"EXTRACTO HIDRO-GLICÓLICO DE CORTIÇA, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO, FORMULAÇÕES COMPREENDENDO O REFERIDO EXTRACTO E SUA

UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um extracto hidro-glicólico de cortiça, processo para a sua preparação, formulações compreendendo o extracto hidro-glicólico de cortiça e à sua utilização. A invenção encontra aplicação no tratamento do ache, processos inflamatórios, prevenção do envelhecimento da pele e despigmentação da pele.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Nos últimos anos, tem-se verificado um aumento no consumo e procura de plantas medicinais. Actualmente, a Organização Mundial da Saúde estima que 80% da população dos países em desenvolvimento ainda depende de medicamentos tradicionais pára cuidados de saúde primários, sendo as plantas medicinais as mais utilizadas. Além disso, a actividade biológica dos produtos naturais tem vindo a destacar-se em detrimento dos produtos sintéticos, devido aos múltiplos efeitos secundários que estes provocam.

O envelhecimento e doenças como o cancro, obesidade, diabetes tipo II, cardiovasculares e neurodegenerativas têm como denominador comum um estado de inflamação crónica.. A inflamação crónica e a infecção levam à sobre-regulação de uma panóplia de enzimas, mediadores pró-inflamatórios e proteínas de sinalização em tecidos e células afectadas. Entre os enzimas pró-inflamatórios , as formas indutíveis da sintase do óxido nítrico (iNOS) e da ciclo-oxigenase-2 (COX-2), responsáveis pelo aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE2), respectivamente, são conhecidas por estarem envolvidas em várias doenças Crónicas, incluindo doenças auto-imUnes, como a esclerose múltipla e diabetes tipo I, doenças neurodegenerativas, como Parkinson e Âlzheimer é ainda cancro do cólon .

Os anti-inflamatórios não esteróides têm sido muito utilizados para combater a inflamação. No entanto, a aplicação destes agentes é limitada devido aos efeitos ulcerogénicos bem documentados e, mais recentemente, ao risco aumentado de doença cardíaca e acidente vascular cerebral (AVC) .

Dado que as abordagens terapêuticas e cirúrgicas convencionais não têm sido capazes de controlar totalmente a incidência e o desenvolvimento de muitas doenças inflamatórias, há uma necessidade crescente de compostos mais seguros e de desenvolver estratégias terapêuticas que actuem em alvos moleculares responsáveis pelo desenvolvimento da resposta inflamatória, de modo a controlar a incidência e progressão destas patologias.

A melanina é o principal agente responsável pela cor da pele e desempenha um papel importante na prevenção de lesões em condições fisiológicas normais. Embora a melanina confira uma protecção eficaz contra a radiação UV, a acumulação anormal de melanina pode causar problemas estéticos, como é o caso de^ melasma e sardas. Deste modo, é essencial recorrer à modulação da biossíntese de melanina (melanogénese ) e evitar a sua produção e acumulação excessiva.

As Metaloprotéinases da Matriz (MMP) sâo um grupo importante de enzimas responsáveis pela degradação dos componentes da matriz extracelular (MEC) e das membranas basais. Actualmente, foram identificados mais de 20 tipos diferentes de MMP humanas, as quais são classificadas em grandes grupos de acordo com a especificidade do substrato e a sua homologia interna. As MMP degradam as macromoléculas da matriz, incluindo o colagénio intersticial, a fibronectina , a laminina e a proteoglicana , entre outras.

Em condições fisiológicas normais, os níveis basais de expressão das MMP são baixos, o que permite manter a homeostase celular. Contudo, a incidência de radiação ultra-violeta nas células da pele leva, como consequência, à produção de espécies reactivas de oxigénio e à libertação de mediadores pró-inflamatórios, resultando na activação das MMP e aumento da degradação da MEC. Este desequilíbrio na produção de MMP está associado a várias patologias, como a arteriosclerose, doenças cardiovasculares e cancro, entre outras. As MMP-1, 3 e 9 causam a degradação do colagénio e da elastina, levando consequentemente ao aumento da formação de rugas e flacidez da pele .

Como tal, recentemente, tem existido uma grande procura por potenciais candidatos (extractos de origem natural) capazes de inibir a actividade das metaloprotéinases e, de um modo particular, capazes de inibir a actividade das MMP-1, 3 e 9 de modo a manter a integridade e. elasticidade da pele e, ao mesmo tempo, prevenir o seu envelhecimento.

A cortiça, tecido celular suberizado produzido pelo felogénio do sobreiro {Quercus suber L., Fagaceae) , é um produto de considerável valor económico no sul da Europa. Portugal produziu, em 2011, cerca de 157000 toneladas de cortiça, o que equivale a cerca de 53% da produção mundial.

A indústria da cortiça gera, durante a produção de granulado de cortiça para materiais aglomerados , quantidades significativas de granulados de diversas granulometrias e densidades, cuja quantidade se estima em 40000 toneladas por ano, ou seja, cerca de 25% da produção total de cortiça.

A cortiça é principalmente constituída por suberina (-40%, p/p), lenhina (-25%, p/p), polissacáridos (-20%, p/p), extraíveis (-15%, p/p) e inorgânicos (-1%, p/p). Os extraíveis de cortiça são principalmente constituídos por compostos alifáticos, triterpénicos e fenólicos.

Os polifenóis têm sido apontados como responsáveis por muitos benefícios para a saúde, incluindo as actividades anti-bacteriana e anti-viral, anti-alérgica, anti-inflamatória, anti-cancerígena e ant i-envelhecimento (Laranjinha & Cadenas, 1999; Santos-Buelga & Scalbert, 2000) .

Há evidências epidemiológicas e experimentais de que os compostos fenólicos, nomeadamente os polifenóis, têm actividade anti-inflamatória, designadamente como modificadores de vias de transdução de sinal. Os flavonóides, taninos, ácidos fenólicos, são metabolitos secundários de plantas, muitos deles detentores de actividade antioxidante. Estes actuam como captadores de oxigénio singletos e como captadores de radicais livres, actividades que podem contribuir para as suas propriedades anti-inflamatórias . Estudos recentes indicam que estas propriedades não se devem apenas ao potencial antioxidante dos polifenóis mas também ao efeito inibidor que os mesmos exercem em enzimas e vias de sinalização intracelular p.ró-inflamatórias , nomeadamente, iNOS, COX-2, 5-lipoxigenase e telomerase e receptorès celulares.

