DE MYRTE ET SON UTILISATION

Domaine technique

La présente invention se rapporte à une composition cosmétique ou dermatologique et son utilisation pour lutter contre les effets du vieillissement de la peau, en améliorant la nutrition et la régénération cutanée, la longévité cellulaire, l'éclat, l'uniformité du teint et l'aspect des tâches de pigmentation.

La présente invention se rapport également à une méthode de traitement cosmétique comprenant une étape d'application sur la peau d'un sujet d'une quantité efficace de la composition.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

Etat de la technique

Le vieillissement est un phénomène physiologique lent qui démarre à la maturité humaine, soit vers une quinzaine d'années, avec une certaine non évolution jusqu'à 25-30 ans. Les premières manifestations extérieures apparaissent vers une trentaine d'années, pour évoluer et s'accélérer vers 45-50 ans.

Le vieillissement est également un processus multifactoriel, qui se marque par l'apparition de nombreux signes extérieurs, variables selon les individus en fonction de l'impact génétique propre à chacun. On parle alors de vieillissement biologique intrinsèque, encore appelé vieillissement naturel chrono-biologique.

Par ailleurs, le vieillissement est accéléré selon l'influence des possibles agresseurs environnementaux tels que le soleil, la pollution, le stress, etc. On parle alors de vieillissement photo-induit ou de vieillissement actinique.

La baisse de la synthèse des lipides est à l'origine des ridules et premières rides. Avec l'âge, les variations hormonales entraînent une diminution de l'activité sécrétrice des glandes sébacées. La peau devient plus sèche.

Les atteintes du vieillissement biologique cutané touchent tous les organes, tous les tissus et toutes les cellules constitutives de ces derniers. Ces atteintes seront prédominantes et plus marquées dans le tissu conjonctif dermique. C'est l'atteinte fonctionnelle des fibroblastes qui semble jouer le rôle le plus important dans la genèse du vieillissement cutané. La baisse de la synthèse des fibres de collagène, de glycosaminoglycanes, laminine etc. et la baisse de fonctionnalité de l'élastine sont à l'origine des rides profondes.

Après 45 ans, et plus spécialement au-delà de 55 ans, relâchement et aspect fripé de la peau sont les phénomènes qui apparaissent. La peau s'amincit, devient fine et atone et subit une atteinte généralisée des structures de soutien mécanique ce qui conduit à un relâchement cutané généralisé marqué : peau moins tendue, moins élastique, moins ferme, moins tonique et moins résistante, peau plus dure, plus raidie. La diminution des fibres de soutien, leur rigidification et l'affaissement de la jonction dermo-épidermique en sont à l'origine. La peau a moins de résistance sous l'action de la pesanteur. Les marques de sensibilité sanguine et taches hypo- pigmentaires ou hyper-pigmentaires sont aussi les signes de dérèglements internes.

De nombreuses recherches scientifiques portent sur l'étude du vieillissement mais également sur celle de la longévité.

Me Cay dans ses expériences à montré dès 1930 que les levures, sous restriction calorique voyaient leur durée de vie s'allonger de façon significative et reproductible. A cette date- là, il ne savait pas encore que le gène de longévité SIR2 (Silent Information Regulator 2) est activé sous restriction calorique.

En 2000, l'équipe de Léonard P. Guarente, professeur de biologie au Massachussets Institute of Technology aux USA identifie ce gène de longévité [1] (Lin, S.J et ail. Science 2000) En 2004, Frédéric Picard découvre avec ses collègues du

Massachussets un gène homologue chez les mammifères (souris), le SIRT-1 [2] (Picard, F et ail. Nature 2004)

En 2005, Eriko Michishita du National Cancer Institute de Bethesda aux USA montre que les fibroblastes humains vieillis présentent une expression réduite de la protéine SIRT-1 [3] (Michishita, E et ail. Molecular biology of the cell 2005). Les cellules de la peau expriment donc les sirtuines, découverte majeure présentée au Congrès IFSCC de Florence en 2005.

Sept sirtuines ont été identifiées. SIRT-1, SIRT-2, SIRT-6 et SIRT-7 sont situées dans le noyau des cellules. SIRT-3, SIRT-4 et -5 sont localisées au niveau des mitochondries. La protéine SIRT-1 est la sirtuine humaine la mieux caractérisée à ce jour. Pouvant vivre jusqu'à 300 ans, le myrte est un arbuste de la famille des Myrtacées, de 2 à 3 mètres de haut à fleurs blanches et odorantes et à feuilles toujours vertes parsemées de glandes contenant l'huile essentielle. Sa floraison a lieu entre mai et juillet, son fruit ovoïde est peu charnu, noir- bleuâtre à maturité et à saveur âpre et résineuse assez agréable.

L'écorce rousse des tiges se détache par plaques et exhale comme toutes les autres parties de la plante une odeur aromatique.

Le myrte est présent dans la frange littorale de la frontière italienne à la frontière espagnole, mais ce n'est pas une espèce très répandue sauf en Corse où il est bien commun.

Les fleurs, les feuilles et l'écorce sont donc aromatiques. Les feuilles renferment en outre de la vitamine C et des flavonoïdes (myricétol et son rhamnoside). L'huile essentielle se trouve également dans les fruits à côté des acides citriques et maliques. L'huile essentielle est incolore à vert jaune, très fluide, soluble dans l'alcool et l'éther et presque insoluble dans l'eau. Parmi ses principes actifs, on peut noter : 1,8cinéole (45%) α-pinène (>25%), cinéol, camphène, linalol, géraniol, nérol, myrténol, méthyleugénol, acétate de linalyle, de myrtényle, aldéhydes et lactones.

Au 1 ^er siècle, Dioscoride prescrit les feuilles et baies macérées dans le vin comme astringent, avec Pline, ils indiquent de nombreuses applications médicales qui montrent que les anciens avaient déjà deviné l'action antiseptique du myrte.

Au, XIXe siècle, Linarix (Paris, 1878) lui a consacré une importante thèse exposant le parti qu'on pouvait tirer de l'alcoolature et de l'essence de myrte en thérapeutique. Grâce à son huile essentielle le myrte jouit de propriétés antiseptiques, désinfectantes, parasiticide. Son composant, le myrtol agit dans les bronchites, favorisant l'expectoration, une plus grande amplitude à la respiration et un apaisement de la toux. Linarix précise aussi que l'action du myrte sur les affections cutanées squameuses rebelles -principalement sur le psoriasis- est également assez marquée.

