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Title:
COSMETIC COMPOSITION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2011/125057
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to novel eucomic acid (2-(4-hydroxybenzyl)malic acid) derivatives or plant extracts comprising such derivatives, and also to cosmetic or dermatological compositions containing these compounds or these extracts, and to cosmetic care methods using said compositions. The invention relates in particular to compounds characterized in that they are represented by formula (I) below: (I) in which, with the proviso that R1, R2 and R3 are not simultaneously a hydrogen atom, R1 and R3 each independently represent a hydrogen atom or a saturated or unsaturated, preferably C1-C12, hydrocarbon-based chain comprising an aromatic group, preferably a phenyl, said aromatic group being preferably substituted with a group comprising a sugar, preferably a monosaccharide or disaccharide, said chain optionally also comprising one or more heteroatoms preferably chosen from O, S and N, and R2 represents a hydrogen atom or a sugar, preferably a monosaccharide or disaccharide, said sugar being optionally substituted, in particular with a residue comprising a saturated or unsaturated, preferably C1-C12, hydrocarbon-based chain itself comprising an aromatic group, preferably a phenyl, said hydrocarbon-based chain optionally also comprising one or more heteroatoms preferably chosen from O, S and N.

Inventors:
SIMMLER, Charlotte (58bis route de Lyon, Illkirch, F-67400, FR)
LEPLANQUAIS, Virginie (2 venelle du quai au vin, Fay-aux-Loges, Fay-aux-Loges, F-45450, FR)
NOBLESSE, Emmanuelle (7 allée du Lac, Donnery, F-45450, FR)
ANDRE, Patrice (9 rue Charles Vappereau, Neuville Aux Bois, Neuville Aux Bois, F-45170, FR)
LOBSTEIN, Annelise (36 rue des roses, Lipsheim, Lipsheim, F-67640, FR)
Application Number:
IB2011/051628
Publication Date:
October 13, 2011
Filing Date:
April 14, 2011
Export Citation:
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Assignee:
GUERLAIN (68 Avenue des Champs Elysées, Paris, Paris, F-75008, FR)
UNIVERSITE DE STRASBOURG (4 rue Blaise Pascal, Strasbourg, Strasbourg, F-67000, FR)
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (3 rue Michel-Ange, Paris, Paris, F-75016, FR)
SIMMLER, Charlotte (58bis route de Lyon, Illkirch, F-67400, FR)
LEPLANQUAIS, Virginie (2 venelle du quai au vin, Fay-aux-Loges, Fay-aux-Loges, F-45450, FR)
NOBLESSE, Emmanuelle (7 allée du Lac, Donnery, F-45450, FR)
ANDRE, Patrice (9 rue Charles Vappereau, Neuville Aux Bois, Neuville Aux Bois, F-45170, FR)
LOBSTEIN, Annelise (36 rue des roses, Lipsheim, Lipsheim, F-67640, FR)
International Classes:
C07H15/203; A61K8/60; A61K31/7034; A61Q19/08
Foreign References:
FR2924348A12009-06-05
FR2924348A12009-06-05
Other References:
HELLER ET AL., HELVETICA CHIMICA ACTA, vol. 57, no. 6, 1984, pages 1766 - 84
ROEHM ET AL., J. IMMUNOL. METHODS, vol. 142, 1991, pages 257 - 265
Attorney, Agent or Firm:
PORTAL, Frédéric et al. (Cabinet BEAU DE LOMENIE, 158 Rue de l'Université, Paris Cedex 07, F-75340, FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1. Composé de formule (I),

dans laquelle sous réserve que Ri, R2 et R3 ne soient pas simultanément un atome d'hydrogène,

Ri et R3 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée, de préférence en C1-C12, saturée ou insaturée, comprenant un groupement aromatique, de préférence un phényle, ledit groupement aromatique étant de préférence substitué par un groupement comprenant un sucre, de préférence un mono- ou disaccharide, ladite chaîne comprenant éventuellement en outre un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi O, S et N, et R2 représente un atome d'hydrogène ou un sucre, de préférence un mono- ou disaccharide, ledit sucre étant éventuellement substitué, notamment par un reste comprenant une chaîne hydrocarbonée de préférence en CrCi2, saturée ou insaturée comprenant elle-même un groupement aromatique, de préférence un phényle, ladite chaîne hydrocarbonée comprenant éventuellement en outre un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi O, S et N. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Ri et/ou R3 représentent un groupe benzyle substitué par un groupe OR4, de préférence en position para, groupe dans lequel R4 représente un groupe choisi parmi (i) un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comprenant une chaîne hydrocarbonée, de préférence en Q-C12, linéaire ou ramifiée, et/ou cyclique, aromatique ou non aromatique, saturée ou insaturée, comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi O, S et N, ladite chaîne carbonée étant elle-même non substituée ou substituée, de préférence avec un groupement comprenant un sucre, de préférence un mono- ou disaccharide; et (ii) un reste de sucre, de préférence un mono- ou disaccharide, ledit sucre étant éventuellement substitué, notamment par un reste comprenant une chaîne hydrocarbonée, de préférence en Ci-Ci2, linaire ou ramifiée, etyou cyclique, aromatique

FEUILLE MODIFIÉE (ARTICLE 19) ou non aromatique, saturée ou insaturée, substituée ou non substituée, comprenant elle- même éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi 0, S et N.

3. Composé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que Rx et R3 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupement benzyle de préférence substitué par un groupement glucopyranosyloxy, tel que le groupement 4-p-D-glucopyranosyloxybenzyle, et R2 représente un groupement glucopyranosyle, tel que le groupement β-D-glucopyranosyle, de préférence substitué, notamment par estérification d'une fonction hydroxyle, par une chaîne hydrocarbonée de préférence en C1-C12, saturée ou insaturée comprenant elle-même un groupement aromatique, de préférence un phényle, R2 représentant notamment le groupe β-D- glucopyranosyl-3-.rans-cinnamoyl ester ; R R2, et R3 n'étant pas simultanément un atome d'hydrogène.

4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que Ri et/ou R3 sont identiques ou différents et représentent un groupe benzyle substitué par un groupe O 4, R» représentant un groupe glucopyranosyle, éventuellement substitué.

5. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que i et R3 sont identiques et représentent chacun un groupe 4'-(glucopyranosyloxy)-benzyle.

6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il l'atome de carbone asymétrique en position 2 de la partie malate selon la formule (I), se présente selon une conformation énantiomère (R).

7. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est représenté par la formule ci-dessous :

8. Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que VTl est le 4-(4-β- D-glucopyranosyloxybenzyl)-(2R)-2-( 7-hydroxybenzyl)-malate.

9. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est représenté par la formule ci-dessous :

FEUILLE MODIFIÉE (ARTICLE 19)

10. Composé selon la revendication9, caractérisé en ce que VT2 est le 1,4- bis(4- -D-glucopyranosyloxybenzyl)-(2R)-2-( ?-hydroxybenzyl)-malate.

11. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est représenté par la formule ci-dessous :

12. Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que VT3 est le 1,4- bis(4- -D-glucopyranosyloxybenzyl)-(2R)-2-(2-p-D-glucopyranosyl-3-6ra 7s^cinnamoyl ester)-2-( >hydroxybenzyl)-malate.

13. .Extrait de plante caractérisé en ce qull est spécifiquement enrichi en un ou plusieurs des composés de formule (I) tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 12.

14. Extrait selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'au moins une partie d'une orchidée, en particulier d'une orchidée appartenant au genre Papilionanthe, Vanda ou Encyclia.

15. Extrait selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de l'orchidée Papilionanthe teres, notamment à partir de tiges, de racines, de fleurs ou des feuilles de ladite orchidée, et en ce qull comprend au moins un composé de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 à 12.

16. Extrait selon la revendication 15, caractérisé en ce qull est enrichi par élimination des sucres ou par fractionnement.

17. Extrait selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que l'extrait comprend au moins 40% en poids de composés de formule (I) par rapport au poids total de l'extrait sec.

18. Extrait selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs composés choisis parmi VT1 et/ou VT2, à une teneur cumulée supérieure à 40% en poids par rapport au poids de l'extrait sec, de préférence supérieure à 60%, et encore de préférence supérieure à 80%.

19. Extrait selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce quil comprend le composé VT3 à une teneur supérieure à 8% en poids par rapport au poids de l'extrait sec, de préférence supérieure à 15% en poids.

20. Extrait selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que l'extrait est constitué par au moins 80% en poids des composés VT1, VT2 et VT3 par rapport au poids total de l'extrait sec, de préférence au moins 90% en poids.

21. Extrait selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisé en ce quil est préparé à partir des tiges ou des racines de l'orchidée Papilionanthe teres.

22. Composition cosmétique ou dermatologique comprenant à titre d'agent actif cosmétique ou dermatologique, au moins un composé selon la formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 12 et/ou au moins un extrait selon l'une quelconque des revendications 13 à 21.

