CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con la industria de la biomedicina, la ingeniería de tejidos y regeneración de dientes. En particular, la presente invención se relaciona con un constructo para evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante en el tratamiento de enfermedades (sin el uso de drogas inmunosupresoras), ya sea xenotrasplante o alotrasplante. La presente invención también se relaciona con el método de obtención de dicho constructo. Adicionalmente, se describe un método para producir colágeno en estado de gel, ya sea en forma 3-D o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar. Por último, la presente invención se relaciona con el uso del constructo para evitar el rechazo inmunológico producido durante el trasplante del mismo.

ESTADO DEL ARTE

Los procedimientos de regeneración de tejido dental tienen su origen desde alrededor de 1952, cuando se reportó la regeneración de células pulpares mediante la aplicación de hidróxido de calcio en un caso clínico de amputación de una pulpa vital. A partir de esa evidencia se realizaron numerosos avances usando estímulos locales durante la endodoncia siempre dependiendo de tejido pre-existente sano; sin embargo, se desconocía la naturaleza de estas regeneraciones parciales hasta que se descubrió que en la pulpa del diente había células madres mesenquimales adultas. La pulpa de dientes permanentes contiene células madres (Human Dental Pulp Stem Cells, DPSCs), que forman diferentes tipos de colonias clonogénicas en cultivos con mayor frecuencia (22 a 70 colonias /104 células sembradas) y mayor proliferación celular

i (72% vs. 42%) que similar número de células sembradas de médula ósea, pero en menos proporción que la pulpa de dientes exfoliados primarios de niños de 7 a 8 años de edad (Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED); cuando se mantienen por largo tiempo en cultivos con medio osteogénico las DPSCs secretan matriz que mineraliza (nodos de mineralización) demostrando altos niveles de calcio, sin embargo en cultivos no se pudo demostrar presencia de dentina debido a la naturaleza del cultivo in vitro. Estas células madres al ser trasplantadas en presencia de hidroxiapatita y fosfato tricálcico (HA/TCP) en el dorso subcutáneo de ratones inmunosuprimidos, mostraron la formación de un complejo pulpo/dentina, con vasos sanguíneos, secreción de dentina y ordenados odontoblastos. Además de su potencial dentinogénico, las células madres derivadas de pulpa dental adulta, poseen potencial adipogénico y neurogénico, condrogénico y miogénico confirmando la plasticidad y heterogeneidad de esta población de células madres mesenquimales in vitro. Sin embargo, no se ha demostrado aún su uso in vivo en ausencia de inmunosupresión para evitar su rechazo inmunológico. Al comparar las SHED con las DPSC, se concluye que los dientes primarios de niños son una fuente de células madres muy diferentes a las células madres presentes en la pulpa de dientes permanentes, el potencial neurogénico de las SHED las hace muy interesantes para regeneración neuronal y más aún porque se logró aislar las células con características de células madres embrionarias (ES-cells) partir de estos tejidos; sin embargo, esta última característica podría constituir un riesgo de malignidad debido al potencial infinito de multiplicaciones que poseen las células madres embrionarias. Por otro lado, las SHED no constituyen una buena fuente de tejido para regenerar un germen dentario debido a que no forman el complejo pulpo/dentinario y son solo inductoras de hueso, porque no se diferencian a osteoblastos. El tercer tipo de células madres de tejido dental lo constituyen las SCAP (Stem Cells from Apical Papila), obtenidas desde la papila apical de tercer molar incluido en estadios tempranos de desarrollo (Nolla, C-D-E); las cuales, se podrían considerar la fuente de las células de la pulpa radicular (odontoblastos productores de dentina coronal) y es tentador pensar que estas mismas SCAP dan origen a las DPSCs, pero no se ha demostrado que las SCAP se constituyen como DPSCs en la futura pulpa del diente adulto y se han demostrado varias diferencias entre estos dos tipos de MSCs. El trasplante de colonias SCAP in vivo, al igual que se realizó con las DPSCs en ratón inmunosuprimido, demostró que forman el complejo pulpo/dentinario, lo que le da ventajas por su potencial de desarrollo; por otro lado, otro tipo de estudios en el que se extrajo la papila apical a dientes en desarrollo, demostró que este tejido tiene un rol importante en la formación de la raíz porque aunque se mantuvo intacta la pulpa, el germen sin la papila no fue capaz de formar raíz. Así, se concluye que en el germen dental las células SCAP son fundamentales para el desarrollo de la raíz dental. El cuarto tejido dental en el que se caracterizó un grupo de MSCs, es el folículo dental; el cual, se puede obtener desde terceros molares incluidos humanos en desarrollo temprano, separando el ectomesénquima que rodea al órgano del esmalte en la papila dental. Este tejido contiene células madres clonogénicas (Dental Follicle Precursor Cells, DFPCs) que en cultivo muestran multipotencialidad miogénica, neurogénica, adipogénica, condrogénica, además del potencial cementogénico y odontogénico; las que, transplantadas in vivo dan origen a tejido fibroso similar al ligamento periodontal, pero no forman dentina, cemento, ni hueso. Por otro lado, células inmortalizadas del folículo dental si son capaces de formar el ligamento periodontal completo cuando son trasplantadas in vivo, sin embargo la complejidad de esta técnica de inmortalización las hace difíciles de usar en clínica. A partir de los antecedentes descritos anteriormente, queda claro que la regeneración del órgano dental requiere más de un tipo de células madres dado su origen epitelio- mesenquimal y a pesar de los avances recientes en las propiedades de las células madres, aún falta una solución biológica que permita anclar el diente al nicho alveolar y devuelva la funcionalidad al sistema masticatorio del individuo a partir de un tipo de células madres. El ligamento periodontal contiene células capaces de diferenciarse a cementoblastos y osteoblastos; sin embargo, también contiene un reservorio de células madres con las características de las MSC denominadas células madres del ligamento periodontal (Periodontal Ligament Stem cells, PDLSCs), estas células aisladas en cultivo se caracterizan por responder a la inducción con los correspondientes medios para diferenciarse a adipocitos, condrocitos y osteoblastos. Además, se demostró su capacidad de diferenciación a precursores neuronales. El trasplante de PDLSCs, en ratones inmunosuprimidos demostró la formación de ligamento periodontal conteniendo fibras de Sharpey unidas al cemento formado por estas células similares a lo observado en condiciones fisiológicas en un individuo; más aún, el trasplante de estas células a la región periodontal de ratas con daño inducido quirúrgicamente, mostró que el tejido periodontal formado se adhiere a la superficie alveolar y a la superficie del diente. Hasta la actualidad todas las publicaciones indican que los transplantes de células madres dentales se han realizado con inmunosupresión del animal y solo usando modelo reparativo en ratas o en cerdo. La presente invención muestra un constructo que puede contener células madres adultas de ligamento periodontal de dientes extraídos en clínicas dentales y que evita el rechazo inmunológico al ser usadas en el tratamiento de enfermedades o condiciones relacionadas con la dentadura humana, sin el uso de inmunosupresión. El intento de regenerar un diente completo lo iniciaron grupos de investigación experimentando mediante recombinación heterotípica de tejidos dentales que tiene la complejidad de requerir la formación de cuatro tipos de tejidos distintos: pulpa, dentina, cemento (estos dos últimos de origen mesenquimático), y finalmente, esmalte, tejido mineralizado de origen epitelial, el más duro del cuerpo humano. Este esmalte es secretado por los ameloblastos que existen sólo durante el desarrollo, una vez erupcionado el diente los ameloblastos mueren. El proceso de mineralización toma más de seis años, desde la sexta semana de vida intrauterina hasta la infancia en que ocurre el recambio de los dientes primarios, que no poseen raíz dental, por los dientes definitivos que si no son dañados permanecerán en boca hasta la muerte del individuo debido a que poseen raíz dental. Estos tejidos mineralizados, se unen desde la raíz al nicho alveolar óseo mediante el ligamento periodontal, que también debe ser regenerado si se pierde por razones patológicas o traumáticas. Sin embargo, esta regeneración del ligamento periodontal solo tomará un par de meses comparado con los años que normalmente tomaría regenerar los tejidos mineralizados. Sin el descubrimiento de las células madres, la odontología se enfocó en reemplazar la raíz dental para recuperar la función de oclusión mediante prótesis artificiales denominadas implantes dentales.

