【발명의 명칭】

티모신 베타 4 및 시트르산을 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물

【기술분야】

본 발명은 티모신 β 4 및 시트르산을 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

【배경 기술】

각막은 안구 앞쪽 표면에 있는 투명하고 혈관이 없는 조직으로 흔히 검은자위라고 하는 부분이다. 각막은 눈을 외부로부터 보호할 뿐만 아니라 빛을 통과， 굴절시켜 볼 수 있게 하는 투명한 조직으로 빛의 굴절과 전달에 주요한 가능을 하며 신경이 잘 발달되어 있어 외부의 이물질에 민감하게 반웅한다. 각막은 각막상피， 보우만막， 각막실질， 뒤경계판 (데스메막)， 각막내피 5개의 층으로 구성된다.

각막 표면은 외부에 직접 노출되어 있어 외상이나 스크래치에 취약하다. 특히， 눈물의 양이 부족하게 됨에 따라， 눈물에 의한 안구 보호 기능이 현저히 낮아져서 나타나는 안구건조증과 같은 질환을 겪고 있는 환자에서 각막 손상은 자주 발생한다. 각막이 손상될 경우 자극감， 이물감 또는 건조감 등의 자극 증상은 물론， 손상이 심각해 질 경우 각막염 등으호 발전할 수 있다. 따라서， 안구를 건강하게 유지하고 시력을 보존하기 위하여는 각막 손상을 예방하거나， 경미한 각막 손상이 악화되지 않도록 하거나， 손상된 각막을 치료하는 것이 필수적이다.

또한， 각막 손상， 특히 화학적 화상 (alkal i burn)에 의한 각막 손상에 있어 다형핵백혈구 (polymorphonuc lear leukocyte , BIN)의 광범위한 침투 ( inf i l trat ion)가 일어남은 잘 알려져 Invest. Ophthalmology Vis.

Sci. , 1987, 28， 295-304) , 이러한 Ρ丽의 침투는 조직 손상에 대한 일반적인 염증 반웅 중의 일부이다. 그러나 각막의 화학적 화상에 있어서는 이러한 Ρ丽의 침투가 일차적인 염증 반응일 뿐 아니라 궤양으로 발전하거나 각막 천공에 이르게 할 수도 있으며 (7 a/25. Am. Acad. Ophthalmol. Otolaryngol. , 1970, 74， 375-383, Invest. Ophthalmology Vis. Sci. , 1979, 18， 570-587) , 실제로 P丽은 각막의 콜라겐 조직을 파괴하는 콜라게나제를 활성화시키는 주요 원인으로 알려져 있다. 그러므로 P丽의 침투를 방지함으로써 병변의 확장을 막을 수 있으며 , P丽 대사를 저해함으로써 각막 상처가 궤양으로 진행되는 속도를 늦출 수도 있다. 이러한 P丽의 침투를 낮추는데 시트르산이 효과를 나타내는 사실은 여러 연구를 통하여 보고된 바 있다 {Exp. Eye. Res. , 1984, 39, 701-708) .

한편, 티모신 β4는 1981년에 흉선에서 처음으로 발견된 단백질로서， 41 ~ 43개의 아미노산으로 이루어져 있고， 등전점 (isoelectric point)이 5.1인 단백질이다ᅳ ₁₉₉₁ 년 리바 등에 의해 동물세포에서 액틴 -격리 분자 ( _ac tin- sequestering molecule)로 밝혀진 티모신 β4는 이후 면역 조절 및 신경내분비에도 관여함이 밝혀졌다. 최근， 대한민국 공개특허공보 제 10-2008- 33939호에는 티모신 β4와 아미노산 안정제를 포함하는 점안액 조성물에 대해 개시하였고， 벌킹제， 완층제， ρΗ 조절제를 추가적으로 포함하는 점안액 조성물을 개시하고 있다. 그러나 상기 대한민국 공개공보에는 티모신 4의 효능을 최적화하거나 증진시킬 수 있는 성분의 조합 및 함량에 대하여는 개시하고 있지 않다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명자는 티모신 β4의 효능을 최적화할 수 있는 성분와 조합， 및 각 성분의. 함량을 찾기 위해 노력하던 중, 특정 유기산이 티모신 4의 활성에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였고， 이러한 특정 유기산을 포함하는 조성물이 각막 손상치료에 활용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 티모신 β4 및 유기산을 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물， 상기 조성물을 포함하는 안과용 제제， 및 상기 조성물을 투여하는 각막 손상 치료방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 각막 손상 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한， 상기 조성물의 용도를 제공한다. 【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 티모신 β 4, 및 시트르산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 안과용 제제를 제공한다.

