Composition cosmétique comprenant un ou plusieurs composés de type β-(l,3)- glucuronane ou β-(l,3)-glucoglueuronane

La présente invention concerne une composition cosmétique comprenant un ou plusieurs composés de type β-(l,3)-glucuronane ou β-(l,3)-glucoglucuronane ainsi que leur sel pharmaceutiquement acceptable, et l'utilisation de cette composition et de ces composés pour diverses applications cosmétiques.

Les glucuronanes sont des polysaccharides naturels ou des polysaccharides naturels oxydés par voie chimique, contenant des taux significatifs de segments d'acides glucuroniques liés par des liaisons de type β-(l,3), β-(l,4), α-(l,3) ou α-(l,4). A titre d'exemple, on peut citer les glucuronanes bactériens et fongiques (Dantas L. et al, Carbohydr. Res. 1994, 265, 303-310; De Ruiter G.A. et al, Carbohyd. PoI. 1992, 18, 1-7 ; Park J.K. et al, Carbohyd. PoL 2006, 63, 482-486).

Des études antérieures ont montré que des acides polyglucuroniques pouvaient être obtenus par voies d'oxydations chimiques dites régiosélectives de polysaccharides naturels. Notamment, l'oxydation de polysaccharides par le dioxyde d'azote (NO ₂ ZN ₂ O ₄ ), comme agent oxydant, est une réaction souvent utilisée. Ainsi, Vignon et al., dans la demande de brevet français FR A 2 873 700, ont décrit une réaction d'oxydation de la cellulose dans un gaz inerte à l'état supercritique à l'aide du dioxyde d'azote comme agent oxydant. Les acides polyglucuroniques obtenus par ce procédé présentent un taux d'acide carboxylique en pourcentage massique allant jusqu'à 25,5% dans le cas de la cellulose. Cependant, ce type de procédés présente les inconvénients inhérents aux manipulations de gaz sous pression. De même, il a été montré que l'usage du réactif TEMPO en milieu hypochloride de sodium permettait aussi l'oxydation regiosélective des fonctions alcool primaire de certains monosaccharides (N. J. Davis and S. L. Flitsch, Tetrahedron Letters 1993, 34(7), 1181-1184). Par un procédé similaire, Vignon et al., dans la demande de brevet internationale WO 03/035699, décrivent l'oxydation par l'utilisation du réactif TEMPO de polyanhydroglucoses estérifiés et plus particulièrement d'esters de cellulose. Le procédé décrit par Vignon nécessite de travailler avec des celluloses estérifiées hydrosolubles ou hydrodispersables. Les produits obtenus par ce procédé présentent de nombreuses applications.

Ainsi, la demande de brevet WO 91/04988 décrit l'utilisation de tels composés comme agent complexant, additif, support, stabilisant ou solubilisant, alors que la demande de brevet US 2003/0209336 décrit l'utilisation de tels composés comme additif pour papier.

Ces composés n'ont jamais été utilisés ni décrits comme ayant une quelconque activité dans le domaine cosmétique.

Or, il a maintenant été découvert, de façon totalement surprenante, que ces composés pouvaient être utilisés pour la préparation de compositions cosmétiques ayant des activités très diverses. Ainsi, il a par exemple été mis en évidence dans le cadre de la présente invention que les compositions cosmétiques comprenant, à titre de principe actif, un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)-glucoglucuronanes, présentaient des propriétés diverses et variées telles que des propriétés amincissantes, anti-cellulite, raffermissantes, hydratantes, antimicrobiennes, anti-oxydantes, antiradicalaires, cicatrisantes, tenseurs, anti-rides, chélatantes, complexantes et séquestrantes, apaisantes, anti-cernes, anti-rougeurs, émolliantes, démêlantes capillaire, anti-pelliculaires, stimulantes de la repousse du cheveu, gainantes capillaire, épilatoires, limitant de la repousse du poil, participant au renouvellement cellulaire, modulant la réponse inflammatoire ou encore participant au maintien de l'ovale du visage.

La présente invention a donc pour objet une composition cosmétique comprenant, à titre de principe actif, un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)- glucoglucuronanes de formule (I) :

dans laquelle :

- R ₁ , R ₂ et R ₃ , identiques ou différents, choisis indépendamment pour chaque unité glucose, représentent un groupe hydroxy, alkyloxy, acyloxy ou sulfonyloxy;

- R, choisi indépendamment pour chaque unité glucose, représente un groupe carboxy, alkoxycarbonyl, acyl, ou un groupement -CH ₂ R ₄ , où R ₄ représente un groupe hydroxy, alkyloxy, acyloxy, sulfonyloxy, sulfmyl ;

- n est choisi de telle manière que les poids moléculaires moyens soient compris entre 500 et 4 000 000 Daltons ; et où au moins 0,1% des groupements R, choisis indépendamment pour chacune des unités glucose concernées, représentent un groupe carboxy, alkoxycarbonyl, acyl ; ainsi que leur sel pharmaceutiquement acceptable.

