【발명의 명칭】

이소세코타나파솔라이드를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 아토피 피부염 개선용화장료조성물

【기술분야】

본 발명은 가려움증 억제 및 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

가려움증이란 많은 피부질환에서 유발되는 감각으로 주로 아토피 피부염， 접촉 피부염， 두드러기， 결절성 양진， 음， 만성단순태선， 곤충물림， 화폐상습진 등의 질환과 관련하여 발생한다. 이러한 가려움증은 피부신경이 자극을 받아 생기는 것으로 가려움증을 없애기 위해서 심하게 긁거나 문지르는 경우 흥반， 균열， 궤양， 팽진， 색소침착 등이 나타나며 좀 더 지속되면 피부가 두꺼워지는 상태가된다. (Greaves et al , The Lancet . , 348， pp .938-40 , 1996)

임상학적으로 가려움은 두 가지 의미를 갖는데 하나는 원래 가려움증을 야기시키지 못하던 아주 약한 자극에도 가려움증을 느끼는 과민성에 의한 가려움증 (hyperknesi s)과 다른 하나는 바늘로 찌르는 통증 감각과 같은 가려움증으로 가려움증과는 무관한 이질적인 자극에 대한 과민성 (al lokness)가려움이 있다. 이러한 두 가지 가려움증의 발병은 다양한 외부요인 (아토피 피부염， 접촉 피부염， 두드러기, 결절성 양진， 음， 만성단순태선， 곤층물림, 화폐상 습진)에 의해 유발되며， 이렇게 유발된 가려움증은 이를 해결하기 위해 피부를 긁게 되고 이는 다시 가려움증으로 이어지는 순환 고리가 형성되어， 가려움증과 이와 동반하는 염증적 질환이 증가하는 악순환이 이어지게 된다. (이갑석, Al lergy asthma respi r Di s2( l) :8- 15,March 2014) 가려움증은 피부에서의 염증반웅과 복잡하게 얽혀 있으며， 가려움증 억제의 차단은 이로 인해 야기되는 다양한 질병들의 치료의 선행적 과제로 여겨질 수 있다. 현재 가려움증 억제제로 많이 사용되고 있는 항히스타민제는 아토피로 유발되는 가려움증에 효과적이지 못하다. 그 이유는 가려움증을 유발하는 다양한 경로에서 히스타민 단지 하나에 불과하다는 사실에 기인한다 · (Budden )Ue J, Steinhof f M. Pathophysiology and therapy of pruritus in allergic and atopic diseases. Allergy 2010 ;65 :805-821. ) 가려움증 완화, 염증완화， 물리적 자극에 의한 긁기를 줄이는 복합적 문제 해결은 피부의 가려움증을 유발하는 다양한 질병들의 해결책을 제시할 수 있을 것이다.

사이토카인은 세포 간 상호 기작에서 중요한 역할을 담당하고 있으며 이 중 인터루킨 -3UIL-31)은 인터루킨 -6 군 류에 속하여 인터루킨 -31알에이 (IL-31 receptor A)와 0SMR(0ncostain M receptor)로 구성된 이종수용복합체 (Heterodimeric receptor complex)로 구성된다. 인터루킨—31은 환경과 가깝게 접해있는 피부조직에서 선천면역 (innate imunity)과 양자면역 (adaptive immunity)에서 중요한 역할을 담당한다. 인터루킨 -31의 발현증가는 아토피와 같은 가려움증을 포한한 질환뿐만 아니라 알레르기 (allergy)나 염증성 장내질병 (inflammatory bowel disease)과 연결 되어져있다 . (C. Cornel issen et al . European Journal of Cell Biology 91 (2012) 552-566) 인터루킨 -31의 처치는 불완전한 표피두께， 표피조지형성 방해, 배아 (stratum basale)의 배열변경 과립층 (stratum granulosum) 분화 약화를 유발하며 (Cornel issen, C. J. Allergy Clin. Immunol. 2012, 129, 426-33. ) 인터루킨 -31와 과발현 마우스를 이용한 실험에서는 심한가려움증 (severe pruritus) 탈모 (Alopecia)와 피부손상이 야기됨이 밝혀졌다. (Di 1 Ion, S.R. Nat. Immunol. 2004, 5,752-760.) 특히 양진결절 (Prurigo nodularis), 만성적 두드러기 (cronic spontaneous urticaria) 알레르기성 접촉성 피부염 등과 같은 가려움증과 연결된 질환에 중요 역할을 한다. ( Sonkoly, E. et al . J. Allergy Clin. Immunol. 2006， 117, 411-17. , Raap, U. et al . Exp. Dermatol. 2010， 19, 464-66.) 인터루킨 -33GL-33)은 피부표면의 세포 내에 존재한다. 심하게 긁거나 꽃가루, 진드기 등으로 자극을 받으면 세포로부터 나와 백혈구 등과 결합하고 알레르기를 유발한다. 아토파성 피부염 환자에는 인터루킨 -33이 많은 것으로 알려져 있는데， 최근유전자를조작해 인터루킨 -33을 야생형보다 약 10배 만드는 쥐를 이용한 실험에서 쥐의 얼굴과 다리， 꼬리 등에 가려움을 수반하고 피부가 두꺼워지는 아토피성피부염 증상을 나타냈다. 유전자조작 쥐는 가려움의 토대가 되는 히스타민을 분비하는 비만세포가 야생형보다 약 3배 증가했다. ( Imai et al . PNAS, 2013 , vol . 110 , no . 34 , 13921-13926)

인터루킨 -31과 인터루킨 -33은 피부염으로 인한 피부 염증， 가려움증과 관련이 있다는 사실이 최근 여러 연구를 통해 밝혀졌다. 따라서 Human kerat inocyte에서 인터루킨 -31과 인터루킨 -33의 수용체 (receptor )발현 감소효과를 조사하여 가려움 완화 및 피부염 치료에 효과가 있는 식품, 의약품 및 화장품 원료를 탐색할수 있으며, 이는 효과적이면서도부작용이 적은 안전한 가려움증치료제 개발에 옹용될 수 있을 것이다.

이에， 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과， 천연물 유래 화합물 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)를 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물의 경우， 세포독성이 발견되지 않아 안전성이 우수하고 다양한 가려움증의 원인이 되는 사이토카인들 중 IL-3K Inter leukin-31) 또는 IL-33( Inter leukin-33)를 억제시킴으로써 가려움증을 억제 및 완화시킬 수 있음을 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.

또한, 아토피 피부염 (Atopic dermat i t i s)은 만성적이며 재발성이 높은 염증성 피부질환이며, 피부의 부스럼, 습진， 간지러움, 염증 반웅을 통해 쉽게 아토피를 진단할 수 있는 반면 이를 유발하는 병리학적ᅳ 유전학적 메커니즘은 아직까지 정확히 밝혀지지 않았다. 최근 2~30년 동안 아토피는 시골이나 개발도상국에 비해 특히 서구화된 나라에서 그 증가율이 크게 증가되고 있는데 이는 hygi ene hypothesi s (위생가설)에 의해 뒷받침되고 있다. 이 가설은 면역계의 성장을 위해서는 세균을 포함한 외부환경으로부터 자극이 필요하며 그렇지 못할 경우 면역계에 문제가 생겨 알레르기 등과 같은 질환이 발생한다는 것이다 [Yazdanbakhsh,M.， P.G. Kremsner , and R.van Ree, Allergy, Parasites, and the hypothesis Science, 296(5567)： 490-494, 2002] .