23. Composition selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'elle comprend un ou plusieurs autres agents actifs cosmétiques ou dermatologiques, choisi(s) par exemple parmi des substances ayant une activité anti-vieillissement ; des substances ayant une activité dépigmentante ou une activité éclaircissante de la peau; des substances ayant une activité amincissante ; des substances ayant une activité hydratante ; des substances ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; des substances stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; des substances ayant une activité sébo-régulatrice pour le soin des peaux grasses ; des substances destinées à nettoyer ou purifier la peau ; des substances ayant une activité anti-radicalaire, et en outre au moins un excipient cosmétiquement ou dermatoplogiquement acceptable, qui peut être notamment choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des conservateurs, et leurs mélanges.

24. Composition selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce qu'elle se présente avantageusement sous forme d'un sérum, d'une lotion, d'une crème ou d'un hydrogel, notamment un masque, ou encore sous la forme d'un stick ou d'un patch.

25. Utilisation d'au moins un composé selon la formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou d'au moins un extrait tel que défini à l'une quelconque des revendications 13 à 21, en tant qu'agent actif cosmétique ou dermatologique dans une composition cosmétique ou dermatologique, ledit agent actif étant destiné à lutter contre le vieillissement cutané, notamment pour atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides et les propriétés protectrices de l'épiderme, et/ou à maintenir ou améliorer l'hydratation cutanée et/ou à favoriser la cicatrisation cutanée.

26. Utilisation, selon la revendication 25, caractérisé en ce que ledit agent actif stimule l'expression et/ou l'activité des déshydrogénases mitochondriales, et/ou de la cytochrome C oxidase, et/ou la chaîne respiratoire des mitochondries, et/ou le métabolisme énergétique des cellules, et/ou la différenciation et le renouvellement des cellules épithéliales.

27. Utilisation, selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce que ledit agent actif agit au niveau de l'épiderme et en particulier des cellules épithéliales, et encore plus particulièrement au niveau des kératinocytes.

28. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisé en ce que la concentration dudit composé ou dudit extrait, en tant qu'agent actif cosmétique ou dermatologique, dans une composition cosmétique ou dermatologique est comprise entre 0,0001 et 1% en poids, plus particulièrement entre 0,001 et 0, 1 % en poids, encore mieux entre 0,01 et 0, 1 % en poids, par rapport au poids de ladite composition.

29. Méthode de soin cosmétique ou dermatologique caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur les zones de peau concernées, d'une composition cosmétique ou dermatologique telle que définie selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, en une quantité efficace pour lutter contre le vieillissement cutané, notamment pour atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, restructurer l'épiderme, raffermir la peau, favoriser l'atténuation ou la résorption des rides et les propriétés protectrices de l'épiderme, et/ou pour maintenir ou améliorer l'hydratation cutanée et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée.

30. Méthode, selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application de ladite composition sur une zone de peau du visage, du cou ou du corps, notamment des mains, présentant des signes de vieillissement tels que la présence de rides ou de ridules.

31. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou un extrait selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'extraction d'au moins une partie d'une plante, en particulier de l'orchidée Papilionanthe teres, comprenant un tel composé, et au moins une étape d'enrichissement de l'extrait obtenu à l'étape d'extraction en un ou plusieurs composés de formule (I).

32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'extraction est réalisée à l'aide d'au moins un solvant polaire un mélange de solvants polaires, les solvants polaires étant de préférence l'eau ; un alcool en Q-Q, et notamment le méthanol, l'éthanol, un propanol ; un polyol, et notamment un glycol, et par exemple le glycérol, le propylène glycol ou le butylène glycol, un mélange hydro-alcoolique, et de préférence un mélange éthanol/eau, et plus particulièrement un mélange éthanol/eau dans un rapport de l'ordre de 90/10 v/v.

33. Procédé selon la revendication 31 ou 32, caractérisée en ce que ladite étape d'enrichissement est obtenu par élimination des sucres ou par fractionnement, notamment par chromatographie d'exclusion stérique.

Description:
Composition cosmétique

L'invention concerne de nouveaux dérivés de l'acide eucomique (acide 2- (4-hydroxybenzyl)-malique), des compositions cosmétiques ou dermatologiques comprenant au moins un de ces composés et des méthodes de soin utilisant lesdites compositions.

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les mitochondries constituent l'usine de production d'énergie cellulaire, grâce à leur chaîne respiratoire et la phosphorylation oxydative. Lors du vieillissement cutané, notamment photo-induit, on observe une baisse des fonctions mitochondriales.

En règle générale, une chaîne respiratoire mitochondriale défectueuse conduit à une augmentation intracellulaire d'espèces oxygénées réactives (EOR), ce qui accélère le processus de vieillissement cutané. Cette dysfonction mitochondriale est responsable d'une baisse du métabolisme énergétique cellulaire qui compromet au final la production d'énergie cellulaire. En cosmétique, les actifs capables de stimuler le fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale, et ainsi d'activer le métabolisme énergétique cellulaire, revendiquent des fonctions anti-âges (CoQlO, Resvératrol). Par ailleurs, les actifs cosmétiques qui stimulent le renouvellement et donc la différenciation cellulaire participent au maintien d'une peau saine et jeune.

La présente invention porte sur de nouveaux composés dérivés de l'acide eucomique (acide 2-(4-hydroxybenzyl)-malique), notamment obtenus à partir d'un extrait de l'orchidée Papilionanthe teres, qui présentent de telles propriétés.

L'acide eucomique est connu. Il a tout d'abord été isolé à partir d'un extrait de bulbes à'Eucomis punctata (famille des Liliacées) {Heller et al, Helvetica Chimica Acta, 1984, 57 (6), 1766-84), puis identifié ensuite dans d'autres espèces végétales telles que Lotus japonicus (Fabaceae), Crotalaria sessiflora (Fabaceae), Crataegus pinnatifada (Rosaceae), ou bien encore Encyclia michuacana (Orchidaceae).

La famille des Orchidaceae (Orchidacées ou Orchidées) est une très grande famille de plantes monocotylédones. C'est la famille végétale la plus diversifiée, comptant plus de vingt-cinq mille espèces, réparties en huit-cent cinquante genres. Un certain nombre d'orchidées ont déjà fait l'objet d'études dans le domaine de la cosmétique, visant des applications pour les soins de la peau.

Par exemple, la demande de brevet FR 2 924 348 divulgue un extrait obtenu à partir d'au moins une partie de l'orchidée Vanda teres, maintenant classée dans le genre Papilionanthe en tant qu'espèce dénommée Papilionanthe teres, ainsi que l'utilisation dudit extrait en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique comprenant au moins un excipient cosmétiquement acceptable, et destinée à être appliquée sur la peau pour atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau.

Cet extrait de Papilionanthe teres est donc particulièrement intéressant du point de vue de ses activités, notamment cosmétiques ou dermatologiques. Cependant, à la connaissance des inventeurs, aucune molécule responsable de ces activités n'a été, à ce jour, ni isolée, ni identifiée.

BUTS DE L'INVENTION

La présente invention a pour but principal de fournir de nouveaux composés chimiques utilisables comme agents actifs cosmétiques ou dermatologiques aptes à atténuer ou retarder les effets du vieillissement cutané, et/ou à maintenir ou améliorer l'hydratation cutanée et/ou favoriser la cicatrisation cutanée.

Elle a également pour but de fournir ces nouveaux composés sous une forme utilisable en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique ou dermatologique, notamment sous la forme d'extraits végétaux enrichis en au moins un de ces nouveaux composés.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition cosmétique ou dermatologique contenant au moins un de ces composés en tant qu'agent cosmétique ou dermatologique, ou un tel agent actif sous forme d'extrait végétal, dans un véhicule cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable, compatible avec une application topique sur la peau.

L'invention a également pour but de résoudre le problème technique consistant en l'isolement et la caractérisation d'une ou plusieurs molécules actives d'un extrait de l'orchidée Papilionanthe teres.

L'invention a enfin pour but de proposer une solution à ces problèmes techniques de manière particulièrement simple, relativement peu coûteuse, et utilisable à l'échelle industrielle et cosmétique.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Les inventeurs de la présente invention ont isolé et identifié de nouveaux composés dérivés de l'acide eucomique, obtenus notamment à partir d'un extrait de l'orchidée Papilionanthe teres. Ces nouveaux composés, de formule (I) ci-dessous, sont collectivement dénommés « vandatérosides » dans la présente demande (en abrégé « T »}.

Les inventeurs ont également mis en évidence l'impact des vandatérosides de l'invention sur le fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale des kératinocytes humains (KHN et HaCaT), en s'intéressant plus précisément aux complexes I et II de la chaîne respiratoire ainsi qu'à la cytochrome C oxydase. Ils ont également montré qu'ils stimulent significativement le fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale et la différenciation cellulaire des kératinocytes humains. Ces molécules agissent donc au cœur de la régulation du métabolisme énergétique et de la régulation du stress oxydant cellulaire et présentent donc un intérêt inattendu en tant qu'agents actifs dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques pour lutter contre le vieillissement cutané. En stimulant le renouvellement et la différenciation cellulaire, les composés participent au métabolisme cellulaire et stimulent le renouvellement du stratum corneum et contribuent au maintien d'une peau saine et jeune.

