NUTRACEUTIQUES, VETERINAIRES ET PHARMACEUTIQUES CONTENANT UN EXTRAIT DE

PÉRICARPE DE NOISETTE

La présente invention concerne l'utilisation d'extraits d'une plante très répandue, notamment en Europe, dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou vétérinaires. Plus précisément, elle se rapporte à de nouvelles applications du péricarpe de noisette pour traiter la peau humaine ou animale.

Le Noisetier ou Coudrier (Corylus avellana L.) est un arbrisseau de 3 à 8 mètres de hauteur et appartenant à la famille des Bétulacées. C'est une plante des bois, des haies et des jardins qui donne un fruit comestible apprécié, la noisette. Il a un bois souple. Il est parfois appelé Avelinier. L'arbrisseau forme une touffe de 10 à 12 branches pouvant atteindre 3 à 4 m de haut, multigaule (composé de plusieurs troncs fins). Son écorce est marron et peut se détacher en fines lamelles selon les variétés. Ses feuilles cordiformes caduques sont dentées avec un sommet en pointe. Les fleurs mâles, jaunâtres, forment des épis pendants ou chatons de 6 cm, et les fleurs femelles, très condensées, forment des épis dressés.

La noisette est un akène doté d'un péricarpe ligneux appelé « écale » et renfermant une seule graine (l'amande) qui occupe toute la cavité interne du péricarpe. Ce fruit à coque, de forme plus ou moins ovoïde, peut atteindre 3 cm de long et 2 de diamètre; il est protégé avant maturité complète par une enveloppe de forme tubulaire, l'involucre (bractée), d'aspect foliacé et divisée en lobes irréguliers à son extrémité, elle est plus ou moins enveloppante selon les variétés.

Le péricarpe est un déchet de l'industrie agro-alimentaire et se trouve en grande quantité. La plupart du temps, il a subi une étape de torréfaction.

Le péricarpe de noisette a été étudié pour ses propriétés anti-oxydantes compte tenu des tannins qu'il renferme (Alasalvar et al, Antioxidant activity of haselnut skin phenolics, J. agric. Food. Chem. (2009)57 p. 4645). Diverses publications scientifiques décrivent également les tannins qu'il renferme (Del Rio et al, Phenolic composition of haselnut skin, J. Agric. Food Chem. (2011)59 p. 9935) ou des sucres (Montella et al, Identification and characterisation of water alkali soluble oligosaccharides from haselnut skin (C. avellana L.) Food Chemistry 140 (2013) 717- 725.

La présente invention met en évidence de nouvelles applications des extraits du péricarpe de noisette pour dépigmenter au moins partiellement les peaux normales ou pour supprimer au moins partiellement les taches brunes inesthétiques liées à l'âge ou à des expositions répétées au soleil par exemple. Mais, en outre, les extraits de péricarpe de noisette améliorent significativement la fonction barrière de l'épiderme pour lutter contre les agressions externes et joue donc un rôle de protecteur cutané. Ces extraits de péricarpe de noisette jouent aussi un rôle favorable dans les compositions anti-âge. Enfin, ces extraits de péricarpe ont un rôle lipolytique.

Selon l'invention on a découvert que les extraits de péricarpe de noisette permettaient de diminuer l'expression de la tyrosinase, enzyme clé de la pigmentation dans les mélanocytes humains normaux. Ce résultat permet d'envisager des actions dépigmentantes sur des peaux naturellement pigmentées ou sur des taches pigmentaires induites par le soleil, le vieillissement ou toutes autres agressions externes. La présente invention vise donc à proposer de nouvelles compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, nutraceutiques ou vétérinaires capables de diminuer la pigmentation naturelle ou induite de la peau d'un animal vivant et notamment d'un sujet humain.

Selon l'invention on a également découvert que les extraits de péricarpe de noisette permettaient de stimuler l'expression de différents marqueurs protéiques essentiels dans la formation du stratum corneum ou couche cornée, dont l'enzyme- clé, la transglutaminase TGK.

