Die Erfindung bezieht sich auf eine kontinuierlich arbeitende Trennanlage, bei welcher das Trennmaterial unter einer Aufgabestelle für die Probe vorbeibewegt und über Auffangorgane für durch das Material hindurchtretende Flüssigkeit hinweggeführt wird.

Bei einer bekannten Ausbildung dieser Art handelt es sich um eine kontinuierliche Flüssigkeitschromatographie, bei welcher das Bett zwischen zwei Zylindern eingebracht ist, die fest mit einer Platte verbunden sind, welche den Boden der Chromatogaphiesäule bildet. Diese Platte weist im Bereich des Ringraumes Öffnungen auf, durch welche das austretende Material gezielt abgeführt werden kann. Diese bekannte Anlage hat den Nachteil, daß mit dieser Anlage nur solche Proben verarbeitet werden können, die frei von Feststoffen sind, da es sonst zu einem Verlegen des Bettes bzw. der Auslauföffnungen kommt.

Derzeit erfolgt die Aufarbeitung von Fermentationsbrühen (Mikroorganismen, tierische oder humane Zellen, Pflanzenextrakte) in mehreren Schritten. Zunächst wird durch Zentrifugieren oder Mikrofiltration die Kulturbrühe von den Zellen oder Zellbruchstücken geklärt. Der Kulturüberstand wird dann durch eine Serie von Aufarbeitungsschritten weiter verarbeitet, welche die Präzipitation, Ultrafiltration und verschiedene Chromatographieschritte, wie Hydrophobie Interaction Chromatography (HIC), Ion Exchange Chromatography (IEC), Affinity Chromatography, Size Exclusion Chromatography, Hydroxyapatit Chromatography usw. Tierische und menschliche Seren werden nach dem Auftauen geklärt, d. h. das

Kryopräzipitat wird abgetrennt und danach wird durch Präzipitation mit Ethanol, Rivanol oder Caprylsäure und einer Serie von Chromatographieschritten das gewünschte Biologikum gereinigt. Pflanzenextrakte werden auf ähnliche Weise behandelt, jedoch mit der Ausnahme, daß dem Reinigungsverfahren ein oder mehrere Extraktionschritte vorgeschaltet sind.

Der Nachteil dieser bekannten Verfahren liegt darin, daß zwar die Klärschritte kontinuierlich durchgeführt werden können, daß aber die chromatographischen Schritte dann in der Regel nur chargenweise ausgeführt werden, bzw. daß die chromatographischen Techniken sehr anfällig für teilchenförmige Bestandteile der Prozeßlösungen sind, was bedingt, daß diese Prozeßlösung sehr sorgfältig geklärt werden müssen, da ansonsten sofort das Fouling und als Konsequenz daraus ein Druckanstieg auftritt. Die Lebensdauer des Bettes wird dadurch stark verkürzt bzw. im Extremfall sind derartige Fermentationslösungen auf diese Art gar nicht verarbeitbar. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine kontinuierliche Trennanlage zu schaffen, mit welcher ohne Schwierigkeiten auch solche Lösungen verarbeitet werden können, die Feststoffpartikel enthalten.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß das Trennmaterial durch ein endloses Gewebeband gebildet ist, das über wenigstens zwei Umlenkwalzen geführt ist, wobei die Aufgebestelle für die Probe, das Elutionsmittel und eventuell Waschmittel oberhalb des oberen Trums des Bandes und die Auffangorgane für das getrennte Abführen der Fraktionen unterhalb des oberen Trums angeordnet sind. Dadurch wird erreicht, daß die Feststoffteilchen an der Oberfläche des Gewebebandes zurückgehalten werden, wogegen die mit den aufzutrennenden Teilchen beladene Lösung durch das Gewebeband hindurchsickert und dann je nach Grad des Festhaltens der einzelnen Teilchen an unterschiedlichen Stellen unterhalb des Bandes aufgefangen bzw. mit der entsprechenden Elutionslösung ausgewaschen werden kann.