Les techniques employées font appel d'une part à la mesure de la transformation du XTT (2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide) en formazan soluble par les complexes I et II des KHN, d'autre part à la mesure propre de l'activité enzymatique du cytochrome C oxydase extraite des mitochondries de kératinocytes humains modifiés (HaCaT).

De même, les inventeurs ont évalué l'action de ces vandatérosides sur la production de protéines d'expression (transglutaminase, involucrine, desmogléine I) de la différenciation des KHN par immuno-marquage. Ce processus de différenciation participe au renouvellement cellulaire de l'enveloppe cornéenne.

Un premier objet de l'invention vise un composé de formule (I),

dans laquelle

sous réserve que Ri, R 2 et R 3 ne soient pas simultanément un atome d'hydrogène^ ! et R 3 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée, de préférence en CrQ 2 , saturée ou insaturée, comprenant un groupement aromatique, de préférence un phényle, ledit groupement aromatique étant de préférence substitué par un groupement comprenant un sucre, de préférence un mono- ou disaccharide, ladite chaîne comprenant éventuellement en outre un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi O, S et N, et R 2 représente un atome d'hydrogène ou un sucre, de préférence un mono- ou disaccharide, ledit sucre étant éventuellement substitué, de préférence par estérification de l'une des fonctions hydroxyles, notamment par un reste comprenant une chaîne hydrocarbonée de préférence en CrQ 2 , saturée ou insaturée comprenant elle-même un groupement aromatique, de préférence un phényle, ladite chaîne hydrocarbonée comprenant éventuellement en outre un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi O, S et N.

Le sucre est de préférence un monosaccharide tel que par exemple le glucose, le mannose, le fructose, le xylose, l'arabinose, ou un disaccharide tel que par exemple le saccharose ou le maltose, ou l'un de leurs dérivés.

Des composés préférés de l'invention sont en particulier ceux de formule (I) dans lesquels Rj et/ou R 3 représentent un groupe benzyle substitué par un groupe OR4, de préférence en position para, groupe dans lequel R 4 représente un groupe choisi parmi (i) un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comprenant une chaîne hydrocarbonée, de préférence en CrCn, linéaire ou ramifiée, et/ou cyclique, aromatique ou non aromatique, saturée ou insaturée, comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi O, S et N, ladite chaîne carbonée étant elle-même non substituée ou substituée, de préférence avec un groupement comprenant un sucre, de préférence un mono- ou disaccharide; et (ii) un reste de sucre, de préférence un mono- ou disaccharide, ledit sucre étant éventuellement substitué, notamment par un reste comprenant une chaîne hydrocarbonée, de préférence en Q-C 12 , I inaire ou ramifiée, et/ou cyclique, aromatique ou non aromatique, saturée ou insaturée, substituée ou non substituée, comprenant elle-même éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis de préférence parmi O, S et N.

De préférence, R, et R 3 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupement benzyle de préférence substitué par un groupement glucopyranosyloxy, tel que le groupement 4- -D-glucopyranosyloxybenzyle, et R 2 représente un groupement glucopyranosyle, tel que le groupement β-D- glucopyranosyle, de préférence substitué, notamment par estérifïcation d'une fonction hydroxyle, par une chaîne hydrocarbonée de préférence en C r C 12 , saturée ou insaturée comprenant elle-même un groupement aromatique, de préférence un phényle, R 2 représentant notamment le groupe p-D-glucopyranosyI-3-£ra/?s-cinnarnoyl ester ; R 1( R,, et R 3 n'étant pas simultanément un atome d'hydrogène.

Des composés plus particulièrement préférés sont ceux pour lesquels R r et/ou R 3 sont identiques ou différents et représentent un groupe benzyle substitué par un groupe OR4, R, représentant un groupe glucopyranosyle, éventuellement substitué.

Parmi ces derniers, les composés préférés sont en particulier ceux pour lesquels, selon la formule (I), Ri et R 3 sont identiques et représentent chacun un groupe 4'-(glucopyranosyloxy)-benzyle.

Avantageusement, l'atome de carbone asymétrique en position 2 de la partie malate selon la formule (I), se présente selon une conformation énantiomère (R).

Les composés particulièrement préférés pour la mise en œuvre de l'invention sont ceux qui présentent les formules ci-dessous :

et en particulier le 4-(4- -D-glucopyranosyloxybenzyl)-(2R)-2-( ?-hydroxybenzyl)- malate,

et en particulier le l,4-bis(4- -D-glucopyranosyloxybenzyl)-(2R)-2-(/>hydroxybenzyl)- malate,

et en particulier le l,4-bis(4- -D-glucopyranosyloxybenzyl)-(2R)-2-(2- -D- glucopyranosyl-S-fra^cinnamoyl ester)-2-(^hydroxybenzyl)-malate.

Un deuxième objet de l'invention concerne un extrait de plante caractérisé en ce qull est spécifiquement enrichi en un ou plusieurs des composés de formule (I) tels que définis ci-dessus.

Ledit extrait est avantageusement obtenu à partir d'au moins une partie d'une orchidée, en particulier d'une orchidée appartenant au genre Papilionanthe, Vanda ou Encyclia.

Un extrait préféré est en particulier caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de l'orchidée Papilionanthe teres, notamment à partir de tiges, de racines, de fleurs de ladite orchidée, et en ce qu'il comprend au moins un de composé formule (I), et de préférence VTl et/ou VT2 et/ou VT3.

On entend par « spécifiquement enrichi » ou « enrichi » un extrait qui est obtenu par une étape visant à augmenter volontairement la teneur de l'extrait en composés de formule (I), de préférence en composé(s) VTl et/ou VT2 et/ou VT3. Ledit extrait enrichi est en particulier avantageusement obtenu par une étape d'élimination des sucres ou par fractionnement, et par exemple par chromatographie d'exclusion stérique.

Des extraits typiques sont ceux dont l'extrait sec comprend une concentration en composés de formule (I), de préférence en composé(s) VTl et/ou VT2 et/ou VT3, supérieure à celle d'un extrait sec obtenu après extraction, sans étape visant à augmenter spécifiquement la concentration des composés précités.

De préférence ledit extrait enrichi comprend au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 70% et encore de préférence au moins 80% en poids de composés de formule (I), de préférence en composé VTl et/ou VT2 et/ou VT3, par rapport au poids total de l'extrait sec.

Un extrait particulier de l'invention, avantageusement préparé à partir de l'orchidée Papilionanthe teres, est caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs composés choisis parmi VTl et/ou VT2 à une teneur cumulée supérieure à 40% en poids par rapport au poids de l'extrait sec, de préférence supérieure à 60%, et encore de préférence supérieure à 80%.

Un autre extrait de l'invention, également avantageusement préparé à partir de l'orchidée Papilionanthe teres, est caractérisé en ce qu'il comprend le composé VT3 à une teneur supérieure à 8% en poids par rapport au poids de l'extrait sec, de préférence supérieure à 15% en poids, de préférence supérieure à 25% en poids, et encore de préférence supérieure à 40% en poids.

Avantageusement l'extrait de l'invention est caractérisé en ce qu'il est constitué par au moins 80% en poids des composés VTl, VT2 et VT3 par rapport au poids total de l'extrait sec, de préférence au moins 90% en poids.

Un extrait enrichi préféré est plus particulièrement préparé à partir des tiges ou des racines de l'orchidée Papilionanthe teres.

Un troisième objet de l'invention porte sur une composition cosmétique ou dermatologique comprenant à titre d'agent actif cosmétique ou dermatologique, au moins un composé selon la formule (I) et/ou un extrait de plante comprenant un tel composé, avantageusement selon l'une quelconque des variantes et modes de réalisation décrits précédemment.

Outre au moins un des composés ou extraits précités, la composition cosmétique peut également comprendre un ou plusieurs autres agents actifs cosmétiques ou dermatologiques, sous forme de molécules purifiées et/ou d'extraits végétaux, présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à celles des desdits composés.

La composition peut ainsi notamment comprendre un ou plusieurs autres extraits de plantes, obtenus à partir de plantes entières ou de parties de plantes ou encore des solutions réalisées à partir d'extraits de ces plantes, les extraits étant avantageusement obtenus par les procédés classiquement utilisés par l'homme de l'art, et plus particulièrement par extraction à l'aide d'un solvant polaire ou d'un mélange de solvants polaires, avantageusement choisis parmi l'eau, des alcools en Q-Q ou des glycols.