Dans le cadre de la présente invention :

- les expressions « degré d'oxydation » et « poids moléculaire » utilisés ci-après se réfèrent indifféremment à la molécule seule ou au mélange de molécules et représentent alors dans ce cas une valeur moyenne ;

- l'expression « taux d'oxydation d'un β-(l,3)-glucuronanes et/ou β-(l,3)- glucoglucuronanes » utilisé ci-après désigne le pourcentage d'unités glucuroniques ou d'unités dérivées de l'acide glucuronique présentes dans l'enchaînement d'unités dudit β-(l,3)-glucuronanes et/ou β-(l,3)-glucoglucuronanes. Plus précisément, ledit taux d'oxydation selon la présente invention est caractérisé par le pourcentage de groupements R représentant un groupe carboxy, alkoxycarbonyl ou acyl, par rapport à l'ensemble des groupements R ;

- on entend par un groupe alkyle, une chaîne hydrocarbonée saturée, monovalente, linéaire ou ramifiée, comportant de 1 à 6 atomes de carbone, dont des éléments représentatifs sont par exemple les suivants : les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, sec-butyle, iso-butyle, tert-butyle, pentyle, hexyle.

- le terme « alkyle » tel que défini ci-dessus conserve la même définition quand il intègre le nom d'un groupe, par exemple dans le groupe alkyloxy. Ainsi, parmi les groupes alkyloxy, des éléments représentatifs sont les suivants : les groupes méthoxy, éthoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy, iso-butoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentyloxy ;

- on entend par « sel pharmaceutiquement acceptable » tout sel d'addition avec un acide minéral ou organique par action d'un tel acide au sein d'un solvant organique ou aqueux tel qu'un alcool, une cétone, un éther ou un solvant chloré, et qui soit acceptable d'un point de vue pharmaceutique. A titre d'exemple de tels sels, on peut citer les sels suivants : benzènesulfonate, bromhydrate, chlorhydrate, citrate, éthanesulfonate, fumarate, gluconate, iodate, iséthionate, maléate, méthanesulfonate, méthylène-bis-b-oxynaphtoate, nitrate, oxalate, palmoate, phosphate, salicylate, sulfate, tartrate, théophyllinacétate et p-toluènesulfonate.

Préférentiellement, la présente invention a pour objet une composition cosmétique comprenant, à titre de principe actif, un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)-glucoglucuronanes de formule (I) telle que définie ci-dessus, et dans laquelle les caractéristiques suivantes sont choisies seules, ou en combinaison : - R ₁ , R ₂ et R ₃ , identiques ou différents, sont choisis indépendamment pour chaque unité glucose, représentent un groupe hydroxy, alkyloxy, ou sulfonyloxy, de préférence un groupe hydroxy ou alkyloxy ;

- R, choisi indépendamment pour chaque unité glucose, représente un groupe carboxy, acyl, ou un groupement -CH ₂ R ₄ , où R ₄ représente un groupe hydroxy, alkyloxy, sulfonyloxy, de préférence un groupe hydroxy ou alkyloxy;

- n est choisi de telle manière que les poids moléculaires moyens soient compris entre 500 et 4 000 000 Daltons, de préférence de 500 à 200 000 Daltons, plus préférentiellement encore inférieure à 5000 Daltons et les degrés de polymérisation desdits oligo- et/ou polysaccharides sont de l'ordre de 25 ; - les composés de formule (I) présentent un taux d'oxydation d'au moins 5%, préférentiellement d'au moins 30%, préférentiellement encore d'au moins 90%. De façon toute à fait préférée, les composés de formule (I) sont 100% oxydés.

Plus préférentiellement encore, la présente invention a pour objet une composition cosmétique comprenant un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)- glucoglucuronanes de formule (I) telle que définie ci-dessus, et dans laquelle les groupements R ₁ , R ₂ et R ₃ représentent un groupe hydroxyle et les groupements R représentent un groupe carboxy ou un groupe -CH ₂ OH. Plus préférentiellement encore, la présente invention a pour objet une composition cosmétique comprenant un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)-glucoglucuronanes de formule (I) telle que définie ci-dessus, et dans laquelle les groupements R ₁ , R ₂ et R ₃ représentent un groupe hydroxyle et les groupements R représentent un groupe carboxy ou un groupe -

CH ₂ OH, lesdits composés présentant un taux d'oxydation d'au moins 95%.