Los implantes dentales existentes en la actualidad en el comercio se componen de una base metálica generalmente de titanio. Estos metales son implantados en el hueso alveolar sin lograr regenerar el complejo periodontal, por lo que no tienen una relación natural debido a la falta de disipación y transmisión de fuerzas, falta de propiocepción y falta de estereognosis. Estas son propiedades que posee sólo el diente natural o biológico, debido a que sólo las células pueden estructurarse para formar vasos sanguíneos, inervaciones y matriz extracelular rica en fibras además de producir nutrientes, señales químicas y eléctricas que informen al cerebro de la propiocepción, dimensión tridimensional volumétrica, transmisión y dispersión de fuerzas masticatorias que finalmente ayudan a mantener la homeostasis del hueso alveolar y la señal de vida del diente que prolonga la edad competitiva del individuo y evita el envejecimiento prematuro.

Por otro lado, los implantes de titanio son susceptibles de aflojarse o de producir infecciones como gingivitis o periodontitis, debido a la relación no natural entre el hueso y el implante metálico.

El mercado mundial de los implantes dentales metálicos para el año 2010 fue de 3.200 millones de dólares aproximadamente. Al año 2015 hubo una tasa de crecimiento anual de un 6%, alcanzando un valor de 4.200 millones de dólares. Si se considera que el mercado latinoamericano es de un 10%, se tiene un mercado potencial de 420 millones de dólares para el año 2015.

Por lo tanto, se hace fundamental desarrollar un producto que permita el implante o desarrollo de piezas dentales de base biológica para la regeneración dental, que eviten el envejecimiento prematuro de tejidos dentales, que proporcionen mayor bienestar y calidad de vida, y que tengan mayor biocompatibilidad a la vez que reduzca los problemas generados por la relación no natural entre el hueso y el implante metálico. Ante tal problemática, la presente solicitud presenta un constructo que contiene colágeno que sirve de soporte para el implante de piezas de base biológica, que aparece como una alternativa a los implantes actualmente utilizados, y que además mejora la biocompatibilidad reduciendo drásticamente los niveles de rechazo hasta prácticamente cero. De este modo, la presente solicitud comprende productos tales como un constructo para evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante en el tratamiento de enfermedades (sin el uso de drogas inmunosupresoras), ya sea xenotrasplante o alotrasplante, un método de obtención de este constructo, un método para producir colágeno en estado de gel, ya sea en forma 3-D o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar, y el uso del mismo.

En el arte previo existe la publicación US 20100196854 que describe un método de reconstrucción de dientes utilizando un portador de un material bio-compatible que puede incluir hidroxiapatita cargado con células madres Stem cells of apical papilla (SCAPs), Periodontal Ligament Stem Cells (PDLSC) y Dental Pulp Stem Cells (DPSC), que podría ser usado especialmente como reconstructor de la raíz. Sin embargo este documento no hace referencia a que el material bio-compatible es colágeno ni menos se especifican las etapas específicas y componentes necesarios para producir el constructo de la presente invención. Por lo cual, tampoco expone el uso de un producto en base a colágeno para evitar el rechazo inmunológico de un implante de origen alogénico.