Les autres agents actifs cosmétiques ou dermatologiques peuvent être choisis par exemple parmi des substances ayant une activité anti-vieillissement ; des substances ayant une activité dépigmentante ou une activité éclaircissante de la peau; des substances ayant une activité amincissante ; des substances ayant une activité hydratante ; des substances ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; des substances stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; des substances ayant une activité sébo-régulatrice pour le soin des peaux grasses ; des substances destinées à nettoyer ou purifier la peau ; des substances ayant une activité anti-radicalaire.

La composition peut avantageusement comprendre au moins un extrait d'orchidée telle qu'une orchidée appartenant au genre Brassocattleya, par exemple un extrait de l'orchidée Brassocattleya marcella, ou au genre Encyclia, par exemple un extrait de l'orchidée Encyclia michuacana ou au genre Cattleya, ou au genre Vanda, par exemple un extrait d'une orchidée parmi Vanda coerulea ou Vanda denisoniana, ou bien encore au genre Papilionanthe.

Avantageusement, la composition comprend en outre au moins un excipient cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable qui peut être notamment choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des conservateurs, et leurs mélanges.

La composition cosmétique ou dermatologique se présente avantageusement sous forme d'un sérum, d'une lotion, d'une crème ou d'un hydrogel, notamment un masque, ou encore sous la forme d'un stick ou d'un patch.

Un quatrième objet de l'invention concerne l'utilisation d'au moins un composé selon la formule (I) ou d'au moins un extrait de plante comprenant un tel composé, avantageusement selon l'une quelconque des variantes et modes de réalisation décrits précédemment, en tant qu'agent actif cosmétique ou dermatologique dans une composition cosmétique ou dermatologique.

Avantageusement ledit composé ou ledit extrait est un agent actif destiné à lutter contre le vieillissement cutané, notamment pour atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides et les propriétés protectrices de l'épiderme, et/ou à maintenir ou améliorer l'hydratation cutanée et/ou à favoriser la cicatrisation cutanée.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un composé selon la formule (I), ou un extrait de plante comprenant un tel composé, avantageusement selon l'une quelconque des variantes et modes de réalisation décrits précédemment, en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique ou dermatologique, ledit agent actif stimulant l'expression et/ou l'activité des déshydrogénases mitochondriales, et/ou de la cytochrome C oxydase, et/ou de la chaîne respiratoire des mitochondries, et/ou le métabolisme énergétique cellulaire et/ou la différentiatîon et le renouvellement des cellules épithéliales.

Avantageusement ledit agent actif permet d'agir au niveau de l'épiderme et en particulier des cellules épithéliales, et encore plus particulièrement des kératinocytes.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un extrait de l'orchidée Papilionanthe teres, en particulier de tiges ou de racines de l'orchidée Papilionanthe teres, comprenant un tel composé, avantageusement selon l'une quelconques des variantes et modes de réalisation décrits précédemment, en tant qu'agent actif destiné à lutter contre le vieillissement cutané, notamment pour atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides et les propriétés protectrices de l'épiderme, et/ou à maintenir ou améliorer l'hydratation cutanée et/ou à favoriser la cicatrisation cutanée., dans une composition cosmétique ou dermatologique, ledit agent actif stimulant l'expression et/ou l'activité des déshydrogénases mitochondriales, et/ou de la cytochrome C oxydase, et/ou de la chaîne respiratoire des mitochondries, et/ou le métabolisme énergétique cellulaire et/ou la différentiatîon et le renouvellement des cellules épithéliales.

Avantageusement les composés de l'invention sont actifs pour stimuler l'expression des protéines de différentiatîon des kératinocytes.

Pour chacun des objets l'invention précitée, la concentration en composé de formule (I) ou en extrait comprenant un tel composé, utilisé en tant qu'agent actif cosmétique ou dermatologique, dans une composition cosmétique ou dermatologique est comprise entre 0,0001 et 1% en poids, plus particulièrement entre 0,001 et 0,1 % en poids, encore mieux entre 0,01 et 0,1 % en poids, par rapport au poids de ladite composition.

Les compositions de l'invention présentent un effet particulièrement recherché pour lutter contre le vieillissement cutané, notamment pour atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides et les propriétés protectrices de l'épiderme, et/ou pour maintenir ou améliorer l'hydratation cutanée et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée.

L'invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique ou dermatologique caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur les zones de peau concernées, d'une composition cosmétique ou dermatologique telle que définie précédemment, en une quantité efficace pour lutter contre le vieillissement cutané, notamment pour atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, restructurer l'épiderme, raffermir la peau, favoriser l'atténuation ou la résorption des rides et les propriétés protectrices de l'épiderme, et/ou pour maintenir ou améliorer l'hydratation cutanée et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée.

Avantageusement, ladite méthode comprend l'application de l'adite composition sur une zone de peau du visage, du cou ou du corps, notamment des mains, présentant des signes de vieillissement tels que la présence de rides ou de ridules.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un composé de formule (I) selon l'invention, ou d'un extrait enrichi selon l'invention, ledit procédé comprenant une étape d'extraction d'au moins une partie d'une plante, avantageusement d'une orchidée, en particulier de l'orchidée Papilionanthe teres, comprenant un tel composé, et au moins une étape d'enrichissement de l'extrait obtenu à l'étape d'extraction, en un ou plusieurs composés de formule (I), et de préférence en composés VT1 et/ou VT2 et/ou VT3.

De préférence, préalablement à l'étape d'extraction, ce procédé comprend une étape de broyage de la plante entière ou d'au moins une partie de la plante, de préférence les tiges, les feuilles ou les racines, puis une étape d'extraction de cette plante ou des parties de ladite plante.

La plante ou les parties de plantes sont avantageusement séchées ou congelées avant broyage. De préférence, l'extraction est réalisée à l'aide d'au moins un solvant polaire. Parmi les solvants polaires on peut utiliser un solvant unique ou un mélange de solvants. Les solvants polaires utilisés sont de préférence l'eau ; un alcool, de préférence en Q-Q, et notamment le méthanol, l'éthanol ou un propanol ; un polyol, et notamment un glycol, et par exemple le glycérol, le propylène glycol ou le butylène glycol.

Parmi les mélanges de solvants on utilise de préférence un mélange hydroalcoolique, et de préférence un mélange éthanol/eau, et plus particulièrement un mélange éthanol/eau dans un rapport de l'ordre de 90/10 v/v.

L'extraction peut s'effectuer de préférence dans un solvant polaire à reflux et de préférence au Soxhiet. Il est possible d'optimiser l'extraction au Soxhiet en utilisant des solvants de polarité croissante, comme par exemple avec une succession de solvants du type alcane (par exemple pentane, hexane, cyclopentane, cyclohexane, heptane, etc.), alcane halogéné (par exemple dichlorométhane), puis alcool (par exemple éthanol ou méthanol).

L'extrait peut être ensuite concentré pour éliminer le solvant ou le mélange de solvants. On peut donc obtenir un composé sec, qui peut être solubilisé ou dispersé dans un excipient cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable pour une utilisation finale dans une composition de l'invention.

Le procédé de l'invention comprend avantageusement une étape d'enrichissement de l'extrait obtenu à l'étape d'extraction susmentionnée, en un ou plusieurs des composés de formule (I) tels que définis ci-dessus. Le procédé comprend en particulier une étape d'enrichissement par élimination des sucres ou par fractionnement, et par exemple par chromatographie d'exclusion stérique.

En outre, l'extrait peut être décoloré partiellement ou complètement, notamment en présence de charbon actif après avoir été mis en présence d'un solvant polaire.

On peut purifier les fractions extraites par toute méthode connue de l'homme de l'art, et par exemple par chromatographie, notamment chromatographie sur colonne de gel, et/ou chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC).

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention, apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre, faite en référence à des exemples de préparation d'extraits et de tests mettant en évidence les propriétés des extraits et à un exemple de composition cosmétique utilisant de tels extraits, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention.

Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, la température est en degrés Celsius, la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.

Sur les figures ;

La figure 1 représente les formules semi-développées des composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention ainsi que de l'acide eucomique ;

La figure 2 représente les spectres de masse des composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention ;

La figure 3 représente les spectres de RMN *H des composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention ;

La figure 4 représente les spectres de RMN 13 C (DEPT135)des composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention ;

La figure 5 représente le profil obtenu par CLHP et détection UV de l'extrait selon l'exemple 1.2 (solubilisé dans 5mg/mLMeOH) comprenant les composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention ;

La figure 6 représente l'effet des composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention sur l'activation des déshydrogénases mitochondriales ; Durée de traitement 48h. Témoin négatif DMSO (0,1% ; v/v). Moyennes ± EC (écart type) calculées à partir de trois expériences.

La figure 7 représente l'activité des composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention sur l'expression de la cytochrome C oxydase ; Traitement des cellules HaCaT : 3h. Témoin négatif : cellules non traitées (DMSO (0.1% ; v/v), témoin positif: Resveratrol (11.41 Lig/ml). Moyennes ± EC (écart type) obtenues sur de trois expériences indépendantes.