La présente invention concerne plus particulièrement une composition cosmétique comprenant, à titre de principe actif, un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes de formule (II) :

(H) dans laquelle n est choisi de telle manière que les poids moléculaires moyens soient compris entre 500 et 2 500 000 Daltons.

Préférentiellement, la présente invention a pour objet une composition cosmétique comprenant, à titre de principe actif, un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes de formule (II) telle que définie ci-dessus, et dans laquelle n est choisi de telle manière que les poids moléculaires moyens soient compris entre 500 et 200 000 Daltons, préférentiellement entre 500 et 5000 Daltons.

De façon toute à fait préférée, la présente invention a pour objet une composition cosmétique comprenant, à titre de principe actif, un ou plusieurs β-(l,3)- glucuronanes ou β-(l,3)-glucoglucuronanes possédant différents degrés d'oxydation, linéaires et non ramifiés sélectionnés parmi :

- l'acide β-(l,3)-D-polyglucuronique ayant des masses molaires comprises entre 500 et 2 500 000 Daltons ;

- l'acide β-(l,3)-D-polyglucuronique peracétylé ayant des masses molaires comprises entre 600 et 3 500 000 Daltons; et - l'acide β-(l,3)-D-polyglucuronique, sulfaté en positions C2 et C4 ayant des masses molaires comprises entre 800 et 4 000 000 Daltons.

Les composés de type β-(l,3)-glucuronanes et/ou β-(l,3)-glucoglucuronanes tels que définis ci-avant peuvent être préparés selon des procédés bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemple de tels procédés, on peut citer le procédé de préparation à partir d'au moins un β-(l,3)-glucane linéaire, non ramifié et non estérifié, comprenant au moins une opération d'oxydation régiosélective en position C6 desdits β-(l,3)-glucanes à l'aide de 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-l-oxyle (TEMPO) et d'au moins un co-additif hypochlorite de métal alcalin. De façon préférentielle, ladite étape d'oxydation régio-sélective du procédé selon la présente invention, est effectuée à l'aide de 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-l-oxyle (TEMPO), et à l'aide d'un co-additif hypochlorite de métal alcalin associé à un bromure de métal alcalin. De façon préférentielle encore, le co-additif hypochlorite de

métal alcalin est Phypochlorite de sodium et le bromure de métal alcalin est le bromure de sodium.

Ledit β-(l,3)-glucane linéaire, non ramifié et non estérifié mis en œuvre pour réaliser le procédé selon l'invention sera ci-après dénommé par « substrat ». Ledit substrat peut être un β-(l,3)-glucane linéaire, non ramifié et non estérifié obtenu par synthèse ou hémisynthèse, ou bien être d'origine naturelle, de préférence bactérienne. Ledit substrat peut présenter une masse molaire en poids de l'ordre de 500 à 2 500 000 Daltons.

De façon préférentielle, ledit substrat est choisi parmi les β-(l,3)-glucanes linéaires, non ramifiés et non estérifiés, hydrosolubles (solubilité d'au moins 1 g/1 dans l'eau de pH alcalin) ou ne formant pas d'agrégat dans le temps.

Un substrat préféré est le curdlane, un β-(l,3)-glucane linéaire, non ramifié d'une taille moléculaire d'environ 2 000 000 à 2 500 000 Daltons, et produit notamment par les bactéries du genre Agrobacterium et Rhizobium. L'étape d'oxydation sélective est généralement opérée selon la méthode décrite dans la demande de brevet FR A 2 831 171.

Différents degrés d'oxydation des β-(l,3)-glucoglucuronanes préparés par ledit procédé peuvent être obtenus en contrôlant, par exemple, le temps de réaction de ladite étape d'oxydation sélective. En particulier, une oxydation complète du substrat peut être obtenue. Ainsi, ladite réaction d'oxydation sélective peut être arrêtée, par exemple, par addition d'un acide minéral tel que les acides chlorhydrique ou sulfurique. Les β-(l,3)- glucuronanes et/ou β-(l,3)-glucoglucuronanes peuvent être éventuellement précipités au moyen d'un alcool comme Péthanol. Les β-(l,3)-glucuronanes et/ou β-(l,3)- glucoglucuronanes obtenus à la suite de l'étape d'oxydation peuvent être éventuellement purifiés par toute méthode connue habituelle, par exemple resolubilisation, lavage, dialyse, ou nano et ultrafiltration tangentielle.