O pedido de patente internacional WO 20090729.16 ^' Al, com a epigrafe "Extracção e purificação de friedelina", divulga processos de extracção sólido-liquido e de purificação para isolar a. friedelina a partir de cortiça e derivados de cortiça. Este processo utiliza um solvente apolar e técnicas de (re). cristalização fáceis de utilizar a nível industrial, obtendo elevados rendimentos e elevados níveis de pureza. A friedelina é um composto natural com actividades biológicas relevantes, tais como actividade anti -cancerígena, anti-envelhecimento, entre outras .

O pedido de patente internacional WO 2009067036 Al, intitulada "Extracção de fracções de polióis a partir de cortiça e materiais derivados de cortiça" refere-se a processos de extracção de polióis a partir de materiais de cortiça e derivados de cortiça (condensado negro) , utilizando álcoois como solvente de extracção. Por meio deste processo simplificado, obtêm-se rendimentos melhorados que proporcionam o surgimento de novas aplicações para os compostos extraídos.

Os pedidos de patente acima referidos, embora divulguem processos de extracção de cortiça ou de materiais derivados de cortiça, não divulgam a utilização de misturas de solventes hidro-glicólicos nesses processos.

Existe assim a necessidade de obter extractos dé cortiça com uma qualidade melhorada dos seus compostos bioactivos, que permitam potenciar e ampliar os seus efeitos anti-oxidantes , anti-inflamatórios , anti-envelhecimento/anti-rugas, despigmentantes e anti-acne.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção resolve os problemas identificados acima uma vez que proporciona um extracto hidro-glicólico de cortiça, um processo para a sua preparação, formulações compreendendo o extracto hidro-glicólico de cortiça e a sua utilização cosmética e farmacêutica.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um extracto hidro-glicólico de cortiça caracterizado por compreender 60-100 pg de ácido gálico, 100-130 pg de ácido protocatecuico, 6800-8200 pg dê ácido elágico, 500-3200 pg de roburina e grandinina, 1800-2100 μ-g de castalagina e 800-1900 pg de vescalagina, por grama de cortiça.

A presente invenção proporciona ainda um processo de preparação de um extracto hidro-glicólico de cortiça como descrito acima, compreendendo os passos de: colocar num extractor uma suspensão formada por granulado de cortiça e uma mistura água : propilenoglicol ; e - extrair compostos bioactivos de cortiça da suspensão do passo anterior a uma temperatura entre 20 °G e 80 °C.

Numa forma de realização, uma proporção em volume entre água e propilenoglicol da referida mistura água : propilenoglicol está compreendida entre 0,2:0,8 e 0,8:0,2, de um modo mais preferido está compreendida entre 0,2:0,8 e 0,7:0,3 e, de um modo muito preferido, é de 0,4:0,6.

Numa outra forma de realização, uma proporção entre a massa de granulado de cortiça e o volume da mistura água : propilenoglicol está compreendida entre 1:20 e 1:40 e, de um modo mais preferido, é 1:20.

Ainda noutra forma de realização, a temperatura de extracção está compreendida entre 20 e 70 °C. De um modo preferido, a temperatura de extracção é 70 °C.

Noutra forma de realização, a extracção realiza-se durante 1 a 24 horas e, de um modo preferido, durante 6 horas.

A presente invenção proporciona também um extracto hidro- glicólico dê cortiça caracterizado por ser obtido pelo processo da presente invenção.

A presente invenção proporciona ainda uma formulação farmacêutica caracterizada por compreender o extracto hidro- glicólico de cortiça da presente invenção.

Mais, a presente invenção proporciona também uma formulação cosmética caracterizada por compreender o extracto hidro- glicólico de cortiça da presente invenção. A presente invenção proporciona. ainda uma formulação farmacêutica e/ou cosmética compreendendo o extracto hidro- glicólico de cortiça da presente caracterizada por se aplicar no tratamento de no tratamento de acne, processos inflamatórios, na prevenção do envelhecimento da pele e no tratamento de despigmentação da. pele.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig . 1 mostra o perfil cromatográfico de um extracto obtido pelo processo da presente invenção, por HPLC-DAD a 280 e a 360 rim .

A Fig. 2 mostra o cromatograma dã amostra a 280 nm e cromatogramas em modo MRM (Monitorização de múltiplas reacções) correspondentes às transições características dos compostos: ácido gálico (169>125), vescalagina (933>493) e castalagina (933>631; 933>425) , ácido protocatecuico ( 153>109) e ácido elágico (301>145) .

A Fig. 3 apresenta gráficos comparativos que mostram a actividade das MMP-1, 3 e 9 após incubação com várias concentrações dó extracto hi.dro-glicólico, em comparação com um agente quelante inibidor de MMP (EDTA) e um produto do estado da técnica derivado do Pericarpo da Romã (PCPR) .

A Fig. 4 mostra a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) na presença do extracto a 5%, ao fim de 0,5; 2 e 24 horas de incubação nos queratinócitos humanos. A Fig. 5 apresenta gráficos comparativos que mostram a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) na presença do extracto hidro-glicólico ao fim de 0,5, 2 e 24 horas de incubação nos fibròblastos humanos, em comparação com os produtos do estado da técnica (G: extracto de noz; P: extracto de romã) .

A Fig. 6 mostra a actividade ,da tirosinase nã presença de 5% de extracto

A Fig. 7 mostra o conteúdo em melanina em células de melanoma após incubação com 0,5% de extracto.

A Fig. 8 mostra a avaliação da citotoxicidade do extracto e de produtos do estado da técnica (G: extracto de noz; P: extracto de romã), era rcacrófagos . Cada ponto representa a média ± EPM. #: p<0,05 em comparação com o grupo controlo. ###: p<0,001 em comparação com o grupo controlo.

A Fig. 9 mostra a avaliação da actividade anti-inflamatória do extracto e de produtos do estado da técnica (G: extracto de noz; P: extracto de romã) em macrófagos. Cada ponto representa a média ± EPM. *: p<0,05 em comparação com o grupo LPS. * ^■ **: p<0,001 em comparação com o grupo LPS.

A Fig. 10 mostra os niveis totais da proteína reguladora IkB-α, na forma fosforilada e não fosforilada, para o extracto em macrófagos, normalizados para a β-tubulina.

A Fig. 11 mostra os níveis totais da proteína iNOS para o extracto, em macrófagos. Cada ponto representa a média ± EPM _. .