나아가， 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 각막 손상 치료방법을 제공한다.

더불에 본 발명은 각막 손상 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한， 상기 조성물의 용도를 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명의 조성물은 티모신 β 4와 시트르산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함함으로써， 티모신 β 4를 단독으로 사용했을 때보다 각막 상피 세포 이동 및 증식을 촉진시키고 손상된 각막에서 Ρ丽의 침투를 저해하여 각막 손상의 회복에 도움을 줄 수 있다. 또한， 티모신 β 4, 시트르산 및 아세트산을 동시에 사용할 경우， 티모신 4에 비해 우수한 세포 이동 및 증식 효능을 보이는 것과 동시에 이들 각각을 사용할 경우에 비하여 Ρ丽 침투를 낮추는데 효과를 보이므로， 티모신 β 4의 활용성을 높여 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물로 활용가능하다.

【도면의 간단한 설명】

도 1 내지 3은 티모신 β 4와 유기산을 흔합한 조성물을 처리한 후 세포 이동을 관찰한 것이다.

도 4는 티모신 β 4와 유기산을 흔합한 조성물에 따른 세포 증식 정도를 관찰한 것이다.

도 5는 티모신 β 4와 유기산을 흔합한 조성물의 Ρ丽 침투 억제 효과를 관찰한 것이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 일 측면으로， 티모신 β 4 및 시트르산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용조성물을 제공한다. 본 발명에서 사용하는 용어인 ''티모신 β 4"는 Thymosin bet a-4 또는 Τβ 4로 지칭되기도 하는 단백질로서， 최초 흉선으로부터 단리되었고， 여러 조직들에서 식별된 4.9 kDa의 43개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다. 상기 단백질은 시험관 내 내피 세포 이동 및 분화 중에 상향ᅳ조절되는 단백질로서， 많은 티모신 β 4 이소 ( iso) 형태들이 확인되었다.

본 발명의 티모신 β 4는， 티모신 β 4의 공지된 아미노산 서열과 약 또는 약 75%， 또는 약 80% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 티모신 β 4는 야생형의 티모신 β 4의 Ν-말단 변종, 및 티모신 4의 C-말단 변종에 적용될 수 있다. 구체적으로， 상기 티모신 β 4는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 본 발명에서 사용하는 시트르산은 구연산이라고도 하며， C ₆ ¾0 ₇ 의 화학식을 갖는 화합물이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 시트르산은 시트르산염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 시트르산염은 시트르산의 유도체로서， 일 구체예로는 시트르산 나트륨 또는 시트르산 삼나트륨일 수 있다.

상기 시트르산 또는 이의 염은 통상 pH 변화를 완화하기 위한 완층제로 사용되고 있으나， 본 발명에서 사용되는 시트르산 또는 이의 염은 통상적으로 사용되는 양에 비하여 많은 양을 사용하여야 한다. 이때， 상기 시트르산 또는 이의 염은 전체 조성물에서 1 %(w/v) 내지 15 %(w/v)가 포함될 수 있다. 구체적으로， 상기 시트르산 또는 이의 염은 전체 조성물에서 5 %(w/v) 내지 12 %(w/v) , 또는 10 %(w/v)가 포함될 수 있다.