Ainsi, un procédé préféré est celui qui permet d'obtenir des β-(l,3)- glucoglucuronanes présentant au moins 95% des groupements R constitués d'un groupe carboxy ou des β-(l,3)-glucuronanes. Afin de moduler les propriétés des β-(l,3)-glucuronanes et/ou β-(l,3)- glucoglucuronanes obtenus, ladite étape d'oxydation sélective dudit procédé peut être suivie des deux étapes suivantes, dans un ordre quelconque : a) une opération de fonctionnalisation chimique par des fonctions choisies parmi: methyle, methyloxy, ethyle, ethyloxy, butyl, butyloxy, isobutyle, isobutyloxy, propyl, propyloxy, isopropyle, isopropyloxy, sulfate, sulfoacetate, acétate, propionate, acetobutyrate, acetopropionate, glycerate ou phosphoryl ;

b) une opération de dégradation chimique et/ou physique et/ou enzymatique.

De façon préférentielle, ladite étape d'oxydation sélective dudit procédé peut être suivie des deux étapes suivantes, dans un ordre quelconque : c) une opération de fonctionnalisation chimique par des fonctions choisies parmi: methyle, methyloxy, ethyle, ethyloxy, butyl, butyloxy, sulfate, sulfoacetate, ou phosphoryl ; d) une opération de dégradation chimique et/ou physique et/ou enzymatique. Lesdites étapes peuvent être effectuées suivant les méthodes connues. Les β-

(l,3)-glucuronanes et/ou β-(l,3)-glucoglucuronanes intermédiaires et/ou finaux obtenus à la suite de l'une quelconque des étapes ou des deux étapes dudit procédé peuvent être éventuellement purifiés par toute méthode connue habituelle, par exemple resolubilisation, lavage, élimination des sels par dialyse, nano- ou ultrafiltration tangentielle.

Les β-(l,3)-glucuronanes et/ou β-(l,3)-glucoglucuronanes représentés par les formules (I) ou (II) ou les produits intermédiaires obtenus par le procédé de la présente invention peuvent être purifiés par les méthodes connues habituelles, par exemple par resolubilisation, lavage, dialyse ou nano- ou ultrafiltration tangentielle.

Les compositions selon la présente invention peuvent être formulées sous forme galénique : crèmes, gels, lotions, laits, émulsions huile dans eau ou eau dans huile, solutions, onguents, pulvérisateurs, huiles corporelles, lotions capillaires, shampooings, lotions après-rasage, savons, bâtons protecteur des lèvres, bâtons et crayons pour maquillage à des teneurs de 0,01% à 75% en poids, préférentiellement entre 0,01% et 25% sous forme de poudre et à des teneurs comprises entre 0,01% et 35%, préférentiellement entre 0,01% et 15% sous forme encapsulée.

Pour la préparation de ces compositions, un ou plusieurs composés de type β- (l,3)-glucuronane ou β-(l,3)-glucoglucuronane ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont mélangés aux excipients généralement employés dans la technique cosmétique. Les compositions selon la présente invention peuvent prendre la forme d'une crème dans laquelle un ou plusieurs composés de type β-(l,3)-glucuronane ou β-(l,3)- glucoglucuronane ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont associés aux excipients couramment utilisés dans la cosmétologie.

Les compositions selon la présente invention peuvent prendre la forme de gels dans les excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autres agents gélifiants, tels que le carbopol, la gomme guar, etc.

Les compositions selon la présente invention peuvent aussi prendre la forme d'une lotion ou d'une solution dans lesquelles un ou plusieurs composés de type β- (l,3)-glucuronane ou β-(l,3)-glucoglucuronane ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont sous forme encapsulée. Les microsphères suivant l'invention peuvent par exemple être constituées de corps gras, d'agar et d'eau. Un ou plusieurs composés de type β-(l,3)-glucuronane ou β-(l,3)-glucoglucuronane ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être incorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, cyclodextrines, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules et aussi être absorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux.

Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuvent être conservées pendant le temps nécessaire pour l'utilisation à des températures comprises entre 0 et 50 ⁰ C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ou séparation des phases. Les compositions selon la présente invention peuvent aussi contenir des additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologies, comme par exemple des agents antimicrobiens ou des parfums mais aussi des lipides d'extraction ou de synthèse, des polymères gélifiants et viscosants, des tensio-actifs et des émulsifiants, des principes actifs hydro- ou liposolubles, des extraits de plantes, des extraits tissulaires, des extraits marins, des actifs de synthèse.