Le stratum corneum est la partie la plus superficielle de la peau et représente l'aboutissement du processus de différenciation des kératinocytes. Au cours de cette différenciation, les kératinocytes issus de l'assise basale subissent une série de remaniements métaboliques et structuraux tout au long de leur migration vers la surface de la peau. Le dernier stade est leur transformation en cornéocytes dont l'accumulation en une structure cohésive constitue le stratum corneum qui assure une fonction de barrière. Tout au long du processus de différenciation, plusieurs protéines interviennent. L'une d'elles, la TGK, de la famille des glutaminases, catalyse l'établissement de liaisons peptidiques covalentes du type B(g-glutamyl)-lysine entre divers précurseurs protéiques qui forment le stratum corneum et lui confère cette capacité à protéger la peau vis-à-vis d'agressions extérieures et à limiter la diffusion de l'eau provenant de l'intérieur. La transglutaminase forme des polymères de protéines généralement insolubles. Ces polymères biologiques sont indispensables à l'organisme pour créer des barrières et structures stables. Selon l'invention nous avons enfin mis en évidence un effet lipolytique des extraits de péricarpe de noisette en agissant sur la libération des acides gras non esterifiés dans les adipocytes humains.

La présente invention vise précisément à offrir de nouvelles compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou vétérinaires capables de stimuler les facteurs intervenant dans la différenciation, appelés facteurs pro-différenciants comme la TGK, et permettant ainsi d'améliorer les états de la peau, des phanères et des muqueuses, sains ou lésés.

Selon l'invention, lesdites compositions comprennent, à titre de principe actif, au moins un extrait de péricarpe de noisette.

On entend par « extrait de péricarpe de noisette », un extrait ou un mélange d'extraits de plante du genre Corylus sp de la famille des Bétulacées. Il s'agit plus spécialement d'un extrait ou d'un mélange d'extraits de cellules de Corylus sp. Ce matériel cellulaire peut être obtenu par culture in vitro ou in vivo. Par culture in vitro, on entend l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier, qui permettent, de manière artificielle, l'obtention d'un végétal ou d'une partie de végétal. Ainsi, l'extrait peut être un extrait ou un mélange d'extraits d'organe (racine, tige, feuille, écorce), voire de cellules d'organe, d'au moins une plante du genre Corylus sp de la famille des Bétulacées, ou encore un extrait de cellules indifférenciées d'au moins une telle plante.

Les applications selon l'invention s'étendent au traitement de la peau, des phanères et des muqueuses. Par phanères, on inclut notamment les ongles et le système pileux, en particulier les cheveux. Par muqueuses, on entend les tissus de revêtement des cavités anatomiques, qui se raccordent à la peau par des orifices naturels, comme la bouche, l'estomac, l'intestin, ainsi que ceux de cavités naturelles externes comme les narines ou les oreilles.

Ainsi, la présente invention a pour objet une utilisation d'un extrait de péricarpe de noisette pour dépigmenter et/ou protéger la peau, les phanères et les muqueuses des agents extérieurs physiques, chimiques ou biologiques, et/ou pour améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau et/ou renforcer les phanères et les muqueuses et/ou avoir une action lipolytique.

Elle a aussi pour objet un procédé de traitement cosmétique de lutte contre la sécheresse d'une peau ou de traitement cosmétique d'une peau sèche, ledit procédé comprenant une étape selon laquelle on applique au moins un extrait de péricarpe de noisette sur la peau, pour lui redonner souplesse et/ou élasticité.

L'invention porte aussi sur un procédé de traitement cosmétique anti-âge de la peau ou de traitement cosmétique d'une peau âgée, comprenant une étape selon laquelle on applique au moins un extrait de péricarpe de noisette sur la peau. Ce traitement permet de retarder les phénomènes de pigmentation et/ou de vieillissement de la peau, mais aussi de réparer une peau âgée en lui redonnant souplesse et élasticité.

Dans toute application cosmétique de l'invention, un extrait de péricarpe de noisette peut être associé à un autre ou d'autres agents prodifférenciants de la peau, comme le calcium, la vitamine D et leurs dérivés ou au moins un autre agent dépigmentant complémentaire connu de l'homme de métier.

Selon un autre aspect, l'invention concerne les applications pharmaceutiques, nutraceutiques ou vétérinaires d'un extrait de péricarpe de noisette, telles que présentées ci-après.