***: p<0,001 em comparação com o grupo LPS. A Fig. 12 mostra os níveis de mRNA dos genes que codificam Os mediadores inflamatórios IL-6, TNF-ά, CCL5 e IL-Ιβ em macrófagos, na presença do extracto. Cada ponto representa a média ± EPM. ***: p<0,001 em comparação com o grupo LPS.

A Fig. 13 mostra o ensaio com a sonda "Oil Red" em queratinocitos com incubação do extracto e do seu solvente, durante 24 horas.

A Fig. 14 mostra os níveis de mRNA do gene SREBP-1, envolvido na síntese do colesterol e ácidos gordos, na presença do extracto, em queratinocitos.

A Fig. 15 mostra o ensaio de protecção de ADN com a sonda Hoescht em queratinocitos com incubação do extracto durante 3 horas. Cada ponto representa a média ± EPM. ***: p<0,001 em comparação com o grupo ST.

A Fig. 16 mostra o ensaio de protecção de ADN com a sonda Hoescht em queratinocitos com incubação do extracto durante 24 horas. Cada ponto representa a média ± EPM. ** : p<0, 01 em comparação com o grupo ST.

A Fig. 17 mostra o ensaio de protecção de ADN com a sonda TÚNEL em queratinocitos com incubação do extracto durante 3 horas.

A Fig. 18 mostra o ensaio de protecção de ADN com a sonda TÚNEL em queratinocitos com incubação do extracto durante 24 horas. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um extracto hidro-glicóliço de cortiça, processo para a sua preparação, formulações farmacêuticas e cosméticas compreendendo o extracto de cortiça e à sua utilização no tratamento do acne, processos inflamatórios, prevenção do envelhecimento da pele e despigmentação da pele.

Salvo indicação em contrário, os intervalos de valores apresentados na presente descrição dest inam-se a proporcionar um modo simplificado e tecnicamente aceite para indicar cada valor individual dentro do respectivo intervalo. A titulo de. exemplo, a expressão "1 a 2" ou "entre 1 e 2" significa qualquer valor dentro deste intervalo, por exemplo 1 0; 1,1; 1,2; 1,3; 1 _/ 4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1 _/ 9; 2,0. Todos os valores mencionados na presente descrição devem ser interpretados como valores aproximados, por exemplo a referência ã "70 °C" significa "cerca de 70 °C".

No contexto da presente descrição, o termo "compreendendo" deve ser entendido como "incluindo, entre outros". Como tal, o referido termo nãò deve ser interpretado como "consistindo apenas de" .

Por granulado de cortiça entende-se, no contexto da presente descrição, fragmento de cortiça cuja dimensão está compreendida, de um modo geral, entre 0,005 e 8 mm.

No contexto da presente descrição, o termo "extractor" refere-se ao equipamento que assegura o contacto entre a matriz original que contém os compostos alvo passíveis de serem extraídos, assim como as condições necessárias para a extracção e recuperação desses compostos.

No processo da presente invenção, uma suspensão formada por granulado de cortiça e uma mistura água : propilenoglicol é colocada num extractor para extracção dos compostos bioactivos.

A proporção em volume entre água e propilenoglicol está compreendida entre 0,2:0,8 e 0,8:0,2, de um modo preferido, 0,2:0,8 e 0,7:0,3. Numa forma de realização preferida, a proporção em volume entre água e propilenoglicol é 0,4:0,6.

A proporção entre ò granulado de cortiça e a referida mistura água : propilenoglicol está compreendida numa gama de cerca de 1:20 a 1:40 referente a uma relação entre massa de granulado (g) / volume de mistura (mL) .

Os compostos bioactivos de cortiça são extraídos da referida suspensão enquanto esta é agitada, aquecida a uma temperatura entre 20 °C e 80 °C, de um modo preferido entre 20 °C e 70 °C, e mantida nestas condições durante 1 a 24 horas.

Numa forma de realização preferida dá invenção, a proporção entre a massa de granulado de cortiça e o volume da mistura ág a : propilenoglicol é de 1:20, a temperatura é de 70 °C, sendo o tempo de extracção de 6 horas.

Em seguida, os sólidos são separados e a fase líquida é parcialmente seca por meio de técnicas evaporativas conhecidas na técnica. Com vista a identificar e quantificar os compostos fenó.licos mais representativos existentes nos extractos obtidos pelo processo acima descrito, a requerente procedeu à sua caracterização por meio de cromatografia liquida de alta resolução acoplada a um detector de díodos (DAD) e a um espectrometro de itiassa (MS) .

Ò extracto hidro-glicólico da invenção compreende 6.0-100 de ácido gálico, 100-130 g de ácido protocatecuico, 6800-8200 pg de ácido elágico, 500-3200 pg de roburina e grandinina, 1800- 2100 g de castalagina e 800-1900 g de vescalagina, por grama de cortiça.

Surpreendentemente, verificou-se uma concentração muito elevada de ácido elágico e élagitaninos , face às concentrações já conhecidas do estado da técnica e, por conseguinte, face às concentrações que seriam esperadas utilizando outros solventes ou outras misturas de solventes hidro-alcoólicos do estado da técnica. Sem pretender teorizar, pensa-se que o referido aumento dá concentração de compostos fenólicos deriva do facto de ter sido utilizada uma mistura água : propilenoglicol como solvente de extracção, em vez de outros solventes orgânicos (ex: metanol, etanol, éter) ou suas misturas vulgarmente utilizados nos processos da técnica anterior.

O propilenoglicol não é um solvente utilizado em processos de extracção de material à base de cortiça devido a possuir características físico-químicas pouco favoráveis a este tipo de processos, isto é, elevada viscosidade e baixa volatilidade.

Efectivamente, os especialistas no campo da cortiça têm utilizado solventes de baixa viscosidade e elevada volatilidade para proceder à extracção de granulado de cortiça. Surpreendentemente, ao contrário do que seria dé esperar, verificou-se que a utilização de uma mistura de água : propilenoglicol no processo de extracção proporcionou um extracto de cortiça cõm propriedades melhoradas face aos processos da técnica anterior.

De facto, embora o propilenoglicol fosse já utilizado como meio de dispersão em formulações cosméticas, a sua utilização como solvente de extracção não era equacionada devido à expectativa dè uma baixa capacidade extractiva para õs compostos bioactivos da cortiça.