El documento EP1920788A1 está relacionado con una matriz que contiene células madre mesenquimales y plasma rico en plaquetas, para su uso en la preparación de implantes para el tratamiento de patologías periodontales o de hueso, en donde dicha matriz puede contener colágeno, sin embargo la presente invención no enseña ni sugiere que el producto contiene plasma rico en plaquetas. Por otro lado, este documento tampoco enseña ni sugiere el constructo con los elementos particulares de la presente invención ni los pasos para obtenerlo. Adicionalmente, existen publicaciones científicas que describen el uso de células madres en el implante de piezas dentales con matrices apropiadas, tales como Zhou Y. et al. Periodontal healing by periodontal ligament cell sheets in a teeth replantation model. Arch. Of Oral Biology 57 (2012) 169-176, y Zhao et al. The combined use of cell sheet fragments of periodontal ligament stem cells and platelet-rich fibrin granules for avulsed tooth reimplantation. Biomaterials 34 (2013) 5506-5520; sin embargo, ninguno de estos documentos describen el constructo de la presente invención con los elementos particulares descritos, así como tampoco el método para fabricarlo, ni menos el uso de células madres alogénicas o heterólogas para crear constructos que evitan el rechazo inmunológico, como sí lo hace la invención presente. Por lo tanto, es necesario contar con productos útiles en trasplante, ya sean alotrasplantes o xenotrasplante y métodos que los produzcan que no presenten rechazo inmunológico cuando son trasplantados, y que no haya infección de xenovirus durante el trasplante. Para resolver este problema técnico, se presenta un constructo que evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante en el tratamiento de enfermedades (sin el uso de drogas inmunosupresoras), ya sea xenotrasplante o alotrasplante; un método de obtención de dicho constructo; un método para producir colágeno en estado de gel, ya sea en forma 3-D o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar; y por último, el uso del constructo para evitar el rechazo inmunológico producido durante el trasplante del mismo.

Una de las ventajas de la presente invención es la independencia de la fuente de células, donde esta independencia acarrea beneficios técnicos (por ejemplo facilidad en cultivo de células, sin depender de una fuente fija o definida) y económicos (por ejemplo menores requisitos para mantención de cultivo celular en comparación a obtención de células desde el mismo paciente)

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Se muestra los resultados de la optimización del medio de cultivo usado en cultivos de células madres del ligamento periodontal. En la presente solicitud se seleccionó el medio a-MEM, estándar para cultivo de células madres, debido a que el tiempo de doblaje es el óptimo reduciendo el tiempo a menos de la mitad para este tipo celular comparado con el medio D-MEM alto en glucosa.

Figura 2. Se muestra los resultados de la caracterización de células madres dentales mediante citometría de flujo. De acuerdo a los resultados obtenidos se estableció que es recomendable usar hasta el séptimo pasaje las células madres dentales congeladas para realizar los constructos de la presente invención con el máximo potencial de las células. La figura muestra que los marcadores para células madres permanecen presentes según lo esperado para CD90, CD29 y STRO-1 ; en tanto, que siempre ausentes para CD34. Además son negativas para CD-14 (no mostrado). Figura 3. Se muestra el control microbiológico de tejido para obtención del producto de colágeno, mediante la metodología descrita en la presente solicitud. Corresponde a UFC/placa en tejido de cerdo tratado con povidona yodada o ácido peracético. Se ensayó varios desinfectantes usados en la literatura y se compararon con el procedimiento descrito en la presente invención (povidona yodada); los resultados en triplicado demostraron que la povidona yodada fue el único 100 % efectivo para desinfección de la piel de cerdo, previo a someterla a la extracción. En la gráfica se muestra la comparación con el ácido peracético, como ejemplo. Abreviaturas: PY - Povidona Yodada, AP - Ácido Peracético, UFC - unidades formadoras de colonias, CC - control de campana de trabajo. Figura 4. Se muestran resultados del control microbiológico. Las fotografías de las placas de cultivo muestran el crecimiento inicial de colonias bacterianas al inicio (tiempo 0), y la disminución de UFC a los 5 minutos, 30 minutos, 1 hora y 3 horas de exposición al desinfectante; en el panel superior povidona yodada (PY) y en el panel inferior ácido peracético (AP). La povidona yodada resultó más efectiva y elimina totalmente la formación de colonias bacterianas a las 3 horas, mientras que con el ácido peracético aún persiste la presencia de una colonia.

Figura 5. Se muestran fotografías de los cultivos de células madres obtenidas a partir de ligamento periodontal, cultivadas en (A) medio a-MEM y (B) cultivadas en el mismo medio sobre el producto de colágeno (específicamente la matriz 3-D de colágeno), obtenido según la presente invención.

Figura 6. Se muestra en gel de SDS-Page, la migración electroforética del extracto de colágeno a concentraciones de 3,0 μg, 15,0 μg y 30 μg obtenido del análisis de los componentes del producto de colágeno obtenido desde la piel de cerdo con el método aquí descrito. Se observan el patrón típico de colágeno, en el cual se distinguen las cadenas α1 , a2 y β; y con mayor claridad con mayor concentración del extracto entre 15 μg y 30 μg total.

Figura 7. Se muestra corte histológico de la matriz 3-D conteniendo las células madres del ligamento dental humano creciendo en la matriz de colágeno 3-D, mostrando sus núcleos teñidos con el compuesto fluorescente DAPI. Se observa el producto de colágeno producido para mantener células madres del ligamento periodontal en cultivo. La presencia de las células en la matriz fijada, incluida en parafina y cortada con micrótomo se muestra mediante inmunofluorescencia de los núcleos con tinción DAPI (40X). Se observan los núcleos distribuidos a lo largo de la matriz evidenciando que las células se integran en la malla de colágeno. Este producto con células es usada para cubrir el elemento a trasplantar.