Vorteilhalfterweise können auf dem Gewebeband Liganden zur spezifischen Bindung des gewünschten Produktes immobilisiert sein, wodurch erreicht wird, daß die Trennwirkung des Bandes den jeweiligen Bedürfnissen angepaßt ist. Das untere Trum des Gewebebandes kann unter Düsen zur Beaufschlagung mit Waschflüssigkeit hindurchgeführt sein, wodurch in der Gegenrichtung zum Durchströmen des Bandes durch die Prozeßlösung nun das Band durch eine Waschlösung durchströmt ist, durch welche dann die festen Partikel, die an der Oberfläche des Gewebebandes

zurückgehalten sind, abgewaschen werden. Zum gleichen Zweck kann das Band durch ein Becken mit Waschflüssigkeit hindurchgeführt sein. Um zu verhindern, daß die auf das Band aufgegebene Prozeßflüssigkeit seitlich von dem Gewebeband abfließt, bzw. durch die Wasch- und/oder Elutionsflüssigkeit abgewaschen wird, kann das Band an den Seitenrändern mit einem Wulst versehen sein, wodurch die aufgegebene Flüssigkeit an einem seitlichen Abrinnen gehindert ist. Dabei kann der Wulst durch allseitiges Einschmelzen des Randes des Bandes in ein flexibles Material gebildet sein, wodurch das Band seitlich abgeschlossen ist und damit verhindert wird, daß im Gewebeinneren Material seitlich aus dem Band herausgeführt wird. Zur Sicherung eines gezielten Vorschubes des Bandes kann der Wulst mit einer längs verlaufenden Lochreihe zum Eingriff mit Vorsprünge an der Transportwalze versehen sein, wodurch ein Durchrutschen des Bandes auf der Transportwalze verhindert ist. Zur gleichmäßigen Beaufschlagung des Bandes über die gesamte Breite können oberhalb des oberen Trums hintereinander mehrere quer zur Vorschubrichtung des Bandes verlaufende Aufgabetröge vorgesehen sein, welche den jeweiligen Materialien entsprechend mit Equilibrierungslösung, Beladungslösung, Waschlösung, Elutionslösung und/oder Regerationslösung befüllt sind. Die Auffangeinrichtung unterhalb des oberen Trums kann durch eine Anzahl von längsseitig aneinandergereihten Rinnen gebildet sein, von welchen eine Seite offen ist und an der die Ausläufe zu Sammelbehältern angeschlossen sind. Damit kann eine gezielte Trennung der aus der Unterseite des Bandes austretenden Fraktionen erzielt werden, wobei je nach Durchtrittsgeschwindigkeit bzw. Art des zu trennenden Materials die einzelnen Rinnen gruppenförmig zusammengeschaltet werden können, d. h., daß mehrere nebeneinander liegende Rinnen in ein und denselben Sammelbehälter einmünden. Zu einer noch genaueren Einstellung kann die Auffangeinrichtung in Vorschubrichtung des Bandes verschieb- und festlegbar sein.

In der Zeichnung ist ein Ausführunsbeispiel des Erfindungsgegenstandes dargestellt.

Fig. 1 zeigt schaubildlich eine erste Ausführungsvariante. Fig. 2 gibt in analoger Darstellung eine zweite Ausführungsvariante wieder.

Fig. 3 ist ein Vertikalschnitt durch das Band im Bereich der Umlenkwalzen.

Fig. 4 gibt schematisch den Trennablauf im Band wieder.

Beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 ist ein Trägerband 1 um Umlenkwalzen

2, 3 geführt. Oberhalb des als Trennorgan wirkenden Trägerbandes sind Aufgabetröge 4, 5, 6, 7, 8 angeordnet, wobei deren Zahl und Anordnung in

Abhängigkeit von dem aufzutrennenden Material variiert werden kann. Unterhalb des oberen Trums des Bandes 1 ist eine Auffangeinrichtung 9 vorgesehen, welche im vorliegenden Fall durch V-förmigen Querschnitt aufweisende Rinnen gebildet ist, wobei die Rinnenwandungen entlang der Oberkante zu einer scharfkantigen Verbindungsstelle vereinigt sind. Der Boden der Auffangeinrichtung, also der

V-förmigen Rinnen, ist gruppenweise zusammengefaßt und führt zu Auffanggefäßen

10 - 14, wobei das Zusammenfassen durch die Linien 10', 11 ' , 12', 13' und 14' angedeutet ist. Auch hinsichtlich der Auffanggefäße und der entsprechenden

Einrichtungen 10' - 14' gilt das zu den Aufgabeträgen Gesagte, nämlich daß sich die Zahl und Anordnung derselben in Abhängigkeit von dem aufzutrennenden Material ändern kann.

Oberhalb des unteren Trums des Bandes 1 sind Waschdüsen 15 vorgesehen, mittels welchen Waschflüssigkeit von der Innenseite her auf das Trägerband 1 aufgesprüht wird, wodurch die am Trägerband anhaftenden festen Teilchen in einen Auffangtrog 16 eingeschwemmt werden können.

Beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2 sind gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen versehen. Das Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2 unterscheidet sich von jenem gemäß Fig. 1 dadurch, daß anstelle der Waschdüsen das Trägerband 1 über Umlenkwalzen 17, 18 und 19, 20 geführt ist, wobei zwischen diesen Walzenpaaren das Trägerband 1 frei durchhängt und durch im Auffangtrog 16 vorgesehene Flüssigkeit hindurchgeführt wird, um solcherart feste Teilchen von dem Trägerband 1 abzulösen.

Das Band 1 ist, wie aus Fig. 3 ersichtlich, an seinem Rand mit Randwülsten 21 versehen, welche die Seitenkanten des Bandes 1 umschließen. Diese Randwülste dienen dabei einerseits dazu, das Band von den Umlenkwalzen 2, 3 abgehoben zu

halten und anderseits vor allem auch dazu, auf das Trägerband 1 aufgegebene Flüssigkeit an einem seitlichen Herabrinnen zu hindern, wobei zudem verhindert wird, daß aufgrund der Kapillarwirkung im Trägerband aufgegebene Flüssigkeit seitlich über die Kanten herausrinnen kann. Die zugehörige Umlenkwalze, in Fig. 3 die Umlenkwalze 3, ist spulenartig ausgebildet, d.h., daß sie zwischen den Rändern, auf welchen die Wülste 21 laufen, eine Eintiefung aufweist, sodaß das Band 1 auch im Bereich der Umlenkwalzen nach unten zu völlig frei ist.

Das Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 4 zeigt schematisch den Verfahrensablauf im Trägerband. Es wurden dabei durch die Kreise am Trägerband jene Stellen aufgezeigt, in welchen die entsprechenden Schritte gesetzt werden. Beim Kreis Nr. 23 wird das zu trennende Gemisch aufgegeben, u.zw. derart, daß die zu trennenden Teilchen, wie im obersten Bereich dargestellt wird, in einem Gemisch vorliegen. Im Mittelbereich, der dem Trägerband entspricht, werden vorbestimmte Teilchen festgehalten, u.zw. im vorliegenden Fall entweder durch an dem Trägerband vorgesehene Liganden oder aber auch durch die entsprechende Adsorptionswirkung des Bandes. Jene Teilchen, die nicht festgehalten werden, in Punkt 23 die durch kleine Kreise wiedergegebenen Teilchen, gehen durch das Band durch und werden in der Auffangeinrichtung 9 gesammelt und über die Zusammenführungen 10' dem Auffangkolben 10 zugeführt. Im Punkt 24 sind die ersten Teilchen bereits abgegeben und durch Aufgabe von