A mistura água : propilenoglicol revela excelentes propriedades de selectividade para os compostos bioactivos de interesse, a partir de granulados de cortiça. Deste modo, os extractos de cortiça obtidos pelo processo acima definido proporcionam importantes aplicações no campo farmacêutico e cosmético e podem ser utilizados na preparação de formulações farmacêuticas e/ou cosméticas que apresentam propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, anti-envelhecimento/anti-rugas, despigmentantes e anti-acne.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Preparação e caracterização de extractos de cortiça

O exemplo 1 ilustra o processo de preparação e caracterização de um extracto hidro-glicólico de cortiça de acordo com a invenção. Num extractor equipado còm um meio de aquecimento e um condensador colocaram-se 0,5 kg de granulado de cortiça, com. uma distribuição granulométrica entre 0,005 mm - 1 mm (90% das partículas) e 10 litros de uma mistura água : propilenoglicol com uma proporção de 0,4:0,6 v/v.

Aqueceu-se a mistura até 70 °C e realizou-se a extracção, nessas condições, durante 6 horas.

Em seguida, separaram-se os sólidos por filtração e concentrou-se o extracto utilizando uma técnica evaporativa, até remoção completa da água.

O conteúdo em fenóis totais foi determinado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, tendo sido obtido um valor de 30131113 mg _EAG /L.

De um modo particular, a actividade antioxidante do extracto foi ainda analisada utilizando os métodos de ORAC, HORAÇ, HOSC, DPPH e radical superóxido (conhecidos na técnica, pelo que a sua descrição é desnecessária) , sendo os resultados obtidos apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 - Actividade antioxidante do extracto

Método Actividade antioxidante

ORAC 22603 ± 2097 ymolET/L

HORAC 15712 ± 1419 molEAC/L

HOSC 22678 ± 3225 pmolET/L

DPPH 1,68 (IC ₅₀ ) mL/L

o ₂ ^" 11,08 (IC ₅₀ ) mL/L De modo a identificar e quantificar os principais compostos bioactivos, fez-se uma análise cromatográfica para determinar o perfil cromatográfico do extracto por HPLC-DAD (Fig. 1) e por HPLC-MS (Fig. 2) .

Para estudar a variabilidade e reprodutibilidade da matriz de cortiça, fez-se ainda a identificação e quantificação dos principais compostos presentes em diferentes lotes de extracto. Os resultados estão presentes na Tabela 2 , assim como uma comparação com os valores conhecidos da literatura..

Tabela 2 - Quantificação dos principais compostos presentes no extracto da invenção.

Comparando os resultados obtidos entre o extracto da presente invenção e os extractos caracterizados em artigos previamente publicados (Conde et al., 1997-1998; e Santos e al., 2010 e 2013) verifica-se que o extracto da invenção possui uma concentração consideravelmente superior em ácido elágico e elâgitaninos .

Exemplo 2 - Actividade anti-envelhecimento/anti-rugas-: Ensaios químicos in vitro

2.1 Inibição da actividade de metaloproteinases

0 ensaio de inibição das metaloproteinases (MMP) baseia-se na capacidade que o extracto tem em bloquear a acção das MMP na clivagem de um substrato especifico. Esta inibição da actividade das metaloproteinases vai contribuir para a prevenção do aumento da formação de rugas e flacidez dá pele, devido à manutenção da integridade do colagénio e elastina da pele.

Neste ensaio várias concentrações do extracto hidro-glicólico foram colocadas a incubar com o substrato sintético fluorogénico e com as MMP-1, 3 e 9. Após 20 horas de incubação a 37 °C, analisou-se -a capacidade do extracto de cortiça, em inibir a clivagem do substrato através da medição da intensidade da fluorescência a 340 nm (excitação) e 440 nm (emissão) num espectrofluorimetro . Para comparar a actividade do extracto hidro-glicólico, utilizou-se um agente quelante (EDTA) como controlo positivo (inibidor de metaloproteinases) e um produto comercial derivado do Pericarpo da Romã (designado de PCP.R) , rico em ácido elágico e no composto punicalagina .

Os resultados obtidos para a MMP-1, MMP-3 e MMP-9 estão representados na Fig. 3 e são expressos em percentagem relativamente ao controlo. À medida que se aumenta a concentração de extracto, verifica-se a diminuição da actividade dos três enzimas (efeito dependente da dose) , observando-se uma inibição mais acentuada na MMP-9. Por outro lado, o produto comercial (PCPR) possui alguma actividade inibidora para as MMP- 3 e 9 mas não para a MMP-1.

De um modo geral os resultados indicam que o extracto hidro-glioólico é um bom inibidor da actividade das MMP-1, 3 e 9, sugerindo que a aplicação tópica do extracto através de uma formulação cosmética poderá revelar-se uma boa estratégia para prevenir o stress oxidativo e consequentemente inibir a flacidez da pele e o aparecimento de rugas.

2.2. Avaliação da protecção do ADN celular através da análise da inibição da síntese de espécies reactivas de oxigénio (ROS) - ensaio em células ih. vitro

Queratinócitos

Os queratinócitos são células diferenciadas do tecido epitelial (pele) e representam cerca de 80% das células epidérmicas. Para realizar os ensaios foi utilizada a linha celular imortalizada HaCaT, uma vez que são consideradas um bom modelo de estudo e, por esse motivo, bastante tilizada em ensaios de investigação.

Antes de avaliar a capacidade do extracto em inibir a síntese de ROS, procedeu-se à análise da citotoxicidade do extracto nos queratinócitos humanos. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inactivadó, 100 Q/mL penicilina e 100 g/mL de estreptomicina , a 37 °C numa atmosfera húmida de 95% de ar e 5% de C0 ₂ .

Para o ensaio dê citotoxicidade, as células foram colocadas a incubar em placas de 96 poços e após 3 dias de crescimento, o extracto hidro-^glicólico foi adicionado às células nas concentrações de 2,5% e 5%, tendo sido realizado também um controlo com o respectivo solvente (propilenoglicòl ) . Após os períodos de incubação (2, 4 e 24 horas) foi avaliada a viabilidade celular das células pelo método do reagente MTS {Cel ITiter 96® AQ _ueous Assay) . Este método permite avaliar a percentagem de células viáveis, uma vez que estas são capazes de metabolizar o reagente num produto que é medido espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 490 nm.