Figura 8. Se muestra un ejemplo del biodiente humano con ligamento periodontal regenerado fuertemente adherido a la matriz del diente, de tal manera que es posible sostenerlo con una pinza al extraerlo del dorso del ratón (figura A); en la figura B) y C) del centro e inferior se muestran cortes histológicos de este diente después de desmineralización, donde se observa la estructura de los túbulos dentinarios de la dentina (D) cortados transversalmente y sagitalmente, con clara presencia de cemento (C) y fibras del ligamento periodontal (PDL) en íntima asociación con la superficie de la dentina. Por otro lado, el mareaje con anticuerpos contra las mitocondrias humanas confirma claramente la presencia de las células humanas diferenciadas a partir de las células madres humanas en el constructo implantado en ratón sin inmunosupresión.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un constructo para trasplante, ya sea xenotrasplante o alotrasplante, que no genera rechazo inmunológico, que comprende: a) células con capacidad regenerativa; b) colágeno en estado de gel 3-D, o también llamado matriz 3-D de colágeno, obtenido de mejillas de cabeza de cerdo; c) medio de cultivo; d) un elemento destinado a trasplantar; y e) colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado con la forma del elemento a trasplantar.

El constructo está conformado de forma que las células con capacidad regenerativa (a) están cultivadas sobre el colágeno en estado de gel 3-D (b), y el medio de cultivo (c) se encuentra sobre las células con capacidad regenerativa (a); dicho medio de cultivo con células y colágeno en estado de gel 3-D está envolviendo el elemento destinado a trasplantar (d); el elemento a trasplantar envuelto con células y el colágeno 3-D está dentro del colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado (e), de tal manera que el producto resultante queda inmerso y rodeado de una segunda capa de colágeno liofilizado seco.

En una realización específica, las células con capacidad regenerativa (a) se seleccionan del grupo que comprende: células madres alogénicas o autólogas, o células madres inducidas o células progenitoras de líneas celulares conducentes a tejidos específicos, o fragmentos de tejidos de órganos mantenidos vivos o en desarrollo. Más específicamente, las células madre son células que se seleccionan del grupo que comprende: células mesenquimales de origen adiposo, médula ósea, cordón umbilical, pulpa dental, papila dental, folículo dental, ligamento periodontal, epitelio bucal, ligamento condilar, músculo cardíaco, epitelios de recubrimiento, huesos planos maxilofaciales o craneales, células progenitoras óseas, endoteliales. Estas células madres son alogénicas o autólogas.

En una realización específica, el elemento a trasplantar (d) se selecciona del grupo que comprende: diente, hueso craneal, hueso maxilo facial, hueso iliaco, huesos largos, órgano dental en desarrollo, riñon, hígado, corazón, tubo traqueal, pulmón, cornea, nervios motores, ligamentos, cartílago, piel. Específicamente, el elemento a trasplantar es diente mineralizado adulto humano. En caso de que sea diente, el constructo para trasplante puede llamarse bio-diente.

En un segundo aspecto de la presente invención, se describe un método para producir el constructo para trasplante, ya sea xenotrasplante o alotrasplante, que no genera rechazo inmunológico, que comprende las etapas de: a) preparar un elemento destinado a trasplantar fresco a temperatura ambiente entre 20 a 25°C, o previamente mantenido en frío entre 4 ^e C a 10 ^e C o congelado (-20 ^e C hasta -170 ^e C en criopreservación); b) recubrir placas de cultivo con el colágeno en estado de gel 3-D en forma de una lámina sobre la placa, luego depositar las células con capacidad regenerativa, tal como, células madres alogénicas o autólogas, o células madres inducidas o células progenitoras de líneas celulares conducentes a tejidos específicos, o fragmentos de tejidos de órganos mantenidos vivos o en desarrollo, y cubrir con el medio de cultivo según el tipo celular e incubar hasta evidenciar por observación microscópica la incorporación de las células a la matriz tridimensional desde 4 horas a 24 horas; c) disponer de colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado con la forma del elemento a trasplantar; d) tomar la lámina de cultivo con células madres de la etapa (b), eliminar el exceso de medio de cultivo por contacto sobre papel absorbente y enrollar completamente sobre el elemento a trasplantar; e) cubrir o sumergir el constructo obtenido de la etapa d), que consta del elemento a trasplantar incorporado en la matriz 3-D de colágeno, en los moldeados de colágeno de la etapa (c); de tal manera que, el constructo tridimensional de colágeno 3-D tipo gel queda inmerso y rodeado de una segunda capa de colágeno esponjoso liofilizado seco (tipo molde esponjoso con o sin entrecruzamiento, descrito en la especificación para el diente) y moldeado de acuerdo a la forma del implante y f) almacenar congelado a una temperatura entre -80 ^e C a -150°C hasta su uso.

En una realización específica, el elemento a trasplantar de la etapa a) se selecciona del grupo que comprende: diente, hueso craneal, hueso maxilo facial, hueso iliaco, huesos largos, órgano dental en desarrollo, riñon, hígado, corazón, tubo traqueal, pulmón, cornea, nervios motores, ligamentos, cartílago, piel. Específicamente, el elemento a trasplantar es diente mineralizado adulto humano. En caso de que sea diente, el constructo para trasplante puede llamarse bio-diente. En una realización particular, en el caso de que el tejido a trasplantar sea un diente, se considera el siguiente método para tratar el diente previo a la etapa a): i) descelularizar, mediante enjuague con agua ultrafiltrada, sumergido en una solución de 17% EDTA entre 5 a 15 minutos a pH neutro (7,0 a 7,2) a temperatura ambiente (20 a 25°C) y luego mantenidos entre 30 segundos a 5 minutos en una solución de entre 10 a 30% ácido cítrico y se lava con agua ultrapura. ii) desinfectar, sumergiendo en povidona yodada entre 30 a 90 minutos con agitación, se enjuaga y se desinfecta con una solución de NaOH a pH 14 en buffer por un período de tiempo entre 5 a 15 minutos para finalmente enjuagar en agua ultrapura hasta llevar a pH entre 5 a 9 y se mantiene en solución salina o buffer fosfato salino (PBS) estéril, en frío, o en etanol 70%, o se mantiene en seco en envase estéril hasta su uso.