Les compositions selon la présente invention peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, par exemple pour l'effet amincissant, l'effet anti-cellulite, l'effet raffermissant, l'effet hydratant, l'activité antimicrobienne, l'activité anti-oxydante, l'activité antiradicalaire, l'effet cicatrisant, l'effet tenseur, l'effet anti-ride, l'activité chélatante, l'activité complexante et séquestrante, l'effet apaisant, l'effet anti-cernes, l'effet anti-rougeurs, l'activité émolliente, l'effet démêlant capillaire, l'activité anti-pelliculaire, l'effet stimulant de la repousse du cheveu, l'effet gainant capillaire, l'activité épilatoire, l'activité limitant la repousse du poil, l'activité participant au renouvellement cellulaire, l'activité modulant la réponse inflammatoire, l'activité participant au maintien de l'ovale du visage, mais également la protection solaire, l'activité anti-irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire, les traitements anti-séborrhéiques, la tonicité cutanée, Ia protection du cheveu.

Lorsque les compositions selon la présente invention contiennent des principes actifs complémentaires, ceux-ci sont généralement présents dans la composition à une concentration suffisamment élevée pour qu'ils puissent exercer leur activité.

Les compositions selon la présente invention sont de préférences à utiliser quotidiennement en les appliquant une ou plusieurs fois par jour.

Les compositions selon la présente invention sont très bien tolérées, elles ne présentent aucune toxicité et leur application sur la peau, pour des périodes de temps prolongées, n'implique aucun effet systématique.

Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées pour de nombreuses applications cosmétiques . A titre d'exemple, on peut citer l'utilisation d'une composition selon la présente invention comme composition amincissante, composition anti-cellulite, composition raffermissante, composition hydratante, composition antimicrobienne, composition anti-oxydante, composition antiradicalaire, composition cicatrisante, composition tenseur, composition anti-rides, composition chélatante, composition complexante et séquestrante, composition apaisante, composition anti-cernes, composition anti-rougeurs, composition émolliente, composition démêlante capillaire, composition anti-pelliculaire, composition stimulante de la repousse du cheveu, composition gainante capillaires, composition épilatoire, composition limitant la repousse du poil, composition participant au renouvellement cellulaire, composition modulant la réponse inflammatoire, composition participant au maintien de l'ovale du visage. De façon préférée, la composition selon la présente invention est utilisée comme composition amincissante, composition anti-cellulite, composition raffermissante, composition cicatrisante, composition anti-rides, compositions anti-cernes ou composition anti-inflammatoire. De façon toute à fait préférée, la composition selon la présente invention est utilisée comme composition amincissante.

Il a en effet été découvert que les composés β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)- glucoglucuronanes de formule (I) tels que définis selon la présente invention induisent la production et l'organisation de fibrilles de collagène responsable de la réorganisation de la matrice extra-cellulaire couplée à une modulation de la réponse immunitaire. De ce fait ces composés peuvent être utilisés pour le renouvellement cellulaire, pour la modulation de l' inflammation, comme apaisants et comme hydratants. II a également été découvert que les composés β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)- glucoglucuronanes de formule (I) tels que définis selon la présente invention présentent

des propriétés cosmétiques amincissantes lorsqu'elles sont appliquées par voie topique ou par voie générale. En effet, ces composés entrainent la surexpression du gêne ANGPTL4 qui code pour l'adipokine qui possède notamment la propriété d'inhiber l'activité de l'enzyme lipoprotéine lipase (LPL) qui est fixée sur l'endothélium vasculaire accolé aux tissus adipeux. L'inhibition enzymatique empêche le transfert des acides gras depuis les lipoprotéines vers les adipocytes diminuant ainsi fortement la Iipogénèse. De plus, l'adipokine possède la propriété d'activer l'enzyme ATGL (Adipose Triglycéride Lipase), présente dans les adipocytes. Cette activation enzymatique augmente ainsi fortement la lipolyse et la libération des acides gras des adipocytes.

Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un ou plusieurs β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)-glucoglucuronanes de formule (I) tels que définis selon la présente invention comme agent amincissant, comme agent anti- cellulite, comme agent raffermissant, comme agent hydratant, comme agent antimicrobien, comme agent anti-oxydant, comme agent antiradicalaire, comme agent cicatrisant, comme agent tenseur, comme agent anti -rides, comme agent chélatant, comme agent complexant et séquestrant, comme agent apaisant, comme agent anticernes, comme agent anti-rougeurs, comme agent émollient, comme agent démêlant capillaires, comme agent anti-pelliculaire, comme agent stimulant de la repousse du cheveu, comme agent gainant capillaire, comme agent épilatoire, comme agent limitant la repousse du poil, comme agent participant au renouvellement cellulaire, comme agent modulant la réponse inflammatoire ou comme agent participant au maintien de l'ovale du visage. De façon préférée, les β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)- glucoglucuronanes de formule (I) tels que définis selon la présente invention sont utilisés comme agent amincissant, comme agent anti-cellulite, comme agent raffermissant, comme agent cicatrisant, comme agent anti-rides, comme agent anticernes, comme agent anti-inflammatoire. De façon toute à fait préférée, les β-(l,3)- glucuronanes ou β-(l,3)-glucoglucuronanes de formule (I) tels que définis selon la présente invention sont utilisés comme agent amincissant.