상기 조성물은 티모신 β 4의 1 중량부에 대하여 10 내지 120 중량부와 시트르산 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 구체적으로， 상기 조성물은 티모신 β 4의 1 중량부에 대하여 10 내지 100 중량부의 시트르산 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로， 상기 조성물은 티모신 β 4의 1 중량부에 대하여 15 내지 100 중량부의 시트르산 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 조성물은 티모신 J34의 1 중량부에 대하여 50 내지 100 중량부의 시트르산 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어인 "각막 손상" 은 안구의 표면인 각막에 생긴 상처를 의미하며, 외부적인 층격뿐만 아니라 신체 내부에 의한 요인에 의해 생성될 수 있다. 이러한 상처는 각막상피， 보우만막， 각막실질, 뒤경계판 또는 각막내피의 부위 중 어느 하나에 생길 수 있는 상처를 포함한다. - 본 발명에서 사용하는 용어인 "중량 /부피 퍼센트" 또는 "%(w/v) " 은 용액 부피에 대한 용질의 질량으로 계산된 용액 내 용질의 질량 퍼센트를 나타내는 것으로， 일 예로 (w/v) 용액은 100 i 용액 내 1 g의 용질이 용해되어 있는 것을 의미한다. 상기 조성물은 아세트산, 아스코르브산, 또는 이의 염으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 유기산을 더 포함할 수 있다ᅳ

본 발명에서 사용되는 아세트산은 초산이라고도 지칭되는 CH ₃ C00H의 화학식을 갖는 약산이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 아세트산은 아세트산염의 형태로 사용될 수 있다. 아세트산염의 일 구체예는 아세트산나트륨일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 아스코르브산은 비타민 C라고도 지칭되는， C ₆ ¾0 ₆ 의 화학식을 갖는 약산이다. 또한， 본 발명에서 사용되는 아스코르브산은 염의 형태로 사용될 수 있다. 아스코르브산염의 일 구체예는 아스코르브산 나트륨일 수 있다.

상기 유기산은 통상 pH 변화를 완화하기 위한 완층제 또는 항산화제 등으로 사용될 수 있으나， 상기 유기산은 통상적으로 사용되는 양에 비하여 많은 양을 사용하여야 한다. 이때， 상기 유기산은 전체 조성물에 0.5 %(w/v) 내지 8 (w/v) , 또는 1.0 %(w/v) 내지 5 %(w/v)의 양으로 포함될 수 있다. 구체적으로， 상기 유기산은 전체 조성물에 1.5 %(w/v) 내지 5 %(w/v)의 양으로 포함될 수 있다.

상기 유기산은 시트르산 또는 이의 염 100 증량부에 대하여 15 내지 400 증량부의 양으로포함될 수 있다. 구체적으로， 상기 유기산은 시트르산 또는 이의 염 100 중량부에 대하여 15 내지 350 중량부， 15 내지 100 중량부， 15 내지 70 중량부， 또는 30 내지 100 중량부의 양으로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 유기산은 시트르산 또는 이의 염 100 중량부에 대하여 40 내지 60 중량부의 양으로 포함될 수 있다. 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 안과용 제제를 제공한다. 상기 제제는 용액， 로션 , 고약， 겔， 크림， 페이스트， 분무제， 현탁액， 분산액， 하이드로겔， 연고， 오일 또는 발포제 형태일 수 있다.

일 실시예에 따라， 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는， 특히 안과용으로 허용되는 비독성 부형제들 또는 담체와 흔합함으로써 제제화될 수 있다. 예를 들어， 아래 언급된 유형의 것들， 특히 담체， 안정제， 용해제， 완층제 기질， 보존제， 증점제， 긴장제 및 기타 부형제가 사용될 수 있다. 또한， 각각의 제제는 바람직한 pH로 조절되어 사용될 수밌다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 담체는 전형적으로 국소 투여 또는 범용 투여에 적절하고, 예를 들면 물, 물과 수-흔화성 용매들의 흔합물 [상기 수-흔화성 용매는 예를 들면， d 내지 C ₇ 알칸을류， 식물성 오일류 또는 미네랄 오일류 (예를 들면 0.5 내지 5 중량 %의 히드록시에틸셀를로스, 에틸 올레에이트， 카르복시메틸샐를로스， 폴리비닐―피를리돈 등)， 아크릴레이트류 (예를 들면 폴리아크릴산의 염류 또는 에틸 아크릴레이트) , 메타크릴레이트류, 폴리아크릴아미드류， 천연 생성물류 (예를 들면 젤라틴， 알기네이트류， 팩틴류， 트라가칸트， 카라야 검, 크산탄 검， 캐라기닌， 한천， 아카시아, 전분 유도체 (예를 들면 전분 아세테이트 및 히드록시프로필 전분) ) ]， 안과 용도의 기타 무독성 수- 용해성 중합체 (예를 들면 셀를로스 유도체 (예를 들면 메틸셀를로스， 카르복시메틸샐를로스의 알칼리금속 염들， 히드록시메틸셀를로스， 히드록시에틸셀를로스， 메틸히드록시프로필셀를로스 및 히드록시프로필샐를로스) )， 다른 합성 생성물들 (예를 들면 폴리비닐 알콜， 폴리비닐피를리돈; 폴리비닐 메틸 에테르， 폴리에틸렌 산화물， 가교된 폴리아크릴산 (예를 들면 중성 카보폴) )， 또는 이들 중합체들의 흔합물일 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 물, 샐를로스 유도체， (예를 들면 메틸셀를로스， 카르복시메틸샐를로스의 알칼리 금속염류， 히드록시메틸셀를로스， 히드록시에틸셀를로스, 메틸히드록시프로필셀를로스 및 히드록시프로필셀를로스)， 중성 카보폴, 또는 이들의 흔합물일 수 있다.