Os resultados obtidos indicaram que o extracto hão é citotóxico para os queratinócitos nas concentrações testadas após os vários períodos de incubação uma vez que a viabilidade das HaCaT manteve-se nos 100% dé viabilidade celular.

Posteriormente avaliou-se o potencial do extracto na inibição da formação de ROS. O método consistiu em incubar 5% do extracto obtido no exemplo 1 no meio reaccional com os queratinócitos durante um período de tempo pré-determinado (0,5, 2 e 24 horas) e após incubação adicionou-se um marcador: DCFH-DA (diclorofluoresceína diacetato) . A fluorescência nas células foi monitorizada através da leitura num espectrofluorímetro, sendo a intensidade de fluorescência directamente proporcional à quantidade de espécies reactivas produzidas. Na Tabela 3 e Fig. 4 apresentam-se os valores de inibição dà produção de ROS utilizando 5% de extracto após 0,5, 2 e 24 horas de incubação na linha celular HaCaT.

Tabela 3 - Inibição (%) da produção de ROS utilizando 5% de extracto em células HaCaT.

A partir dos resultados apresentados na Tabela 3 verifica-se que com o aumento do tempo de incubação do extracto nas células, também aumentou a inibição da produção de ROS, não Sendo está diferença muito significativa entre as 2 e 24 horas. Portanto, verificou-se que o extracto inibiu cerca de 50% de ROS ao fim de 24 horas de incubação nos queratinócitos, realçando assim o seu efeito protector a nivel do ADN e a sua bioactividade como antioxidante.

Fibroblastos humanos (HFF)

Os fibroblastos são as células predominantes da segunda camada da pele humana (derme) e uma das suas principais funções é a produção de colagénio e elastina. Como os fibroblastos são células muito afectadas pelo envelhecimento e importantes na função de regeneração da pele tornou-se indispensável a avaliação da inibição de produção de ROS do extracto neste tipo de células. Tal como para os queratinócitos , em primeiro lugar, fez-se uma análise da citotoxicidade do extracto em células humanas de fibroblastos . As células foram cultivadas ém meio de Dulbeccô modificado por Iscové suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inactivado, 100 U/mL penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina , a 37 °C numa atmosfera húmida de 95% de ar e 5% de C0 ₂ .

Para o ensaio de citotoxicidade, incubaram-se várias concentrações de extracto hidro-glicólico do exemplo 1 no meio de cultura dos fibroblastos , durante 2, 4 e 24 horas. Para monitorizar a viabilidade celular utilizou-se o reagente PRESTO BLUE {PrèstoBlue™ Celi Viability Reagent) , por ser um método mais simples, rápido e sensível. Tal como o reagente MTS, o PRESTO BLUE tem a capacidade de ser activamente metabolizado pelas células viáveis dando origem a um produto que pode ser medido fluorometricamente .

Os resultados obtidos indicaram que o extracto não era citotóxico após 2 e 4 horas de incubação na concentração máxima (5% de extracto hidro-glicólico), havendo um ligeiro aumento da. citotoxicidade após 24 horas de incubação (a concentração máxima não tóxica é 2,5% de extracto).

A avaliação da inibição de ROS nas células de fibroblastos realizou-se utilizando o método descrito do marcador fluorescente DCFH-DA. Para comparar a acção inibidora do extracto hidro-glicólico, utilizaram-se dois produtos comerciais disponíveis no mercado: i) Extracto de Romã, que será designado por "P", e ii) Extracto de Noz, que será designado por "G". Ambas as amostras comerciais foram seleccionadas com base na sua composição rica em elagitãninos , uma vez que o extracto hidro- glicólico da invenção é também uma fonte destes fenóis bioactivos. Os dois produtos do estado da técnica foram também incubados com os fibroblastos durante os mesmos períodos de tempo (0,5; 2 e 24 horas).

Na Tabela 4 e Fig. 5 apresentam-se os valores de inibição da produção de ROS utilizando o extracto hidrò-glicólico e os produtos do estado da técnica.

Tabela 4 - Inibição (%) da produção de ROS em células de fibroblastos

De um modo geral, os resultados indicaram que o extracto hidro-glicólico possui uma maior capacidade de inibição de ROS nos fibroblastos do que os produtos do estado da técnica disponíveis no mercado (extractos de romã e noz). Estes resultados sugeriram que o extracto de cortiça possui actividade antioxidante intracelular em células de fibroblastos, protegendo o ADN celular do ataque das espécies reactivas de oxigénio. Exemplo 3 - Actividade despigmentante : Inibição da actividade da tirosinase - Ensaio químico in vitro e inibição da produção de melanina numa linha celular de melanócitos

3.1 Inibição da actividade da tirosinase - Ensaio químico in vitro

A tirosinase é um enzima que desempenha um papel crítico na biossíntese de melanina e é considerado o enzima chave na coloração de pele, cabelo, olhos e no escurecimento de alimentos. A tirosinase é um enzima que contém cobre e está presente em mamíferos, plantas e fungos, tendo muitos compostos fenólicos como substrato. Nos mamíferos, a tirosinase está envolvida na transformação de L-tirosiha em dopaquinona, que ocorre através de duas etapas: hidroxilação da L-tirosina, para L-3, 4-di-hidroxifenilalanina (L-DOPA), seguida da oxidação da última para orto-quinona (dopaquinona) . A dopaquinona será transformada, posteriormente, por meio de várias reacções para produzir a melanina que é responsável pela cor da pele nos mamíferos .

Como a tirosinase é o enzima chave que catalisa o passo limitante da biossíntese da melanina, avaliou-se o potencial do extracto hidro-glicólico obtido no exemplo 1 como agente despigmentante, através da inibição do enzima tirosinase (proveniente de cogumelo) na presença do substrato L-DOPA.

Incubou-se o extracto hidro-glicólico com o enzima tirosinase e o substrato (L-DOPA) e, após 30 minutos de incubação a 37 °C, determinou-se a percentagem de inibição da actividade enzimática relativamente ao controlo através da leitura da absorvância num espectrofotómetro (Fig. 6). Os resultados obtidos indicaram que o extracto de cortiça possui um grande potencial como despigmentante, uma vez que 5% de extracto inibiu a actividade da tirosinase in vitro em cerca de 54%.

3.2 Inibição da produção de melanina numa linha celular de mélanócitos

Utilizou-se uma linha celular de melanoma de rato (B16F10 - muríne metastatic melanoma) , a qual produz quantidades elevadas de melanina, sendo, por esse motivo, um modelo celular largamente utilizado nos ensaios de despigmentação .

