发明名称：一种毕赤酵母中共表达血红蛋白 VHb和纤维素酶蛋白的 构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种共表达透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)和纤维素酶蛋白的重组毕赤 酵母系统的构建， 属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 纤维素酶是一类多组分酶的总称， 能够将难以被生物利用的纤维素水解为利于 被生物利用的葡萄糖， 因此被认为是潜力巨大的酶制剂之一。 纤维素酶属于糖 苷水解酶， 能够降解纤维素的纤维素酶系至少包括三类组 分， 分别为葡聚糖外 切酶 (CBH)， 葡聚糖内切酶 (EG)以及 β-葡萄糖苷酶 (BG)。 其中 EG作用于纤维素非 结晶区， 水解 β-1,4糖苷键， 可将线性纤维素多聚物截断生成大量纤维素小 分子 ； CBH水解 1,4-β-ϋ-糖苷键， 作用于线性纤维素多聚物末端， 生成纤维二糖分子 ； BG则将纤维二糖水解成为葡萄糖。 通过纤维素酶复合酶组分相互协同作用， 可以将地球上最丰富的生物高聚物 _纤维素， 转化为微生物可以轻易利用的葡 萄糖， 通过发酵产生生物燃料， 用以缓解目前能源短缺问题。

[0003] 近些年来， 异源表达纤维素酶基因获得单酶组分是研究热 点。 Pichia pastoris可 以实现翻译后修饰作用， 如糖基化、 二硫键形成， 使蛋白可以进行正确折叠， 并获得有活性的目标蛋白， 另外， 毕赤酵母并不产生内源性木质纤维素酶组分 ， 且胞外蛋白成分并不复杂， 重组毕赤酵母菌发酵上清液甚至可以不经过纯 化 直接作为单酶制剂进行使用， 因此， 以 Pichia pastoris作为首选宿主菌， 实现纤维 素酶组分异源表达以获得高浓度和高纯度的纤 维素酶蛋白组分， 已成为研究热 点。

[0004] 资料表明， 透明颤菌血红蛋白 (VHb)产自严格好氧细菌透明颤菌， VHb是在透 明颤菌处于缺氧状态吋的一种自动急救蛋白。 关于其功能的假说表明 VHb能在低 氧环境中捕获氧气， 供给与呼吸作用相关的氧化酶， 从而提高呼吸效率并促进 A TP的生成。 以毕赤酵母作为宿主菌实现纤维素酶蛋白组分 异源表达， 其工业化 的前提是必须在氧气供应不足的高密度培养方 面具有优质潜力， 通过在毕赤酵 母中实现 VHb与纤维素酶蛋白的共表达， 可以提高重组毕赤酵母的产酶水平以及 工业化应用潜力。

技术问题

[0005] 纤维素酶来源广泛， 产生纤维素酶的生物包括昆虫、 软体动物、 原生动物、 细 菌和真菌。 然而， 这些自产酶天生具有一定的配比缺陷， 就目前工业应用最为 广泛的产纤维素酶真菌里氏木霉 (Trichoderma reesei)而言， 其纤维素酶系中缺乏 外切酶 CBH II和 β-葡萄糖苷酶 BG， 导致其纤维素酶系酶解效率低下。 另外， 无 论是来源于生物的自产酶系还是人工制成的商 业纤维素酶系， 其中所含蛋白多 达八十余种， 甚至更多， 导致核心酶组分比酶活降低， 这同样也是纤维素酶系 酶解效率低下的原因。 更为重要的是， 不同木质纤维素材料中纤维素、 半纤维 素以及木质素的比例有显著差异， 导致同一类商业纤维素酶制剂或自产酶并不 能发挥最佳的酶解效果。 所以， 优化定制纤维素酶， 使各组分达到最佳配比， 才能在最少酶用量吋获得最优的水解效果。 因此， 为了优化定制纤维素酶， 获 得纤维素酶单酶组分十分关键。