아토피는 민감성이 높은 특정 유전자， 환경， 피부 외벽의 손상 정도, 면역적인 요인 등이 영향을 미치는 복합적 면역 반웅이다. 아토피의 주된 증상은 어린 아이들의 경우 얼굴 부분의 부스럼과 습진， 어른들의 경우 관절이 굽혀지는 부분의 습진을 들 수 있으며 무엇보다도 간지러움 증상이 심각하여 환자의 사회적 활동에 큰 지장을 초래하며 그에 따라 아토피 피부염은 환자에게 질병에 따른 육체적 고통뿐만 아니라 심각한 수준의 정신적 고통을 더한다.

최근 연구결과에 따르면 아토피 피부염의 근본적 원인이 되는 면역 불균형은 다양한 생물학적 신호 전달의 결과물이고 이러한 비정상적 신호전달의 최상위 단백질이 바로 TSLP(thymic stromal lymphopoietin) 사이토카인임을 밝혀내었다. 알러젠 (allergen)이 몸에 침투되면 TSLP 둥의 물질이 수지상 세포를 자극하여 반웅을 하게 되는데, 이 과정에서 아토피 피부염의 증상이 나타나는 것이다. 구체적으로， 아토피피부염에서 유전 및 여러 환경 요인에 의해 피부장벽이 손상되면 외부로부터 침투한 각종 알레르겐에 쉽게 노출되고, 각질형성세포에서는 IL-7과 유사한 사이토카인인 TSLP를 분비한다. TSLP는 알레르기 염증반웅의 'master switch' 라고도 불리는데 비만세포， 호염구, 호산구 등 피부 염증을 일으키는 중요한 세포에 영향을 주고, 선천면역 및 후천면역 반응 모두에 영향을 주며， Th2 면역반웅을 유도하여 아토피피부염의 병인에 매우 중요한 요소로 인식되고 있다 [Ziegler SF, Art is D. Sensing the out s i de world: TSLP regulates barrier immunity. Nat Immunol 2010; 11:289一 293]. 아토피피부염 환자의 피부와 혈액에서는 TSLP가 증가 되는데， 알레르겐에 의해 각질형성세포의 PAR-2 발현이 증가 되면 표피에서의 TSLP 분비가 증가되고 이로 인하여 Th2 염증반웅이 우세하게 일어나서 아토피피부염의 임상양상으로 나타난다 [Lee EB, Kim KW, Hong JY, Jee HM, Sohn MH, Kim KE. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol 2010;21: e457- _e 460] . 한편으로는 TSLP 유전자에 돌연변이가 있을 경우에 TSLP 분비가 더 증가 되고 Th2 면역반웅이 더 심하게 나타난다 [Wu WH, Park CO, Oh SH, Kim HJ, Kwon YS, Bae BG, Noh JY, Lee KH. Thymic stromal lymphopoiet in-act ivated invariant natural killer T eel Is trigger an innate allergic immune response in atopic dermatitis. J Allergy CI in Immunol 2010； 126 :290-299e4]. 또한 알레르기 행진에서 아토피피부염 환자가 천식이나 알레르기 비염으로 진행하는데 중요한 매개자로 TSLP가 거론되고 있어서 TSLP는 아토피피부염의 발생을 예방하는 타깃인 동시에 알레르기 행진으로의 진행을 막는 치료적 타깃으로 생각되고 있다 [Zhang Z, Hener P, Frossard N, Kato S, Metzger D, Li M, Chambon P. Thymic stromal lymphopoiet in overproduced by kerat inocytes in mouse skin aggravates experimental asthma. Proc Nat 1 Acad Sci U S A ^* 2009 ;106 :1536-1541].

한편 아토피성 피부염 환자에서 케모카인 (chemokine)인 MDC(macrophage_ derived chemokine)^- TARC (thymus and ac t i vat i onr egu 1 at ed chemokine)의 혈청 농도가 현저히 증가한다는 보고가 있고 (Hijnen et . al. , J. Allergy Clin. I瞧 unol. 113(2) 334-340), 아토피성 피부염의 치료 물질로 사용되는 사이크로스포린 A나 코르티코스테로이드를 아토피성 피부염 환자에게 투여하였을 때는 MDC 및 TARC와 혈청 농도가 감소한다는 보고가 있으며 (Y. Shimada et al . , J. Dermatol . Sci. , 34， 201-208, 2004), 또 시험관내 실험에서 HaCaT 세포에 INF— γ나 TNF-α를 처리하였을 때 MDC 및 TARC가 다량 발현되는데 이러한 발현을 억제할 수 있는 물질은 아토피성 피부염 치료제로 사용될 수 있음이 제시된바 있다 (Horikawa et . al . , Int. Immunol., 14(7) 767-773, 2002) . 따라서 MDC나 TARC과 같은 캐모카인의 발현을 억제하는 물질 등은 아토피성 피부염 개선제로 활용될 수 있다.

아토피의 주된 특징 중 하나는 피부장벽 (skin barrier)의 기능장애 (dysfunction)와 경표피 수분손실 (transepi dermal water loss; TEWL) 로 인한 건조 증상이며， 주로 부스럼과 염증 반웅을 동반한다는 것이다. 따라서 규칙적인 피부 연화로션이나 보습제 사용은 아토피 치료에 있어서 일반적으로 사용되고 있는 방법이다. 또 다른 방법으로 초기 증상의 아토피 치료에 있어 glucocorticosteroid는 가장 효과적이라 알려져 있으며， 널리 쓰이는 치료법이다. 이 방법은 항염증 작용 (ant i -inflammatory effect)이 있을 뿐만 아니라 S. aures (Staphylococcus aures)의 콜로니화 (colonization)를 막아 2차적인 감염에 의한 아토피 증상이 심화되는 것을 방지하기도 한다. 국소적인 steroid 사용은 초기의 습진 증상을 치료하게 위해 단기간 사용되는 것이 좋으며, 피부 연화 로션 등과 함께 사용하면 그 효과가 훨씬 좋다.

그리고 피메크로리무스 (pimecrolimus)와 타크로리무스 (tacrol imus)는 면역조절 효과 ( immunomodulatory effect)가 있는 칼시뉴린 억제제 (calcineurin inhibitor)로서 항염증 치료제로 널리 쓰이고 있다. 이는 steroid 성분이 없기 때문에 얼굴과 같은 민감한 부위에 효과적으로 쓰이고 있으나 단점이라면 일시적인 따가움 증상을느낄 수 있다는 것이다.