Un des objets selon l'invention est donc une composition pharmaceutique, nutraceutique ou vétérinaire comprenant un extrait de péricarpe de noisette, pour restaurer la fonction barrière de l'épiderme d'une peau lésée. Cet état peut résulter de l'action d'un agent extérieur physique, chimique ou biologique et/ou d'un trouble ou d'une maladie, comme par exemple du psoriasis ou une dermatose atopique.

Un autre objet selon l'invention est une composition pharmaceutique, nutraceutique ou vétérinaire comprenant un extrait de péricarpe de noisette, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière d'une muqueuse ou pour restaurer la fonction barrière d'une muqueuse lésée. A titre d'exemple, il peut s'agir de la muqueuse intestinale. La lésion de la muqueuse peut résulter d'un trouble ou d'une maladie ; dans le cas de la muqueuse intestinale, la lésion peut être provoquée par le syndrome du colon irritable.

Dans la visée thérapeutique de l'invention, l'extrait de péricarpe de noisette peut être administré par voie topique ; il peut aussi être administré par voie orale.

Selon un aspect de l'invention, l'extrait est administré après que le processus inflammatoire est terminé, notamment en traitement réparateur par reconstruction du stratum corneum.

Dans une composition de l'invention, l'extrait de péricarpe de noisette peut aussi être associé à un ou plusieurs agents anti-inflammatoires et/ou immunosuppresseurs utilisés dans le traitement de l'inflammation cutanée, tels que les cyclosporines et leurs dérivés, les biothérapies anti-cytokines et les corticoïdes.

Un extrait de péricarpe de noisette selon l'invention peut être obtenu par toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier. On peut en particulier, citer les procédés d'extraction solide-liquide en milieux alcooliques (notamment éthanoliques), aqueux, ainsi qu'en milieux utilisant des solvants tels que les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités, comme les milieux hydroalcooliques.

Avantageusement, un extrait est obtenu par extraction de péricarpe de noisette, broyé ou non, en milieu aqueux hydroalcoolique ou alcoolique, notamment avec une solution aqueuse d'éthanol. La concentration de l'éthanol peut varier de 10 à 90% (v/v).

Des méthodes alternatives aux solvants peuvent aussi être envisagées comme le C0 ₂ supercritique ou les micro-ondes...

Ces extraits peuvent être utilisés tels quels, sous forme liquide ou en poudre, non purifiés ou purifiés.

Si l'extrait est en poudre, son séchage peut être conduit par toute technique bien connue de l'homme du métier. L'extrait peut être séché par atomisation, évaporation ou lyophilisation. La poudre ainsi obtenue peut être encapsulée dans des liposomes ou autres vecteurs et supports pour une meilleure homogénéité de la composition et une meilleure diffusion du principe actif notamment sur la peau.

L'extrait est de préférence obtenu à partir des péricarpes de noisettes broyés ou non et rôtis ou non.

On a observé que les extraits obtenus par macération hydroalcoolique des péricarpes de noisettes présentent une forte activité biologique et ceci quel que soit le pourcentage d'éthanol dans le solvant d'extraction. Des résultats similaires sont observés dans l'eau ou dans l'éthanol.

Les extraits de péricarpe de noisette peuvent être associés dans les compositions selon l'invention avec des substances augmentant la protection cutanée. A titre d'exemple mais de manière non limitative, on peut citer les associations avec des mucopolysaccharides, des vitamines, des céramides, des substances antiradicalaires ou des filtres U.V.

De même, l'activité réparatrice des extraits selon l'invention est particulièrement intéressante quand ils sont associés avec des substances ayant un effet cicatrisant comme des protéines, l'acide hyaluronique, des acides aminés, et/ou avec des substances anti-inflammatoires, anti-âge, après-solaire ou avec des actifs anti-acné et anti-dermatoses.

L'activité protectrice des extraits de l'invention vis-à-vis des radicaux libres et des U.V. est également très intéressante dans le domaine capillaire, notamment dans le cas d'association avec des substances facilitant le bon état du cuir chevelu et de celui du cheveu, comme des minéraux, des vitamines, des céramides, des extraits protéiques, des mucopolysaccharides, des acides de fleurs ou de fruits. Les compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées à une application topique pour prévenir et/ou traiter de nombreuses altérations cutanées.

