| WO2008105797A2 | 2008-09-04 | |||
| WO2001057081A2 | 2001-08-09 |
MATHILDE VARRET: "A third major locus for autosomal dominant hyperchole- sterolemia maps to 1p34.1-p32", AM. J. HUM. GENET., 31 December 1999 (1999-12-31), pages 1379 - 1387, XP002253512, ISSN: 0002-9297
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| 权利要求书 [权利要求 1] 一种 FH3基因的特异性弓 I物对， 其序列为 SEQ ID NO.1和 SEQ ID N0.2。 [权利要求 2] FH3真核表达载体制备方法， 其通过如下步骤制备， 表达 FH3的细胞 总 RNA的提取、 FH3编码区的克隆、 真核表达载体的构建。 [权利要求 3] 根据权利要求 2所述的 FH3真核表达载体制备方法， 其特征在于， 所 述的表达 FH3的细胞总 RNA的提取、 FH3编码区的克隆、 真核表达 载体的构建， 具体方法如下： ①表达 FH3的细胞总 RNA的提取与逆转录 a) 收集 Jurkat细胞加入 lml Trizol裂解液， 室温下静置 5min。 b) 加入 250 μΐ三氯甲烷， 充分混匀， 室温放置 5 min， 12000 g离心 10 min， 取上清。 c) 加入 500 μΐ异丙醇混匀， 室温静置 10 min， 12000 g离心 10 min。 d) 弃上清， imi ml 75%的乙醇 （DEPC水配制） 漂洗， 7500 rpmi¾ 、5 min° e) 吸取 75%的乙醇， 于超净台晾干， 直到 EP管底部的 RNA变透明， 加入 30μ1 RNase-free ddH20， 所得即为样本总 RNA。 f) 应用 PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒， 将上一 步得到的总 RNA进行反转录反应， 在 200μ1反应管中加入总 RNA Ιμΐ 、 5xPrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) 2μ1、 RNase Free dH20 7 μ1， 混匀后 37°C反应 60 min将 RNA逆转录为 cDNA。 ② FH3真核表达载体的构建 取 1 μΐ cDNA, 加入上述 FH3编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master Mix2 ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min ； 95°C 20 s， 60°C 20 s， 72°C 60 s， 30个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化， 得到 FH3编码区 DNA 用 EcoR I和 Xma I双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 FH3编码区 DNA ， 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase, 4°C连接过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中 。 挑取单克隆置于 LB培养基中振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司进行测序。 将测序正确的菌接种到 15 ml LB培养基 （含 lOO g/ml氨苄青霉素） 中 ， 37°C， 300 rpm培养 16 h， 用 Endo-Free Plasmid Mini Kit II进行抽提 重组质粒 pEGFP-Nl-FH3。 [权利要求 4] 根据权利要求 3所述的一种稳定转染细胞株的方法， 具体包括以下步 骤： ①细胞转染及稳转细胞系的筛选 a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 HAP-s细 胞接种至 6孔板中培养 24h， 待细胞长至 80% -90%融合吋进行转染。 b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 LipofeCtamine 2000， 取 8ul试 剂用 400ul无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。 c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-FH3各 20ug， 分别 与稀释的 Lipofectamine 2000， 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便 允许复合物的形成。 d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 HAP-s细胞和 培养基的孔中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。 e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基 f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418 进行培养， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 400μ§/ ml G418的选择培养液培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳 定表达 FH3的 HAP-s细胞株。 ②稳转细胞系中 FH3的表达鉴定 收集稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株、 同吋以未转染 HAP-s细胞、 pEGF P-N1空质粒转染的 HAP-s细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白 质。 从 mRNA水平检测 FH3的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录 得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过引物 F2和 R2进 行荧光定量 PCR检测 FH3的表达水平。 [权利要求 5] —种稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株， 其由权利要求 3或 4制备得到。 [权利要求 6] 权利要求 1的引物在制备检测人 FH3基因试剂盒中的应用。 [权利要求 7] 权利要求 2-3任意一项所述的载体或权利要求 6的细胞株在制备人 FH3 蛋白中的应用。 |