Jadis, on employait ses fruits et ses feuilles comme tonique. On préparait par distillation avec ses feuilles et ses fleurs, une eau cosmétique, dite "eau d'ange". Cette « eau d'ange » fait partie de nos anciennes eaux de toilette et reste réputée en Italie et en Grèce.

Par ailleurs, FR01/11224 [4] en date du 3 décembre 2004 et FR06/05953 [5] en date du 26 septembre 2008, présentant notamment les propriétés de l'huile essentielle d'immortelle, en association avec d'autres actifs définis, décrivaient déjà par des études in-vitro les actions :

• Effet anti-radicalaire

· Stimulation de la production de collagène I

• Stimulation de la microcirculation cutanée

• Stimulation de la synthèse de l'ATP pour accélérer le renouvellement cellulaire

• Stimulation de la prolifération des kératinocytes pour réparer les tissus

• Inhibition de la mélanogénèse

• Réduction de la couleur de la mélanine existante

• Effet anti-collagénase

Si différentes compositions ont été mises au point dans l'art antérieur, aucune n'apporte une réponse globale pour combattre les signes de l'âge et présentant simultanément, en plus des propriétés citées précédemment et développées dans FR01/11224 [4] et FR06/05953 [5], une action de :

• stimulation de la synthèse du collagène III par les fibroblastes

• augmentation de la production de SIRT-1 (Sirtuine 1) par des fibroblastes âgés

• stimulation de la production des protéoglycanes

Il existe donc encore aujourd'hui un réel besoin d'une composition permettant d'apporter une action globale nourrissante, régénérante, éclaircissante et retardant le relâchement de la peau en agissant plus particulièrement encore sur la longévité cellulaire.

Description de l'invention

La présente invention répond précisément à ce besoin en fournissant une composition cosmétique ou dermatologique comprenant :

- une huile essentielle de myrte,

- au moins une huile végétale riche en oméga-3 et en oméga-6,

- au moins un minéral, choisi dans le groupe comprenant le sodium, le calcium ou le magnésium,

- au moins un oligoélément choisi dans le groupe comprenant le zinc, le cuivre ou le fer,

- au moins de la vitamine C ou un dérivé de celle-ci.

Dans la présente, sauf indication contraire, la concentration des composés est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids total de la composition. L'au moins une huile végétale riche en oméga-3 et en oméga-6 peut être, par exemple, une huile d'échium, de cameline, d'onagre, de bourrache de colza, de noix, de pépins de raisin ou de germe de blé. La concentration totale d'huile végétale riche en oméga-3 et en oméga-6 peut aller de 0,1 % à 10 %, par exemple de 0,1 % à 5 %, par exemple de 0,1 à 3 %. Par exemple, les concentrations respectives d'huile d'échium, de cameline, d'onagre ou de bourrache peuvent aller chacun de 0,1 % à 10 %, par exemple de 0,1 % à 5 %.

L'huile essentielle de myrte, peut être par exemple, une huile essentielle de myrte vert, par exemple une huile essentielle de myrte vert corse. Cette huile peut par exemple être une huile biologique. La concentration en huile essentielle de myrte peut aller, par exemple, de 0,001 % à 2 %, par exemple de 0,01 % à 1 %.

La composition selon la présente invention peut en outre comprendre des sphérulites d'huile essentielle de myrte, par exemple, d'huile essentielle de myrte vert, par exemple d'huile essentielle de myrte vert corse, par exemple d'huile essentielle biologique de myrte vert corse. La concentration en sphérulites d'huile essentielle de myrte peut, par exemple aller de 0,05 % à 7 %, par exemple de 0,1 % à 3 %.

Avantageusement, selon l'invention, la composition peu comprendre une huile essentielle d'immortelle, par exemple, une huile essentielle d'immortelle corse. Cette huile peut par exemple être une huile biologique. La concentration en huile essentielle d'immortelle peut aller, par exemple, de 0,001 % à 2 %, par exemple de 0,01 % à 1 %.

La composition selon la présente invention peut en outre comprendre des sphérulites d'huile essentielle d'immortelle, par exemple, d'huile essentielle d'immortelle corse, par exemple d'huile essentielle biologique d'immortelle corse. La concentration en sphérulites d'huile essentielle d'immortelle peut, par exemple aller de 0,05 % à 7 %, par exemple de 0,1 % à 3 %.

On entend par « sphérulites », des vésicules composées d'une alternance de bicouches de lipidique d'environ un micron.

Suite à des travaux effectués par la Demanderesse, il a été démontré que l'association d'huiles essentielles d'immortelle et de myrte développe une synergie bénéfique aux soins de la peau qui agit plus particulièrement de manière globale pour lutter contre tous les effets du vieillissement sur le visage et le cou en améliorant la nutrition et la régénération cutanée, la longévité cellulaire, l'éclat, l'uniformité du teint et l'aspect des tâches pigmentaires.

L'extraction de des huiles essentielles d'immortelle ou de myrte peut classiquement être effectuée à l'aide d'un générateur de vapeur d'où le fluide vaporisé est conduit par une tubulure dans le fond d'une chambre d'extraction dans laquelle sont enfermés les végétaux. Cette installation est reliée à un dispositif de maintien de pression régulée. Les fluides d'extraction sont alors conduits dans un serpentin de refroidissement. La séparation finale des fluides d'extraction et des composants des huiles essentielles s'effectue à la pression atmosphérique par différence de densité.

La concentration en vitamine C ou de l'un de ses dérivés peut aller, par exemple de 0,5 % à 10 %, par exemple de 0,5 à 5 %.

La concentration totale en oligoélément peut aller de 0,001 % à 5 %, par exemple de 0,001 % à 1 %, par exemple de 0,1 à 0,5 %. Par exemple, les concentrations respectives de magnésium, de cuivre ou de zinc peuvent aller chacune de 0,001 % à 5 %, par exemple de 0,001 % à 1 %.