L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation dermo-cosmétique d'une composition contenant au moins un extrait de péricarpe de noisette, comme agent dépigmentant d'une peau naturellement pigmentée ou partiellement pigmentée, afin d'homogénéiser le teint, ou pour réduire les taches brunes liées à l'âge ou aux agents externes comme le soleil. L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation dermo- cosmétique d'un extrait de péricarpe de noisette, comme agent réparateur et/ou protecteur de la peau et du système pileux comme les cheveux, notamment pour lutter contre les agressions externes, telles que celles liées à la pollution, au soleil, au stress oxydatif, au vieillissement et aux pathologies cutanées entraînant un dysfonctionnement de l'homéostasie de l'épiderme ou des cheveux. C'est pourquoi, une application directe des compositions de l'invention concerne la lutte contre le vieillissement et la mort cellulaire induits par les U.V.

Pour une utilisation cosmétique, les compositions de l'invention peuvent se présenter sous la forme de crèmes, gels, lotions, laits, émulsions H/E et E/H, solutions, onguents, pulvérisateurs, huiles corporelles, lotions capillaires, shampooings, lotions après-rasage, savons, bâtons protecteur des lèvres, bâtons et crayons pour maquillage. Les compositions peuvent comprendre tous excipients nécessaires à leur formulation. Ainsi, lorsqu'elles sont sous la forme de gel, elles comprennent des excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autres agents gélifiants, tels que le Carbopol ^® , la gomme de guar, ou analogues.

Ces compositions cosmétiques peuvent aussi prendre la forme de lotion ou solution dans laquelle les extraits et/ou molécules sont sous forme encapsulée, par exemple dans des microsphères. Ces microsphères peuvent par exemple être constituées de corps gras, d'agar-agar et d'eau. Les agents actifs peuvent être aussi incorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nano-capsules et peuvent aussi être adsorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuvent être conservées pendant le temps nécessaire pour une utilisation à des températures comprises entre 0 et 50 °C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ou séparation des phases.

Les compositions cosmétiques de l'invention comprennent de l'ordre de

0,01 à 5% en poids, préférentiellement entre 0,1 et 2,5%, d'extrait de péricarpe de noisette lorsqu'elles sont sous forme de poudre et de l'ordre de 0,01 à 25% en poids, préférentiellement entre 0,5 et 10%, lorsqu'elles sont sous forme encapsulée. Les pourcentages donnés ci-dessus sont exprimés en poids d'extrait sec de péricarpe de noisette par rapport au poids de la composition finale.

Pour la préparation de ces compositions, les extraits de péricarpe de noisette sont mélangés aux excipients généralement employés en cosmétique.

Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent aussi contenir des additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologie, comme par exemple des agents antibactériens ou des parfums, mais aussi des lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, des tensio-actifs et émulsifiants, des principes actifs hydro ou liposolubles, des extraits de plantes, des extraits tissulaires, des extraits marins et des actifs de synthèse.

Les compositions cosmétiques ou nutraceutiques selon l'invention, peuvent être utilisées pour exercer une action lipolytique par application topique ou par voie orale.

L'utilisation cosmétique ou dermocosmétique d'extraits comprend tous les soins du corps et de la peau y compris les produits solaires, protecteurs et bronzants, lipolytiques, les produits anti-âge, anti-seborrhéïques, toniques, les produits assurant l'amélioration de l'aspect de la peau y compris le traitement acnéique, les rougeurs cutanées, le traitement du cuir chevelu et celui de la chute des cheveux.

Les compositions cosmétiques de la présente invention peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, par exemple pour la protection solaire, l'effet anti-rides, l'activité antiradicalaire et antioxydante, l'activité anti-irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire, l'hydratation et la régénération cellulaire, les traitements anti-séborrhéïques, la lipolyse comme la caféine ainsi que d'autres principes actifs ayant une action sur la tonicité cutanée, la protection du cheveu, des cils et des ongles