Elutionsflüssigkeit im Band festgehaltene Teilchen, vorliegend durch kleine Quadrate gekennzeichnet, aus dem Band herausgelöst. Diese Teilchen werden dann wieder über die Auffangeinrichtung 9 und die entsprechende gruppenweise Zusammenführung in die zugehörigen Auffanggefäße geführt. In der letzten Stufe, also im Bereich des Kreises 25, wird dann durch Aufgabe einer weiteren Elutions- oder Waschflüssigkeit der restliche Teil ausgewaschen, welcher dann wieder über die Auffangeinrichtung 9, gegebenenfalls über die gruppenweise Zusammenführung 14' , in das Auffanggefäß 14 eingebracht werden.

Am Retourweg, also im Bereich des unteren Trums, wird über die Waschdüsen 15 Flüssigkeit von unten aufgespritzt, die noch vorhandene Teilchen vom Trägerband lösen und in den darunter befindlichen Auffangtrog 16 einspülen.

Die Wirkungsweise der vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Einrichtung wird nachstehend anhand der Beispiele näher erläutert.

Verfahren zur Gewinnung von Reinprodukten aus Lösungen

Auf das inerte Gewebe des Trägerbandes 1, wie zum Beispiel Cellulose, wird ein biospezifischer Ligand gebunden. Das Gewebe wird in Form des beschriebenen Endlosbandes 1 auf mindestens zwei rotierende Walzen 2, 3 aufgebracht. Über Düsen oder andere Auftragevorrichtungen 4 - 8 wird die zu reinigende Kulturbrühe oder der Extrakt aufgebracht und kann das sich weiter drehende Band durchdringen. Dabei binden die gewünschten Moleküle, die Verunreinigungen und das Lösungsmittel, in den meisten Fällen ein wäßriger Puffer, fließen ab und werden aufgefangen und abgeleitet.

Gleichzeitig wird etwas versetzt zur Auftragestelle Puffer oder ein anderes geeignetes Lösungsmittel in analoger Weise wie die Kulturbrühe aufgebracht. Diese Vorgangsweise bewirkt eine Entfernung der Verunreinigungen, die in den Hohlräumen des Gewebes oder durch unspezifische Wechselwirkungen zurückgehalten werden. Wieder etwas versetzt werden ein entsprechender Puffer oder ein Lösungsmittel aufgebracht, das die Bindung zwischen dem Biomolekül und dem Liganden löst. Die Biomoleküle werden somit aus dem Gewebe eluiert und gesammelt. Danach wird wieder durch Zugabe des entsprechenden Puffers das mit dem Liganden immobilisierte Gewebe regeneriert (Waschdüsen 15). Die Aufgabe des Puffers oder des Lösungsmittels erfolgt in analoger Weise wie in den vorhergegangenen Schritten.

Vorrichtung zur Gewinnung von Reinprodukten aus Lösungen Ein Cellulosegewebe wird einem Aktivierungsverfahren ( z. B.

Bromcyanaktivierung) unterzogen, um reaktive Gruppen einzubringen. Der Ligand

(Protein A, Nucleotide, Inhibitoren, Substrate, Hormone, Rezeptoren, Bindungspeptide, Antikörper, Antigene, etc..) wird kovalent gebunden. Die freien reaktiven Gruppen werden abgesättigt.

Dadurch entsteht ein. Endlosband 1 mit einem spezifischen Liganden, das für die Reinigung von Biologika geeignet ist. Dieses Band wird auf zwei Rollen 2, 3 aufgebracht. Zur Fixierung und Verbesserung der Laufeigenschaften kann das Band am Rand durch ein flexibles Kunststoffband, u.zw. die Randwülste 21, verstärkt sein.