La composition selon la présente invention peut en outre comprendre d'autres actifs généralement utilisés en cosmétique ou dermatologie, par exemple des agents hydratants, restructurants ou apaisants. Ces actifs s'ils sont présents, peuvent être présents à une concentration allant de 0,1% à 50%, par exemple de 0,15% à 25%.

Par exemple, la composition selon la présente invention peut en outre comprendre toute teneur appropriée en oligoéléments, vitamines, en huiles et en huiles essentielles d'immortelle et de myrte pour obtenir les effets fermeté, antirelâchement, pro collagène I pro collagène III production de SIRT-1 et stimulation des protéoglycanes.

Les différents composés de la composition de la présente invention peuvent être libres ou inclus dans des microsphères à libération retardée de façon à créer un effet de rémanence.

La composition selon l'invention peuvent se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétique et de la dermatologie, comme par exemple, une crème, un lait, une lotion, un gel, un masque, sans aucune restriction galénique particulière autre que celle de la compatibilité avec la composition de l'invention et pour l'application sur la peau.

La présente invention se rapport également à un conditionnement comprenant une composition selon la présente invention et un manuel ou une notice d'utilisation. La présente invention se rapport également à l'utilisation d'une composition selon la présente invention pour améliorer la régénération cutanée, la longévité cellulaire retardant le relâchement de la peau, l'éclat de la peau, l'uniformité du teint, diminuer la taille des taches de pigmentation de la peau ou diminuer la couleur des taches de pigmentation de la peau.

En la présente invention se rapporte également à une méthode de soin cosmétique comprenant une étape d'application sur la peau d'un sujet d'une quantité efficace d'une composition selon la présente invention. L'homme du métier est tout à fait à même de déterminer la quantité de composition à utiliser et la fréquence d'utilisation.

D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.

Brève description des figures

La figure 1 représente des photographies représentant le marquage du collagène III dans les fibroblastes,

(a)en absence de TGF-β et d'HE Im,

(b) en présence de TGF-β à une concentration de 10 ng/ml et en absence d'HE Im,

(c) en présence d'HE Im à une concentration de 8 x 10 ^"5 % et en absence de TGF-β,

(d)en présence d'HE Im à une concentration de 4 x 10 ^"4 % et en absence de TGF-β.

« T » signifie « témoin » et « HE Im » signifie « huile essentielle d'immortelle biologique corse ».

La figure 2 représente des photographies représentant le marquage de SIRT-1 dans les fibroblastes,

(a)en absence de resvératrol et d'HE My, (b) en présence de resvératrol à une concentration de 5 ng/ml et en absence d'HE My,

(c) en présence d'HE My à une concentration de 2 x 10 ^"4 % et en absence de resvératrol,

(d)en présence d'HE My à une concentration de 6 x 10 ^"4 % et en absence de resvératrol,

(e)en présence d'HE My à une concentration de 2 x 10 ^"3 % et en absence de resvératrol,

« T » signifie « témoin », « Res » signifie « resvératrol » et « HE My » signifie « huile essentielle de myrte vert biologique corse ».

La figure 3 est un graphique représentant le pourcentage de surface occupée par le marquage de SIRT-1 dans l'épiderme avant l'application d'un excipient « T », « E1 », « E2 », « P2 », « P7 » ou « P10 » (J0) et dix jours après l'application de cet excipient (J10).

En abscisse, « % s » représente le pourcentage de surface occupée par le marquage de SIRT-1 dans l'épiderme. « T », « E1 », « E2 », « P2 », « P7 » et « P10 » correspondent respectivement au témoin, au perhydrosqualène, eau distillée, huile essentielle de myrte vert biologique corse à 0,5%, resvératrol à 0,1% et huile essentielle de myrte vert biologique corse à 0,5% + huile essentielle d'immortelle biologique corse à 0,5%.

EXEMPLES

Exemple 1 : Exemple de crème de soin du visage réalisée à partir de la composition de la présente invention On prépare par mélange des différents composants, crèmes ayant une composition décrite dans le tableau 1 dessous.

Tableau 1 : exemple de composition pour le visage

Dans ce tableau, « qs » signifie « quantité suffisante » et correspond, par exemple, à la quantité de conservateurs à utiliser afin d'obtenir l'effet souhaité. « qsp » signifie « quantum satis » ou « quantité suffisante pour » et correspond à la quantité d'un produit à ajouter pour arriver à la composition finale. Exemple 2 : Effet de l'huile essentielle d'immortelle biologique corse sur la production de collagène III par des fibroblastes dermiques humains normaux

A partir de 65 ans, il apparaît un déséquilibre marqué entre collagène fibrillaire I et III lié à l'augmentation relative du collagène de type I par rapport au collagène de type III qui lui tend à diminuer.

Les travaux réalisés par la Demanderesse dans le cadre de l'invention ont permis de mettre en évidence la capacité de l'huile essentielle d'immortelle biologique corse (composé HE immortelle Bio Corse) à augmenter la production de collagène III de 20% par marquage en immunofluorescence sur des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF), ce qui s'est avéré particulièrement utile pour lutter contre les rides et plus généralement contre les dommages du temps.

I- Objectif de l'étude

L'objectif de cette étude est de rechercher l'effet du composé HE immortelle Bio Corse sur la production de collagène III par des NHDF.

L'objectif de cette étude est d'apprécier le pouvoir stimulation de la production de collagène III d'un actif cosmétique par des fibroblastes dermiques.

Dans la présente étude, l'activité du composé HE immortelle Bio Corse sur la stimulation de la synthèse/maturation du collagène III a été évaluée par marquage en immunofluorescence sur NHDF.

Il- Matériels et méthodes

11.1- Modèle biologique

- Type cellulaire : Fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF),

Référence B\Oalternatives : pool PF2, utilisés au 9 ^eme passage

La dénomination PF2 signifie : Pool de Fibroblaste n°2. Cette référence est préparée à partir de cultures primaires qui sont isolées et préparées par eux-même à partir de biopsie de peau.