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 本发明的目的在于构建一种共表达透明颤菌血 红蛋白基因和纤维素酶蛋白基因 的毕赤酵母。

[0007] 本发明提供的共表达 VHb蛋白和葡聚糖内切酶 II的毕赤酵母系统具体步骤如下 [0008] 1、 EG II密码子偏向性优化：

[0009] 本发明实现了 EG II密码子偏向性优化， 其原始密码子序列如下：

[0010] SEQ ID NO. 1

[0011] 1 ATGAACAAGT CCGTGGCTCC ATTGCTGCTT GCAGCGTCCA

TACTATATGG CGGCGCCGTC

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[0031] 1201 AGTGGTAACT CATGGACGGA CACATCCTTG GTCAGCTCGT

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[0032] 密码子优化前 EG II氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示。

[0033] SEQ ID NO. 2

[0034] 1 MNKSVAPLLL AASILYGGAV AQQTVWGQCG GIGWSGPTNC

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[0035] 61 TTITTSTRPP SGPTTTTRAT STSSSTPPTS SGVRFAGVNI AGFDFGCTTD

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[0040] 361 QDMCQQIQYL NQNSDVYLGY VGWGAGSFDS TYVLTETPTG

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[0041] 本发明利用 Gene Designer (DNA2.0, Menlo Park, CA, USA)实现对 SEQ ID NO. 1 所示的 EG II核苷酸序列密码子偏向性优化， 优化后核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 。

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TGACTGAAAC TCCAACTGGT

[0063] 1201 TCCGGTAACT CCTGGACTGA CACTTCCTTG GTTTCTTCCT

GTTTGGCTAG AAAGTAA

[0064] 经过密码子优化后， EG II氨基酸序列与 SEQ ID NO. 2相同。

[0065] 2、 构建表达载体 pPIC9K-eg2 _:

[0066] 以质粒 pPIC9K作为载体， 将优化后的 EG II基因插入启动子 AOX1下游， 5'端酶 切位点为 EcoR I, 3'端酶切位点为 Not I， 构建 pPIC9K-eg2表达载体。

[0067] 3、 获取重组菌株：

[0068] 以 Sac l作为 _P PIC9K-eg2表达载体线性化位点， 实现表达载体线性化， 通过电转 化转入毕赤酵母。

[0069] 4、 获得 vgb基因：

[0070] 从 NCBI中获取透明颤菌血红蛋白核苷酸序列 (GenBank Accession No.

M30794.1) , 在 5'端添加 EcoR I酶切位点， 3'端添加 Not I酶切位点， 通过人工合 成获得目的基因。

[0071] 5、 构建表达载体 pPICZaA-vgb: [0072] 以质粒 pPICZotA作为载体， 将 vgb基因插入启动子 AOX1下游， 5'端酶切位点为

EcoR I, 3'端酶切位点为 Not I， 构建 pPICZaA-vgb表达载体。

[0073] 6、 获取共表达重组菌株：

[0074] 以 Sac l作为 pPICZotA-vgb表达载体线性化位点， 实现表达载体线性化， 通过电 转化转入已含有 eg2基因的重组毕赤酵母。

[0075] 7、 重组 VHb蛋白活性检测：

[0076] 利用 CO差光谱检测方法检测重组毕赤酵母是否分泌� ��活性的 VHb蛋白。

[0077] 8、 发酵产酶以及产酶水平比较：

[0078] 通过摇瓶发酵产酶， 比较 EG II重组菌株与 EG II和 VHb共表达菌株的产酶水 平。

发明的有益效果

有益效果

[0079] 本发明有益效果：

[0080] 1、 本发明实现了里氏木霉葡聚糖内切酶 II (EG II)基因密码子偏向性优化， 偏 向对象为毕赤酵母菌， 优化过程中降低了 GC含量， 由 55.9 %降低为 46.2 %， 提 高重组毕赤酵母菌表达效率。