La figure 8 représente l'activité des composés VTl, VT2, et VT3 de l'invention sur la biogenèse mitochondriale ; Traitement des cellules HaCaT : 48h. Témoin négatif ; cellules non traitées (DMSO (0.1% ; v/v), témoin positif: Resveratrol (11.41 , ug/ml). Moyennes ± EC (écart type) obtenues sur de trois expériences indépendantes.

La figure 9 représente l'effet de traitement à l'aide des composés VTl, VT2, ou VT3 de l'invention sur l'expression de la transglutaminase ;

La figure 10 représente une photographie au microscope électronique de l'expression de la transglutaminase en présence des composés VT1, VT2, ou VT3 de l'invention ;

La figure 11 représente l'effet de traitement à l'aide des composés VT1, VT2, ou VT3 de l'invention sur l'expression de l'involucrine ;

La figure 12 représente l'effet de traitement à l'aide des composés VT1,

VT2, ou VT3 de l'invention sur l'expression de la desmogléine 1 ;

La figure 13 représente une photographie au microscope électronique de l'expression de la desmogléine 1 en présence des composés VT1, VT2, ou VT3 de l'invention;

EXEMPLE

Exemple 1 : Extraits de Papilionanthe teres. Différentes parties de l'orchidée Papilionanthe teres sont analysées afin de détecter la présence de vandatérosides dans chacune de ces parties de la plante, et d'en déterminer la teneur.

100 g de matière végétale (MV) sèche, constituée des tiges (exemple 1.1 et 1,2), de racines (exemple 1.3) ou de feuilles (exemple 1.4) de l'orchidée Papilionanthe teres (origine Tian Zi, Chine), sont broyés avant l'étape d'extraction.

Exemple 1.1. -Extrait hydro-alcoolique de tiges de Papilionanthe teres

Un extrait total hydroalcoolique de la MV sèche (éthanol (EtOH)/eau 90/10 v/v, rapport MV/solvant: 1/15) est réalisé à reflux (30min, 80°C). Cet extrait total est obtenu avec un rendement massique de 12,8% (masse d'extrait/masse de MV sèche).

Exemple 1.2. Extrait méthanolique de tiges de Papilionanthe teres Une extraction de type Soxhlet (appareillage SOXTEC Avanti 2055), plus spécifique que celle de l'exemple 1.1, permet d'épuiser la MV sèche par l'utilisation successive de trois solvants de polarité croissante: cyclohexane (45min, 180°C), dichlorométhane (cycle 1 : 45min, 180°C, cycle 2 : puis 30min, 180°C) et méthanol (MeOH) (2 cycles de 45min, 180°C).

Cet extrait méthanolique, qui concentre les vandatérosides, est obtenu avec un rendement massique de 6,9% (masse d'extrait/masse de MV sèche). -Exemple 1.3. Extrait hydro-alcoolique de racines de Papilionanthe teres

Un extrait hydro-alcoolique total est réalisé selon les conditions suivantes : EtO H/eau 90/10, en utilisant un rapport MV /solvant de 1/15. L'extrait est réalisé à reflux (30 minutes, 80°C). Le rendement massique obtenu pour l'extrait de racines est de 14,8%.

Exemple 1.4. Extrait hydro-alcoolique de feuilles de Papilionanthe teres

Un extrait hydro-alcoolique total est réalisé selon les conditions suivantes : EtOH/eau 90/10, en utilisant un rapport MV sèche broyée/solvant de 1/15. L'extrait est réalisé à reflux (30 minutes, 80°C). Le rendement massique obtenu est de 15,0% pour l'extrait de feuilles.

Ces extraits (exemples 1.1 à 1.4) sont analysés selon les conditions décrites dans l'exemple 2 (Fractionnement, isolement) pour confirmer la présence de 3 composés de formule (I), respectivement dénommés VTl, VT2 et VT3 après isolement et élucidation structurale. Leurs concentrations respectives dans les différents extraits et fractions est déterminée par RP-HPLC selon la méthode de l'exemple 2.1, par étalonnage externe : des dilutions en série de chacun des composés isolés VTl, VT2 et VT3 sont réalisées pour déterminer la courbe d'étalonnage.

Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous (voir aussi

Tableau 1

Tableau 1: concentrations des vandatérosides VTl, VT2 et VT3 dans les différents extraits de P. teres (% m/m moyennes ± EÇ injections en triplicata)

CONCLUSIONS

Il ressort de ces analyses que :

- les vandatérosides VTl, VT2 et VT3 sont présents dans toutes les parties de plantes de Papilionanthe teres (tiges, feuilles et racines).

- l'extrait de racines de Papilionanthe teres concentre VT2 à une teneur égale à 1,8 fois celle déterminée dans les extraits hydro-alcooliques de tiges ou de feuilles. Exemple 2 : Extraits spécifiquement enrichis en vandatérosides.

On sélectionne les extraits obtenus selon l'exemple 1 ci-dessus pour procéder à une étape de fractionnement stérique visant à enrichir spécifiquement ces extraits en composés de formules (I), respectivement dénommés VT1, VT2 et VT3 après isolement et élucidation structurale.

Exemple 2.1. Fractionnement par Chromatoqraphie sur colonne de gel Le fractionnement de l'extrait méthanolique obtenu selon l'exemple 1.2. est réalisé sur colonne de gel Sephadex LH 20 (LH20-100-Sigma) (28*180 mm) à l'aide d'un gradient de solvant polaire (passage de 100 % d'eau à 100% de méthanol, débit de lml/min).

1 gramme (g) de cet extrait méthanolique est dilué dans un mélange eau/méthanol (50/50 v/v) et déposé sur 30 g de gel Sephadex. Les molécules polaires sont séparées selon leur taille et leur solubilité dans le solvant d'élution.

On obtient 20 fractions de 10ml qui sont rassemblées selon leurs profils similaires obtenus par chromatographie sur couche mince (Eluant: acétate d'éthyle: acide acétique: acide formique : eau (100:11:11:26 v/v/v/v, Support : gel de silice 60 F 254 (0.25mm, MERCK), Révélation : Vanilline (Merck) -H 2 S0 4 (97% Flucka) 5%) pour donner au final dix fractions.

Des analyses en Chromatographie Liquide Haute Performance en phase inverse (RP-HPLC) visent à identifier les fractions, parmi les dix de départ, qui concentrent les composés de formule (I), présents dans l'extrait total.

L'analyse en RP-HPLC est conduite à l'aide d'un chromatographe (Varian), muni d'une colonne Nucleodur C 18 ec (5 pm, 250 mm x 4.6 mm î.d.), équipé d'une pompe (Prostar 230) et d'un détecteur à barrettes de diodes (Prostar 330). On utilise à titre de solvant d'élution un mélange MeOH-(eau + 0,1% d'acide formique (HC0 2 H)), à un débit 1 ml/min, selon un gradient linéaire partant de 20% jusqu'à 47% MeOH en 13,5 minutes, puis en maintenant 47% MeOH pendant 10 minutes et enfin de 47% à 100% MeOH en 10 minutes. Les fractions sont visualisées à une longueur d'onde comprise entre 200 nm et 400 nm.

On recueille une masse de 178 mg de la fraction A et de 39,5 mg de la fraction B. Exemple 2.2. Isolement des composés de formule fi) :

On utilise les deux fractions A et B sélectionnées à l'exemple 2.1, pour purifier les composés de l'invention, et procéder à leur quantification dans chacune des fraction de l'exemple 2.1.

L'isolement des composés de formule (I) (VT1, VT2 et VT3) à partir de chacune des deux fractions sélectionnées, est réalisé par CLHP semi-préparative, à l'aide d'un chromatographe Gilson, équipé d'une pompe à gradient (Gilson 322), d'un détecteur UV (Gilson UV-VIS 151) et d'une colonne Nucleodur C18ec (5 pm, 250 mm x 21 mm i.d.). Chaque fraction est préparée à 30mg/ml dans du MeOH puis filtrée (Filtres Minisart RC 15, û,45pm). Les conditions d'élution font appel à un mélange MeOH-(eau + 0,1% HC0 2 H) dans les conditions suivantes: de 20% à 47% MeOH en 13,5 minutes, 47% MeOH pendant 10 minutes et retour à 20% en 5 minutes au débit de 14 ml/min. La détection se fait à 205 nm.

Après purification par CLHP semi-préparative de la fraction A„ on recueille une masse de 64mg du composé VT1 et une masse de 112 mg du composé VT2.

Après purification de la fraction B selon la même méthode, on recueille une masse de 20mg du composé VT3.

Les teneurs en chacun des composés VT1, VT2, VT3 et la teneur cumulée (VT1 +VT2+VT3) de chacune des fractions A et B et dans la fraction (A+B), sont indiquées dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2

CONCLUSIONS

Les fractions A et B constituent chacune un extrait spécifiquement enrichi en composés de formule (I) qui constitue un objet de l'invention, puisque chacune est constituée à plus de 50% en poids de composés de formule (I).