L'obtention de fibroblastes, cellules adhérentes, à partir de biopsie de peau peut être mise en œuvre de la manière suivante :

o le tissu est dissocié mécaniquement et enzymatiquement de façon séquentielle : on obtient une suspension de cellules que l'on peut purifier o les cellules sont mises en culture : c'est la culture primaire, on parle de passage 0

o elles sont repiquées lorsque ces cellules sont soumises à l'inhibition de contact et remise en culture (= ensemencé) (comme en microbiologie) : c'est la culture secondaire, on parle de passage n°1 et ainsi de suite

On réalise un repiquage d'une culture cellulaire en dissociant le tapis obtenu par action de la trypsine (ou d'autres enzymes protéolytiques) qui, en dégradant enzymatiquement les protéines d'adhésion, brisent les liens entre les cellules.

- Conditions de culture : 37°C, 5% CO ₂

- Milieu de culture : DMEM (« Dulbecco's Modified Eagle Médium ») complémenté avec : L-glutamine 2 mM ; Pénicilline 50 U/ml - Streptomycine 50 g/ml ; Sérum de veau fœtal (SVF) 10%. 11.2- Composé testé : Huile essentielle d'immortelle biologique Corse (Lot n°OC0611367 ; Réf. MPBiOOl 16-3)

- Aspect : Liquide

- Stockage à température ambiante

- Solution stock : 1% en dyméthylsulfoxyde (DMSO)

- Dilution dans le milieu de culture

- Concentrations testées : 8 x 10 ^"5 et 4 x 10 ^"4 %

11.3- Référence : TGF-β

- Solution stock 2 g/ml

- Dilution dans le milieu de culture

- Concentration testée : 10 g/ml

11.4- Culture et traitement

Les fibroblastes ont été cultivés en plaques 96 puits en milieu de culture. A subconfluence, le milieu a été remplacé par du milieu de culture contenant ou non (témoin) le composé testé ou la référence. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 72 heures. Toutes les conditions ont été réalisées trois fois.

11.5- Production de collaqène III par des fibroblastes - immunofluorescence

Après incubation, les milieux de culture ont été éliminés par simple pipetage du milieu de culture suivi d'un rinçage.

. Les cellules ont été rincées avec une solution de « phosphate buffered saline » (PBS) et fixées avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4%. Après saturation des sites de liaison non spécifiques par incubation dans un tampon de PBS- Tween, albumine de sérum bovin (BSA) à 5%, les cellules ont été marquées par un anticorps primaire dirigé contre le collagène III à température ambiante pendant 1 heure.

L'anticorps primaire a ensuite été révélé par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (GAR-Alexa 488) et les noyaux des cellules ont été colorés par le Hoechst (bis- benzimide).

L'acquisition des images a été réalisée à l'aide de l'appareil InCell Analyzer™ 1000 (GE Healthcare). Des contrôles sans anticorps primaire ont été réalisés afin de régler les paramètres d'acquisition de la caméra. Pour chaque puits, 5 saisies d'images numérisées ont été réalisées. Le marquage a été quantifié en mesurant l'intensité de fluorescence (intégration des données numériques avec le logiciel Developer Toolbox 1.5, GE Healthcare).

III- Résultats

La référence TGF-β a significativement stimulé la production du collagène III par les fibroblastes.

Comme le montrent les résultats du tableau 2 ci-dessous, le composé HE immortelle Bio Corse, testé à 8 x 10 ^"5 % et 4 x 10 ^"4 % a significativement stimulé la production du collagène III par les fibroblastes. Cette stimulation est d'au moins +19 % par rapport au témoin négatif.

Tableau 2 : Effet de l'huile essentielle d'immortelle biologique Corse sur la production de collagène III par des fibroblastes

Traitement I / nb cell Moy ₀ , -r- _l0/ ,

Concentration (UA) (UA) ^%Tem esm(%) p

162

Témoin

^33 170 100 4 216

TGF-β

10 ng/ml 2¾ 215 126 2

HE immortelle 192

Bio Corse

?? 206 121 5

8x 10 ^_5 % 219

HE immortelle 187

Bio Corse

?^ 202 119 5

4x 10^% 214

Dans ce tableau « I / nb cell » signifie « intensité de fluorescence par nombre de cellule » et est exprimé en unité arbitraire (UA). « moy » correspond à la moyenne de ces intensités, exprimé en UA. « % Tem » correspond à comparaison en pourcentage de l'intensité mesurée par rapport à celle du témoin. « esm % » correspond à « l'écart type de la moyenne ». « p » correspond au seuil de significativité statistique où « * » correspond à une valeur de p allant de 0,01 à 0,05 (significatif) et « ** » correspond à une valeur de p allant de 0,001 à 0,01 (très significatif).

Le composé HE immortelle Bio Corse a donc un effet stimulant sur la synthèse/maturation du collagène III par les fibroblastes dermiques humains normaux.

Exemple 3 : Effet de l'huile essentielle de myrte vert biologique corse sur l'expression de SIRT-1 par des fibroblastes normaux et par des fibroblastes âgés

Les travaux réalisés sur l'huile essentielle de myrte vert biologique corse (composé HE myrte vert Bio Corse) ont permis de mettre en évidence l'augmentation de la production de SIRT-1 par marquage en immunofluorescence sur fibroblastes, ce qui s'est avéré particulièrement utile pour stimuler l'action de la protéine de longévité, contribuant à accroître la vitalité cellulaire et préservant l'aspect jeune de la peau.

I- OBJECTIF DE L'ETUDE

L'objectif de cette étude est d'apprécier l'effet du composé

HE myrte vert Corse Bio sur la production de la Sirtuine 1 (SIRT-1) par des fibroblastes dermiques humains âgés (16 ^eme passage).

Dans la présente étude, l'activité du composé HE myrte vert Corse Bio sur la stimulation de la production de SIRT-1 a été évaluée par marquage en immunofluorescence et cela à la fois sur des fibroblastes dermiques normaux et des fibroblastes âgés traités ou non avec le composé à l'essai. II- MATERIELS ET METHODES

11.1- Modèle biologique

- Type cellulaire :

Fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF),

Référence B\Oalternatives : « pool PF2 », utilisés au I6 ^eme (R16) passage

Après 15 à 25 passages, représentant entre 30 et 60 mitoses, on constate que les cellules vieillissent et cessent de se multiplier. Cette limite a été appelée « la limite d'Hayflick ». La limite de Hayflick a été découverte en 1965. Hayflick avait observé que des cellules en mistose dans une culture cellulaire ne se divisaient que 50 fois avant de mourir. Quand des cellules approchaient cette limite, elles montraient des signes de sénescence.