또한 아토피 환자의 피부에는 S. aures가 많이 증식하고 있기 때문에 여기서 분비되는 슈퍼항원 (superantigen)이 아토피의 증상을 더욱 심화시킨다. 따라서 국소적 항균성 연고 (topical antimicrobial ointment)는 이 박테리아의 증식을 막아 아토피 증상을 완화시킨다. 이 방법은 steroid 제품과 함께 사용 시 2차적인 감염을 막을 수 있어 더 효과적이나 장기간 이 방법을 사용 시 저항성이 생기기 때문에 적당량을 단기간 사용하는 것이 좋다. 그리고 calcineurin dependent pathway를 막는 시클로스포린 ACcyclospor ine A)가 IL-2, IFN-gamma 와 같은 proinflammatory cytokine의 발현을 감소시키는 역할을 하여 경구용으로 사용되고 있다. 효과적인 아토피 완치 능력이 있음에도 불구하고 신장에 독성을 가져다줄 수 있기 때문에 이 방법은 심각한 난치병 환자들에게만 사용되는 것이 적당하다.

또한 기존의 아토피 피부염 치료제는 칼시뉴린 (calcineurin)을 억제하여， 사이토카인 (cytokine) 발현을 줄이는 시클로스포린 (cyclosporin)과 FK506 등이 개발되어 사용되고 있으나, 이들은 장기 사용 시 면역체계를 약화시켜 이차 감염증의 저항력을 떨어뜨리며， 피부 가려움 및 소양증을 완화시키는 steroid 계열의 외용 치료제들도 소아가 장기간 사용할 경우 면역력이 감소 되고 성장이 저해되는 등의 문제점이 있다.

아자티오프린 (Azathioprine)은 퓨린 뉴클레오티드 합성 (purine nucleotide synthesis)과 신진대사 (metabol ism)에 영향을 미쳐 피부 질환에 효과적인 대표적인 면역 억제제 (immune suppressor)이다. 다른 방법으로는 항히스타민제 (antihistamines), 코르티코스테로이드 (cort icosteroid)와 함께 사용하면 아주 효과적인 광선 치료법 (phototherapy)이 있다. 이는 280-320陋의 UVB , 340-400nm인 UVA 파장을 전신에 쬐어 주는 방법으로 어른에게 있어서 아주 효과적이라는 보고가 많이 있으나 어린아이들의 경우는 아직 피부가 많이 약하기 때문에 사춘기 이후에만사용이 가능하다.

이처럼 현재의 치료방법은 치료제가 일시적 병변의 완화와 부작용이 많은 치료제들이다. 따라서 이러한 부작용이 없으면서 효능이 우수한 치숲：제 개발이 요구되고 있다.

현재 많은 국내의 학교 및 바이오기업 연구진들에 의해 아토피 피부염을 개선하기 위한 개선제들이 연구 및 제품화되고 있음에도 불구하고 개발되는 제품의 대부분이 시장 진입 초기에 사라지는 현상이 반복되고 있다. 이러한 이유는 아토피 피부염이 유발되고 악화 되는 병리학적 기전에 대웅되는 제품의 개발보다 막연히 피부의 보습효과를 강화하거나 피부에 저자극성 화장품이 아토피 개선제품으로 개발되고 있기 때문이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 부작용 및 피부 자극성 없이 아토피 피부를 개선할 수 있는 뛰어난 물질을 개발하기 위해 연구노력한 결과, 천연물 유래 화합물 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)를 함유한 화장료 조성물의 경우 세포독성이 발견되지 않아 안전성이 우수하고, 아토피 피부염의 근본적 원인이 되는 면역 불균형에 의한 비정상적 신호전달의 최상위 단백질인 TSLP thymi c stromal lymphopoiet in) 사이토카인 저해능이 우수하며 HaCaT 세포에서 MDC 및 TARC의 캐모카인 발현을 억제하여 아토피 피부를 전반적으로 개선 시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

따라서, 본 발명의 주된 목적은 다양한 가려움증의 원인이 되는 사이토카인들 중 IL-3K Inter leukin-31) 또는 IL-33( Inter leukin— 33)를 억제시킴으로써 가려움증의 억제 및 완화 효과가 우수한 이소세코타나파솔라이드를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료조성물을 제공하는 데 있다. 또한， 본 발명의 또 다른 목적은 세포독성이 없고， 아토피 피부염의 근본적인 원인이 되는 면역 불균형에 의한 비정상적 신호전달의 최상위 단백질인

TSLP 사이토카인 저해능이 우수하고， MDA 및 TARC의 캐모카인 발현 억제능이 우수한 이소세코타나파솔라이드를 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물을 제공하는 데 있다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 하기 화학식 [ 1]로 표시되는 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료조성물을 제공한다.

화학식 [ 1]

본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 하기 화학식 [ 1]로 표시되는 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)를 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물을 제공한다.

화학식 [ 1]

본 발명에서 동정된 화합물 "이소세코타나파솔라이드" 는 다양한 천연물에 함유되어 있다. 예컨대 더위지기 (Artemisi a iwayomogi ) , 애엽 (Artemi sia princeps var . oriental i s ' Pampan ' Hara) , 또는 쪽에 함유되어 있다. 상기 이소세코타나파솔라이드 화합물은 신규 미백제， 미백용화장료 조성물로 웅용가능성이 개시된 적이 있다 [JP 5307369] . 그러나 아직까지 본 발명에서 동정된 화합물 "이소세코나타파솔라이드" 의 가려움증 억제 및 완화 또는 아토피 피부염 개선에 관한 연구는 진행되어 있지 않은 실정이다.

이에， 본 발명자들은 애엽으로부터 동정한 이소세코타나파솔라이드가 가려움증 억제 및 완화에 효과가 있을 뿐만 아니라， 아토피 피부염 개선에 효과가 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에서의 상기 용어 '가려움증' 은 소양증이라고도 하며， 다양한 피부염에 의해 발생 되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서， 상기 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)는 화장료 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 5 중량 % 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.0001 내지 0.5 중량 ¾ 함유되는 것을 특징으로 하며， 이에 제한되지 않는다. 이소세코타나파솔라이드가 0.0001 중량 % 미만으로 함유할 경우， 화장료에 첨가시 너무 극소량으로 유효성분으로 인한 가려움증 및 아토피 개선 효과가 미미하며， 0.5 중량 ¾ 초과 시， 피부 안전성이나 효과에서는 문제가 없으나 상기 이소세코타나파솔라이드를 천연물에서 정제하기 때문에 대량으로 얻는데 어려움이 있으므로 경제적인 측면에서 바람직하지 않다.

본 발명에 있어서， 상기 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)는 종래 당업계에 알려잔 화학합성법으로 제조되거나 천연물에서 분리될 수 있으나， 바람직하게는 애엽 (Artemi sia princeps var . or iental is)으로부터 분리된 것임을 특징으로 한다.

바람직한 애엽의 추출 방법의 한 예로 애엽의 전초를 농도 0 ~ 95¾ 에탄올을 이용하여 실온또는 60 ^° C로 열을 가하여 3일 이상 추출 한 후 여과하여 얻어지는 여과액을 농축하여 용매를 제거하고 추출물을 얻은 후 그 중량의 약 2 내지 20배， 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물을 분산시킨 후 핵산， 클로로포름， 메틸렌클로라이드， 에틸아세테이트， 글리세린 또는 프로필렌글리콜， 바람직하게는 핵산， 클로로포름 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트를 물의 0.1 내지 0.5배 정도의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 애엽 비극성용매 가용 추출물을 수득할수 있다.