Adicionalmente, si los ápices radiculares están cerrados se pueden abrir para realizar una limpieza radicular y cameral usando las técnicas convencionales de endodoncia con una lima tipo H o K, previo a la descelularización, quedando la pieza dental con su canal y raíz libre de células, manteniendo la parte mineral y orgánica.

En otra realización específica, las células madre de la etapa b) son células madre que se seleccionan del grupo que comprende: células mesenquimales de origen adiposo, médula ósea, cordón umbilical, pulpa dental, papila dental, folículo dental, ligamento periodontal, epitelio bucal, ligamento condilar, músculo cardíaco, epitelios de recubrimiento, huesos planos maxilofaciales o craneales, células progenitoras óseas, endoteliales. Estas células madres son alogénicas o autólogas.

Estas células madres son cultivadas en las siguientes condiciones: Extraer ligamento periodontal desde el tercio inferior radicular de una pieza dental, pudiendo ser un tercer molar erupcionado o cualquier diente erupcionado, obtenido del paciente o donante, o de una pieza dental animal (cerdo, perro u otro); se tritura en solución salina (PBS), se traspasa a platillos cubiertos de una matriz 3-D de colágeno y se agrega medio de cultivo a-MEM con FBS (10% a 15%) o con suero humano autólogo (10% a 15%) para obtener las células madres. Una vez alcanzada la confluencia de 60% a 75% se digiere con enzimas colagénicas, y a continuación, se expanden en medio a-MEM con FBS o con suero humano autólogo, pudiendo ser usadas para implantes desde la primera expansión hasta el séptimo pasaje, fresco o después de congelar y descongelar; durante el cultivo el proceso de selección celular permite obtener células madres caracterizadas por citometría de flujo o una mezcla de células madres con otros tipos de células en vías de diferenciación.

Alternativamente, previo a su uso las células se pueden obtener directamente en platillos de cultivos sin colágeno mediante extracción enzimática y cultivo en medio a- MEM con 10% o 15% FBS o con 10% a 15% suero humano autólogo hasta que lleguen a una confluencia óptima (60% a 75%) para expandir y congelar hasta su uso. Al momento de su uso se cultivan sobre la matriz de colágeno 3-D como se describen anteriormente y se usa la lámina con células para enrollar completamente sobre el elemento a trasplantar de la etapa a) del método para producir un constructo para trasplante.

Además, previo a cubrir el diente con la matriz de colágeno 3-D y células madres, se rellena la cavidad pulpar de la matriz mineralizada y descelularizada del diente a trasplantar con células madres de la pulpa dental (DPSCs) de dientes erupcionados y extraídos por indicación ortodóncica o las células del ápice de un tercer molar en desarrollo (SCAPs) o las DPSCs de este tipo de diente, alogénicas o autólogas crecidas y mantenidas por el método estándar de expansión de células madres mesenquimales de origen dental usando de preferencia el medio a-MEM en la matriz 3-D de colágeno descrita aquí, con o sin VEG (factor de crecimiento de vasos sanguíneos) o alternativamente, en lugar de células madres dentales se introducen células en vías de diferenciación mediante una corta inducción en un medio estándar para diferenciación odontoblástica que contiene de preferencia el medio de cultivo a- MEM, suplementado con 10% FBS (o suero autólogo) junto a ácido ascórbico, glicerol fosfato. Este procedimiento se realiza con la ayuda de una jeringa de tal manera que el gel de colágeno conteniendo las células llena completamente la cavidad pulpar; luego, se procede como lo descrito en esta sección desde (d) en adelante para completar el constructo con la lámina de gel conteniendo células madres del ligamento periodontal y el moldeado esponjoso que permitirá el implante dental en nicho alveolar.

En caso de que el elemento a trasplantar sea hueso maxilofacial, se somete a las etapas de: i) limpiar tejidos anexos, inmersión en buffer Tris-NaCI o PBS entre 30 segundos a 5 minutos o en 70% etanol entre 1 y 5 minutos, y luego enjuague en agua ultrapura para recubrir con la matriz de colágeno 3-D sembrado con células madres mesenquimales o células precursoras; ii) alternativamente, luego de la limpieza descrita en (i) se somete a descelularización siguiendo los mismos pasos que para el diente.

La descelularización se realiza aplicando los mismos principios descritos previamente para la matriz mineralizada de una pieza dental, (exceptuando el proceso endodóntico) se usa un ácido diluido (por ejemplo ácido clorhídrico) por 15 minutos o más, dependiendo del tamaño del fragmento de hueso, y se descelulariza por un rango de 15 minutos a varias horas (3 a 8 horas según el tamaño del fragmento de hueso) con acetona o una solución de ácido nítrico diluido. Finalmente, se enjuaga en agua ultrapura estéril por 24 horas y se sumerge en etanol entre 60% y 90% hasta su uso.

El hueso descelularizado se recubre con la mezcla de matriz 3-D de colágeno-células madres mesenquimales o precursores osteoblásticos, conteniendo el medio estándar de cultivo a-MEM suplementado con 10% FBS, dexametasona, ácido ascórbico, glicerofosfato. Estos elementos son insertados en un moldeado de colágeno sometido a entrecruzamiento según lo ya descrito anteriormente y se trasplanta en el organismo sin inmunosupresión.