상기 안정제는， 예를 들어, 틸록사폴， 지방산 글리세를 폴리 -저급 알킬렌 글리콜 에스테르류， 지방산 폴리 -저급 알킬렌 글리콜 에스테르류， 폴리에틸렌 글리콜류， 글리세를에테르류 또는 이들 흔합물을 들 수 있다. 상가 안정제의 첨가량은 활성 성분인 상기 조성물을 용해시키기에 층분한 양일 수 있다. 상기 완층제는 보레이트계, 탄산 수소 /카르보네이트계， 글루코네이트계， 포스페이트계， 프로피오네이트계 및 트로메타민 (TRIS)계 완충제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 았다. 구체적으로 상기 완층제는 트로메타민계 완층제 또는 보레이트계 완층제일 수 있다. 상기 완층제 기질의 양은， 예를 들어/ 생리학상 허용되는 pH 범위를 보장하고 유지하는데 필요한 양일 수 있다. 상기 생리학상 허용되는 pH 범위는 pH 5 내지 9， 구체적으로， 6 내지 8.2， 더욱 구체적으로， 6.8 내지 8. 1일 수 있다.

상기 보존제는 4차 암모늄염 (예를 들면 세트리미드， 염화 벤잘코늄 또는 염화 벤족소늄)， 티오살리실산의 알킬 -수은 염류 (예를 들면 티메로살, 페닐머큐리산 나이트레이트， 페닐머큐리산 아세테이트 또는 페닐머큐리산 보레이트)， 파라벤류 (예를 들면 페닐파라벤 또는 프로필파라벤)， 알콜류 (예를 들면 클로로부탄을， 벤질 알콜 또는 페닐 에탄올)， 구아니딘 유도체 (예를 들면 클로로핵시딘 또는 폴리핵사메틸렌 비구아니드)， 또는 소르브산일 수 있다. 구체적으로， 상기 보존제는 4차 암모늄염 또는 파라벤류일 수 있다. 상기 보존제의 함량은 세균 및 진균에 의해 사용증에 유발되는 2차 오염을 막을 수 있는 양이라면 특별히 한정되지 않는다.

상기 긴장제는 목적물인 제제꾀 생리학적 강장성 (예， 0.9% 염수)을 조절하기 위해 사용되는 것이다. 상기 긴장제의 양은 부가되어야 하는 특정작용제에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어， 본 발명의 조성물은 150-450 mOsm, 보다 구체적으로， 250-350 mOsm의 안과용으로 허용되는 삼투성을 최종 조성물이 갖게 위해 긴장제가 첨가될 수 있다. 구체적으로， 상기 긴장제는 나트륨 염 또는 칼륨 염일 수 있다. 보다 구체적으로， 상기 긴장제는 염화나트륨 또는 염화칼륨일 수 있다. 예를 들면, 상기 긴장제는 염화나트륨， 칼륨 염화물， 염화칼슘， 덱스트로스 및 만니틀로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로， 상기 긴장제는 염화나트륨일 수 있다.