Les compositions cosmétiques de la présente invention sont de préférence à utiliser quotidiennement en les appliquant une ou plusieurs fois par jour. Les compositions cosmétiques de la présente invention sont très bien tolérées, elles ne présentent aucune phototoxicité et leur application sur la peau, pour des périodes de temps prolongées, n'implique aucun effet systémique.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'extraits de péricarpe de noisette pour la préparation de compositions dermocosmétiques présentant une activité anti- inflammatoire et dermoprotectrice. Ces compositions sont utiles pour prévenir et/ou traiter notamment des maladies dermatologiques liées à des activités séborrhéiques, acnéiques et/ou inflammatoires. Ces compositions dermocosmétiques se présentent sous forme liquide, de poudre, de pâte ou d'émulsion, seuls ou en combinaison avec d'autres substances. Elles comprennent de l'ordre de 0,01 à 25% en poids d'extrait de péricarpe de noisette. Les pourcentages sont exprimés en poids d'extrait sec de péricarpe de noisette par rapport au poids de la composition finale. Pour la préparation de ces compositions dermocosmétiques, les extraits de péricarpe de noisette sont mélangés à des excipients.

En conséquence, de manière générale, l'invention se rapporte notamment à l'utilisation d'un extrait de péricarpe de noisette, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, vétérinaire, nutraceutique, dermatologique ou cosmétique destinée à prévenir et/ou traiter les pathologies et désordres résultant :

■ du vieillissement naturel ou prématuré de la peau ou des cheveux, en favorisant la détoxification et la purification de la peau.

^■ de dermatoses, comme le psoriasis, la dermatite atopique...,

^■ d'états inflammatoires des systèmes cutanés ou pileux, induisant des démangeaisons, irritations, rougeurs chroniques, irritations et démangeaisons persistantes et des troubles fonctionnels de la fragilité capillaire ou des ongles

^■ de la pigmentation cutanée,

^■ de désordres liés à l'adipocytes, comme l'excès de stockage de graisses, la formation de capitons, de la perte de l'ovale du visage.

Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend, outre au moins un agent actif comme défini précédemment, un vecteur, ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Une composition nutraceutique par voie orale selon l'invention comprend, outre au moins un agent actif comme défini précédemment, un vecteur, ou un excipient acceptable sur le plan des compléments alimentaires. Cette composition nutraceutique peut cibler n'importe quel organe comme la peau ou un organe interne comme l'intestin.

La présente invention est maintenant illustrée, de manière non limitative, par les exemples 1 à 5 suivants. L'exemple 1 illustre des procédés de préparation d'extraits de péricarpe de noisette selon l'invention.

Les exemples 2, 3 et 4 illustrent les propriétés biologiques revendiquées selon l'invention. L'exemple 2 montre les effets dépigmentants de certains extraits selon l'invention. L'exemple 3 illustre les propriétés des extraits de l'exemple 2, qui ont été évaluées par la capacité de ces extraits à stimuler l'expression de marqueurs-clé de la différenciation épidermique. Les marqueurs choisis, tous impliqués dans l'arrangement des filaments de kératine et dans la formation de l'enveloppe de la couche cornée, sont la transglutaminase K (TGK), la filaggrine et la cytokératine 10 (KRT10). La TGK catalyse l'établissement de liaisons peptidiques du type s(g-glutamyl)- lysine entre divers précurseurs protéiques. La filaggrine et la KRT10 sont peu exprimées dans les monocouches de kératinocytes primaires et sont considérés comme des marqueurs de différenciation terminale de l'épiderme. Ces résultats témoignent de la capacité des extraits à agir sur les peaux âgées ou lésées. Ces propriétés peuvent être étendues aux autres organes du corps humain ou animal. L'exemple 4 démontre l'effet lipolytique des extraits. Enfin, l'exemple 5 est un cas de formule cosmétique.

Exemple 1 : Obtention des extraits de péricarpe de noisette

Une série d'extractions a été réalisée avec les solvants suivants

• hexane ;

• acétate d'éthyle ;

• éthanol/eau : 90/10 ;

• éthanol/eau : 60/40 ;

• éthanol/eau : 30/70 ;

• eau.

Les extractions ont été réalisées à température ambiante (sauf pour l'eau à 50°C), après un broyage préalable de la matière végétale. Le ratio plante/solvant est de 1/10. Le temps de macération (sous agitation) est de 24 heures.

Pour chaque extrait, une partie a été traité sur charbon actif avec un ratio charbon/plante de 1/10, l'autre a été gardé brut.