En un tercer aspecto de la presente invención, se describe un método para producir el colágeno en estado de gel, ya sea en estado gel 3-D donde se cultivan las células con capacidad regenerativa o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar, que comprende: a) Desinfectar un segmento de piel de cerdo (específicamente mejilla de cabeza de cerdo) sumergiéndolo en una solución comercial de povidona yodada en una concentración entre 1 % y 30%, por un período de 3 a 6 horas, y posteriormente se cepilla vigorosamente por ambas caras y se enjuaga con agua calidad ultra-pura; b) extraer y triturar la dermis del segmento de piel obtenido de la etapa a), y posteriormente mezclar con una solución entre 1 y 10 M de acetato de sodio, y se eleva el pH entre 10 a 14 con una solución de hidróxido de sodio entre 10 a 15 M durante un período de tiempo entre 30 minutos y

2 horas a temperatura ambiente (20 i ^!e C a 25 ^e C) para esterilizar la solución y extraer las proteínas; c) lavar la mezcla resultante de la etapa b) 2 a 7 veces con una solución de acetato de sodio entre 1 M y 10M, colectando las proteínas mediante centrifugación a igual o más de 9.000 rpm en frío entre 0 y 10 ^e C; seguido de 2 a 7 lavados con agua calidad ultra-pura mediante el mismo método de centrifugación; luego el sedimento se solubiliza en una solución de ácido acético diluido entre 0,01 N y 0,5N en una proporción de 1 It por 1 ,5 gr del sólido, mediante agitación entre 0 y 10 ^e C; d) recuperar mediante centrifugación entre 0 y 10 ^e C a igual o más de 9.000 rpm, y después separar las partículas sólidas en suspensión de la solución mediante filtración en gasa y; posteriormente, la solución se congela (-20 ^e C a -30 ^e C) y se somete a un proceso de liofilización para eliminar el agua; y e) mantener congelado el producto de la liofilización hasta su uso, obteniendo el colágeno en forma de gel.

Alternativamente, la piel de cerdo desinfectada obtenida en la etapa a) se congela entre -80°C a -196°C para mantenerlo almacenado hasta su uso.

Método de preparación de moldeados de colágeno

Adicionalmente, el colágeno obtenido por el método descrito anteriormente desde las etapas a) a e) puede presentarse en la forma de moldeados esponjosos liofilizado seco para enrollar los elementos a trasplantar siguiendo las siguientes etapas adicionales: f) masar el liofilizado de la etapa e) y disolver en ácido acético (0,5N o mayor concentración) a 4 ^e C (±1 ,0 ^e C), hasta obtener una concentración de 20 a 30 mg/ml; g) introducir el producto disuelto de la etapa f) en moldes plásticos estériles de acuerdo al tamaño y forma del implante, h) congelar a una temperatura entre -20 ^e C a -24 ^e C al menos 24 horas; i) liofilizar el producto congelado de la etapa h) y j) desprender el producto de los moldes de plástico usando una espátula para ser almacenada en un lugar seco a temperatura ambiente (20 a 25°C) hasta el momento de su uso (puede ser almacenada por al menos 12 meses).

Los moldes de la etapa g) pueden ser láminas delgadas o gruesas, o conos de variado grosor, o túbulos de variado grosor, u otra forma según convenga al tejido a trasplantar.

Adicionalmente, los moldeados de colágeno esponjoso obtenidos según las etapas f) a la j) se tratan mediante procedimientos propios de entrecruzamiento con material no tóxico (inocuo), controlando la densidad del colágeno moldeado, a través de las siguientes etapas: i. sumergir e incubar el colágeno (moldeados esponjosos) a temperatura ambiente (20 ^e C a 25 ^e C) en una solución a base de 2,3% p/v de N- hidroxisuccinimida (NHS) y 3,83% p/v N-(3Dimetilaminopropil)-N ^' - etilcarbodiimida clorohidrato) (EDC) en un volumen entre 1 y 40 mi de etanol 70%, y posteriormente realizar lavados de este colágeno en agua ultra pura estéril; ¡i. congelar el colágeno a una temperatura entre -50 y -5 °C entre 12 y 36 horas y luego se liofilizan en las mismas condiciones anteriores, lo cual se denominará moldeados tipo esponja por su nueva consistencia, más firme que el gel de la etapa e).

Método de preparación de matriz 3-D de colágeno

Opcionalmente, el colágeno obtenido después de la etapa e), puede ser presentado como una matriz 3-D de colágeno en estado de gel para el cultivo de células con las siguientes etapas adicionales: i) masar el producto liofilizado obtenido de la etapa e) y disolver en ácido acético (0,01 N a 0,05 N) en frío 4 ^e C (±1 ,0 ^e C) hasta obtener una concentración final requerida entre 2,0 mg/ml a 5,0 mg/ml; ii) tomar el producto completamente disuelto de la etapa k) y dializar en cloroformo en una concentración entre 0,5% y 5% para eliminar impurezas, seguido de diálisis en ácido acético diluido (0,01 N a 0,05 N) en frío 4 ^e C (±1 ,0 ^e C); iii) obtener una matriz biológica 3-D de colágeno tipo gel o en estado de gel que proporciona ambiente tridimensional a las células en cultivo; y iv) almacenar el producto en frío sin congelar a temperatura entre 4 ^e C a 10 ^e C.

En un último aspecto, la presente invención se refiere al uso de dicho constructo para evitar el rechazo inmunológico producido durante el trasplante del mismo.