Ces deux fractions peuvent également être assemblées en une unique fraction (A+B) qui constitue également un exemple d'extrait spécifiquement enrichi de l'invention. Cet assemblage permet d'obtenir un extrait comprenant chacun des trois composés identifiés (VT1, VT2 et VT3), le tout se trouvant à une teneur de 90% en poids dans l'extrait sec.

Chacun de ces extraits est ainsi utilisable en tant qu'agent actif cosmétique ou dermatologique dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques.

Exemple 3 : élucidation structurale des composés de formules (I)

L'élucidation structurale des composés de formule (I) extraits de la MV de l'orchidée Papilionanthe teres (exemple 1.2), puis isolés par fractionnement stérique et R-CLHP et fait appel à un ensemble de techniques spectrales.

• Matériel

Spectrométrie de Masse (SM)

Les vandaterosides sont analysés par chromatographie liquide haute performance Agilent 1200RRLC, équipée d'une colonne C 18 Supelco Discovery (25cm x 2,1mm i.d. x 5pm) et couplée à un spectromètre de masse Agilent 6520 Accurate Mass QTOF muni d'une source ESI.

Les conditions d'élution font appel à un mélange Acétonitrile (ACN)-(eau + 0,01% HC0 2 H) dans les conditions suivantes: de 2% à 50% ACN en 30 minutes, puis passage à 95% d'ACN en 5 minutes, maintien à 95% d'ACN pendant 5 minutes et retour à 2% d'ACN en 5 minutes, avec un débit de 0,6 ml/min.

Par ailleurs, les spectres de masse haute résolution de type ESI MS ont été obtenus sur un spectromètre Bruker microToF-Q avec une source ESI positive. Les calibrations ont été réalisées à l'aide d'une solution à lO^M de formate de Li dans un mélange isopropanol/eau (50/50 v/v).

Résonnance Magnétique Nucléaire (RMW

Les analyses RMN ont été réalisées sur un spectromètre Bruker 400 MHz Avance III. L'obtention de spectres 1D (Ή et , 3 C) et 2D (Cosy, HSQC, HMBC) est nécessaire pour une élucidation structurale complète des molécules isolées. Les spectres sont analysés sur logiciel RMN Notebook.

Un minimum de 10 mg des molécules purifiées est dilué dans 600μΙ du DMSO deutéré (DMSO D 6 , C 2 D 6 OS; 99.9 %D, Sigma). La concentration minimale ainsi obtenue est voisine de 16mg/ml. Spectrométrie Ultra Violet CUV) :

Les spectres UV caractéristiques des vandatérosides sont obtenus à l'aide d'un appareillage Shimazu UV-2401PC. Les molécules sont dissoutes dans du MeOH à 5.10 "5 M pour VTl et 2,5.10 "5 M pour VT2 et VT3. Le coefficient d'extinction molaire ξ (mol^.L.cm ') est déterminé selon la loi de Beer-Lambert :

A= ξ x c x I

Â= Absorbance de la molécule à une longueur d'onde λ

C= concentration de la molécule (en mol/L)

1= longueur du trajet optique (en cm)

Polarimétrie

La détermination de pouvoir rotatoire [a] spécifique de la lumière polarisée par le carbone asymétrique des vandatérosides est réalisée sur un polarimètre Perkin Elmer 341. Les molécules sont maintenues en solutions à lmg/ml dans du MeOH et placées dans la cellule de mesure du polarimètre afin de mesurer l'angle de rotation de la lumière polarisée à 589nm et 20°C. On détermine ainsi [a] 20 °de chacune des molécules selon la loi de Biot :

a= [a] r ° x \ c

a = angle de rotation observé (en degrés)

I = longueur de la cuve (en dm)

c = concentration de la solution (en g/ml)

[a] T °=pouvoir rotatoire spécifique défini à une température T et mesuré pour une longueur d'onde donnée (exprimé en g^.mL.dm "1 )

RESULTATS DE L'ELUCIDATION STRUCTURALE

Les données du spectre RMN obtenu pour chacun des composés VTl, VT2 et VT3, sont indiquées dans le tableau 3 ci-dessous : Tableau 3

Tableau 3: spectre RMN ( : 400MHz, C: lOOMHZ, DMSO ¾ δ en ppm, 3 in Hz) obtenu pour chacun des composés VTl, VT2 et VT3. Les résultats obtenus pour les différentes méthodes analytiques mises en oeuvre sont détaillés ci-dessous pour chaque composé.

Aspect : résine de couleur jaune

Solubilité ; soluble dans le MeOH et le DMSO, et peu soluble dans l'eau RMN : Ή IMMR and 13 C NMR data (DMSO D 6 , 400MHz and 100MHz) → figures 3 à 4 et tableau 3.

MS : HR-ESI-MS ion [(M+NH4)] + à m/z - 526.19236 (formule moléculaire calculée pour C 2 4H 2 80i 2 : 508,15808 Δ: -0,89ppm).→ figure 2 et tableau 4

Tableau 4

Peak List

Formula Calculator ResuKs

UV : maxima d' absorption à 203 (log ξ 4.2), 225 (log ξ 4.0) et 278 (log ξ 3.2)nm. → figure 5

Hydrolyse acide

Après hydrolyse acide des molécules (3h à 80°C, en présence de 2,0 M

HCI), la phase aqueuse est lavée à 3 reprises à l'aide de /?-butanol saturé en eau, puis évaporée à sec. Un mélange (1:4, v/v) de pyridine et l-(trimethylSilyl)imidazole (Sigma) est ajouté sur le résidu sec puis chauffé pendant 1 heure à 60°C pour réaliser une dérivation. 1 à 2μΙ du mélange réactionnel sont ensuite dilués dans 500μΙ de CH 2 CI 2 analytique puis analysés par chromatographie gazeuse (de type Trace GS Ultra) munie d'une colonne capillaire TR-5MS SQC (15mx0,25mm * 0,25 m) et couplée à un spectromètre de masse (DSQII Thermo Scientific). La détection est obtenue par impact électronique à 70eV. Les conditions utilisées sont les suivantes : 1 minute à 40°C puis gradient de 10°C/min jusqu'à 250°C et maintien d'une phase stationnaire à 250°C (débit d'Hélium lml/min, température de llnjecteur 250°C, température de la ligne de transfert 285°C). La détection est réalisée après 2 minutes d'analyse, l'intervalle de mesure de masse s'échelonne de 0 à 500. Le sucre libéré à l'issu de l'hydrolyse acide est identifié par comparaison au temps de rétention et spectre de masse du témoin D-glucose (Merck) (Tr= 15,60 minutes) ayant subi le même processus de dérivation. Pour les trois vandatérosides analysés, le sucre identifié après hydrolyse est le D-glucose.

• VT2

Aspect : poudre blanche amorphe

Solubilité : dans l'eau, formation d'un gel à environ lOmM. VT 2 est soluble dans le MeOH et dans le DMSO, peu soluble dans l'eau.

RMN : *H NMR and 13 C NMR data (DMSO D 6 , 400MHz and 100MHz) → figures 3 à 4 et tableau 3.

MS : HR-ESI-MS ion [(M+NH4)] + à m/z= 794.28867 (formule moléculaire calculée pour C 37 H 44 0 18: 776.25276 â:-0,01ppm).→ figure 2 et tableau 5

Tableau 5

Peak List

Formula Calculator Results

UV ; maxima d'absorption à 203 (log ξ 4.5) 225 nm (log ξ 4.5) et 278 (log ξ 3.5) nm.→figure 5

Hydrolyse acide : se référer à VT1 • VT3

Aspect : résine de couleur jaune

Solubilité : composé soluble dans le MeOH et le DMSO, peu soluble dans l'eau. RMN : l H NMR and 13 C NMR data (DMSO D 6 , 400MHz and 100MHz) → figures 3 à 4 et tableau 3.

MS ; HR-ESI-MS ion [(M+NH4)] + à m/z = 1086.38484 (formule moléculaire calculée pour C 5 2H 6 Q0 24 : 1068, 34745 A:-l,89ppm).→figure 2 et tableau 6

Tableau 6

Peak Ust L ' C 1/Z)

Formula Calculator Results

UV : maxima d'absorption observés à 223 (log ξ 4.5) nm and 276 (log ξ 3.5) nm.→ figure 5

Hydrolyse acide : se référer à VT1

Exemple 4 : activité biologique des composés de l'invention

Traitements

On prépare une solution-mère de chacun des trois composés isolés précédemment, VT1, VT2 et VT3, dans du DMSO (Sigma).

Les solutions mères sont ensuite diluées directement dans le milieu de culture, en vue du traitement des cellules (kératinocytes humains normaux KHN ou lignée de cellules HaCaT). • Stimulation des déshydrogénases mitochondrîales sur kératinocytes.

Les kératinocytes humains normaux (KHN), isolés de paupières de femmes de type caucasien de 37ans, sont cultivés en passage 3 dans du Kératinocytes Sérum Free Médium (KSFM, Invitrogen) complémenté (Invitrogen) et additionné de 5% de sérum de veau fœtal (SVF, Invitrogen).