Pour les besoins de ce projet, cette méthodologie a été utilisée pour obtenir des cellules vieillies. Autrement dit les fibroblastes de passage 8 ou 9 sont considérés comme normaux et les fibroblastes de passage 16 sont âgés.

- Conditions de culture : 37°C, 5% CO ₂

- Milieu de culture DMEM complémenté avec : L- glutamine 2 mM ; Pénicilline 50 U/ml - Streptomycine 50 g/ml ; Sérum de veau fœtal (SVF) 10%

II.2- Composé testé : Huile essentielle de myrte vert biologique Corse (Lot n° 05/07 ; Réf. L'Astratella GT080116-2))

- Aspect : Huile

- Stockage à température ambiante

- Solution stock : 1% en éthanol

- Dilution dans le milieu de culture

- Concentrations testées : 2 x 10 ^"4 , 6 x 10 ^"4 et 2 x 10 ^"3 %

11.3- Référence : Resvératrol

- Solution stock 22.8 mg/ml en DMSO

- Dilution dans le milieu de culture

- Concentration testée : 5 g/ml

11.4- Culture et traitement

Les fibroblastes ont été cultivés en plaques 96 puits en milieu de culture. A subconfluence, le milieu a été remplacé par du milieu de culture contenant ou non (témoin) le composé testé ou la référence. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 24 heures. Les essais ont été réalisés sur fibroblastes âgés (R16 NHDF). Toutes les conditions ont été réalisées en six fois. 11.5- Production de SIRT-1 par des fibroblastes immunofluorescence

Après incubation, les milieux de culture ont été éliminés. Les cellules ont été rincées avec une solution de « phosphate buffered saline » (PBS) et fixées avec une solution de paraformaldehyde (PFA) à 4%. Après saturation des sites de liaison non spécifiques par incubation dans un tampon de PBS- Tween, albumine de sérum bovin (BSA) à 5%, les cellules ont été marquées par un anticorps primaire anti-SIRT-1 à température ambiante pendant 1 heure.

L'anticorps primaire a ensuite été révélé par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (GAR-Alexa 488) et les noyaux des cellules ont été colorés par le Hoechst (bis- benzimide).

L'acquisition des images a été réalisée à l'aide de l'appareil InCell Analyzer™ 1000 (GE Healthcare). Des contrôles sans anticorps primaire ont été réalisés afin de régler les paramètres d'acquisition de la caméra. Pour chaque puits, 5 saisies d'images numérisées ont été réalisées. Le marquage a été quantifié en mesurant l'intensité de fluorescence (intégration des données numériques avec le logiciel Developer Toolbox 1.5, GE Healthcare).

III- Résultats

La référence resvératrol a stimulé la production de SIRT-1 par les fibroblastes âgés.

Comme le montrent les résultats du tableau 3 ci-dessous, le composé HE myrte vert Corse Bio, a significativement stimulé la production de SIRT-1 par les fibroblastes âgés à toutes les concentrations testées. Cette stimulation est d'au moins +24 % par rapport au témoin négatif. Tableau 3 : Effet de l'huile essentielle de myrte vert biologique Corse sur la production de SIRT-1 par des

fibroblastes âgés

(1 ) donnée invalidée

Dans ce tableau « I / nb cell » signifie « intensité de fluorescence par nombre de cellule » et est exprimé en unité arbitraire (UA). « moy » correspond à la moyenne de ces intensités, exprimé en UA. « % Tem » correspond à comparaison en pourcentage de l'intensité mesurée par rapport à celle du témoin. « esm % » correspond à « l'écart type de la moyenne ». « p » correspond au seuil de significativité statistique où « * » correspond à une valeur de p allant de 0,01 à 0,05 (significatif) et « ** » correspond à une valeur de p allant de 0,001 à 0,01 (très significatif).

Le composé HE myrte vert Corse Bio a donc un effet stimulant sur la production de SIRT-1 par des fibroblastes âgés.

Exemple 4 : Effet de l'huile essentielle de myrte vert biologique corse, de l'huile essentielle d'immortelle biologique corse et de leur association sur l'expression de SIRT-1 sur explants de peau

I- Objectif de l'étude

Cette étude a pour but d'observer l'activité de l'huile essentielle Myrte vert Corse Bio, de l'huile essentielle Immortel Bio Corse et de leur association sur explants de peau humaine maintenus en survie.

Son activité a été évaluée par Immunomarquage de la sirtuine-1. II- Mode opératoire

11.1- Préparation des explants

A partir d'une plastie abdominale d'une femme de type caucasien âgée de 54 ans, 21 explants de peau humaine d'un diamètre d'environ 10 mm ont été préparés. Les explants ont été mis en survie en milieu BEM (BIO-EC's Explants Médium) à 37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2.

Ces explants ont été répartis en 7 lots de 3 explants comme suit présenté dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 : Répartition des lots

1) Préparation des produits à tester

a. Solution de HE d'Immortelle à 0,5% : Diluer 25 μ I d'huile d'immortelle dans 5 ml de perhydrosqualène.

b. Solution de HE de Myrte à 0.5% : Diluer 25μΙ d'huile de myrte dans 5 ml de perhydrosqualène.

c. Solution de resvératrol à 0.1% : Diluer 5mg de la poudre de resvératrol à 10% dans 5ml d'eau distillée stérile.

d. Solution d'immortelle à 0.5% + HE Myrte à 0.5% : Dans 5 ml de perhydrosqualène diluer : 25μΙ d'huile d'immortelle et 25μΙ d'huile essentielle de myrte.

2) Traitement

A J0, les explants ont été placés dans 2 ml de milieu de culture et les produits ont été appliqués en topique à raison de 30μΙ de chaque produit sur les explants à l'aide d'un disque de papier filtre. Les témoins n'ont reçu aucun traitement.

Le traitement a été renouvelé tous els deux jours, à J1, J3, J5 et J7 et les explants ont été remis en survie à 37°C en atmosphère humide enrichie de 5% de CO2.