또한， 안과용 제제 내의 적절한 점도를 유지하기 위하여 다음 제형이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다: (a) 단량체성 폴리을류 (예를 들면， 틸록사폴， 글리세를， 프로필렌 글리콜， 에틸렌 글리콜) ; (b) 중합체성 폴리을류， (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (예, PEG 300 , PEG 400) )； (c) 셀를로스 유도체 (셀를로스 부류의 중합체들) (예를 들면， 히드록시에틸셀를로스， 히프로멜로스， 히드록시프로필메틸 샐롤로스， 메틸샐를로스， 카르복시메틸셀롤로스 소듐， 히드록실프로필샐를로스) ; (d)텍스트란류 (예를 들면， 덱스트란 70) ; (e) 수용성 단백질 (예를 들면， 젤라틴) ; ( f ) 비닐 중합체류 (예를 들면， 폴리비닐 알코을， 폴리비닐 피롤리딘) ; (g) 다른 폴리올류 (예를 들면， 폴리소르베이트 80， 포비돈) ; (h) 카르보머류 (예를 들면， 카르보머 934P, 카르보머 941 , 카르보머 940， 카르보머 974P) ; 및 ( 0 다당류 /글리코사미노글리칸류 (예를 들면， 히알루로난 (히알루로란산 /히알루로네이트) , 콘드로이탄 설페이트) .

부가된 부형제의 양 및 유형은 특정 요건들에 따라 달라질 수 있으나, 상기 안과용 제제 총 중량에 대하여 0.0001 내지 90중량 ¾ 범위에서 사용될 수 있으며， 통상 안과용 당업자가사용하는 범위 내에서 사용할 수 있다.

상기 안과용 제제의 pH 범위는 3.5 내지 9， 구체적으로， 4.5 내지 8， 보다 구체적으로， 5.5 내지 7.8， 더욱 구체적으로， 약 7.0 일 수 있다. 본 발명의 다른 측면으로， 상술한 바와 같은 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 각막 손상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 티모신 β 4 및 시트르산을 유효성분으로 함유하는 조성물을 유효량으로 눈 조직에 접촉시키는 단계를 포함하는 각막 손상의 치료 방법을 제공할 수 있다. 상기 투여의 실례는 예를 들면 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 포함하는 용액， 로션， 고약， ¾， 크림， 페이스트, 분무제， 현탁액， 분산액， 하이드로겔， 연고， 오일 또는 발포제에 의한 직접 도포에 의해 조직과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.

또한， 티모신 β 4 및 시트르산 또는 이의 염은 병용 투여 또는 순차적으로 투여될 수 있으며， 일일 수회에 나누어 적정량으로 투여될 수 있다. 하지만， 가장 바람직한 형태의 투여 방법은 티모신 4 및 시트르산 또는 이의 염을 동시에 병용투여하는 것이다. 상가 조성물은 총 조성물 기준으로 0.05 내지 0.5 %(w/v)의 티모신 β 4를 포함하며， 일일 총 0.08 내지 2.0 의 용량으로 투약될 수 있다. 즉， 티모신 β 4는 일일 0.04 내지 10 mg의 용량으로 투약될 수 있다. 구체적으로， 상기 조성물은 총 조성물 기준으로 0. 1 내지 0.4 %(w/v)의 티모신 4를 포함할 수 있다. 또한， 상기 티모신 β 4를 포함하는 조성물은 일일 1회 또는 수회에 나누어 투여될 수 있으며， 구체적으로， 일일 2회 내지 5회에 걸쳐 투여될 수 있다.

나아가， 상기 조성물은 총 조성물 기준으로 1.0 내지 10 %(w/v)의 시트르산 또는 이의 염을 포함하며， 일일 총 0.1 내지 4.0 의 용량으로 투약될 수 있다. 즉， 시트르산 또는 이의 염은 일일 1 내지 400 mg의 용량으로 투약될 수 있다. 또한， 상기 시트르산 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 일일 1회 또는 수회에 나누어 투여될 수 있으며, 구체적으로， 일일 2회 내지 5회에 걸쳐 투여될 수 있다.