Les rendement d'extraction sont rassemblés dans le tableau 1 ci-dessous :

5 On constate tout d'abord que les extraits hexane et acétate d'éthyle présentent des rendement voisins de 10 %, ce qui semble indiquer la présence d'une forte proportion de matière grasse. Ceci est confirmé par la nature huileuse de ces extraits. Il faut noter que les extrait aqueux et à 30 % d'éthanol ont été très difficiles à filtrer. Il est possible que ces difficultés aient engendré des pertes qui diminuent de

10 manière artificielle les rendements. Le rendement semble optimum pour l'éthanol à 60 % : 16 % brut et 13 % traité sur charbon. Lorsque l'on diminue la quantité d'éthanol, la diminution de rendement engendrée par le traitement sur charbon augmente fortement. Ceci est cohérent avec les fortes teneurs en composés phénoliques décrite dans le paragraphe suivant. On constate que le traitement sur

15 charbon est, mis à part pour les huiles, assez peu efficace pour diminuer la couleur des extraits.

Les analyses phytochimiques de ces extraits sont les suivantes:

Nous avons dosé les composés phénoliques totaux et les tanins par la 20 méthode de Folin-Ciocalteu en équivalent acide chlorogénique. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 3 ci-dessous :

On constate que :

• plus le solvant d'extraction est riche en éthanol, plus l'extrait est riche en composés phénoliques ;

5 · parmi les composés phénoliques, les tanins sont minoritaires ;

• à partir de 60 % d'éthanol, le traitement sur charbon permet d'enrichir l'extrait en composés phénoliques et en tanins ;

• les extraits éthanol 90 % et 60 %, traités sur charbon contiennent respectivement 98 % et 95 % de composés phénoliques ; dont respectivement 25 % et

10 24 % de tanins.

Exemple 2 : Evaluation de la cytotoxicité et de l'activité dépigmentante des extraits

15

Nous avons évalué l'activité inhibitrice de la tyrosinase pour les extraits éthanol 30 % (Ex3MF1173) et éthanol 90 % (ExlMF1173) non traités sur charbon.

20 Cytotoxicité

Nous avons dans un 1 ^er temps évalué la cytotoxicité des extraits sur mélanocytes.

• Type cellulaire : NHEM en milieu de culture .

• Temps d'incubation : 72 heures .

25 · Paramètres d'évaluation réduction du MTT et observations morphologiques au microscope. A la fin du traitement, les cellules ont été incubées en présence de MTT (sel de tétrazolium) dont la transformation en cristaux bleus de formazan est proportionnelle à l'activité de la succinate deshydrogénase (enzyme mitochondriale). Après dissociation des cellules et solubilisation du formazan par ajout

30 de DMSO, la densité optique (DO), représentative du nombre de cellules vivantes et de leur activité métabolique, a été mesurée avec un lecteur de microplaques à 540 nm (VERSAmax, Molecular Devices). Des résultats présentés dans le tableau 4 ci-dessous on conclut que la dose maximale non cytotoxique est de 3 μg/ml pour ExlMF1173 et de 10 μ§/ιηί pour Ex3MF1173.

Activité tyrosinase

Les mélanocytes ont été ensemencés et cultivés en milieu de culture 10 pendant 24 heures. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu contenant ou non (témoin) les composés ou la référence (acide lipoïque à 5 et les cellules ont été incubées pendant 72 heures.

Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3.

A la fin de l'incubation, le milieu de culture a été retiré et les cellules 15 lavées avec une solution de PBS. Pour chaque condition, l'enzyme tyrosinase a été extraite en solution PBS-Triton X-100, puis incubée avec le substrat (L-DOPA à 2 mM) pendant 1 heure à 37°C.

L'activité enzymatique des différents extraits cellulaires a été évaluée par mesure de la densité optique (DO) à 540 nm (Lecteur de microplaques Versamax, Molecular Devices) et en utilisant une gamme standard de tyrosinase de champignon (0.39 à 400 U/ml).

L'activité de la tyrosinase a été évaluée après 72 heures de culture des NHEM en présence de la référence ou des composés à l'essai. Dans ce type de protocole, la mesure de l'activité enzymatique permet de rendre compte de la quantité de tyrosinase présente dans les mélanocytes. Toutefois, il ne peut pas être exclu que les composés, incorporés dans les cellules ou liés de façon covalente à l'enzyme, puissent inhiber directement l'activité enzymatique de la tyrosinase.