Les KHN sont ensemencés dans des plaques de 96 puits (Greiner Bio One) à raison de 1.10 4 cellules/puits, puis mis à incuber à 37°C, 5% C0 2 pendant 24h. Ces cellules sont ensuite traitées, après irradiation aux UV B (60mJ/cm 2 irradiateur Vilbert- Lourmat) ou sans irradiation, par des dilutions sérielles des composés VT1, VT2 et VT3 (de 6,25 à 0,78pg/ml) dilués dans du DMSO (sigma) 0,l%v/v en concentration finale. Les plaques sont mises à incuber à 37°C, 5% C0 2 . Les cellules non traitées contenant 0,1% v/v de DMSO sont considérées comme contrôle négatif. Après 48h de traitement, les surnageants sont éliminés et la solution de XTT (Cell prolifération kit II, Roche Diagnostic) est déposée dans chaque puits afin de déterminer l'activité globale des déshydrogénases mitochondrîales. Cette activité est évaluée grâce à la transformation de sel de tetrazolium XTT en formazan soluble, grâce à un mécanisme cellulaire faisant appel aux activités enzymatiques de la glycolytique NAD (P) H déshydrogénases (complexe I) et de la succinate déshydrogénases (complexe II), constitutives de la chaîne respiratoire mitochondriale. La quantité de formazan coloré (déterminée par lecture de densité optique à 450nm) est directement reliée d'une part à l'activité enzymatique des déshydrogénases mitochondrîales et d'autre part à la quantité de cellules métaboliquement actives Roehm et al. J. Immunol. Methods, 1991 ; 142: 257- 265). Après 3 heures d'incubation, le XTT est réduit en un formazan soluble par les déshydrogénases. La lecture des plaques de 96 puits se fait à 450nm avec un spectrofluoromètre (SpectraFluor Plus, Tecan). Les protéines totales sont dosées dans chaque puits par la technique du BCA (Bicinchoninic acid assay (kit Uptima Interchim).

Les résultats sont exprimés en moyenne des densités optiques (DO) à 450nm et normalisés par rapport à la concentration totale en protéines cellulaires (exprimée en pg/ml), ce qui permet de mesurer uniquement l'activité des déshydrogénases et de s'affranchir de l'impact de la prolifération cellulaire sur la mesure des DO obtenues.

Les résultats moyens obtenus pour chaque concentration de molécules (Rm) sont comparés à ceux obtenus pour le contrôle négatif (Rc) : Rm/Rc >1 indique une stimulation de l'activité des déshydrogénases mitochondriales.

• Stimulation de la cytochrome C oxydase sur kératinocytes humains modifiés (HaCaT)

L'objectif de l'étude est d'évaluer le potentiel des composés objet de l'invention pour stimuler les performances de la chaîne respiratoire mitochondriale. Les essais sont menés sur des kératinocytes humain génétiquement modifiés (HaCaT).

Les cellules HaCAT ont été cultivées en plaque de 6 puits dans du milieu

RPMI (Rosewell Park Mémorial Institute) 1640 w/o HEPES (invitrogen) supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF, Invitrogen) et un mélange pénicilline/streptomycine jusqu'à confluence. Elles ont ensuite été traitées dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium, Invitrogen) avec 4,5 g/L de glucose, 0,1 % de BSA (Bovine Sérum albumine AM2618 invitrogen) par des dilutions sérielles de vandatérosides (de 6,25 à 0,78pg/ml) dilués dans du DMSO (0,l%v/v concentration finale). Le resveratrol (Sigma) à 50μΜ soit ll,41pg/ml, a été utilisé comme référence positive. Les cellules non traitées contenant 0,1% v/v de DMSO ont été considérées comme contrôle négatif. Après 3h de traitement, les cellules ont été lysées (20mM HEPES, 0,l%Triton, ImM EDTA) et le dosage des protéines cellulaire totales a été réalisé par la technique de Bradford (B6916 Sigma). La concentration en protéines totales de chaque échantillon a été ensuite ajustée à 2mg/ml.

Le lysat cellulaire a été incubé en présence d'un tampon d'essai (Sigma) afin de déterminer la cinétique enzymatique sans ajout de substrat, notée Vo. Le cytochrome C réduit (from equine heart C-7752 sigma) par du DÎT (DiThioTreitol, Sigma) a été ajouté dans le tampon d'essai à 50μΜ afin de mesurer la vitesse de la réaction enzymatique. La disparition du cytochrome C réduit a été suivie à l'aide d'un spectrophotomètre [Beckman DU 640] à 550nm pendant 90 secondes selon les instructions du fabricant (Sigma). Les résultats ont été calculés à partir des courbes de cinétique enzymatique et sont exprimés en activité de la cytochrome C oxydase (U/pg de protéines).

Les équations permettant le calcul des activités enzymatiques sont les suivantes :

- Activité enzymatique du cytochrome C en U/ml = A C ox = (DA/min)/21,84 avec :

- DA/min= A/min(v) - A/min (vO)

- 21,84 (mM) = ε (coefficient d'extinction molaire) du ferrocytochrome C à

550nm

- A= Absorbance à 550nm

- A/min(v) = Absorbance à 550nm au temps « v » en minutes, correspondant au temps de la mesure après m'ajout du substrat ;

- A/min (vO) = Absorbance à 550nm au temps « vO » (au départ, c'est-à-dire avant l'ajout de substrat) en minutes.

Les résultats sont exprimés par comparaison de l'activité enzymatique mesurée en présence des vandatérosides (Ac OX échantillons) par rapport à l'activité enzymatique contrôle (A x contrôle) : soit (Acox échantillons) / (Acox contrôle).

Un rapport calculé (Acox échantillons) / (Acox contrôle) supérieur à 1 indique une stimulation de l'activité du cytochrome C oxydase en présence des échantillons.

• Mesure de la biogenèse mitochondriale sur kératinocytes humains modifiés (HaCaT)

Pour les vandatérosides VT1 et VT2, qui ont montré un effet stimulant de l'activité du cytochrome C, on réalise des mesures de biogénèse mitochondriale.

L'objectif est de vérifier si l'augmentation de l'activité enzymatique mesurée est liée ou non à une stimulation basale de la chaîne respiratoire des mitochondries initialement présentes ou à une augmentation du nombre de mitochondries intracellulaires, indicatrice d'une stimulation de la biogenèse mitochondriale.

Les cellules HaCaT sont cultivées en plaque de 6 puits puis traitées comme décrit ci-dessus. Après 48h de traitement, les cellules sont lysées à l'aide d'un tampon constitué de lOmM de Tris-base, ImM EDTA, 0,3M d'acétate de sodium et 1% de SDS (1ml /puits) et selon une durée d'incubation d'une nuit à 55°C. L'ADN mitochondrial est extrait du lysat cellulaire avec une solution de phénol (rapport 1/1). Deux cycles de centrifugation à 4000 rpm (5 minutes) sont réalisés. Une solution de CHCI 3 /iso-amyle alcool (24 ; l,v/v) est ensuite ajoutée à la phase aqueuse supérieure, récupérée après décantation. Le mélange est ensuite centrifugé (5 minutes, 4000 rpm, 4°C ).

On induit la précipitation de l'ADN total par ajout au surnageant d'un mélange éthanol absolu/acétate de sodium 3M (2.5/1.10 e , v/v). Après centrifugation (30 minutes, 12000rpm, 4°C) les culots sont lavés avec de l'EtOH à 70° v/v, puis séchés et repris dans de l'eau désionisée. Le dosage de l'ADN est réalisé à l'aide d'un spectromètre (Nanodrop Thermo Scientific). Les solutions d'ADN sont ajustées à une concentration de lOng/μΙ,

L'expression de trois gènes différents est mesurée par qPCR. Cette technique permet de mesurer la quantité d'ADN polymérisé grâce à un marqueur fluorescent. Les gènes sélectionnés sont deux gènes mitochondriaux 16S et COX2, correspondant respectivement aux gènes d'expression d'un ribosome mitochondrial et du cytochrome C oxydase, ainsi qu'un gène UCP-2 localisé dans le noyau cellulaire (ADN génomique). La mesure de l'expression de ce gène sert de contrôle.

Les amorces employées sont les suivantes :

ADN 16S : sens (5'-TGG-ACA-ACC-AGC-TAT-CAC-CA-3 et anti-sens (5'- ACT-TTG-CAA-GGA-GAG-CCA-AA-3') ;

ADN COX-2 : sens (5'-AGG-CGA-CCT-GCG-ACT-CCT-TGA-3') et anti-sens (5'-TTA-GCT-TTA-CAG-TGG-GCT-CTA-GAG-GC-3') ;

ADN UCP-2 : sens (5'-CCT-AGC-GCT-GCC-TCA-TAA-AC-3') et anti-sens (5'CCT-ATG-GGT-CTG-TGC-CTG-TT-3').