또한， 아세트산， 아스코르브산， 또는 이의 염은 티모신 β 4 및 시트르산 또는 이의 염과 병용 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있다. 구체적으로， 아세트산， 아스코르,브산, 또는 이의 염은 티모신 4 및 시트르산 또는 이의 염과 동시에 투여될 수 있다. 또한， 상기 조성물은 총 조성물 기준으로 0.5 내지 8 (w/v) , 또는 1.0 내지 5 ¾>(w/v)의 아세트산， 아스코르브산， 또는 이의 염올 포함하며， 일일 총 0.1 내지 4.0 i 의 용량으로 투약될 수 있다. 즉, 아세트산, 아스코르브산， 또는 이의 염은 일일 1 내지 400 mg의 용량으로 투약될 수 있다. 또한， 상기 아세트산, 아스코르브산， 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 일일 1회 또는 수회에 나누어 투여할 수 있으며， 구체적으로, 일일 2회 내지 5회에 걸쳐 투여될 수 있다.

본 발명의 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물의 투여 경로의 예는 경피 (이를 테면， 국소) 투여 형태가 바람직하며， 비경구， 비강내 (이를 테면， 흡입)， 점액막을 통한 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한， 상기 치료방법은 각막 손상 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상， 예를 들어， 포유류 동물， 보다 구체적으로 인간일 수 있다. 또한, 본 발명은 각막 손상 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 티모신 β 4, 및 시트르산 또는 이의 염을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기 조성물은 시트르산， 아세트산 및 이의 염을 추가적으로 포함할 수 있다.

【발명의 실시를 위한 형태】 이하， 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나， 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며， 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예 1. 티모신 β 4를 포함하는 조성물의 제조 멸균조제용수에 시트르산나트륨이 총 조성물을 기준으로 1.5 %(w/v)이 되도록 정량하고, 시약이 다 녹을 때까지 흔합한 뒤， 흔합된 용액에 약물인 티모신 β 4 (Bachem , US , 서열번호 1)를 0. 1 %(w/v)만큼 넣고 다 녹을 때까지 흔합하였다. 위 흔합 공정을 마친 용액을 수산화나트륨 및 염산을 이용하여 산도를 7.0으로 조정하였다. 그 후， 위 조정 공정을 거친 용액을 0.2 im 필터에 여과시킨 후， 위 여과 공정을 거친 흔합액을 저밀도 폴리에틸렌 용기에 층전한 후 밀봉하였다. 실시예 2 내지 11 및 비교예 1 내지 6. 티모신 β 4를 포함하는조성물의 제조 실시예 1과 동일한 방법으로 하기의 표 1과 같은 조성의 조성물을 제조하였다. 하기의 표 1에서 별도의 표시가 없는 수치의 단위는 총 조성물을 기준으로 한 농도인 %(w/v)이다.

【표 1】

또한， 실시예 1과 동일한 방법으로 하기의 표 2와 같은 조성의 조성물을 제조하였다. 하기의 표 2에서 별도의 표시가 없는 수치의 단위는 총 조성물을 기준으로 한 농도인 %(w/v)이다.

【표 2】

실험예 1. 세포 이동 실험

1차 인간 각막 상피 세포 (primary human corneal epi thel ial cel ls , HCEO CATCC, US) 를 6웰 플레이트 (Thermo, Ltd)에 웰당 3 X 10 ⁵ 세포를 접종한 후， 단층 세포층을 형성하게 하였다. 그 후， 각 웰의 중간을 1 m£의 멸균 파이펫팁으로 유사한 크기의 스크레치를 만들었다. 배양액으로 세척하여 세포 잔해들을 제거한 후， 상기 실시예 1 내지 11 및 비교예 1 내지 6에서 제조한 티모신 β 4를포함하는 조성물을 플레이트에 첨가하였다.

그 후 Oh, 6h, 12h 및 24h 후에 각 웰을 역상 현미경에 디지털 카메라를 결합하여 촬영하였다. 스크레치의 크기는 세포의 이동에 의해 줄어들며, 이는 각막 손상와 치료 효과의 정도를 나타내는 것으로 판단하였다.

