos control agroinfiltrados sólo con CamV35S:GFP/GUS, mientras que Ia expresión de ambas cadenas fue indetectable en hoja de tomate agroinfiltrada con el mismo T-DNA. Se demuestra de esta forma que ambas cadenas de IgA se expresan en el fruto y que el promotor CNH 1 es eficiente para Ia producción de complejos IgA en el fruto cuando se necesita el concurso de más de un promotor constitutivo en el fruto. La ausencia de IgA detectable en hoja se interpreta como resultado de los niveles bajos de expresión de IgL conferidos por CNH1 en hoja y Ia inestabilidad de IgH en ausencia de IgL.

La figura 8b muestra cómo los extractos crudos de tomates agroinfiltrados con el T-DNA de Ia figura 7 son capaces de unir específicamente el antígeno de rotavirus contra el que fueron inicialmente seleccionados (VP8*). Extractos sin diluir y diluciones 1:10 de los extractos reaccionaron fuertemente frente al antígeno en ensayos ELISA (barras blancas), mientras que extractos de frutos control agroinyectados con Ia construcción 35S:GFP/GUS muestran sólo una señal basal en placas tapizadas con el antígeno. Se demuestra por tanto que el concurso de CNH 1 permite Ia expresión de complejos proteicos funcionales en el fruto.