3) Prélèvement pour l'histologie

A J0, les trois explants du lot T0 ont été prélevés et coupés en deux. Une moitié a été fixée au formol tamponné, et l'autre moitié a été congelée à -80°C.

A J 10, les 3 explants de chaque lot ont été prélevés et traités de la même manière.

) Traitements histologiques

Après 24 heures de fixation au formol tamponné, les prélèvements ont été déshydratés et imprégnés en paraffine à l'aide d'un automate de déshydratation Leica 1020. Ils ont été mis en bloc selon le mode opératoire MO-H-153 à l'aide d'une station d'enrobage Leica EG 1160. Des coupes de 5μηη ont été réalisées à l'aide d'un microtome type Minot, Leica RM 2125 et collées sur des lames de verre histologiques Superfrost (marque déposée).

SIRT-1 a été marquée sur coupes paraffine formolées avec un anticorps polyclonal anti-SIRT-1, (Santa Cruz, réf : sc- 15404), fait sur lapin, au 1/200 ^ème pendant 24 heures à température ambiante avec système amplificateur streptavidine/biotine (Vector, Vectastain), et révélé en VIP (Vector, SK-4600).

Cet immunomarquage a été réalisé sur les T0, T, E1, E2, P1, P2, P7, P10, soient 24 explants. III- Résultats

III.1- SIRT-1 Aucun marquage n'est observé sue les coupes sur lesquelles l'anticorps primaire ou secondaire a été remplacé par du PBS, ce qui montre la spécificité du marquage observé.

111.2- A J0

Lot témoin à T0

Quelques cellules à noyau nettement marqué sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

111.3- A J10

Lot non traité (T)

Un nombre modéré de cellules à noyau nettement positif sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

Un marquage cytoplasmique faible, est également observé dans les couches spineuses de l'épiderme.

Lot traité avec le perhydrosqualène (E1)

Un nombre modéré de cellules à noyau nettement positif sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

Un marquage cytoplasmique modéré, est également observé dans les couches spineuses de l'épiderme.

Lot traité avec de l'eau distillée (E2)

Un nombre modéré de cellules à noyau nettement positif sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

Un marquage cytoplasmique modéré, est également observé dans les couches spineuses de l'épiderme. Lot traité avec de l'huile essentielle d'immortelle à 0.5% (P1) De nombreuses cellules à noyau nettement positif sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

Un marquage cytoplasmique modéré, est également observé dans les couches spineuses de l'épiderme.

Lot traité avec de l'huile essentielle de myrte à 0.5% (P2)

D'assez nombreuses cellules à noyau nettement positif sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

Un marquage cytoplasmique modéré, est également observé dans les couches spineuses de l'épiderme.

Lot traité avec le resvératrol à 0.1% (P7)

D'assez nombreuses cellules à noyau nettement positif sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

Un marquage cytoplasmique très modéré, est également observé dans les couches spineuses de l'épiderme. Lot traité avec HE immortelle à 0.5% + HE myrte à 0.5% (P10)

De nombreuses cellules à noyau nettement positif sont observées dans les couches supérieures de l'épiderme vivant.

Un marquage cytoplasmique assez net, est également observé dans les couches spineuses de l'épiderme.

L'ensemble des résultats est récapitulé dans le tableau 5 ci-dessous. Tableau 5 : Détermination du pourcentage de surface occupé par le marquage de SIRT-1 dans l'épiderme

IV- Discussion

IV.1 - Sirtuine-1

A J0

L'expression de SIRT-1 est très modérée. A J10

Après 10 jours de survie, l'expression de SIRT-1 est légèrement augmentée. Elle est modérée.

- Après traitement avec l'excipient E1, l'expression de SIRT-1 est proche de celle observée sur le lot non traité. L'excipient E1 n'induit pas de modification notable de l'expression de SIRT-1 dans l'épiderme.

- Après traitement avec l'excipient E2, l'expression de SIRT-1 est proche de celle observée sur le lot non traité. L'excipient E2 n'induit pas de modification notable de l'expression de SIRT-1 dans l'épiderme.

- Après traitement avec le produit P1, l'expression de SIRT-1 est nette dans tout l'épiderme. Le produit P1 induit une nette expression de SIRT-1 dans l'épiderme. - Après traitement avec le produit P2, l'expression de SIRT-1 est assez nette dans tout l'épiderme. Le produit P2 induit une assez nette expression de SIRT-1 dans l'épiderme.

- Après traitement avec le produit P7, l'expression de SIRT-1 est assez nette dans tout l'épiderme. Le produit P7 induit une assez nette expression de SIRT-1 dans l'épiderme.

- Après traitement avec le produit P10, l'expression de SIRT-1 est nette dans tout l'épiderme. Le produit P10 induit une nette expression de SIRT-1 dans l'épiderme.

La détermination du pourcentage de surface occupé par la sirtuine-1 dans l'épiderme par analyse d'image montre que :

Le produit P1 induit une augmentation significative de 65% du pourcentage de surface occupé par la sirtuine-1, par rapport au lot non traité à J 10.

Le produit P2 induit une augmentation significative de 43% du pourcentage de surface occupé par la sirtuine-1, par rapport au lot non traité à J 10.

Le produit P7 induit une augmentation significative de 42% du pourcentage de surface occupé par la sirtuine-1, par rapport au lot non traité à J 10.

Le produit P10 induit une augmentation significative de 70% du pourcentage de surface occupé par la sirtuine-1, par rapport au lot non traité à J 10.

V- Conclusions

L'huile essentielle Myrte Vert Corse Bio montre une bonne activité sur l'expression de SIRT-1, équivalente voire supérieure au resvératrol, molécule de référence. Cette étude sur explant confirme le résultat observé dans l'exemple précédent (exemple III). L'intérêt ici est d'être dans des conditions très proches de l'application topique cutanée.

Un excellent effet de synergie est observé avec l'huile essentielle Immortelle Corse Bio.

Exemple 5 : Effet de l'huile essentielle de myrte vert biologique corse sur la modulation d'expression d'un marqueur cutané (HSPG2)

I- Objectif de l'étude

La ou les cibles biologiques (thématiques ou marqueurs) de l'huile essentielle de myrte vert biologique Corse ont été recherchées.

Le protocole réalisé est le même que celui décrit par Bagory M. [7].