Das Trägergewebe 1 wird auf zumindest einer Antriebswalze 2 fixiert und eine

Walze 3 mitgetrieben. Zum Spannen des Trägergewebes sind die Walzen in nicht dargestellter Weise horizhontal gegeneinander verschiebbar. Zum Dirigieren der durchdringenden Flüssigkeiten kann das Endlosband in leichten Wellen geführt werden. Das Trägergewebe ist an den Rändern durch Randwülste 21 verstärkt und kann in diesem Bereich perforiert sein, um eine querseitige Spannung des Trägergewebes gewährleisten zu können, da an den Walzen entsprechende, in die Perforationen eingreifende Stifte vorgesehen sein können. Das Kunststoffband dient gleichzeitig zur Abdichtung der Kapillaren, die im Trägergewebe vorhanden sind.

Beispiel 1:

200 g Emulsion PVC, 50 g MOLLAN B (Dibuthylphtalat), 8 g Austrostab XBZ 113, 40 g Titandioxid und 20 g Kreide werden in einer Reibschale vermischt und fein gerieben. Die Paste wird dann mit einem Ziehrahmen beiderseits auf den Rand eines Celluloseendlosbandes in einer Tiefe von 1 cm und in einer Stärke von je 2,5 mm aufgezogen. Danach wird das Band 25 min bei 180°C im Trockenschrank behandelt und somit ein flexibles Kunststoffführungsband erzeugt. Das Endlosband aus Cellulose mit einem hohen Gehalt an α-Cellulose, LB =

120x10 cm, Stärke 0,5 mm, wird mit 0,1 M NaHCO ₃ 15 min. gewaschen und anschließend in ein Gefäß überführt, das 12 g CNBr, gelöst in 500 ml H ₂ 0 enthält. Die Aktivierung wird durch Zugabe von 2 N NaOH gestartet, wobei der pH-Wert durch weitere NaOH-Zugaben auf ca. 11 gehalten wird. Die Aktivierungsdauer beträgt ca. 8 min. , während dieser Zeit wird die Flüssigkeit gerührt. Nach

Beendigung der Aktivierung wird die CNBr-Lösung abdekantiert und das Celluloseband mit 0, 1 M NaHC0 ₃ und H ₂ O gewaschen.

100 mg Protein A werden in 500 ml Kopplungspuffer gelöst (0, 1 M NaHC0 ₃ , 0,5 M NaCl, pH 8,5) und das aktivierte Celluloseband 12 Stunden bei 4°C darin unter leichtem Schwenken inkubiert. Die Kopplungsausbeute beträgt ca. 50% und wird mittels Reversed Phase HPLC bestimmt. Danach werden die freien reaktiven Gruppen durch eine Behandlung mit IM Glycin bei pH 9 abgesättigt (Dauer: 2 Stunden bei 20°C). Das Celluloseband wird dann auf die Walzen aufgebracht.

Die Vorschubgeschwindigkeit des Bandes beträgt 5 cm/min. Das Äquilibrieren erfolgt mit 0, 1 M Glycin, pH 9,0. Der Puffer wird von einem Vorratsbehälter mit einer Flußrate von 5 ml/min aufgebracht. Wenn das gesamte Band äquilibriert ist, wird 10 cm versetzt von einem anderen Vorratsbehälter die Kulturbrühe eines humanen monoklonalen Antikörpers mit 50 ml/min aufgebracht. 20 cm versetzt davon wird mit dem Äquilibrierungspuffer mit 5ml/min nachgewaschen. Die Elution erfolgt wiederum 10 cm versetzt mit einer Flußrate von 3 ml/min. Der Elutionspuffer ist ein 0,2 M Na,HPO ₄ -Puffer, der mit 0, 1 M Citronensäure auf pH 4,0 gestellt wurde. In den Auffangrinnen unter der Elutionsstelle ist eine UV-Zelle zur Detektion des Proteins installiert. 10 cm versetzt von der Elutionsstelle wird das Band mit 5ml 0, 1 M Glycin, pH 3,0/min regeneriert. Das sich weiter drehende Band gelangt nun im unteren Teil des Gerätes in ein

Bad aus 0, 1 M PBS-Puffer, der kontinuierlich erneuert wird, und somit von den anhaftenden Zellen und Zellbruchstücken befreit wird. Danach beginnt ein neuer Reinigungszyklus mit Äquilibrieren, Beladen, etc.. . Das Celluloseband wird in 20% Ethanol bei 4°C gelagert.