En el caso de que el constructo final sea un biodiente, éste se utiliza para cualquiera de los 32 dientes humanos, o de mascotas o animales con raíz dental. EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1 : Obtención del colágeno de piel de cerdo y fabricación de la matriz 3-D de colágeno i. Esterilización y congelado del tejido: Se usó piel de la mejilla de cabezas de cerdo de 175 a 190 días de edad. La cual, se sumergió durante 3,5 horas en una solución comercial de povidona yodada 10% (Marca: Centrovet) y cepillada por ambas caras cada 30 minutos, en ambiente estéril, y se enjuaga con agua calidad ultra-pura. La tabla 1 y las figuras 3 y 4, muestran los resultados de análisis de efectividad de la povidona yodada (PY) usada en la presente invención, comparada con la efectividad de ácido peracético (AP); demostrando que la povidona es más efectiva, dado que elimina el 100% del crecimiento microbiano a las 3 horas post tratamiento y mantiene la integridad del colágeno obtenido más adelante, mientras que el ácido peracético daña la calidad del colágeno alterando la viscosidad del producto final, de tal manera que no adquiere la consistencia necesaria para ser usado en los implantes. El tejido desinfectado se introduce en bolsas y sella para congelar a -80°C (±2,0 ^e C) en ultracongelador (marca Thermoline).

Tabla 1 . Tratamiento del tejido de cerdo con desinfectantes.

Descongelación y limpieza del tejido: El tejido congelado se pone sobre superficie fría (4°C), en ambiente estéril para retirar el tejido adiposo y el epitelial con la ayuda de un bisturí. La dermis, así obtenida, se cortó en trozos de 1 cm ² aproximadamente, y se molió en 200 ml_ de una solución de 5M acetato de sodio (Marca: JT Baker) con una trituradora de alimentos en pulsos cortos de menos de 5 segundos cada uno para evitar elevación de la temperatura. La eliminación de posibles patógenos en esta etapa se realizó ajusfando el pH de la solución a pH14 con una solución 12 M NaOH por 1 hora y 10 minutos a temperatura ambiente (20 ^e C a 25 ^e C).

Extracción y solubilización de colágeno: La mezcla de tejido molido y desinfectado se lavó 5 veces con 5M acetato de sodio estéril, mediante centrifugación a 9500 rpm por 20 minutos en frío en centrífuga marca Hettich a 4°C. Seguido de 5 lavados con agua ultrapura estéril mediante el mismo método de centrifugación. El sedimento final se extrajo en 2 litros de 0,02 N ácido acético por cada 3,0-3,2 gr de sedimento usando una licuadora de acero inoxidable con pulsos de 45 segundos en condiciones de esterilidad. Seguido de agitación en frío por 50 horas.

Purificación y congelado de colágeno: La solución de colágeno obtenida se limpió de impurezas mediante centrifugación a 9500 rpm por 20 minutos en centrifuga marca Hettich a 4°C y se filtró volúmenes de 100 mi en gasa hidrófila (estéril de uso terapeútico) doblada en 10 pliegues sobre frasco estéril. Estos extractos se congelaron a -20 ^e C por 48 horas para proceder a la etapa de liofilización.

Liofilización: Se liofilizaron volúmenes de 100 mi de extracto congelado a -85 ^e C con presión constante en liofilizador marca Labconco por aproximadamente 48 horas hasta sequedad de las muestras.

Obtención de matriz 3-D de colágeno: Se masó el producto obtenido (colágeno seco) y se disolvió en proporción de 90 mg por 30 mi de 0,02 N ácido acético estéril, a 4 ^e C con agitación ocasional hasta su completa disolución. Esta solución se introdujo en membranas de diálisis ((SnakeSkin Dialysis Tubing, Marca Thermoscientific) y se dializó contra 1 % cloroformo por una hora y luego, contra 0,02 N ácido acético realizando cambios de la solución hasta eliminar el cloroformo. El gel obtenido se retiró de la bolsa de diálisis y se guardó a 4 ^e C en envase estéril.

vi. Prueba de esterilidad y análisis: se tomaron alícuotas del colágeno obtenido en forma gel y se incubaron a 37 ^e C en la incubadora con 5% C0 ₂ por 48 horas para monitorear su esterilidad. También se analizó su composición proteica mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-Page; lo cual, mostró el patrón típico de colágeno tipo-1 . En la figura 6, a concentración de 3,0 mg se distinguen las cadenas α1 , a2 y β; las que se observan con mayor claridad al aumentar la cantidad a 15mg y 30mg del extracto de colágeno obtenido, vii. El colágeno obtenido a una concentración de 3,0 mg/ml (+/-0,1 mg, aproximadamente) se usó para cubrir placas de cultivo celular y para mezclar con solución de células obtenidas desde tejidos frescos dentales u óseos; este colágeno le da un ambiente tridimensional (3-D) a las células en cultivo.

Ejemplo 2: Método de fabricación de los moldeados esponjosos liofilizado seco de colágeno.

La matriz de colágeno esponjosa usada para trasplantes del biodiente o de hueso, o gérmenes de dientes alogénicos se preparó a partir del colágeno liofilizado obtenido según el procedimiento en el ejemplo 1 hasta el punto (v). Se masó un mínimo de 200 mg del colágeno seco, se disolvió en una solución de 10 mL 0,5 N ácido acético y se introdujo con la ayuda de una espátula a moldes plásticos estériles para luego, una vez solidificado, introducir el elemento a trasplantar. El moldeado para constructo de dientes tiene forma de cilindro tapado por uno de sus extremos con paredes de 2 mm de grosor y una profundidad de 2 cm aproximadamente, de tal manera que la pieza dental a trasplantar se introdujo totalmente en su interior. Estos moldeados se congelaron a -20 ^e C por al menos 48 horas y luego, se sometieron al proceso de sublimación del agua mediante liofilización en liofilizador marca labconco.