技术领域
[0001] 本发明涉及一种真核表达载体的构建及其利用 该载体制备稳定表达细胞株。 具 体而言， 本发明将 FH3全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的 pEGFP-Nl真核表达 载体中， 并用构建的真核表达载体转染 HAP-s细胞， 建立 FH3稳定过表达的 HAP- s细胞系。
背景技术
[0002] 人体内 LDL-C主要是在细胞溶质中， 通过与 LDLR的结合来完成代谢。 LDL-C 的多少则主要取决于血浆低密度脂蛋白胆固醇 受体 （LDLR) 的循环。 人 FH3蛋 白可以直接增加细胞核或者溶酶体内 LDLR的降解， 减少 LDLR的量， 从而增加 L DL-C的循环量。
技术问题
[0003] FH3基因属于前蛋白转化酶 (PC)家族， 可以直接增加细胞核或者溶酶体内
LDLR的降解， 减少 LDLR的量， 从而增加 LDL-C的循环量； FH3亦可以减少进 入细胞溶质内 LDLR的量， 从而间接增加 LDL-C的血浆浓度， 可作为高胆固醇 相关的心脑血管疾病的治疗靶点， 需做大量研究方可实现临床转化， 但现有技 术中缺乏促进 FH3基因表达的载体和 FH3高表达的细胞系， 对相关研究的进展造 成了一定的阻碍。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明根据 GenBank中 FH3的 mRNA序列， 设计包括整个 FH3编码区的上、 下游 弓 I物， 上游引物 F1的序列见序列表 SEQ NO.l , F1的 5'端引入 EcoR I酶切位点， 下游引物 R1的序列见 SEQ N0. 2, R1的 5'引入 Xma l酶切位点。 同吋设计用于细 胞转染后 RT-PCR鉴定的 FH3片段扩增引物 F2其序列见序列表 SEQ NO. 3， R2序 列见序列表 SEQ NO. 4。
[0005] 本发明构建了 FH3真核表达载体， 通过以下步骤制备： 表达 FH3的细胞总 RNA 的提取、 FH3编码区的克隆、 真核表达载体的构建。
[0006] ①表达 FH3的细胞总 RNA的提取与逆转录：
[0007] a) 收集 Jurkat细胞加入 lml Trizol裂解液， 室温下静置 5min。
[0008] b) 加入 250 μΐ三氯甲烷， 充分混匀， 室温放置 5 min， 12000 g离心 10 min， 取 上清。
[0009] c) 加入 500 μΐ异丙醇混匀， 室温静置 10 min， 12000 g离心 10 min。
[0010] d) 弃上清， imi ml 7 5%的乙醇 （DEPC水配制） 漂洗， 7 500 rpm离心 5 min。
[0011] e) 吸取 75%的乙醇， 于超净台晾干， 直到 EP管底部的 RNA变透明， 加入 30μ1
RNase-free ddH20, 所得即为样本总 RNA。
[0012] f) 应用 PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒， 将上一步得到的 总 RNA进行反转录反应， 在 200μ1反应管中加入总 RNA 1μ1、 5xPrimeScript RT
Master Mix (Perfect Real Time) 2μ1、 RNase Free dH20 7 μΐ , 混匀后 37°C反应 60 min将 RNA逆转录为 cDNA。
[0013] ② FH3真核表达载体的构建
[0014] 取 1 μΐ cDNA， 加入上述 FH3编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master
Mix2 ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min; 95°C 20 s， 60°C 20 s, 72°C 60 s, 30个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并 切胶回收纯化， 得到 FH3编码区 DNA。
[0015] 用 EcoR I和 Xma I双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 FH3编码区 DNA， 将酶切 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase， 4°C连接 过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中。 挑取单克隆置于 LB培养基中 振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司进行
[0016] 本发明通过将上述得到的 pEGFP-Nl-FH3真核表达载体转入 HAP-s细胞中， 得 到稳定表达 FH3的细胞株， 转染条件及稳定细胞株的筛选和鉴定方法如下 ： [0017] ①细胞转染及稳转细胞系的筛选
[0018] a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 HAP-s细胞接种至 6 孔板中培养 24h， 待细胞长至 80% -90%融合吋进行转染。 [0019] b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000， 取 8ul试剂用 400ul 无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。
[0020] c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-FH3各 20ug， 分别与稀释的
Lipofectamine 2000, 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便允许复合物的形成
[0021] d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 HAP-s细胞和培养基的 孔中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
[0022] e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基。
[0023] f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418进行培养
， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 40(Vg/ml G418的选择培养液 培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株。
[0024] ②稳转细胞系中 FH3的表达鉴定
[0025] 收集稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株、 同吋以未转染 HAP-s细胞、 pEGFP-Nl空质 粒转染的 HAP-s细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白质。 从 mRNA水平检 测 FH3的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过弓 I物 F2和 R2进行荧光定量 PCR检测 FH3的表达水平。 发明的有益效果
对附图的简要说明
附图说明
[0026] 图 1为 G418筛选细胞后荧光定量 PCR检测结果示意图。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0027] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步 的说明。
[0028] 实施例一 FH3基因引物的设计
[0029] 本发明根据 GenBank中 FH3的 mRNA序列， 设计包括整个 FH3编码区的上、 下游 弓 I物， 上游引物 F1的序列见序列表 SEQ NO.l , F1的 5'端引入 EcoR I酶切位点， 下游引物 R1的序列见 SEQ N0. 2, R1的 5'引入 Xma l酶切位点。 同吋设计用于细 胞转染后 RT-PCR鉴定的 FH3片段扩增引物 F2其序列见序列表 SEQ NO. 3， R2序 列见序列表 SEQ NO. 4。
[0030] 实施例二 FH3真核表达载体的构建
[0031] 收集 Jurkat细胞， 使用 Trizol提取总 RNA， 并逆转录为 cDNA。 取 l l cDNA, 加入 FH3编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master Mix2
ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min; 95°C 20 s， 60°C 20 s， 72°C 60 s , 30个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切 胶回收纯化， 得到 FH3编码区 DNA。
[0032] 用 EcoR I和 Xma I双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 FH3编码区 DNA， 将酶切 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase， 4°C连接 过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中。 挑取单克隆置于 LB培养基中 振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司进行 测序。 测序结果同样表明该重组质粒含有完整的 FH3基因序列。
[0033] 将测序正确的菌接种到 15 ml LB培养基 （含 100
g/ml氨苄青霉素） 中， 37°C， 300 rpm培养 16 h， 用 Endo-Free Plasmid Mini Kit II 进行抽提重组质粒 pEGFP-Nl-FH3。
[0034] 实施例三 细胞转染及稳转细胞系的筛选
[0035] a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 HAP-s细胞接种至 6 孔板中培养 24h， 待细胞长至 80%-90%融合吋进行转染。
[0036] b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000， 取 8ul试剂用 400ul 无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。
[0037] c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-FH3各 20ug， 分别与稀释的
Lipofectamine 2000, 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便允许复合物的形成
[0038] d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 HAP-s细胞和培养基的 孔中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
[0039] e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基。
[0040] f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418进行培养 ， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 40(Vg/ml G418的选择培养液 培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株。
[0041] 实施例四 稳转细胞系中 FH3的表达鉴定
[0042] 收集稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株、 同吋以未转染 HAP-s细胞、 pEGFP-Nl空质 粒转染的 HAP-s细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白质。 从 mRNA水平检 测 FH3的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过引物 F2和 R2进行荧光定量 PCR检测 FH3的表达水平， 结 果如图 1所示， 可以看到， 稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株的 FH3基因表达量有 70倍 以上的升高， 而 pEGFP-Nl空质粒转染的 HAP-s细胞 FH3基因表达量与正常 HAP-s 细胞相比基本没有变化， 说明本发明提供的 FH3基因 cDNA序列成功插入至 pEGF P-N1表达载体中， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 FH3基因高表达。