Après 72 heures de culture, une activité tyrosinase était détectée dans les NHEM de la condition Témoin. Le traitement des NHEM par l'acide lipoïque, testé à 5 μg/ml, a induit une très forte inhibition de l'activité de la tyrosinase (90% d'inhibition). Ces résultats étaient attendus et ont permis de valider l'essai.

L'extrait EX3MF1173, testé à 10 μg/ml, a inhibé l'activité de la tyrosinase (25% d'inhibition). Aux plus faibles concentrations testées, ce composé n'a pas eu d'effet. L'effet aqueux a montré également une activité dépigmentante.

L'extrait EX1MF1173, testé à 3 concentrations, n'a pas modulé l'activité de la tyrosinase. Il faut cependant noter que l'extrait ExlMF1173 a, du fait de sa plus grande cytotoxycité, été testé à une concentration trois fois plus faible que Ex3MF1173. A cette même concentration Ex3MF1173 n'a pas non plus d'effet. Il est donc possible que la seule différence entre ExlMF1173 et Ex3MF1173 ne réside que dans leurs teneurs maximales non cytotoxiques.

Les résultats sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous :

Deux extraits de péricarpe de noisette ressortent de ces premiers essais.

Le 1 ^er est l'extrait éthanol 30 % brut (Ex3MF1173) qui présente un effet inhibiteur de la tyrosinase (25%) significatif. Il contient environ 60 % de composés 5 phénoliques (équivalent acide chlorogénique), dont environ 5 % de tanins (équivalent acide chlorogénique). Le rendement d'extraction est d'environ 7 %.

Afin d'évaluer l'impact couleur dans une formule cosmétique, les deux 10 extraits vont être dilués à 10 % dans de la maltodextrine, puis formulés dans une crème à 1 %. Les formules ainsi que les actifs seront mis en vieillissement accéléré pour évaluer leur stabilité sur le plan de la couleur et de la teneur en composés phénoliques. Exemple 3 : Evaluation dans des primocultures de kératinocvtes épidermiques humains normaux (NHEK)

1) Matériels et méthodes

Cellules

Kératinocvtes épidermiques humains normaux (NHEK) ; référence

BlOalternatives K341, utilisés au troisième passage.

Conditions de culture : 37°C, 5% C0 ₂

Milieu de culture : KeratinocyteSFM complémenté avec facteur de croissance épidermique (EGF) 0,25ng/ml, extrait pituitaire (EP) 25μg/ml et gentamycine

Milieu d'essai : KeratinocyteSFM complémenté avec gentamycine

25μg/ml.

Extraits testés

Dans l'étape initiale de sélection d'un extrait pour la poursuite des essais, et après évaluation de cytotoxicité préalable, les extraits EX8MF1113 et EX9MF1113 sont testés aux concentrations suivantes :

L'étape ci-dessus a conduit à retenir ces deux extraits à des concentrations non cytotoxiques de 10 μg/ml ; dose utilisée pour les expériences suivantes.

Immunomarquages in situ

Les kératinocytes ont été ensemencés et cultivés à confluence en plaques

96 puits puis le milieu a été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin) l'extrait testé ou la référence (CaCI ₂ à 1,5 mM) et les cellules ont été incubées pendant 72 heures. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3, pour chaque marqueur.

Après incubation, le milieu d'essai est éliminé et les cellules sont rincées, fixées et perméabilisées. Les cellules sont marquées avec les anticorps primaires dirigés contre les protéines d'intérêt (TGK, filaggrine et KRT10) selon la référence Mcheik JN et al. Foreskin-isolated kératinocytes provide successful extemporaneous autologous paediatric skin grafts. J Tissue Eng Regen Med. 2013 Mar 14. Ces anticorps ont été révélés par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (GAMAlexa 488). En parallèle, les noyaux des cellules sont colorés par le Hoechst 33258 (bisbenzimide). L'acquisition des images est réalisée avec un système d'imagerie à haute résolution, INCell Analyzer™1000 (GE Healthcare). Pour chaque puits, 5 saisies d'images numérisées sont effectuées. Les marquages sont quantifiés par mesure de l'intensité de fluorescence des protéines rapportée au nombre de noyaux identifiés par le Hoechst (intégration des données numériques par le logiciel Developer Toolbox 1.5, GE Healthcare).