Em placas de 6 poços, cultivarâm-se células B16F10 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inactivado, 100 U/mL penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina, a 37 °C numa atmosfera húmida de 95% de ar e 5% de CO ₂ . Em seguida, incubaram-se as células com 0,5% de extracto, durante 72 horas, a 37 °C e 5% C0 ₂ . No fim do tratamento, lavaram-se as células com tampão PBS e recolheram-se para posterior derivatização, utilizando um método de oxidação alcalina com peróxido de hidrogénio. Inj ectaram-se as amostras num sistema de HPLC e quantificou-se o conteúdo de melanina através de uma recta de calibração de melanina sintética.

Os resultados obtidos mostraram que 0,5% de extracto inibiu 32% da produção de melanina em células de melanoma, relativamente ao controlo, sendo mais uma vez realçado o efeito despigmentante do extracto (Fig. 7). Exemplo 4 - Avaliação da toxicidade in vitro e in vivo 4.1 Citotoxicidade em macrofagos

Este ensaio teve como objectivo determinar as concentrações de extracto isentas de toxicidade em células de macrofagos. Além disso, a toxicidade do extracto de cortiça foi ainda comparada com a toxicidade ém macrofagos de outros produtos do estado dá técnica no mercado.: extracto de romã (P 2% e P 10%) e extracto de noz (G 2% e G 6%) .

A linha celular de macrofagos de murganho (Raw 264.7) foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME ) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) não inactivado, 100 0/mL penicilina, e 100 g/mL de estreptomicina, a 37 °C numa atmosfera húmida controlada, contendo 95% de ar e 5% de C0 ₂ .

Para a determinação da viabilidade celular utilizou-se o método colorimétrico do brometo de 3— ( 4 , 5-dimetiltiazol-2-il ) ^ 2 , 5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito por Mosmanh ém 1983. As células foram mantidas em meio de cultura (Ctrl) ou pré- incubadas com òs extractos durante 1 hora e, posteriormente , activadas com LPS 1 μg/mL durante 24 horas.

A avaliação da significância estatística entre os tratamentos fez-se através do teste ANOVA seguido de um teste de comparação múltipla de Dunnett. Os testes estatísticos foram realizados com recurso ao GraphPad Prism, versão 5.0a (GraphPad

Software, San Diego, CA, EUA) . Foram considerados significativos os seguintes valores: #p < 0,05 e ###p < 0,001, quando comparados com as células não tratadas (Ctrl) . Os resultados revelaram que o extracto possui citotoxicidade na linha celular de macrófagos para concentrações iguais ou superiores a 1,25% (Fig. 8).

4.2. Toxicidade in vivo

Para avaliar a toxicidade e segurança ih vivo do extracto obtido no exemplo 1, avaliou-se o potencial de irritação aguda, numa escala de 6 parâmetros (negativa a muito forte/cáustica) , em 30 voluntários humanos após aplicação do extracto sob oclusão (adesivo) .

Foram preparadas seis soluções diferentes: extracto hidr.o- glicólico de cortiça diluído em solução aquosa, á 5% (P003) e 2,5% (P004) (p/v) ; controlo negativo (água purificada) e controlo positivo (solução de lauril-sulfato de sódio em água, a 0,25% (p/p)). Esfas soluções foram, posteriormente, aplicadas em adesivos, os quais foram colocados nas costas dos voluntários durante 24 ho as .

O ensaio rea 1 izou-se ao longo de. 3 dias: dia 0 - aplicação do adesivo contendo o extracto de cortiça;

dia 1 - remoção do adesivo após 24 horas da aplicação e avaliação de reacções irritantes agudas após 30 minutos;

dia 2 - avaliação de reacções irritantes agudas após 24 horas da remoção do adesivo. A avaliação das reacções irritantes provocadâs na pele foi, como já referido, realizada de acordo com uma escala de 6 parâmetros, obtendo-se os resultados expressos na tabela 5.

Tabela 5 - Classificação da irritação da pele para os produtos testados (em % de voluntários) 24 horas após aplicação do adesivo.

Após 24 horas da aplicação do adesivo, a maioria dos voluntários não evidenciou quaisquer reacções duvidosas.

As reacções cutâneas foram novamente observadas e classificadas 24 horas após a remoção do adesivo, correspondendo a uma avaliação 48 horas após a aplicação do adesivo, de acordo com a tabela 6. Tabela 6. - Classificação da irritação da pele para os produtos testados (em % de voluntários) 24 horas apôs remoção do adesivo .

Não foi observada reacção cutânea em nenhum dos voluntários para o "extracto hidro-glicólioo (2,5%)", enquanto para o "extracto hidro-glicólico (5%)" se observou ma reacção Cutânea duvida em apenas 1 voluntário.

Exemplo 5 - Avaliação da actividade anti-inflamatória

Os ensaios seguintes (pontos 5.1 e 5.2) foram realizados em linhas celulares de macrófagos de murganho (Raw 264.7) cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino ( FBS ) não inactivado, 100 U/mL penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina, a 37 °C numa atmosfera húmida de 95% de ar e 5% C0 ₂ . As células foram mantidas em meio de cultura (Ctrl) ou pré-incubadas com o extracto da presente invenção/hidro-glicólico do exemplo 1 ou com produtos do estado da técnica contendo extracto de noz e de romã durante 1 hora, e mais tarde activadas com 1 pg/mL de LPS durante períodos de tempo específicos.

A avaliação da significância estatística entre õs tratamentos fez-se através do teste ANOVA seguido de um teste de comparação múltipla de Dunnétt. Os testes estatísticos foram realizados com recurso ao GraphPad Prism, versão 5.0a (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA.) . Foram considerados significativos os seguintes valores : *p < 0,05 e ** *p < 0,001, quando comparados com as células submetidas a um estímulo pró- ihflâmatório (LPS) .

5.1. Produção de nitritos

O óxido nítrico (NO) é úm marcador biológico produzido em concentrações elevadas nos processos inflamatórios agudos e crónicos. É ura radical extremamente reactivo, inclusive com o anião superóxido, originando o peroxinitrito, que constitui um oxidante extremamente agressivo para o nosso organismo. Consequentemente, o impedimento da formação destes compostos, ou a sua inibição, constituem estratégias importantes para prevenir os danos celulares decorrentes da sua presença.