La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants.

Exemple 1 - Exemple de préparation de composés β-(l,3)-glucuronanes ou β-(l,3)- glueoglucuronanes

Les spectres RMN ¹³ C ont été enregistrés sur un spectromètre RMN Avance 400 Bruker (9.4 T ₃ 400 MHz). 30000 accumulations ont été réalisées à 3O ⁰ C.

Production en milieu liquide de β-(l,3)-glucuronane (degré d'oxydation d'au moins

95%).

Le curdlane (10g) est dissous dans de l'eau distillée (IL) à une température de 0°C et à pH 10. Du TEMPO (43,3 mg), du NaBr (0,95 g) et du NaClO (50 mL à 13 %) sont ajoutés au milieu réactionnel. La réaction d'oxydation est stoppée après 1 heure par ajout de méthanol puis, neutralisée avec de l'acide chlorhydrique (2M). Le β-(l,3)- glucuronane formé est précipité avec de l'alcool glacé. Ce polysaccharide anionique est ensuite récupéré par centrifugation (15000 g, 20', 4 ⁰ C) puis enfin séché par lyophilisation (24h).

L'analyse RMN ¹³ C met en évidence l'oxydation complète du carbone C6 du curdlane puisque un signal à 61,4 ppm correspondant au carbone C6 portant l'alcool primaire (CH ₂ OH) a entièrement disparu et qu'un nouveau signal à 175,5 ppm apparaît, caractéristique de la carboxylation du carbone C6 du curdlane (COO ^" ). Le degré d'oxydation est également calculé par dosage conductimétrique.

Production en milieu liquide de β-(l,3)-glucoglucuronane (41% d'oxydation).

Le curdlane (10g) est dissous dans de l'eau distillée (IL) à une température de 0 ⁰ C et à un pH 10. Du TEMPO (43,3 mg), du NaBr (0,95 g) et du NaClO (50 mL à 13 %) sont ajoutés au milieu réactionnel. La réaction d'oxydation est stoppée après 30 minutes par ajout de méthanol puis, neutralisée avec de l'acide chlorhydrique (2M). Le β-(l,3)- glucoglucuronane formé est précipité avec de l'alcool glacé. Ce polysaccharide partiellement oxydé est ensuite récupéré par centrifugation (15000 g, 20', 4°C) puis enfin séché par lyophilisation (24h). L'analyse RMN ¹³ C met en évidence l'oxydation partielle (41%) du carbone C6 du curdlane par intégration des signaux à 175,5 ppm et 61,4 ppm.

Dégradation thermique du β-(l,3)-glucuronane.

Une solution de β-(l,3)- glucuronane (lOg/L dans l'eau) est chauffée à une température de 100 ⁰ C pendant 20 minutes. Après refroidissement, la solution est acidifiée (pH 2)

puis centrifugée (15000 g, 20', 4 ⁰ C). Le surnageant contenant les oligosaccharides est récupéré, neutralisé puis séché par lyophilisation.

Peracétylation du β-(l ,3)-glucuronane Une solution de β-(l,3)-glucuronane (lOg/L dans la pyridine), à laquelle est ajoutée de l'anhydride acétique (1 volume), est maintenue à température ambiante durant une période d'au moins 24 heures (24-48 heures) puis évaporée sous vide. Le β-(l,3)- glucuronane peracétylé ainsi obtenus est récupéré.

L'analyse RMN ¹³ C de ces molécules met en évidence la présence d'un signal à 23,4 ppm, caractéristique du groupement méthyl de l'acétate, confirmant ainsi l'acétylation de l'acide β-(l,3)-polyglucuronique.

Persulfatation du β-(l ,3)-glucuronane

Une solution de β-(l,3)-glucuronane (lOg/L dans le DMF), à laquelle est ajoutée une solution de SO ₃ /DMF (1 volume), est maintenue à température ambiante durant une période d'au moins 24 heures (24 à 48 heures) puis neutralisée avant d'être lyophilisée. Le taux de sulfatation est mesuré par dosage potentiométrique.