상기 수득 방법으로 얻어진 애엽의 비극성용매 가용 추출물을 탄소수 1 내지 4의 알코을 바람직하게는 메탄올에 녹이고 C18 컬럼에 흡착시킨 후 비극성 용매 바람직하게는 디클로로메탄 ： 메탄을을 약 80: 1 내지 1 : 1이 되도록 흔합하여 분획물을 얻어 실리카겔에 흡착시킨 다음， 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 2회 내지 5회 수행하여 활성분획을 분리하고， 최종적으로 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 본 발명의 이소세코타나파솔라이드를 수득할수 있다.

본 발명자들은 애엽 추출물을 박막크로마토그래피하고 각 성분을 분리한 후 이들 성분 중 피부세포에서의 인터루킨 -31과 인터루킨 -33의 발현을 억제하는 성분인 이소세코타나파솔라이드에 주목하였다. 상기 이소세코타나파솔라이드는 쑥이나 국화과로부터 분리 정제되는 단일화합물로, 가려움증 완화의 용도로 사용된 예는 없었으며， 본 발명에서 처음으로 이소세코타나파솔라이드의 가려움중 억제를 위한조성물로사용될 수 있음을 발견한 것이다.

본 발명에 있어서， 상기 가려움증을 유발하는 원인 또는 형태는 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 염증성 피부염， 아토피성 피부염， 살갗의 거칠어짐으로 인한 피부염， 땀띠， 진무름， 동상， 접촉성 피부염， 지루성 피부염, 건선 또는 유건선으로 야기되어 발생하는 것을 특징으로 한다. 상기 가려움증의 경우， 계속되는 가려움으로 인해 지속적으로 피부를 문지르거나 긁거나， 또는 꼬집게 된다. 이에 의해, 피부의 진무름， 찰과상， 태선， 양진， 과색소 침착또는 색소 침착의 감소 등 2차적인 피부손상이 유발되며, 피부에서 염증반웅을 유도하는 여러 물질들이 분비되고， 이러한 분비는 다시 가려움을 증가시켜 가려움-긁기의 순환고리를 형성하게 된다.

본 발명에 있어서， 상기 이소세코타나파솔라이드 ( I sosecotanapar t ho Π de )는 IL-31 ( Int er 1 euki n-31 ) 또는 IL-33( Inter leukin-33)와 같은사이토카인 (cytokine)의 방출량을 감소시킴으로써 가려움증 억제 및 완화 효과를 나타내는 것을특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면， 본 발명의 이소세코타나파솔라이드의 경우， 인간 각질형성세포 (HaCaT cel l )에서 가려움증과 관련이 있는 IL-31 및 IL-33의 발현 억제 효과가 우수하다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 본원발명의 이소세코타나파솔라이드는 가려움증이 발생할 때 방출되는 사이토카인인 IL-31 및 IL-33의 발현을 억제함으로써 가려움증의 억제 및 완화 효과를 나타낼 수 있음을 알수 있다 (실험예 2 내지 4 참조) .

또한， 본 발명의 이소세코타나파솔라이드는 TNF-알파와 IFN-감마에 의해 유발되는 IL-1베타 ( IL-Ιβ ) 및 인터루킨 -6( IL-6) 발현을 억제하여 면역 과민성 반웅과 관련된 인터루킨 -6， 인터루킨 -1베타의 발현 억제를 유의하게 감소시킬 수 있음을 확인하여, 이소세코타나파솔라이드가 매우 우수한 가려움 억제 효과를 나타냄을 확인하였다 (실험예 2 참조) .

또한， 피부각질세포에서 이소세코타나파솔라이드의 세포독성을 확인하였으며， 세포독성이 발견되지 않아 안전성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다 (실험예 1) .

본 발명에 있어서， 상기 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)는 TSLP( thymi c stromal lymphopoi et in) 저해능에 의해 아토피 피부염 개선효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면， 본 발명의 이소세코타나파솔라이드의 경우， 인간 각질형성세포 (HaCaT cel l )에서 아토피 피부염의 근본적 원인이 되는 TSLP 저해능이 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때， 본 발명의 이소세코타나파솔라이드가 TSLP를 저해시킴으로써 아토피 피부염 개선 효과를 나타낼 수 있음을 알수 있다 (실험예 5 및 표 5 참조) .

. 본 발명에 있어서, 상기 이소세코타 8나파솔라이드 ( Isosecota卿 arthol ide)는 MDC (macrophage— derived chemokine) 캐모카인 발현 억제에 의해 아토피 피부염 개선효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서， 상기 이소세코타나파솔라이드 ( Isosecotanaparthol ide)는 TARC( thymus and act ivat ionregulated chemokine) 발현 억제에 의해 아토피 피부염 개선효과를 갖는 것을 특징으로한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 본 발명의 이소세코타나파솔라이드의 경우， 아토피 피부염 환자의 혈청에서 농도가 증가하는 케모카인인 MDC 및 TARC를 저해하는 효과를 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때， 본 발명의 이소세코타나파솔라이드가 케모카인인 MDC 및 TARC를 저해시킴으로써 아토피 피부염 개선 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다 (실험예 6 , 도 12 및 13 참조) . 본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수， 에센스, 영양로션， 영양크림， 아이크림， 마사지크림， 클렌징크림， 클렌징품， 클렌징워터， 파우다, 팩, 모발용 화장품류， 바디로션， 바디크림， 바디오일, 바디에센스 또는 바디클렌저로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다. 상기 모발용 화장품류로는 헤어토닉, 헤어컨디셔너， 헤어로션， 샴푸， 헤어린스， 트리트먼트， 헤어크림， 머릿기름, 모발건조제， 모발보존처리제， 모발염색제， 모발용 웨이브제， 모발탈색제， 헤어젤， 헤어글레이즈， 헤어드레싱어， 헤어래커， 해어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 일 수 있으나, 이제 한정되지 않는다.

본 발명이 화장료 조성물로 이용되는 경우에는， 유효 성분으로서의 이소세코타나파솔라이드 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며， 예컨대 수용성 비타민， 유용성 비타민， 고분자 펩티드， 고분자 다당， 스핑고 지질 및 해초 액기스 등을 포함할 수 있다. 이외에 화장품 조성물에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제 _. , 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료， 유기 분체， 자외선 흡수제， 방부제， 살균제， 산화 방지제, 식물 추출물， pH조정제, 알콜, 색소， 향료， 혈행 촉진제， 넁감제， 제한 (制汗)제， 정제수 등을 들 수 있다.