Le screening des extraits n'a été réalisé que sur le paramètre TGK (tableau

6).

Analyse des transcrits, RT-qPCR

Les kératinocytes ont été ensemencés et cultivés à confluence en plaques 24 puits puis le milieu a été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin) le composé à l'essai ou la référence (CaCI ₂ à 1,5 mM) et les cellules ont été incubées pendant 48 heures. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3, pour chaque marqueur.

Après incubation, le milieu d'essai a été éliminé et les cellules ont été rincées et congelées à -80 °C.

L'expression des marqueurs a été évaluée par RT-qPCR sur les ARN messagers (ARNm) extraits des tapis cellulaires de chaque traitement (les réplicats ont été poolés avant l'extraction de l'ARN). Les étapes d'extraction d'ARN, réverse transcription, amorces et conditions de PCR ont été décrites précédemment, selon les références Mcheik JN et al. Foreskin-isolated kératinocytes provide successful extemporaneous autologous paediatric skin grafts. J. Tissue Eng Regen Med. 2013 Mar 14 ; Boniface et al. IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human kératinocytes. J Immunol. 2005 Mar 15;174(6):3695-702 ; Boniface et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. J Immunol. 2007 Apr l;178(7):4615-22.

2) Résultats

Screening

Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci-dessous qui illustre le niveau d'expression de la TGK via le marquage fluorescent des NHEK, l'intensité de fluorescence des NHEK étant proportionnelle à l'expression de TGK. Tableau 6

Ces résultats montrent que l'extrait EX9MF1113 induit de façon dose- dépendante l'expression de TGK dans les cultures de NHEK. L'activité est supérieure à celle de la référence chlorure de calcium, dès la concentration de 1 μg/ml ; l'effet maximum qui est 4 fois supérieur à celui du CaCI ₂ est observé à la concentration non cytotoxique de 10 μg/ml Influence de l'extrait EX9MF1113, sur l'expression de la TKG, la filaggrine et la KRT10

La même méthodologie que celle employée pour évaluer l'effet d'un extrait sur l'expression de TGK a été appliquée pour les marqueurs filaggrine et KRT10.

Le tableau 8 présente une évaluation du niveau d'expression des trois marqueurs ci-dessus via le marquage fluorescent des NHEK.

Dans cette expérience, on retrouve l'effet inducteur de TGK et on observe une très forte surexpression de protéine KRT10. Contrairement au calcium qui focalise l'effet sur quelques cellules en les transformant en très grosses cellules différenciées (cornéocytes), EX9MF1113 induit une très forte surexpression de KRT10 dans de nombreuses cellules mais n'augmente pas significativement la taille des cellules. Le mécanisme d'action du calcium et de EX9MF1113 sont donc différents et pourraient être additionnels ou synergiques. Ceci est confirmé par l'analyse de la filaggrine, qui augmente (plus modérément) suite au traitement par EX9MF1113, mais sans induire la production caractéristique de granules de filaggrine dans les cellules répondant au calcium. Cet exemple ouvre des perspectives vers les positionnements par voie orale ou topique de l'extrait pour redensifier le cheveux, les cils, les ongles mais aussi pour restaurer la fonction barrière, l'hydratation, et améliorer d'une manière générale les manifestations liées à l'âge.

Exemple 4 : Evaluation des effets des extraits de péricarpe de noisettes sur la libération d'acides gras non esterifiés par des adipocytes humains.

Ce test a pour objectif de mesurer l'hydrolyse des triglycérides dans des adipocytes hypodermiques humains. Le composé de référence est la caféine. Le temps d'incubation est de deux heures. Les résultats sont présentés dans le tableau 9 ci- dessous :

Dans ce modèle, les extraits se comportent comme le témoin positif. On peut imaginer un positionnement par voie topique ou orale d'un tel extrait pour réduire les imperfections cutanées liées aux adipocytes comme les capitons ou pour restaurer l'ovale du visage en soins anti-âge.

Exemple 5 : Formulation dermo-cosmétique d'un extrait de péricarpe de noisette.

A titre non limitatif, nous présentons ci-dessous un exemple de formule sous forme d'émulsion dans le tableau 10 ci-dessous.