Les expériences de qPCR sont menées en plaques de 96 puits. Une gamme d'ADN, correspondant au mélange d'ADN de tous les échantillons, est réalisée selon une dilution sérielle, pour chaque amorce. Les échantillons d'ADN cellulaires sont mélangés avec un mélange de MIX-PCR SYBR Green (Applied Biosystems), additionné d'eau désionisée. 45 cycles de PCR sont réalisés avec une température d'hybridation de 60°C. (Thermocycleur Stepone Plus, Applied Biosystems).

La mesure de fluorescence est effectuée au bout des 45 cycles et la quantité d'ADN obtenu est déterminée à l'aide de la gamme d'ADN.

Les résultats sont exprimés en quantité d'ADN 16S et COX2 (Qcox 2 ), calculée en fonction de la quantité d'ADN génomique UCP-2 (Qucp-2), et qui se définit comme (Qcoxz) / (Qucp-2).

Un rapport calculé (Qcox 2 ) / (Qucp-2) supérieur à 1 indique une augmentation de la quantité d'ADN mitochondrial, reflet d'une augmentation du nombre de mitochondries intracellulaires. RESULTATS

Les mesures XTT après 48h de traitement montrent que les composés testés stimulent significativement les fonctions respiratoires mitochondriales des kératinocytes. Aucun effet dose significatif n'est cependant observé.

Par ailleurs, après irradiation aux UV B des kératinocytes, aucune stimulation significative des déshydrogénases n'est observée.

Les composés VT1 et VT2 sont les composés qui stimulent le plus efficacement l'activité des déshydrogénases mitochondriales de kératinocytes.

En particulier, le composé VT2 stimule significativement l'activité des déshydrogénases à la plus faible concentration testée de 0,78pg/ml soit ΙμΜ (+39% par rapport au témoin négatif) (fïg. 6).

Les trois composés testés activent la cytochrome C oxydase, à des niveaux de concentration plus faibles que le resvératrol (témoin positif), le composé VT2 étant le meilleur activateur du cytochrome C oxydase. A une concentration de l,56pg/ml (2μΜ), VT2 stimule l'activité du cytochrome C oxydase à un niveau d'activité comparable au resvératrol à la concentration de ll,41pg/ml (50μΜ) (fîg.7).

Un effet-dose est observé uniquement pour le composé VT1.

Pour VT1 et VT2, on réalise une mesure de biogenèse mitochondriale afin de savoir si l'augmentation de l'activité enzymatique mesurée est liée à une stimulation basale de la chaîne respiratoire des mitochondries initialement présentes, ou à une augmentation du nombre de mitochondries intracellulaires.

Les résultats indiquent qu'aux concentrations testées, à l'exception de VT1 à 6,25pg/ml, aucun des deux composés n'induit une activation de la biogenèse mitochondriale, donc une augmentation du nombre de mitochondries intracellulaires.

Par conséquent, les résultats obtenus, qui mettent en évidence une augmentation de l'activité enzymatique du cytochrome C oxydase ou des déshydrogénases mitochondriales, sont le reflet d'une stimulation basale de ces activités enzymatiques et non d'une augmentation du nombre de mitochondries intracellulaires.

VT1 et VT2 présentent le meilleur potentiel d'activation mitochondriale, au moyen d'une stimulation de l'activité enzymatique des déshydrogénases des complexes I et II, et par stimulation du cytochrome C oxydase de la chaîne respiratoire mitochondriale. Les composés VT1 et plus particulièrement VT2 présentent donc chacun une activité significative vis-à-vis de la chaîne respiratoire mitochondriale de kératinocytes, par stimulation des complexes I et II de ladite chaîne et stimulation de l'activité du cytochrome C oxydase. Ceci confirme qu'ils activent le métabolisme énergétique de la cellule cutanée par l'intermédiaire de ses fonctions respiratoires mitochondriales.

Cette activité justifie l'usage des composés de l'invention, notamment VT1 et/ou VT2, en tant qu'agents actifs cosmétiques ou dermatologiques, et plus particulièrement pour le traitement cosmétique ou dermatologique des peaux matures, tel que la lutte contre le vieillissement cutané et/ou le maintien ou l'amélioration de l'hydratation cutanée et/ou la cicatrisation cutanée.

• Stimulation de la différenciation de kératinocytes humains normaux (KHN)

Les desmogléines sont des cadhérines, protéines transmembranaires, qui lient les cellules épithéliales entre elles, comme les kératinocytes, grâce à la formation de desmosomes. Tout comme la loricrine, l'involucrine est une protéine exprimée par les kératinocytes constitutifs de la couche cornée et ayant atteint le stade terminal de différenciation. Ces kératinocytes sont appelés cornéocytes. Les transglutaminases, enzymes Ca 2+ dépendantes, assurent la formation de points covalents entre ces protéines. Ces trois types de protéines constituent donc des marqueurs de différenciation précoce (desmogléine I) et tardif (involucrine et transglutaminases) des kératinocytes. Un ralentissement du renouvellement des kératinocytes, de leur activité et de leur transformation en cornéocytes s'observe lors du vieillissement cutané. Une atrophie de l'épiderme est observée. La peau se déshydrate, les fonctions protectrices et de cicatrisation de l'épiderme sont alors ralenties. La peau prend alors un aspect terne et desséché. Méthode

Les KHN sont cultivés en passage 3 en milieu KSFM complet en fiasque T75. Au stade de pré-confluence, les KHN sont trypsinés et ensemencés à raison de 20 000 cellules par puits dans des systèmes de culture Lab-Tek II, 8 puits (Nalge Nunc International). 4 puits par condition de traitement. A 80% de confluence, les cellules sont traitées pendant 5 jours avec les différentes compositions d'actifs (VTl, VT2, VT3, chacun à 12pg/ml) jusqu'au stade de postconfluence. Le Vitactyl® clair (extrait de Malva sylvestris, Silab) à 3% est employé comme témoin positif.

Immunomarquaqe

Les cellules sont rincées au PBS (PBS Tablets, Invitrogen GIBCO) puis fixées à la formaline (Formalin Solution 10% Neutral Buffered, Sigma) pendant 10 minutes.

Après rinçage au PBS, les chambres de culture sont remplies avec une solution de Triton 0,1% (Triton X-100, Sigma) pendant 10 minutes afin de perméabiliser les membranes, puis rincées 2 fois au PBS. Les cellules sont ensuite recouvertes d'une solution de PBS/BSA 1% (BSA, Sigma) pendant 30 minutes à température ambiante. La solution de PBS/BSA est retirée des lames en les inclinant sur du papier absorbant.

Les cellules sont ensuite recouvertes d'une solution d'anticorps primaires pendant 60 minutes à température ambiante:

- anti-transglutaminase ( ouse monoclonal Harbor Bio product) diluée au l/200ème,

- anti-desmogléine 1 (Mouse monoclonal - Zymed) diluée au l/100ème ;

- anti-involucrine (Mouse monoclonal - Neomarkers) diluée l/200ème.

Apres rinçage au PBS, les cellules sont ensuite recouvertes d'une solution d'anticorps secondaire dilué au l/200 è (Alexa fluor 488, goat anti-mouse IgG (Molecular probes)). Les lames sont incubées pendant 60 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. Les lames sont rincées trois fois dans du PBS.

Montage

La chambre de culture des lames est démontée et quelques gouttes de milieu de montage (Fluorescent Mounting Médium, DAKO) sont déposées sur les cellules puis recouvertes d'une lamelle (24 x 60 mm, Knittel Glaeser).

Acquisition des photos en microscopie confocale

Les images sont réalisées au vidéomicroscope (Nikon TE 2000) avec un filtre Alexa fluor 488.

Pour chaque condition, quatre photos sont réalisées en fluorescence verte (expression des marqueurs) à l'objectif x20. Les paramètres d'acquisition (temps d'exposition, gain) sont identiques pour chaque marqueur étudié.

Les photos sont analysées à l'aide du logiciel d'analyse d'image Leica QWin. Un programme est créé afin de quantifier l'expression de ces marqueurs de différenciation.

RESULTATS

Les résultats montrent que les composés de l'invention stimulent significativement l'expression des protéines de différenciation des kératinocytes, par rapport au témoin négatif.

Parmi les composés testés, VT1 et VT2 sont les plus efficaces (fig. 8 à 13).

Par ailleurs VT2 stimule l'expression de l'involucrine à un niveau supérieur à celui du témoin positif employé à 3%.

Ceci démontre que les vandatérosides, et plus particulièrement VT1 et VT2, stimulent le renouvellement des kératinocytes, constitutifs de la couche supérieure de l'épiderme.

Les vandatérosides favorisent le renouvellement du stratum corneum donnant ainsi un aspect plus jeune à la peau. Ce phénomène contribue à maintenir les fonctions protectrices et réparatrices de l'épiderme tout en maintenant ou améliorant l'hydratation cutanée.