또한， 본 할명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우에는， 유효 성분으로서의 이소세코타나파솔라이드는 가려움증 억제 효과 또는 아토피성 피부염 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 용도， 제형， 배합 목적 등에 따라 임의의 양 (유효량)으로 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 이소세코타나파솔라이드를 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.0001 내지 0.5 중량 %로 포함할수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우， 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우， 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도, 약물형태， 투여경로 및 기간에 따라 다르지만， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서， 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로， 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며， 바람직하게는 비경구 투여， 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여 (topi cal appl i cat ion) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물은 액상， 크림상， 페이스트상， 고체상 등의 피부에 적용시킬 수 있는 모든 제형으로 제조가 가능 며， 통상의 첨가제를 가하여 가려움증또는 아토피 개선를 위한 크림， 로션， 액상의 에센스 타입 등의 조성물로 제조될 수 있으며 이들 제형의 에어졸 타입도 포함한다.

【유리한 효과】

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 이소세코타나파솔라이드는 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 조성물에 안전하게 사용할 수 있으며， 각질세포에서 인터루킨 -31 및 인터루킨 -33 receptor의 발현을 억제시킴과 동시에 TNF-알파와 IFN-감마에 의해 유발되는 인터루킨 -1 베타 및 인터루킨 -6 발현을 억제하여 가려움증의 억제 및 완화에 우수한 효과를 나타낸다. 또한， 본 발명의 이소세코타나파솔라이드는 아토피 피부염의 근본적 원인이 되는 면역 불균형에 의한 비정상적 신호전달의 최상위 단백질인 TSLP thymi c stromal lymphopoiet in) 사이토카인 저해능이 우수하며 HaCaT 세포에서 MDC 및 TARC의 캐모카인 발현 저해능이 우수하므로， 아토피 피부를 개선 시킬 수 있다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 애엽 추출물의 고성능액체크로마토그래피의 분석 도면을 나타낸 것이다.

도 2는 이소세코타나파솔라이드 0.05% 용해액의 고성능액체크로마토그래피의 분석 도면을 나타낸 것이다.

도 3은 이소세코타나파솔라이드의 세포독성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

도 4는 이소세코타나파솔라이드의 IL-lbeta 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는도면이다.

도 5는 이소세코타나파솔라이드의 IL-6 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는도면이다.

도 6은 이소세코타나파솔라이드의 IL-33 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는도면이다.

도 7은 이소세코타나파솔라이드의 IL-31 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는도면이다.

도 8은 이소세코타나파솔라이드의 IL-31 및 IL-33 억제 효과를 유전자 수준에서 확인한 결과를 나타내는도면이다.

도 9는 이소세코타나파솔라이드의 IL-31 및 IL-33 억제 효과를 단백질 수준에서 확인한결과를 나타내는도면이다.

도 10은 이소세.코타나파솔라이드의 가려움증 개선 효과를 임상실험을 통해 평가한 결과를 나타내는도면이다.

도 11은 이소세코타나파솔라이드의 TSLP 저해능에 대한 결과를 나타내는 도면이다.

도 12는 이소세코타나파솔라이드의 TARC 저해능에 대한 결과를 나타내는 도면이다.

도 13은 이소세코타나파솔라이드의 MDC-1 저해능에 대한 결과를 나타내는 도면이다.

도 14는 본원발명 제형예 3 및 비교제형예 3의 아토피 피부 개선 효과에 대한 결과를 나타내는 도면이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. 실시예 1: 이소세코타나파솔라이드의 제조

애엽 (Artemisia princeps)으로부터 다음과 같이 화합물 이소세코타나파솔라이드를 분리하였다.

먼저, 경동시장에서 구입한 애엽을 건조한 뒤 세절한 전초 5kg에 95¾에탄올 50L를 가하여 실온에서 3일 이상 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기 (EYELA사， N-1000, 일본)로 감압 농축하여 조추출물을 제조한다. 제조된 조추출물 중 200g을 2L 증류수로 현탁시킨 후 동량의 에틸아세테이트를 가하여 6회 반복 추출하고 분액깔때기에서 분획하여 에틸아세테이트층을 회수한 뒤 에틸아세테이트층을 감압농축하여 애엽 에틸아세테이트 가용 추출물 70g을 수득하였다.

상기에서 수득된 애엽의 에틸아세테이트 가용 추출물을 메탄올 용액에 용해시킨 후 디클로로메탄:메탄올 =80:1인 흔합용액을 사용하여 칼럼 (4.5x40cm)에 층진한 실리카겔 (머크사， 상품명 :9385)에 분획물을 흡착시키고 디클로로메탄 ： 메탄올 (80:1→50:1→30:1→20:1→15:1→5:1→1:1)의 조건으로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 시행하여 용출물을 크게 6개의 분획으로 나누었고 3번 용출물에서 하기 표 1에 기재된 조건의 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 하기 물성치를 갖는 이소세코타나파솔라이드를 수득하였고， 하기 실험예에 사용하였다. 표 2에 기재된 조건으로 애엽추출물의 고성능액체크로마토그래피 분석 도면은 도 1에 나타내었다.

【표 1]

NMR 기기로 -匿은 바리안사 (Varian, GEMINI , 400 MHz), C ¹³ -NMR은 바리안사 (Varian, GEMINI , 100 腿 z)로 분리된 화합물의 구조를 분석하였으며， DMS0(알드리치사)를 용매로 사용하였고， NMR 결과는 이미 발표된 자료와 일치함을 확인할 수 있었다 .[Hanna Ahn. et al . , Arch Pharm Res Vol 26, No4, 301-305, 2003]

¾-NMR ( DMSO- d ₆ , 400MHz ) : δ 1.70 (1H , m H-8 ) 1 · 85 ( 1H m H-8' ) 2.05 ( 3H , s H- 14),2.08(lH,d,H-2),2.11(3H,s,H-15),2.45(2H,m,H- 9),2.66(lH ₎ dd,J=18.2,6.2Hz ₎ H-2'),3.05(lH,m ₍ H-7),4.55(lH,s,H- 6),5.02(lH,d,J=5.6Hz,H-3),5.61(lH,brs,-0H),5.73(lH,d,J=2.5Hz ,H- 13),6.11(lH,d,J=2.9Hz,H-13')

^, C-NMR(DMS0-i¾,100MHz):613.4(C-15) ₎ 26.8(C-8),29.7(C-14),39.1(C- 9) ,41.3(C-7) , 44.3(C-2)， 69.7(C-3) ,75.4(C-6)， 121.6(C-13) , 135.7(C-5)， 139. 1(C- 11)， 169.6 C-12) , 175.0(04)， 203.4 C-1) , 207.6(010) 참고예 1 : 이소세코타나파솔라이드의 순도분석

상기 실시예 1에서 수득한 이소세코타나파솔라이드의 순도를 알아보기 위해 상기 표 2에 기재된 조건의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 순도분석을 하였고， 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

【표 3】 분석결과 상기 표 3에 나타난 바와 같이， 실시예 1의 정제물은 고성능 액체 크로마토그래피의 면적 대비 99.9%의 함량으로 정제가 되었음을 알 수 있었다. 실시예 2 : 정제된 이소세코타나파솔라이드 0.05%용해액 제조