A concentração de NO foi inferida pela acumulação de nitritos no meio de cultura onde as células crescem (sobrenadante) e quantificada por recurso ao método colorimétrico com o reagente de Griess.

A capacidade de inibição da produção de NO foi analisada para o extracto da presente invenção e para produtos do estado da técnica contendo extracto de noz e de romã, na presença do estimulo inflamatório - lipopolissacarideo (LPS) durante 24 horas. Com este modelo in vitro de inflamação (macrófagos cultivados na presença do composto microbiano pró-inflamatóriô LPS) , ocorreu uma elevada produção de NO e, deste modo, foi possível avaliar a capacidade do extracto de inibir a formação de NO na presença do estimulo pró-inflamatóriô LPS e compará-la com os produtos do estado da técnica.

Os resultados são mostrados na Fig. 9 e demonstraram que, para doses não citotóxicas (0,625% e 0,3125%) e substancialmente inferiores às dos produtos do estado da técnica, o extracto possui maior capacidade de, inibição do NO (60 e 30%, respectivamente.) rela ivamente ao extracto de noz e uma eficácia idêntica à do extracto de romã.

5.2 Avaliação da expressão de moléculas envolvidas na inflamação

O factor nuclear de transcrição kappa B (NF-kB) desempenha um papel importante na activação de genes que codificam proteínas envolvidas na resposta inflamatória. O IkB-α encontra- se retido no citoplasma por uma proteína inibidora. Num episódio inflamatório, o IkB-α é fosforiladó, ubiquitinado e degradado, deixando assim o ^' NF-kB livre para migrar para. o núcleo e activar a transcrição de genes pró-inflamatórios , nomeadamente o gene iNOS que codifica a proteína produtora de óxido nítrico.

Para avaliar a actividade anti-inflamatória do extracto e avaliar o mecanismo molecular pelo qual este exerce o seu efeito, utilizou-se o ensaio imunológico com recurso a anticorpos específicos (Western blot) que permitiu quantificar a forma fosforilada e não fosforilada da proteína IkB-α, com a finalidade de verificar o envolvimento do factor de transcrição NF-kB na actividade anti-inflamatória do extracto.

Os resultados mostraram que o extracto de cortiça possui efeito anti-inflamatório, através da inibição parcial da fosforilação do IkB-α e da sua consequente degradação induzida pelo estímulo pró-inflamatório LPS durante 10 minutos, diminuindo assim a activação do factor de transcrição NF-kB (Fig. 10). Com este ensaio, comprovou-se a actividade anti- inflamatória do extracto, anteriormente verificada.

As sintases do óxido nítrico (NOS) são uma família de enzimas catalisadores da produção de óxido nítrico (NO) , a partir de L-arginina. Como referido anteriormente, o NO é uma importante molécula de sinalização celular envolvida em diversas respostas celulares, nomeadamente a resposta inflamatória. Deste modo, tornou-se essencial, verificar a expressão destes enzimas, em particular, da isoforma iNOS, directamente envolvida na produção de NO durante os processos inflamatórios para avaliar a actividade anti-inflamatória do extracto.

Este teste teve como objectivo a confirmação da eficácia anti-inflamatória (avaliada no exemplo 5.1), através da quantificação dos níveis proteicos da iNOS, na presença do estímulo inflamatório, o LPS, durante 24 horas. Para tal, utilizou-se a técnica de Western blot.

Os resultados., representados na Fig. 11, suportam os resultados obtidos anteriormente, confirmando a actividade anti- inflamatória do extracto, através da diminuição dos níveis do enzima iNOS.

As citocinas e as quimiocinas são mediadores envolvidos na resposta inflamatória. A sua produção, aumentada num grande número de doenças, torna estas moléculas bons alvos/modelos para rastrear novos produtos anti-inflamatórips , uma vez que durante o processo inflamatório ocorre um aumento na expressão dos genes que codificam citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (IL-Ιβ, IL-6, CCL5, TNF-α,...). Recorrendo ao ensaio de reacção em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real, foi possível quantificar os níveis de mRNA destes genes.

Este ensaio teve como objectivo comprovar a eficácia anti- inflamatória anteriormente verificada e investigar o seu mecanismo de acção recorrendo à quantificação dos níveis de mRNA de genes envolvidos na resposta inflamatória, nomeadamente das citocinas IL-Ιβ, IL-6, TNF-α e a quimiocina CCL5, por PCR. Como estímulo pró-inflamatório utilizou-se o LPS, Após pré-incubaçâo Com os extractos, durante 1 hora, as células foram incubadas com LPS durante 6 horas.

Nos resultados apresentados na Fig. 12, verificou-se que o extracto diminui, de maneira estatisticamente significativa, os níveis de IL-6, TNF- e CCL5, citocinas e quimiocina envolvidas na propagação da resposta inflamatória. No entanto, os níveis de

IL-Ιβ mantiveram-se praticamente inalterados na presença deste extracto, reforçando, o efeito selectivo do extracto ao nível de alguns mediadores inflamatórios.

Exemplo 6 - Avaliação do efeito do extracto na lipogénese

A produção de uma mistura de lípidos pelas glândulas sebáceas (vulgarmente denominada de sebo) é considerada um dos principais factores desencadeadores do acne. Actualmente, as estratégias terapêuticas que visam controlar esta patologia concentram-se no estudo dos mecanismos moleculares que regulam á produção de lípidos, ou seja na lipogénese. ^'

Utilizaram-se dois ensaios distintos, um qualitativo, com uma sonda que marca lípidos intracelulares (corante vermelho para marcação de lípidos - Oi 1 -Red) e outro quantitativo. 0 objectivo deste último ensaio consistiu na avaliação dos níveis dé vários genes codificadores dê proteínas quê regulam os processos de síntese de lípidos, nomeadamente: enzima sintase de ácidos gordos, enzima responsável pela síntese de ácidos gordos, Proteína 1 que liga a elementos reguladores de esteróis (SREBP- 1), factor de transcrição envolvido na síntese de colesterol, captação e síntese de ácidos gordos e enzima Acetil-CoA carboxilase (ACC) , enzima que catalisa o passo limitante na síntese de ácidos gordos. A transcrição destes genes é mediada pela activação do receptor nuclear e factor de transcrição LXR. Para este ensaio utilizou-se a técnica de PCR, de modo a quantificar os níveis destes genes na presença e ausência do agônista do LXR e indutor da lipogénese, o T0901317.