Les thématiques et marqueurs suivants ont été recherchés :

-Jonction dermo-épidermique : lamine ; collagène IV ; fibronectine ; intégrine

-Activité restructurante derme : collagène I ; collagène III ; glycosaminoglycannes ; protéoglycannes ; acide hyaluronique ; tropéolastine ; fibrilline ; SIRT-1 ; cavéolines-1

-Activité épidermique : profilaggrine/filaggrine ; cholestérol/céramides ; involucrine ; loricrine ; cornifine ; kératine (K15/K14 et K1/K10) ; facteurs de croissance (EGF, TGF alpha, TGF beta, TNF alpha) ; transglutaminase membranaire ; aquaporine-3

-Activité éclaircissante : TRP-1 ; TRP-2 ; MC1-R et MC2-R ; PAR-2 Dans cet exemple, les cultures cellulaires adéquates ont été réalisées sur des kératinocytes, fibroblastes et mélanocytes, en présence ou non (témoin) des 11 composés à tester puis il a été procédé à l'extraction des ARN afin de quantifier les marqueurs d'intérêt par RT-QPCR.

Il- Matériel et méthodes

11.1- Modèle biologique

- Type cellulaire :

Fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF)

Référence Bioalternatives : pool PF2, utilisés au 8 ^eme passage

- Conditions de culture : 37°C, 5% CO ₂

- Milieu de culture : DMEM complémenté avec ; L- glutamine 2 mM ; Pénicilline 50 U/ml - Streptomycine 50 pg/ml ; Sérum de veau fœtal (SVF) 10%

- Milieu d'essai : DMEM complémenté avec ; Glutamine 2 mM ; Pénicilline 50 U/ml - Streptomycine 50 pg/ml ; Sérum de veau fœtal (SVF) 2%

11.2- Culture et traitement

Les fibroblastes dermiques humains normaux ont été cultivés en plaques 12 puits en milieu de culture jusqu'à confluence, puis placés en milieu d'essai. Les fibroblastes ont ensuite été traitées ou non (témoin) avec le composé testé et incubées pendant 24 heures. Toutes les conditions ont été réalisées trois fois.

A la fin de chaque période d'incubation, les fibroblastes ont été rincées avec une solution de « phosphate buffered saline » (PBS), 300μΙ de TriReagent ont été ajoutés et les fibroblastes ont été immédiatement congelées à -80°C. 11.3- Reverse-transcription (RT)

- Extraction des ARN de chaque échantillon en utilisant du Tri-reagent (EUROMEDEX) selon les conseils du fournisseur.

- Les potentielles traces contaminantes d'ADN génomique ont été enlevées par la méthode « DNAfree System » (Ambion).

- La reverse-transcription des mARN a été effectuée en présence d'oligo(dT12-18) et du kit « Superscript II» (invitrogen).

11.4- PCR en temps réel (g PCR)

Les PCR (Polymerase Chain Reactions) ont été réalisés en triple exemplaires à l'aide de l'appareil « LightCycler (marque déposée) System » (Roche Molecular Systems Inc.) en accord avec le protocole recommandé par le fournisseur.

Cet appareil permet une rapide et puissante réaction des PCR, après détermination des conditions d'analyses de l'amorce des tests. Cela consiste en deux composantes :

- Un thermo-cycle : optimisé pour une application rapide des PCR, permettant des transferts thermiques extrêmement rapide à l'intérieur de la réaction de la mixture

- Un fluorimètre : permettant de mesurer fidèlement la fluorescence de l'intervalle teinté SYBR Green I ; teinture qui lie spécifiquement au double blocage ADN pendant le cycle d'allongement (détection longueur d'onde : 521nm).

Les amorces SEQ ID No.1 et SEQ ID No.2 présentées dans le tableau 6 ci-dessous), spécifiques du gène « Heparan sulfate protéoglycan » ou (« HSPG2 ») (SEQ ID No.3) référencé à la « Gene Bank » sous le numéro NM_005529, ont permis l'amplification d'un fragment spécifique de 226 paires de bases. Le niveau d'expression de ce gène est normalisé par rapport à un gène de référence quantifié en même temps que HSPG2 [7].

Tableau 6 : Caractéristiques des amorces SEQ ID No.1 et

III- Résultats

Comme le montre le tableau 7 ci-dessous, les résultats ont montré une tendance de l'huile essentielle biologique de myrte vert corse à stimuler les protéoglycanes.

Tableau 7 : Stimulation de l'expression du gène des

protéoglycanes par des fibroblastes

Exemple 6 : Evaluation clinique de l'effet anti-tâches (scorage)

Une composition A comprenant les composés présentés dans le tableau 8 suivants a été préparée. Tableau 8 : Composition A testée

La composition A a été appliquée de manière biquotidienne par 32 volontaires durant 56 jours, dans les conditions normales d'utilisation, afin d'évaluer son effet anti-tâches.

Une synthèse des résultats est présentée dans le tableau 9 ci-dessous.

Tableau 9 : Variations de la taille des taches et de leur couleur, après 28 (J28) et 56 jours (J56) d'utilisation biquotidienne du prod uit, en comparaison à l'état initia moyenne

J56 -0,5 +/- 0.2 -10 ** * des taches

Couleur J28 -0,7 +/- 0,1 -19 ** * moyenne

des taches J56 -1,1 +/- 0.2 -32 ** *

Dans ce tableau « Moy » signifie « moyenne » et « sem » correspond à l'écart-type. « % moy» correspond à « la variation en pourcentage sur les moyennes». « na » signifie « non applicable ». « p » correspond au seuil de significativité statistique où « ^*** » correspond à une valeur de p inférieure à 0,001 (extrêmement significatif).

Dans les conditions de cette étude, sur 32 volontaires, après 28 et 56 jours d'utilisation de la composition A, une diminution significative de la couleur moyenne des taches a été observée (respectivement de -19% et -32%) par le dermatologue en charge de l'étude (p<0,001). Cet effet a été observé chez 74% des volontaires à J28 et chez 81% des volontaires à J56.