상기 실시예 1에서 수득된 화합물 이소세코타나파솔라이드를 0.05 중량 % 함유되도록 정제수와부틸렌글리콜 흔합액 (30 중량 ¾)에 상온에서 1시간교반하여 완전히 용해한 후 와트만 (Whatman) #5 여과지로 여과하여 이소세코타나파솔라이드 0.05 중량 % 용해액을 제조하였다. 또한, 이소세코타나파솔라이드 0.0 용해액의 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)의 분석결과는도 2에 나타내었다. 실험예 1 : 인간피부세포주 HaCaT세포에서의 세포독성 측정

실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드에 대한 세포 독성을 평가하기 위해， 인간피부의 구성 세포주인 각질형성세포 HaCaT 세포주 (CLC Cel l l ine serve ice , Germany)를 사용한 CCK-8 assay를 진행하였다. 세포 생존율의 측정은 CCK-8 ki t를 이용하였다. Cel l을 96 wel l plate에 wel l당 2.5 χ 10 ^{4 χ} 90/^ media로 분주한후 37 ⁰ C C0 ₂ incubator에서 24 시간 배양을 하였다. 이 후 HaCaT 세포에 이소세코타나파솔라이드 (1.25， 2.5, 5， 10 ng/mL)을 농도별로 회석시켜 24 시간 동안 적용시킨 후 kit sol'n lO 를 넣고 차광하여 37 °C incubator에 넣고 1 시간 후에 450 ran에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 나타나는 바와 같이， 본 발명의 이소세코타나파솔라이드를 처리한모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인할수 있었다. 실험예 2: 사이토카인 분비 조절 확인 (ELISA)

실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드에 대한 사이토카인의 분비 조절을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 실험에 사용된 HaCaT keratinocyte를 60匪 dish에 2xl0 ⁵ cells/mi 분주한후 37°C, 5% C0 ₂ 배양기에서 24시간 동안 부착시켰다. 본 발명의 이소세코타나파솔라이드를 농도별로 1시간 동안 전 처리하고 IFN_Y(10 ng/mL)와 TNF-cx(10 ng/mL)를 처리한 후， 24시간 후 세포의 상층액을 수거하여 실험에 사용하였다. IL-lbeta, IL-6, IL-31, IL-33의 cytokine은 eBioscience (CA, USA)에서 판매하는 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 좀 더 상세히 설명하면， coating buffer로 희석한 capture Ab를 well당 100/^씩 넣고 4 ⁰ C 에서 overnight하였다. lx assay diluent를 well당

200 씩 넣어 실온에서 1시 간 동안 방치한 후， 최고농도부터 단계 회석한 standard와 시료를 well당 100^씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 계속해서 lx assay diluent로 회석한 detection Ab를 well당 씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반웅시킨 후 lxassay diluent로 회석한 avidin-HRP를 well당 씩 넣어 실온에서 30분 동안 반웅시켰다. 마지막으로 substrate solution을 well당 100/^씩 넣어 실온에서 15분간 방치한 후， stop solution을 well당 50 /^씩 넣어 반웅을 정지시키고 450 ran에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 4 내지 7에 나타내었다. 도 4 내지 7에서 나타나는 바와 같이， HaCaT keratinocyte 세포 배양액에서 이소세코타나파솔라이드가농도 의존적으로 IL-31, IL-33의 방출량을 감소시키는 것을 확인하였다. 실험예 3: 중합효소 연쇄반웅분석 (Reverse transcript ion-PCR analysis) 실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드를 시료로 역전사 중합 효소 연쇄반웅 (RT-PCR)을수행하여， 유전자수준에서 사이토카인의 방출 억제 정도를 측정하였다. 좀 더 상세히 설명하면， 전체 NA의 분리는 RNeasy Plus mini kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하였으며 제조자의 프로토콜을 사용하여 정제하였다. DNase의 처리 된 총 RNA의 은 first strand—cDNA를사용 하였다. 이 반웅은 임의의 프라이머 및 M-MLV 역전사 효소 (Invitrogen Corp. , CA, USA)를 사용하여 수행 하였다. The general PCR conditions ： 30 35 cycles at 94 °C for 2 10 min, 94 °C for 30 s 3 min, 50 °C - 58 °C for 30 s 1 min, 72 °C for 30 s 1 min, and 72 °C for 4 7 min 조건으로 진행하였다. 이미지는

Quantity One software (Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 사용한 primer는하기 표 4와같다.

【표 4】

실험에 사용된， IL-31의 경우 HaCaT 세포에 IFN-γ를 20ng/mL의 농도로 24시간 반웅시켰고， IL-33은 HaCaT 세포에 TNF-a(20ng/mL)와 IFN- γ (20ng/mL)의 농도로 처리하여 24시간 반웅하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 나타나는 바와 같이， 이소세코타나파솔라이드에 대한 IL-31, IL-33의 감소능을 확인한 결과농도 IL-31, IL-33의 발현을 감소시켜주는 것을 확인하였다. 실험예 4: 단백질 발현 분석 (Western blot analysis)

본 실험예에서는 실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드를 시료로 사용하여 단백질 수준에서 사이토카인의 방출 억제 정도를 확인하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다. 좀 더 상세히 설명하면， hDPCs 를 50mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl , .1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜릭산 (deoxychol ic acid), ImM PMSF를 포함하는 RIPA 완충액으로 용해하고 아이스에서 15분 동안 프로테아제 억제제 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 섞어서 4°C에서

10분 등안 20,000 xg로 원심 분리하였다. 상청액을 10분 동안 재 원심분리하였고， BCA protein assay kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 (20//g)을 SDS-PAGE(polyacryl amide gel electrophoresis)로 분리하였으며, PVDF (polyvinyl idene fluoride) 멤브레인 (Millipore Corp, Bedford, MA)으로 흡착시켰다. 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 0.1¾ Tween-20 및 5%의 skim milk (non-fat mi lk)가 포함된 PBS에서 반웅시키고， 1시간 동안 PBS/0.2% BSA로 희석된 1차 항체 IL-31, IL-33를 사용하여 탐침하였다. 세척한 후， 멤브레인을 2차 HRP가부착된 항 -래빗 (anti-rabbit) 또는 HRP가부착된 항- 마우스 (ant i -mouse) 항체 (Amersham, Arlington Heights, IL)로 반웅하고， 상기 밴드를 ECL Advance kit (Amersham)로 시각화하였다. 로딩 대조군 (Act in) 밴드로 표준화하였다. 가려움증과 관련된 사이토카인인 IL-31, IL-33의 단백질 수준의 조절을 확인하기 위하여 , IL-31의 경우 HaCaT세포에 IFN-γ를 20 ng/mL의 농도로

24시간 반웅시켰고, IL-33은 HaCaT 세포에 TNF-a (20 ng/mL)와 IFN-γ (20 ng/mL)의 농도로 처리하여 24시간 반웅하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 측정결과， 도 9에서 나타나는 바와 같이 이소세코타나파솔라이드가 농도 의존적으로 IL-31, IL-33의 발현을 단백질 수준에서 감소시켜주는 것을 확인하였다. 실험예 5: Real-time PCR을 이용한 이소세코타나파솔라이드의 TSLP