실험 결과， 도 1 내지 3에서 보여지는 바와 같이 티모신 β 4만 유효성분으로 포함하는 조성물에 비하여， 티모신 β 4에 시트르산을 포함하는 조성물의 경우 세포의 이동이 촉진됨을 확인하였다. 또한， 티모신 β 4, 시트르산 및 아세트산을 포함하는 조성물의 각막 상피 세포의 이동을 가장 현저하게 촉진시켰음을 확인하였다. 실험예 2. 세포 증식 실험 티모신 β4를 포함하는 조성물이 1차 인간 각막 상피 세포의 증식을 촉진시키는지 확인하기 위하여， CCK-8 키트 (Dojindo, Japan)를사용하여 세포들을 염색하였다. 96웰 플레이트 (Thermo, Ltd)에 웰당 100 ^ 내에 3 X 10 ³ 세포를 접종한 후， 상기 대조군， 실시예 1， 실시예 3， 실시예 4, 및 비교예 3에서 제조한 티모신 β4를 포함하는 조성물을 첨가하였다.

상기 티모신 β4를 포함하는 조성물 투여 후， 12h, 24h 및 48h후에 CCK-8 시약 10 를 첨가하고 , 37 ^° C에서 2시간 배양하였다ᅳ 마이크로풀레이트 리더기로 450 ran 파장으로 흡광도 (optical density, 0D ₄₅₀ )를 측정하였다. 측정 결과, 티모신 β4만 포함된 조성물에 비해， 티모신 β4와 시트르산을 포함하는 조성물， 및 티모신 β4와 시트르산， 아세트산을 포함하는 조성물이 세포 증식이 촉진됨을 확인하였다 (도 4 참조). 실험예 3. 동물 모델에서 티모신 베타 4， 시트르산 및 혼합물의 치료 효과 측정

3.1. 화학적 화상 동물 모델 제조 상처치료 효과 실험을 위해서 6 내지 8 주령 마우스 (BALB/c)를 에테르로 마취한 후， 1 N NaOH를 적신 등근 여과지 (filter paper , 2 mm diameter)를 각막 중앙부에 30초간 접촉하여 각막 상피에 손상을 유발하였다. 0.9% 생리식염수로 5초간 세척한 후， 각각 0.9% 생리 식염수， 실시예 3， 실시예 4， 및 대조군의 조성물을 각막 손상 유발 후 5분 후에 점안하고， 이후로부터 1일 4회 (20 πι / 1회) 점안하였다.

3.2. Myeloperoxidase (MP0) 활성 검토 종래 보고된 방법 0¾σ. Eye Res., 1984, 39, 261-265)을 사용하여 Myeloperoxidase 활성 분석을 통한 상기 조성물 (0.9% 생리 식염수， 실시예 3， 실시예 10， 및 대조군)을 투여한 각막에서의 P丽을 정량하였다. MP0의 활성은 P丽의 수에 비례한다.

각막 손상 1일， 7일， 14일 후， 각 조성불을 투여한 마우스 (n = 3/군， 각 시점)의 각막을 적출하여 0.5% HTABChexadecyl tr imethylammonium bromide)를 함유한 50 mM 인산버퍼 (pH 6.0) 1 ^를 함유한 바이알에서 잘게 썰고, 얼음상에서 폴 리트론 균질기를 이용하여 균질화하.였다. 균질 후， 균질기를 HTAB 용액으로 세정하였다. HTAB를 첨가하여 균질액을 1 당 100 mg 조직이 되도록 조정하였고， 10초 동안 초음파처리하고， 3회 넁동 및 해동을 하며， 4 ^° C , 14000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액 0. 1 를 0. 167 mg/i o_디아니쉬딘 염산 (으 di ansidine dihydrochlor ide) 및 0.0005% 과산화수소를 함유한 50 mM 인산완층액 (pH 6.0) 2.9 과 흔합하였다. 460 nm에서의 흡광도 변화를 25 ^° C에서 5분 동안 UV 분광분석기를 이용하여 측정하였다. MP0 활성 1 uni t는 25 ^° C에서 1분마다 1 μ πι이의 과산화물을 분해하는 것으로 정의하였다.

측정 결과， 생리 식염수나 티모신 β 4만이 포함된 조성물에 비해， 티모신 β 4와 시트르산을 포함한 조성물, 시트르산과 아세트산을 포함한 조성물이 Ρ丽 침투를 억제함을 확인하였다 (도 ^' 5 참조) .