Exemple 2 : Activités cosmétiques de composés β-d^Vglucuronanes et 3-(13V glucoglucuronanes

Les activités biologiques de composés β-(l,3)-glucuronanes ou d'un mélange de composés β-(l,3)-glucoglucuronanes ont été criblées par une méthode originale de biologie moléculaire (transcriptomique) puis mises en évidence par des méthodologies classiquement employées en cosmétologie.

Exemple 2.1 : Activités amincissante, anti-cellulite, anti- effet peau d'orange d'un composé β-(l,3)-glucuronane ou d'un mélange de composés β-(l,3)- glucoslucuronanes L'étude transcriptomique réalisée sur des fibroblastes humains cultivés in-vitro en absence ou en présence d'un ou plusieurs de ces composés a montré que ces molécules entraînent la surexpression du gène ANGPTL4 qui code pour l'adipokine du même nom. Cette adipokine produite localement au niveau du tissu adipeux inhibe l'activité de l'enzyme lipoprotéine lipase (LPL) empêchant ainsi le transfert des acides gras depuis les lipoprotéines vers les adipocytes diminuant ainsi fortement la lipogénèse. En même temps, cette adipokine active l'enzyme ATGL (Adipose Triglycéride Lipase),

présente dans les adipocytes, augmentant ainsi fortement la lipolyse et la libération des acides gras des adipocytes.

Ces résultats ont été complétés par une étude in-vitro, réalisée sur des adipocytes cultivés en absence ou en présence d'un composé β-(l,3)-glucuronane ou d'un mélange de composés β-(l,3)-glucoglucuronanes, à la concentration de 0,5%, qui a permis de montrer que ces molécules induisent une diminution de l'ordre de 25% de la densité en acides gras stockés sous forme de triglycérides dans les vacuoles lipidiques des adipocytes.

De plus, une seconde étude in-vitro, réalisée sur des pré-adipocytes, a montré que l'utilisation d'un ou plusieurs de ces composés (à la concentration de 0,5%) diminue(nt) fortement la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes matures

(diminution de l'expression du marqueur aP2/FABP4).

La diminution de la lipogénèse, l'augmentation de la lipolyse, l'augmentation de la libération des acides gras depuis les adipocytes, l'augmentation de l'utilisation de ces acides gras et la diminution de la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes matures induites par le composé β-(l,3)-glucuronane ou le mélange de composés β-

(l,3)-glucoglucuronanes mettent en évidence l'activité amincissante de ces molécules.

Une étude clinique, réalisée sur des volontaires humains, a montré que l'utilisation quotidienne, en topique, durant 30 jours d'une préparation cosmétique sous forme de crème contenant 3% d'un composé (β-(l,3)-glucuronane ou 3% d'un mélange de composés β-(l,3)-glucoglucuronanes, entraîne une diminution significative de la cellulite chez plus de 63% de ces individus. L'effet peau d'orange est diminué chez

53% des volontaires (contre 27% dans le groupe de volontaires traités avec un placebo).

Exemple 2.2 : Activité cicatrisante et effet sur le remodelage tissulaire d'un composé β-

(l,3)-εlucuronane. ou d'un mélange de composés β-(l,3)-glucoelucuronanes

L'étude transcriptomique réalisée sur des fibroblastes humains cultivés in-vitro en absence ou en présence d'un ou plusieurs de ces composés a montré que ces molécules entraînent la surexpression des gènes MMP, EGRl, WNTI l, PDGFD, TFPI2, PTGS2 et la sous expression du gène HAPLNl codant pour les protéines portant les mêmes noms et impliquées dans les processus de cicatrisation et de remodelage tissulaire. En effet, l'induction transitoire (sous le contrôle de TFPI2 et de PDGFD) des métaloprotéinases (MMP) et l'inhibition transitoire (sous le contrôle de TFPI2) de HAPLNl, permettent une déstabilisation transitoire et localisée au niveau du site

agressé (à cicatriser) de la matrice extracellulaire principalement par une action catabolique sur les fibres de collagène. A la suite de la dégradation de la matrice extracellulaire, contrôlée par TFPI2, ayant permis l'élimination des fibres de collagène lésées et la migration et la prolifération (contrôlées par PTGS2) des cellules indispensables au processus de remodelage tissulaire (fïbroblastes, kératinocytes, mélanocytes, etc.), les protéines EGRl et WNTI l permettent la stimulation de la synthèse des fibres de collagène et donc la reconstruction et la stabilisation de la nouvelle matrice extracellulaire. Donc, via l'induction de l'expression de ces protéines, le composé β-(l,3)-glucuronane ou le mélange de composés β-(l,3)-glucoglucuronanes sont dotés d'une activité cicatrisante et d'un effet sur le remodelage tissulaire utilisables en cosmétique, notamment dans les produits cicatrisants, anti-âge, anti-rides, anti-cernes, tenseurs, raffermissants, hydratants et ceux participant au maintien de l'ovale du visage.