저해능 시험

5-1. Total RNA분리와 cDNA합성

Real-time PCR에 사용될 cDNA는 실시예 2의 화합물 이소세코타나파솔라이드 용해액을 HaCaT 세포주에 처리 24시간 후 total RNA를 추출하여 합성하였다. 구체적으로， 60醒 dish 당 TrizoKlnvitrogen, Carlsbad, CA) li 을 이용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA를 이용한 cDNA합성을 수행하기 위하여 전체 반웅액 20//«를 아래의 조성들로 구성하였다. 5X PrimeScript Buffer(Kit code RR037A, Lot A1201-1) 와 PrimeScript RT Enzyme Mix(Kit code RR037A, Lot A1201-1) 1 와 Oligo dT Primer(50^M)(Kit code RR037A, Lot A1201-1) 와 Random 6mers(100^M)(Kit code RR037A, Lot A1201-1) 4 ^를 흔합하여 tube에 넣은 후 얼음에 보관하였다. 이 tube에 total RNA를 씩 첨가하여 전체 반웅액이 20^가 되게 한 다음, mild vortexing 3회로 층분히 섞은 후 다시 얼음에 보관하였다. 이것을 PCR machine을 사용하여

37 ⁰ C에서 15분간 반응시킨 후 85°C에서 5초가 반웅하고 4°C로 처리하였다. 처리가끝난 cDNA는 하기 방식으로 real-time PCR분석에 사용되었다.

5-2. TSLP저해능 시험

TSLP (thymic stromal lymphopoiet in)은 아토피 피부염의 원인으로 파악되는 type 2 helper T cell 매개성 면역 편향을 개시하는 최상위 사이토카인으로 분류된다.

상기 실시예 1의 화합물 이소세코타나파솔라이드의 0.05% DMS0 용해액이 인간 각질형성세포 HaCaT의 TSLPCthymic stromal lymphopoietin) 발현에 미치는 감소 효과를 확인하기 위하여， 상기 cDNA real-time (실시간) PCR을 이용한 Taqman 방법을 실행하였다.

비교물질로 항염효과로 잘 알려진 화합물인 퀘르세틴 (sigma), 나린진 (sigma), 헤스페리딘 (sigma)를 같은 농도로 DMS0에 용해한 후 TSLP 사이토카인의 변화를 보았다. 실험은 ljug/z^농도의 cDNA 주형 1 ^에 상기 TSLP에 특이적인 Taqman Primer & Pi )be (HS00263639, AB Applied Biosystems, USA)와 Taqman Gene Expression Master Mix를 사용하여 반웅을 수행하였다. 최종 반웅 샘플들을 조제한 후， Applied Biosystems ABI 7500 Real-time PCR system(AB Applied Biosystems, USA)을 이용하여 측정하였다.

좀 더 상세히 설명하면， real-time PCR을 수행하기 위한 GAPDH와 TSLPCthymic stromal lymphopoietin) 분석용 반웅액을 만들었다. GAPDH 분석을 위한 반웅액은 GAPDH (Hs99999905, Lot 682967) 1^와 . D.W 5 ^와 Master Mix(2X)(TaqMan Gene Expression Master Mix L/N 0810037, P/N 4369016) 와 cDNA 를 잘 흔합하여 만들었다. TSLPCthymic stromal lymphopoietin) 분석을 위한 반웅액은 TSLP(Hs00263639) 1^와 D.W 5/^와 Master Mix(2X)(TaqMan Gene Expression Master Mix L/N 0810037, P/N 4369016) 와 cDNA 를 잘 흔합하여 만들었다. 만들어진 상기 반웅액을 real-time PCR 반웅용 plate (optical 96-well Reaction Plate with Barcode, part No.4306737)에 넣었다. 동일한 plate에 표준곡선 제조에 사용할 HaCaT cDNA 2//«와 Easy Dilution (Kit code RR037A, Lot A1201-1)로 X10, X100배 희석한 cDNA를 씩 첨가 한다. 상기에 제조된 cDNA 씩을 반웅액에 넣고 real-time PCR Cycles로 반웅시킨다.

Real-time PCR 반웅은 먼저 샘플들을 초기 변성을 위해 94 ⁰ C, 10분 동안 반웅시킨 후 전체 60사이클을 증폭시켰다. 각 사이클에 관한 시간과 온도는 94 ⁰ C 에 10초， 60°C에 10초， 25°C에 30초로 이루어졌다. 표적 유전자에 관한 발현은

Ct (threshold cycle) 방법에 의한 내부 대조 유전자 GAPDH (Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase)의 보정 정량화를통한상대적인 값으로 비교되었다. 그 결과， 하기 표 5 및 도 11에 나타난 바와 같이, 무처리한 대조군에 비 ^' 하여， 실시예 1의 화합물 이소세코타나파솔라이드 0.05% 용해액이 TSLP를 60% 이상유의적으로 감소시키는 결과를 확인하였고 다른 화합물에 비해 확연히 크게 감소하는 것을 알수 있었다.

【표 5]

실험예 6: TARC, MDC-1 케모카인 저해 실험 HaCaT keratinocyte를 60讓 dish에 2 ^χ 10 ⁵ cells/mL 분주한 후, 37 ⁰ C, 5% C0 ₂ 배양기에서 24시간 동안 부착시켰다. 농도별로 DMS0에 용해된 이소세코타나파솔라이드를 1시간 동안 전 처리한 고, IFN-y(10ng/mL)와 TNF- a(10ng/mL)를 처리한 후， 24시간 후 세포의 상층액을 수거하여 실험에 사용하였다. TAR (：， MDC-1의 chemokine은 eBioscience (CA, USA)에서 판매하는 ELISA it를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면， coating buffer로 회석한 capture Ab를 well당 100|jL씩 넣고 4 °C 에서 overnight하였다. l assay diluent를 well당 200//ί씩 넣어 실온에서 1 시간 동안 방치한 후， 최고농도부터 단계 희석한 standard와 시료를 well당 100 ^씩 넣고 실온에서 2 시간 동안 반웅시켰다. 계속해서 lxassay diluent로 희석한 detection Ab를 well당

100/ ^씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반웅시킨 후 lxassay diluent로 회석한 avidin-HRP를 well당 100 ^씩 넣어 실은에서 30분 동안 반웅시켰다. 마지막으로 substrate solution을 well당 100^씩 넣어 실온에서 15분간 방치한 후， stop solution을 well당 50/^씩 넣어 반옹을 정지시키고 450ran에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과， 도 12 및 도 13 과 같이 TARC, MDC-1의 케모카인은 이소세코타나파솔라이드 1.25， 2.5, 5， 농도에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것을 알수 있어 아토피 피부염 개선 효과가 탁월한 것을 알수 있었다.

제형예 1： 영양로션 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 영양로션을 하기 표 6의 조성으로 제조하였다.