Beispiel 2:

Die Herstellung des Führungsbandes erfolgt wie in Beispiel 1. Das Celluloseband wird in einem flachen Gefäß mit 1 1 destilliertem Wasser. 5 min gerührt. 200 mg Cibacron F3G-A werden in 10 ml destilliertem Wasser, gelöst und zugegeben und weitere 5min gerührt. Anschließend werden 5 g NaCl zugegeben

und 30 min gerührt. Danach wird der pH-wert mit 2,5 M Na ₂ CO ₃ -Lösung auf 10,5 gestellt und über Nacht weitergerührt. Die Lösung wird abdekantiert und das Celluloseband mit destilliertem Wasser, 6 M Harnstofflösung und 1 M NaCl solange gewaschen, bis in der Waschflüssigkeit kein Farbstoff mehr nachweisbar ist. Die Bestimmung erfolgt durch Messung der Absorption beim Extinktionsmaximum von 602 nm gegen destilliertes Wasser.

Das Celluloseband wird dann auf die Walzen aufgebracht und mit 0,05 M Tris/HCl (pH 7,0) mit 5 ml/min äquilibriert. Die Vorschubgeschwindigkeit des Bandes beträgt 5 cm/min. 10 cm versetzt davon wird humanes Plasma, das vorher vom Kryopräzipitat geklärt wurde, mit 20 ml/min aufgetragen. 20 cm versetzt von der Auftragestelle wird mit 5 mlÄquilibrierungspuffer/min nachgewaschen, wobei Transferrin und einige andere Serumproteine eluiert werden. 10 cm versetzt davon wird Albumin mit 1,5 M KC1 in Äquilibrierungspuffer (5ml/min) eluiert. Das Regenerieren wird mit 2 M Harnstoff 10 cm versetzt mit 5ml/min durchgeführt. Das Celluloseband wird in 20 %Ethanol bei 4°C gelagert.

Beispiel 3:

Die Herstellung des Führungsbandes erfolgt wie in Beispiel 1 und 2. Das Celluloseband wird in einem flachen Gefäß mit destilliertem Wasser gründlich gewaschen. Das Wasser wird abdekantiert und 100 ml 1 ,4-Butandioldiglycidylether, 100 ml 0,5 M Natronlauge und 100 mg Natriumborhydrid zugegeben. Die Lösung wird auf 25°C temperiert und über Nacht gerührt. Danach wird die Lösung abdekantiert und das Celluloseband mit destilliertem Wasser gewaschen. 150 mg Glutathion werden in 200 ml Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, 0,5

M NaCl, pH 10,5) gelöst und damit das Celluloseband 4 Stunden unter Rühren bei 40°C inkubiert. Danach werden die freien reaktiven Gruppen mit 1 M Glycin abgesättigt.

Das Band wird auf die beiden Walzen aufgebracht und mit PBS + 1 % Triton X-100, pH 7,3 mit 5 ml/min äquilibriert. Die Vorschubgeschwindigkeit beträgt 5

cm/min. Das aufgeschlossene Hochdruckhomogenisat eines E. coli, der rekombinant Glutathion-S-Transferase exprimiert, wird 10 cm versetzt mit 30 ml/min auf das äquilibrierte Band aufgetragen und 20 cm versetzt davon mit Aquilibrierungspuffer (5 ml/min) nachgewaschen. Die Elution erfolgt 10 cm versetzt davon mit folgendem Puffer: 20 mM Glutathion (frisch einwiegen), 120 mM NaCl, 100 mMTris/HCl pH 8,0 (Flußrate 3ml/min). Zum Regenerieren wird PBS + 3 M NaCl verwendet. Das Celluloseband wird in 20% Ethanol bei 4°C gelagert.