[0081] 2、 本发明对里氏木霉葡聚糖内切酶 II (EG II)基因密码子偏向性优化过程中， 禾 1J用 RNA二级结构折叠软件 RNAstmcture对优化后的核苷酸序列实现二级结构� �� 叠， 并调整碱基序列， 使起始密码子端碱基呈幵环结构， 利于核糖体结合， 提 高重组毕赤酵母菌表达效率。

[0082] 3、 本发明实现了纤维素酶蛋白与透明颤菌血红蛋 白 (VHb)在毕赤酵母中共表达

， 提高了重组毕赤酵母菌在低氧高密度发酵过程 中的产酶效率， 提升重组毕赤 酵母菌的工业生产潜力。

对附图的简要说明

附图说明

[0083] 图 1 : 实验思路与方案；

[0084] 图 2: eg2核苷酸序列优化前后对比；

[0085] 图 3: eg2氨基酸序列优化前后对比； [0086] 图 4: _P PIC9K-eg2表达载体图谱；

[0087] 图 5: 1%核酸胶电泳：

[0088] 1： Sac l单酶切表达载体 pPIC9K-eg2，

[0089] 2： EcoR I与 Not l双酶切表达载体 pPIC9K-eg2;

[0090] 图 6: 高产重组 EG II蛋白菌株筛选；

[0091] 图 7: pPICZaA-vgb表达载体图谱；

[0092] 图 8: 1%核酸胶电泳：

[0093] 1： Sac l单酶切表达载体 pPICZaA-vgb，

[0094] 2： EcoR I与 Not l双酶切表达载体 pPICZaA-vgb;

[0095] pPICZaA-vgb构建成功， 酶切后核酸电泳图

[0096] 图 9: 高产重组 EG II蛋白共表达菌株筛选

[0097] 图 10: 菌落 PCR验证共表达菌株：

[0098] P: 毕赤酵母原菌，

[0099] E: EG II重组毕赤酵母菌，

[0100] VE1, VE25, VE31等： EG II和 VHb共表达菌株；

[0101] 图 11 : 全波长扫描 CO气体处理后的 EG II和 VHb共表达菌株发酵上清液；

[0102] 图 12: EG II重组菌株与 EG II和 VHb共表达菌株生长与产酶能力比较：

[0103] A: 菌株产酶能力比较，

[0104] B: 菌株生长能力比较。

本发明的实施方式

[0105] 本发明构建了一种共表达透明颤菌血红蛋白基 因和里氏木霉葡聚糖内切酶 II基 因的毕赤酵母， 以提高重组菌株氧气利用效率， 从而提高其菌浓以及产酶能力 ， 构建思路如图 1所示。

[0106] 实施例 1 : 里氏木霉葡聚糖内切酶 II (EG II)基因密码子优化与表达载体构建。

[0107] 1、 本发明利用 Gene Designer (DNA2.0, Menlo Park, CA, USA)实现如 SEQ ID

NO. 1所示 EG II (GenBank Accession No. DQ178347.1)核苷酸序列密码子偏向性优 化， 优化后核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3所示。 通过密码子优化后的氨基酸序列与 原始氨基酸序列一致， 如 SEQ ID NO. 2所示。 以1¾1^& &810]"18 08115作为宿主， 通过密码子偏向性优化后核苷酸序列与原始核 苷酸序列对比见图 2， 通过密码子 偏向性优化后氨基酸序列与原始氨基酸序列对 比见图 3。

[0108] 2、 以 5'端酶切位点为 EcoR I, 3'端酶切位点为 Not

I作为双酶切位点， 插入 pPIC9K质粒载体 AOX1启动子下游， 构建表达载体 pPIC9 K-eg2, 表达载体图谱见图 4。 并通过双酶切对表达载体进行验证， 以确定表达 载体 _P PIC9K-eg2构建成功， 酶切后核酸电泳图见图 5。