Exemple 2.3 : Effet d'un composé β-fl ,3)-glucuronane, ou d'un mélange de composés β-(L3)-glucoglucuronane sur le renouvellement cellulaire

L'étude transcriptomique réalisée sur des fïbroblastes humains cultivés in-vitro en absence ou en présence d'un composé β-(l,3)-glucuronane ou d'un mélange de composés β-(l,3)-glucoglucuronanes a montré que ces molécules entraînent la surexpression des gènes EGRl, PTGS2, PDGFD, NPTXl codant pour les protéines portant les mêmes noms et responsables de l'activation, de la prolifération et de . la différenciation (sous le contrôle de TFPI2 qui est elle aussi surexprimée) des fïbroblastes, des kératinocytes et des mélanocytes qui sont des cellules cibles de la cosmétique.

Exemple 2.4 : Activité anti-inflammatoire d'un composé β-(l ,3)-glucuronane, ou d'un mélange de composés β-(l ,3)-glucoglucuronane

L'étude transcriptomique réalisée sur des fïbroblastes humains cultivés in-vitro en absence ou en présence d'un ou plusieurs de ces composés a montré que ces molécules entraînent la surexpression des gènes NPTXl, PTGS2 et APOE codant pour les protéines portant les mêmes noms et responsables d'une activité anti-inflammatoire. En effet, la protéine PTGS2 intervient comme régulateur négatif de T inflammation en inhibant le switch de la prostaglandine E2 en prostaglandine D2 (pro-inflammatoire). De même, APOE intervient comme régulateur négatif de l' inflammation en diminuant l'arrivée des monocytes sur le site inflammatoire. Pour sa part, NPTXl inhibe l'activation des cellules T. Donc, via l'induction de l'expression de ces protéines, le

composé β-(l,3)-glucuronane ou le mélange de composés β-(l,3)-glucoglucuronanes sont dotés d'une activité anti-inflammatoire utilisable en cosmétique, notamment dans les produits anti-inflammatoires, anti-rougeurs et/ou apaisants.

Exemple 2.5 : Activités antioxydante et antiradicalaire d'un composé β-(l,3)- glucuronane, ou d'un mélange de composés β-(L3)-glucoglucuronane L'étude transcriptomique réalisée sur des fibroblastes humains cultivés in-vitro en absence ou en présence d'un ou plusieurs de ces composés a montré que ces molécules entraînent la surexpression des gènes ALDH3A1, EPXHl et HSP A6 codant pour les protéines portant les mêmes noms et responsables d'activités antioxydante et antiradicaliare. En effet, la protéine ALDH3A1 intervient, à la fois, dans le piégeage direct des radicaux libres, dans le maintien de la balance redox, dans le maintien du statut en glutathion (molécule antioxydante), dans la détoxification des lipides et des aldéhydes peroxydes. De même, la protéine EPXHl intervient dans le métabolisme des lipides peroxydes et dans la détoxification des électrophiles (oxyde de styrène, oxyde d'éthylène, radiations gamma, etc.). Pour sa part, la protéine HSP A6 intervient contre le stress oxydatif en général au niveau cellulaire. Donc, par l'induction de l'expression de ces protéines, le composé β-(l,3)-glucuronane ou le mélange de composés β-(l,3)- glucoglucuronanes sont utilisables à titre de principes actifs, et/ou en association avec d'autres composés, pour la préparation de compositions cosmétiques possédant des activités antioxydantes et/ou antiradicalaires.

Exemple 2.6 : Activités chélatante et séquestrante d'un composé β-(l,3)-glucuronane, ou d'un mélange de composés β-(l ,3)-glucoglucuronane Les composés β-(l,3)-glucuronane ou le mélange de composés β-(l,3)- glucoglucuronanes sont des molécules polyanioniques capables de chélater et de séquestrer les ions mono- et divalents cationiques. Ceci a été mis en évidence par la mise en solution d'ions monovalents cationiques (notamment Na+ et Cu+) et/ou d'ions divalents cationiques (dont notamment Cu2+, Ca2+, Mg2+ et Zn2+) en présence, sous agitation, d'un composé β-(l,3)-glucuronane ou d'un mélange de composés β-(l,3)- glucoglucuronanes. Après récupération de ces composés et lavage, une étude par absorption atomique a permis de mettre en évidence que le composé β-(l,3)- glucuronane ou le mélange de composés β-(l,3)-glucoglucuronanes chélatent et séquestrent les ions mono- et divalents cationiques.