Utilizaram-se linhas celulares de queratinócitos humanos

(HaCaT) cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inactivado, 100 U/mL penicilina e 100 g/mL de estreptomicina, a 37 °C numa atmosfera húmida contendo 95% de ar e 5% de C0 ₂ . As células foram mantidas em meio de cultura (Ctrl) ou pré- incubadas com o extracto da presente invenção durante 1 hora e, posteriormente, activadas com 5 μΜ de T09 durante 8 horas (PCR) ou 24 horas (Oil Red) .

A avaliação da significância estatística entre os tratamentos fez-se através do teste t de Student. Os testes estatísticos foram realizados com recurso ao GraphPad Prism, versão 5.0a (GraphPad Software, San Diego, ÇA, EUA). Foram considerados significativos os seguintes valores: *p < 0,05.

Nos resultados apresentados na Fig. 13, verificõu-se a inibição da acumulação lipídica nos queratinócitos, na presença do extracto. Este efeito é corroborado com os resultados apresentados na Fig. 14, os quais sugerem que O extracto inibiu parcialmente a expressão do gene SREBP-1, envolvido na síntese de colesterol e ácidos gordos, revelando assim a sua contribuição para a redução dos processos de síntese de lípidos, Ou seja a lipogénese.

Exemplo 7 - Avaliação da protecção de ADN

Este ensaio teve por objectivo avaliar a protecção do ADN de células da camada mais superficial da pele, a epiderme, utilizando os extractos da presente invenção. Para tal, utilizaram-se linhas celulares de queratinócitos humanos (HaCaT) cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inactivado, 100 U/mL penicilina e 100 yg/mL de estreptomicina, a 37 °C numa atmosfera húmida contendo 95% de ar e 5% de CO ₂ . As células foram monitorizadas por observação ao microscópio óptico de modo a serem detectadas eventuais alterações morfológicas.

Analisou-se o extracto e o respectivo solvente (propilenogliçol) . O efeito preventivo da apoptose em queratinócitos foi avaliado após 3 e 24 horas de incubação celular com o extracto^ na presença e na ausência do estimulo pró-apoptótico, estaurosporina (ST), um inibidor de cinases de proteínas .

Para avaliar a capacidade do extracto reduzir a apoptose celular realizaram-se dois ensaios que consistiram na indução de apoptose celular por incubação dos queratinócitos com ST, que neste ensaio foi utilizada como indutor apoptótico. Na presença deste composto, as células apoptóticas sofreram condensação da cromatina e consequente condensação do núcleo celular.

O referido efeito foi visualizado utilizando duas metodologias distintas: o marcador fluorescente de ADN Hoechst 33258 (Fig. 15 e 16) e ainda, a sonda TÚNEL (Fig. 17 e 18).

Os resultados obtidos proporcionam informação sobre o número de células viáveis e células apoptóticas, por contagem em 9 campos aleatórios por condição, contendo aproximadamente 270 células por campo. Os resultados são expressos como média ± erro padrão (SEM) de, pelo menos, três ensaios independentes.

A análise dos resultados de protecção de ADN, em ambos õs ensaios, revelou que o extracto, quando incubado com os queratinócitos, durante 3 horas, na presença do indutor de apoptose, previne a formação de corpos apoptóticos. Para a incubação de 24 horas não se verificou protecção do ADN, mas também não se registou qualquer dano no ADN.

Exemplo 8 - Propriedades anti-rugas, despiqmentantes e refirmantes - Ensaios in vivo:

Avaliaram-sc as propriedades anti-rugas, déspigmentântes é refirmantes do extracto hidro-glicólico de cortiça da invenção, por meio de avaliações de pele, em 19 voluntários humanos.

Formulou-se 5% de extracto hidro-glicólico num produto cosmético facial e aplicou-se 2 vezes por dia, durante 28 dias. Os dias 0 e 28 corresponderam aos dias de avaliação pelo que não foram aplicados quaisquer produtos.

Firmeza

Para avaliar a firmeza da pele, utilizou-se o método de sucção na zona das maçãs do rosto, em triplicado, antes e após 28 dias de tratamento (Tabelas 5, 6 e 7).

Os parâmetros analisados para a firmeza/elasticidade da pele foram:

Uf - deformação total da pele (elástica e plástica)

Ua/Uf - índice de recuperação viscoélástica

Ur/Uf parâmetro de firmeza ou índice de recuperação elástica Tabela 7 - resultados médios de deformação plástica e elástica total (Uf) e diferenças médias, obtidos antes e após 28 dias de tratamento (D28: n=19)

* teste t: de Student dos resultados "antes dp tratamento" contra resultados "após 28 dias" .

A deformação total média da pele diminuiu 27,3% e observou- se uma diminuição significativa em todos os voluntários. Tabela 8 - resultados médios de índice de Recuperação

Viscoelástica (Uf) e diferenças médias, obtidos antes e após 28 dias de tratamento (D28: n=19)

teste t de Student dos resultados "antes do tratamento" contra resultados "após

Verificóu-se um aumento médio de 13,6% na recuperação viscoelástica da pele após o tratamento de 28 dias, em 17 voluntários. Deste modo,- a melhoria média entre estes voluntários traduziu-se num aumento de 15% do índice de recuperação viscoelástica. Tabela 9 - resultados médios de parâmetro de firmeza òu índice de recuperação elástica (Ur/Uf) e diferenças médias, obtidos antes e após, 28 dias de tratamento (D28: n=19)

* teste t. de Student dos resultados "antes do tratamento" contra resultados "após 28 dias" .

Observou-se um aumento médio de 22,5% do parâmetro de firmeza em todos os voluntários.

Análise da cor da pele

A cor da pele foi avaliada por três medições de uma mancha de melasma, nos dias 0 e 28, utilizando o parâmetro ITA:

ITA°=arctan (L-50) /b) *180/n èm que L representa o parâmetro de luminosidade e b representa a cromaticidade do eixo do amarelo ( +100) ao azul (-100) . Quanto maior ò valor de ITA, mais clara é a pele.

Na Tabela 10 apresentam-se os resultados obtidos, antes e após 28 dias de aplicação do produto contendo o extracto, para o parâmetro de cor da pele.

Tabela 10 - resultados da média aritmética de rugosidade e diferenças médias, obtidos antes e após 28 dias de tratamento (D28: n=19)

Os resultados obtidos no branqueamento da pele foram significativos em 84,2% dos voluntários.