【표 6]

번호 원 료 제형예 1 비교제형예 1

1 실시예 2 2.0 -

2 시토 스테롤 1.70 1.70 3 폴리글리세릴 2-을레이트 1.50 1.50

4 세라마이드 0.7 0.7

5 세테아레스 -4 1.2 1.2

6 콜레스테를 1.5 1.5

7 디세틸포스페이트 0.4 0.4

8 농글리세린 5.0 5.0

9 선플라우어오일 10.0 10.0

10 카르복시비닐폴리머 0.2 0.2

11 산탄검 0.3 0.3

12 방부제 미량 미량

13 향료 미량 미량

14 정제수 잔량 잔량

합계 100 100 제형예 2 : 영양크림 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 증 영양크림을 하기 표 7의 조성으로 제조하였다.

【표 7]

번호 원 료 제형예 2 비교제형예 2

1 실시예 2 2.0 -

2 시토 스테를 4.0 4.0

3 폴리글리세릴 2-올레이트 3.0 3.0

4 세라마이드 0.7 0.7

5 세테아레스 -4 2.0 2.0

6 콜레스테롤 3.0 3.0

7 디세틸포스페이트 0.4 0.4

8 농글리세린 5.0 5.0

9 선플라우어오일 22.0 22.0

10 카르복시비닐폴리머 0.5 0.5

11 트리에탄올아민 0.5 0.5

12 방부제 미량 미량 13 향료 미량 미량

14 정제수 잔량 잔량

합계 100 100

제형예 3: 맛사지 크림 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 맛사지 크림을 하기 표 8의 조성으로 제조하였다.

【표 8]

제형예 4: 해어토닉 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 헤어토닉을 하기 표 9의 조성으로 제조하였다. 【표 9]

제형예 5: 해어컨디셔너 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 헤어토닉을

조성으로 제조하였다.

【표 10]

번호 원 료 제형예 5 비교제형예 5

1 실시예 2 2.0 -

2 세탄을 3.5 3.5

3 자기유화형 모노스테아린산글리세린 1.5 1.5

4 프로필렌 글리콜 2.5 2.5

5 염화스테아릴쩨틸벤질 암모늄 (25%) 7.0 7.0

6 파라옥시안식향산메틸 0.3 0.3

7 색소 적량 적량

8 향료 적량 적량 9 정제수 잔량 잔량

합 계 100 100 실험예 7 : 임상효과실험 평가 (가려음증개선)

상기 제형예 2 및 비교제형예 2의 화장료를 이용하여， 가려움의 개선도를 평가하였다. 아토피， 습진, 두드러기, 해층에 의한 피부가려움증을 느끼고 있으며， 피험자 중 다른 전신 질환이 없고， 최근 한 달간 경구 항생제 및 면역 억제제를사용하지 않은사람 중에서 심한 가려움을호소하는 40명을 선정하였다. 가려움증의 원인에 대한 구분은 하지 않았으며 단지 피험자가 가렵다고 느끼는 정도가 초기 5이상의 강도를 기준으로 선정하였다. 연령은 20세에서 45세까지였으며, 평균 연령은 31.5세이었고， 남자가 23명， 여자는 17명이었다. 환자들은 실험 시작 전 일주일 이내 스테로이드 외용제를 사용하지 않았으며 실험기간 중에는 스테로이드 외용제의 사용을 제한하였다. 처방예 2의 제형예 2 및 비교예 2를 따라 제조된 영양크림을 환부로 규정된 부위에 비교예 2에 의하여 제조된 시료를 1회 도포 후 30분 후， 1시간 후의 가려움 (소양증)의 정도를 주관적인 판단에 따라 수치화하였으며， 이후 동일한 부위에 제형예 2에 의하여 제조된 시료를 1회 도포하여 30분 간격으로 3시간동안가려움 (소양증)의 정도를 주관적 판단에 따라 수치화하도록 하였다. 가려움증 완화 평가는 가려움증의 강도를 1~10의 수치로 나누어 현재 느끼고 있는 가려움증의 강도를 수치로 나타내게 하였다. 각각의 시간에 따라 얻어진 강도수치를 초기 강도수치로 나누어 백분율로 수치화하여 얻어진 평균값 (가려움 활성 %)을 시간에 따라 하기 표 11에 나타내었다. 또한, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

【표 111

내용 Time(min) 가려움 활성 (¾) 표준편차 비교예 처리전 0 100.0 0.0 비교예 처리 30분 경과 30 91.5 12.4 비교예 처리 60분 경과 60 85.0 13.9

제조예 처리 전

제조예 처리 30분 경과 90 36.2 24.9 제조예 처리 60분 경과 120 7.3 12.4 제조예 처리 90분 경과 150 1.3 4.8 제조예 처리 120분 경과 180 0.9 4.1 _.

제조예 처리 150분 경과 210 ^' 1.8 5.4 제조예 처리 180분 경과 240 2.2 5.9 실험결과， 도 10에 나타난 것과 같이， 비교 제형쉐 2를 병변부위에 도포 후 초기 가려움증 강도보다 30분 경과 후 91.5%, 60분 경과 후 85.0%로 낮아졌으나， 동일한 병변부위에 실시예 2가 함유된 제형예 2를 도포하면 가려움증 강도가 30분 경과 후 36.2¾， 60분경과 후 7.3%로 급속하게 줄어들었으며 , 90분경과 후에는 거의 가려움증을 느끼지 못하는 수준까지 줄어들었다. 따라서 본 발명에서 제형예 2에 함유된 실시예 2가 가려움중을 완화시키거나 억제하는데 뚜렷한 효과가 있음을 확인하였다. 실험예 8: 아토피 피부 개선 효과조사

상기 제형예 3의 화장료에 대한 아토피 피부 개선 효과의 임상평가를 측정하였다. 제형예 3 화장료의 '아토피 피부의 개선 효과를 평가하기 위해， 아토피성 피부를 가지고 병원에 내원 하여 치료받는 환자 15명을 대상으로 다음과 같은 실험을 실시하였다. 시험 시료를 이중 맹검법 (double-blinded test)에 의하여 각각 오른쪽과 왼쪽으로 나누어 전신에 도포하되， 가능한 한 시험시료의 효과에 영향을 미칠 수 있는 다른보습제의 사용은 금지하였다. 시험 시료를 도포한 지 1, 2, 3, 4주 후의 효과를 스코래드 (SCORAD: SCORing Atopic Dermatitis) 측정법으로 식 1에 따라 계산하고 그 결과를 하기 표 11 에 나타냈다.

1) 판정기준

① 정도 기준 (Extent criteria) ： 면적 =피손부위 /100 강도 기준 (intensity criteria) -홍반 (1/2/3) -부종 (1/2/3)

-삼출 (1/2/3)

- 피부 벗겨짐 (1/2/3)

- 태선화 정도 (1/2八 3)

- 건조 정도 (1/2/3)

③주관적 기준

-가려움 (1~10)

-불면증 (1~10)

[식 1]

【표 12】 상기 표 12를 통해 본 발명의 이소세코나타파솔라이드를 함유하는 제형예 3의 화장료가 비교제형예 3에 비해 아토피 피부 개선효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다. 4주 후의 결과로 보아 80.3%의 개선 효과를 나타내고 있었으며， 이에 대한아토피 피부의 개선율을도식화하여 도 14에 나타내었다. 참조문헌

JP5307369 Β2