El entrecruzamiento de las fibras de colágeno de estos moldeados se realizó por seis horas en solución de 70% etanol conteniendo 0,230 gr de NHS y 0,383 gr de EDC a temperatura ambiente (20 ^e C-25°C).

Luego, se enjuagaron por seis horas estos moldeados en agua ultrapura, se congelaron a -20 ^e C y se sometieron al proceso de liofilización en las mismas condiciones anteriormente descritas aquí.

Ejemplo 3: Método de fabricación del biodiente o constructo para trasplantar.

Se obtuvo matrices de dientes humanos (premolar de jóvenes menores de 21 años de edad), se descelularizaron y limpiaron según lo descrito en la presente solicitud, se limpió la cámara pulpar y raíces, se trató por 10 minutos con 17% EDTA y por 1 minuto con ácido cítrico para luego desinfectar con povidona yodada y NaOH y finalmente, después del enjuague se mantuvieron en 70% etanol hasta su uso. Se realizó el cultivo de células madres del ligamento periodontal según descrito anteriormente, específicamente se usó placas desechables de 60 mm de diámetro marca Nunc y el medio de cultivo a-MEM (Invitrogen) con 15% suero fetal bovino (FBS, Invitrogen), sobre una capa de colágeno 3-D preparado de acuerdo a nuestro método descrito aquí. Se esperó llegar a confluencia del 70% aproximadamente, se retiraron los residuos de tejidos de ligamento y se extrajo las células desde el colágeno mediante tratamiento con 3,0 mg/ml colagenasa tipo-1 (Invitrogen) por 5 minutos a 37 ^e C, dispersando con pipeta varias veces, y colectando por centrifugación, 3 veces. Se expandió el cultivo en proporción de 1 :3, en platillos de 100 mm cubiertos de la matriz 3-D de colágeno. La figura 1 , muestra los resultados de la optimización del medio de cultivo usado en nuestros cultivos de células madres del ligamento periodontal, por lo cual, se usó las células cultivadas, congeladas y expandidas hasta el quinto traspaso en este medio. La figura 2, muestra los resultados de la citometría de flujo para las células cultivadas en estas condiciones. Ejemplo de expansión de las células madres del ligamento periodontal cultivado en medio a-MEM directamente sobre platillos de cultivo se muestra en la figura 5 (A); mientras que en la figura 5(B) se muestra un ejemplo de la expansión de estas células en medio 3-D de colágeno usando el mismo medio. La figura 7, muestra corte histológico de la matriz 3-D conteniendo las células madres del ligamento dental humano creciendo en la matriz de colágeno 3-D, mostrando sus núcleos teñidos con el compuesto fluorescente DAPI.

Una vez obtenida la confluencia aproximada del 70% se tomó la lámina de colágeno 3- D conteniendo las células madres del ligamento periodontal y se enrolló sobre la sección radicular de la matriz dental descelularizada, preparada y secada en ambiente estéril por 5 minutos (i), construyendo una matriz tridimensional de cinco capas (al menos) de células sobre esta matriz dental.

Ejemplo 4: Uso del biodiente, resultados obtenidos.

El biodiente construido con matrices dentales de dientes humanos y el colágeno 3-D conteniendo las células madres del ligamento periodontal se introdujo en un moldeado de colágeno entrecruzado según lo descrito aquí y se trasplantó bajo anestesia in vivo a ratones sin inmunosupresión, en regiones tales como, intraperitoneal o en el dorso bajo la piel para incubarlo durante 2 meses. Se realizó un implante por animal completando un total de veinte implantes con los constructos de biodientes humanos con colágeno según lo descrito aquí, sin uso de inmunosupresión. Los animales controles recibieron implantes de constructos humanos con células madres sin colágeno. Los protocolos de uso y cuidado animal fueron aprobado por el Comité Institucional del centro ADG l+D, las cirugías estuvieron a cargo de un veterinario e investigador con más de 30 años de experiencia en estudios experimentales en roedores de laboratorio. Los animales tratados con analgésicos, se les dejó con agua y comida ad libitum y fueron monitoreados las primeras horas para asegurar su bienestar; luego, con observación diaria, y cuidado de rutina hasta el momento en que se los sacrifica sin dolor mediante dislocación cervical.

Luego, se extrajeron los constructos, mediante una pinza. Se fijaron en 4% formaldehido en buffer PBS, durante una semana con agitación suave. Se desmineralizaron los constructos en 10% EDTA hasta obtener consistencia blanda al tacto con pinzas y se incluyeron en parafina para el proceso de histología de rutina con cortes en micrótomo. Los 20 trasplantes de biodientes construidos e implantados con moldeados de colágeno que se mantuvieron en animales sin inmunosupresión mostraron crecimiento del ligamento periodontal altamente adherido a la matriz de la raíz dental, en tanto que los constructos controles sin colágeno no mostraron desarrollo de tejido en su matriz mostrando destrucción y pérdida de las células madres humanas.

La figura 8 muestra un ejemplo del biodiente humano con ligamento periodontal regenerado fuertemente adherido a la matriz del diente, de tal manera que es posible sostenerlo con una pinza al extraerlo del dorso del ratón (fotografía superior); en la fotografía del centro e inferior se muestran cortes histológicos de este diente después de desmineralización, donde se observa la estructura de los túbulos dentinarios de la dentina (D) cortados transversalmente y sagitalmente, con clara presencia de cemento (C) y fibras del ligamento periodontal (PDL) en íntima asociación con la superficie de la dentina. Por otro lado, el mareaje con anticuerpos contra las mitocondrias humanas confirma claramente la presencia de las células humanas diferenciadas a partir de las células madres humanas en el constructo implantado en ratón sin inmunosupresión.