[0109] 实施例 2: 线性化表达载体并进行电转化以及筛选高产菌 株。

[0110] 1、 以 Sac l作为 _P PIC9K-eg2表达载体线性化位点， 实现表达载体线性化， 核酸 电泳对线性化后的质粒进行验证， 见图 5。 通过电转化转入 Pichia pastori _S GS115 ， 获得重组菌株， 利用遗传霉素 G-418浓度梯度筛选多拷贝转化子， 将能在高浓 度抗性平板上正常生长的菌落通过摇瓶发酵获 得高产菌株， 于 120 h处利用 DNS 法测定发酵上清液 CMC酶活， 见图 6， 其中， 1个单位酶活单位定义为在 50 oC水 浴条件下， 1分钟内能转化 1 μηιοΐ底物的酶量。

[0111] 实施例 3: 透明颤菌血红蛋白 (VHb)基因的获取与表达载体构建。

[0112] 1、 从 NCBI中获取透明颤菌血红蛋白基因 (GenBank Accession No. M30794.1) , 在 5'端添加 EcoR I酶切位点， 3'端添加 Not I酶切位点， 通过人工合成获得目的基 因。

[0113] 2、 以 5'端酶切位点为 EcoR I, 3'端酶切位点为 Not

I作为双酶切位点， 插入 pPICZotA质粒载体 AOX1启动子下游， 构建表达载体 pPI

CZaA-vgb, 表达载体图谱见图 7。 并通过双酶切对表达载体进行验证， 以确定表 达载体 pPICZotA-vgb构建成功， 酶切后核酸电泳图见图 8。

[0114] 实施例 4: 线性化表达载体 pPICZotA-vgb并进行电转化以及筛选共表达高产菌 株。

[0115] 1、 以 Sac l作为 pPICZotA-vgb表达载体线性化位点， 实现表达载体线性化， 核 酸电泳对线性化后的质粒进行验证， 见图 8。 通过电转化转入含有 eg2基因的重组 Pichia pastoris GS115 , 获得共表达重组菌株， 利用抗生素 Zeocin浓度梯度筛选多 拷贝转化子， 将能在高浓度抗性平板上正常生长的菌落通过 摇瓶发酵获得高产 菌株， 于 72 h取样并利用 DNS法测定发酵上清液 CMC酶活， 见图 9。 另外， 对这 些菌株进行菌落 PCR， 用以验证 vgb基因与 eg2基因共同存在于毕赤酵母宿主染色 体中， 结果如图 10所示。

[0116] 实施例 5: 重组 VHb蛋白活性检测。

[0117] CO与 VHb蛋白能够发生不可逆的结合， 形成稳定的卟啉环结构， 这种结构在 特定波长下具有吸收峰， 因此可以利用此方法对重组 VHb蛋白进行检测。

[0118] 将 EG II重组菌株与 EG II和 VHb共表达菌株分别接入发酵培养基， 发酵培养 120 h后， 取发酵液上清， 用过量 Na2S204 (保险粉） 作为还原剂处理发酵液 10 min 后， 将 CO通入发酵液中 3 min。 以 EG II重组菌株发酵上清液作为空白对照， 利用 日立 U3900分光光度计进行全波长扫描， 波长范围 300至 500 nm。 结果如图 11所 示。

[0119] 实施例 6: EG II重组菌株与 EG II和 VHb共表达菌株的产酶水平比较。

[0120] 1、 以 BMMY作为产酶培养基， 以甲醇作为诱导剂， 以甲醇添加量 1.5%实现产 酶， 取 72 h、 96 h与 120 h样品进行酶活测定以及菌浓测定， 对 EG

II重组菌株与 EG

II和 VHb共表达菌株从生物量和酶活力方面进行比较 ， 结果如图 12所示。

[0121]

[0122]

[0123] <110>江南大学

[0124] <120>—种毕赤酵母中共表达血红蛋白 VHb和纤维素酶蛋白的构建方法

[0125] <160>3

[0126]

[0127] <210>1

[0128] <211>1257

[0129] <212>DNA

[0130] <213>里氏木霉

[0131]

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