De plus, après 56 jours d'utilisation, une diminution significative de la taille moyenne des taches a été observée (- 10%) par le dermatologue en charge de l'étude (p<0,001). Exemple 7 : Evaluation clinique de l'effet hydratant de la composition cosmétique

Le taux d'hydratation cutanée de la composition A définie dans l'exemple 6 a été étudié à deux, huit et vingt-quatre heures après une application standardisée unique. Les mesures ont été réalisées 13 fois.

Une synthèse des résultats est présentée dans le tableau 10 ci-dessous. Tableau 10 : Variations du taux d'hydratation des couches superficielles de l'épiderme après une application standardisée unique du produit, en comparaison à une zone non traitée

Dans ce tableau « Moy » signifie « moyenne » et « sem » correspond à l'écart-type. « % moy» correspond à « la variation en pourcentage sur les moyennes». « na » signifie « non applicable ». « p » correspond au seuil de significativité statistique où « ^*** » correspond à une valeur de p inférieure à 0,001 (extrêmement significatif).

Le test statistique utilisé pour cet exemple est un test de student.

En comparaison à une zone non traitée et après une application standardisée unique, la composition A a induit une augmentation significative du taux d'hydratation cutanée des couches superficielles de l'épiderme, deux, huit et vingt-quatre heures après son application : +70% à t=2h, +30% à t=8h et + 18% à t=24h.

Exemple 8 : Etude sur l'humeur instantanée (BMIS) après application de la composition cosmétique

Dans cet exemple, une augmentation du score global correspond à une amélioration de l'humeur instantanée des volontaires. Concernant l'analyse des points « désagréables », une augmentation de score traduit une diminution du ressenti « désagréable ».

Un questionnaire portant sur l'humeur a été complété par 32 volontaires avant et après application du produit.

Ce questionnaire en 16 points s'organise autour de 8 dimensions : le bonheur, l'affection, le calme, l'énergie, la peur, la colère, la fatigue et la tristesse.

Une analyse secondaire en regroupant les émotions agréables (dynamique, heureux, bienveillant, content, énergique, calme, affectueux, vif) et désagréables (triste, fatigué, mélancolique, excité, épuisé, grincheux, nerveux, agacé) est ensuite possible.

Pour chacun d'es 16 adjectifs donnés, les volontaires devaient cocher la case qui correspond au mieux, à l'état qu'ils ressentaient avant et 70 minutes après application de la composition A. Les volontaires ont gradué leurs réponses en fonction de l'intensité émotionnelle qu'ils ressentaient. Les réponses données sont codées de la manière suivante :

Tableau 11 : Réponse et scores possible pour l'étude de l'humeur instantané

Le score global obtenu est la somme des valeurs pour chaque item. Il varie de 16 à 64. Un score global au-dessous de 40 caractérise une humeur plutôt "désagréable" et un score global au-dessus de 40 caractérise une humeur plutôt "plaisante".

Avant application de la composition A, le résultat était de 43,7. 70 minutes après son application, la moyenne des résultats est passée à 48,7.

Ces résultats montrent une augmentation significative du score global a été observée, ce qui caractérise un effet "bien- être" pour les volontaires, 70 minutes après l'application de la composition A.

Exemple 9 : Evaluation des qualités cosmétiques de la composition cosmétique

La composition A définie dans l'exemple 6 a été appliquée de manière biquotidienne par 50 volontaires durant 28 jours, dans les conditions normales d'utilisation, afin d'évaluer ses qualités cosmétiques.

L'ensemble des résultats figure dans le tableau 12 ci- dessous.

Tableau 12 : Efficacité et jugement global du produit

B6 Les contours du visage sont mieux définis 68% Oui

B7 L'ovale du visage est plus net 66% Oui

B8 Les traits sont défatigués 82% Oui

B9 Les traits sont comme « liftés » 72% Oui

C1 La peau parait gainée/ maintenue 72% Oui

C2 Le visage parait serein 78% Oui

C3 La peau est débarrassée du voile terne 84% Oui

C4 Le cou est plus lisse 76% Oui

C5 Le cou parait plus jeune 70% Oui

C6 Le vieillissement est visiblement retardé 70% Oui

C7 Le visage parait visiblement plus jeune 68% Oui

C8 L'ensemble des signes de l'âge sont atténués 70% Oui

D1 La peau est revitalisée 90% Oui

D2 Le relâchement cutané est réduit 84% Oui

D3 La peau est plus tonique 82% Oui

D4 La peau est fortifiée 80% Oui

D5 La peau est reconstruite en profondeur 72% Oui

D6 La peau est profondément réparée 64% Oui

D7 La peau est régénérée 82% Oui

D8 La peau est hydratée pendant toute la journée 96% Oui

D9 La peau est confortable tout au long de la journée 94% Oui

% Sign.

JUGEMENT GLOBAL DU PRODUIT

Accord (5%)

E1 Le produit convient-il à votre type de peau ? 80% Oui

E2 Diriez-vous que cette crème est ? 74% Oui

E3 Diriez-vous que cette crème est source de Plaisir 76% Oui et/ou de Bien être ?

E4 Diriez-vous que cette crème est source de nutrition 72% Oui et d'hydratation intense ?

E5 Quelle note globale donneriez-vous au produit ? R D, Ro

(10 étant la meilleure note)

F1 Achèteriez-vous cette crème ? 64% Oui

La composition A a donc été reconnue comme étant très efficace par les utilisateurs. Listes des références

[1] Lin, S.J., Defossez, P. A. and Guarente, L. (2000) Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae. Science 289, 2126- 2128

[2] Picard, F., Kurtev, M., Chung, N., Topark-Ngarm, A., Senawong, T., Machado De Oliveira, R., Leid, M., McBurney, M.W. and Guarente, L. (2004) Sirtl promotes fat mobilization in white adipocytes by repressing PPAR-gamma. Nature 429, 771- 776

[3] Michishita, E., Park, JY., Burneskis, JM., Barrett, JC, Horikawa, I. (2005) Evolutionarily conserved and nonconserved cellular localizations and functions of human SIRT proteins. Molecular biology of the cell, 16, 4623-35

[4] FR 01/11224

[5] FR 06/05953

[6] Matthieu Bagory. La PCR et RT-PCR quantitative temps- réel.

[7] David G. Ginzinger. Gene quantification using real-time quantitative PCR : an emerging technology hits the mainstream. Expérimental Hematology,30 :503-512, 2002