La présente invention concerne essentiellement une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique et milieu de culture, contenant un extrait de Smelophyllum capense.

Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de Smelophyllum capense, pour la préparation d'une composition cosmé¬ tique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, stimulant notamment la synthèse du collagène, et destinée en particulier à lutter contre les effets du vieillissement cutané, à obtenir un raffermissement cutané, à améliorer la cicatrisation ou à traiter les diverses pathologies accompagnées d'une déficience en collagène ; ou comme l'un des principes actifs ou adjuvants d'un milieu de culture de cellules ou de tissus, spécialement pour la culture en masse de cellules de peau, en particulier des fibroblastes, ainsi que des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques ou des milieux de culture en comportant application.

La plante Smelophyllum capense appartient à la famille des Sapindacées qui regroupe environ 1.700 espèces végétales. Les plantes de cette famille contiennent des saponines utilisées depuis longtemps comme détergent et poison de pêche.

La plante Smelophyllum capense est un arbre de hauteur relativement modeste, mesurant de 3 à 4 m, que l'on trouve à l'état endémique en particulier dans les forêts de la partie méridionale de l'Afrique du Sud (voir R.B. Drumont, "Trees of Southern Africa, C. Struik Publisher, Capetown, 1984, page 531). II a maintenant été découvert que des extraits de Smelophyllum capense présentaient un grand intérêt en cosmétique, notamment pour le soin de la peau.

En particulier, il a été découvert une activité surprenante des extraits de Smelophyllum capense sur la synthèse de collagène, en particulier de collagène de type I, ci-après dénommé en abréviation "collagène I". Or, la peau contient essentiellement du collagène I, protéine synthétisée par les fibroblastes, cellules majoritaires du derme. Cette protéine joue un rôle de soutien et est responsable des qualités rhéologiques du derme, en particulier de sa fermeté et du maintien de son architecture (E.U. KUCHARZ, "The collagens Biochemistry and pathophysiology", Springer Verlag, Berlin 1992). Par ailleurs, il a été montré que les fibroblastes du derme des personnes âgées sécrètent moins de collagène que

ceux des sujets jeunes (M. DUMAS et al, Mech, Ageing Dev. (1994) 73, 179- 187). Ainsi, avec l'âge, se produit une diminution des qualités rhéologiques de la peau et de sa réponse aux contraintes auxquelles elle est soumise quotidiennement. La peau se distend, réagit moins bien aux tensions, perd son tonus et les rides se creusent.

De ce fait, l'action des extraits de Smelophyllum capense sur la synthèse de collagène rend ceux-ci particulièrement utiles pour lutter contre les effets de vieillissement cutané, tels que les rides ou le relâchement des tissus du support cutané, ou pour améliorer la cicatrisation. La présente invention a donc pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle formulation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, présentant une bonne efficacité sur la prévention ou le traitement des effets du vieillissement cutané, ainsi que sur le raffermissement cutané, ou pour améliorer la cicatrisation.

La présente invention a encore pour but principal de résoudre ce nouveau problème technique d'une manière particulièrement simple, satisfaisante et utilisable à l'échelle industrielle, notamment dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne l'utilisa¬ tion d'un extrait de Smelophyllum capense comme agent cosmétique, notamment pour le soin de la peau.

Selon une variante de réalisation de l'invention, on utilise un extrait de Smelophyllum capense, pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, stimulant notamment la synthèse du collagène, en particulier celle du collagène I, et destinée notamment à améliorer la cicatrisation cutanée, à améliorer les propriétés biomécaniques et l'aspect de surface de la peau, à obtenir un raffermissement cutané, à lutter contre les effets du vieillissement cutané ou à traiter les diverses pathologies accompagnées d'une déficience en collagène.

Suivant une variante de réalisation avantageuse, l'extrait de Smelophyllum capense est utilisé pour la préparation d'une composition, à effet anti-vieillissement cutané, en particulier anti-rides, destinée à prévenir l'apparition des rides ou en atténuer la profondeur. Selon une variante de réalisation particulière, l'extrait de

Smelophyllum capense précité est obtenu par extraction par un solvant polaire, tel

qu'un alcool inférieur, choisi avantageusement parmi le méthanol ou un mélange hydro-éthanolique, de préférence à partir de l'écorce de la plante, de préférence encore à partir de l'écorce de racine de cette plante.

En particulier, l'extrait de Smelophyllum capense peut être obtenu selon le procédé décrit ci-après à titre indicatif, mais nullement limitatif.

On effectue une première extraction de l'écorce, de préférence de l'écorce de racine, de la plante, par un solvant polaire, avantageusement choisi parmi le groupe constitué par : l'eau, les alcools comportant de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, les solvants chlorés comportant de préférence 1 à 2 atomes de carbone, les esters organiques comportant de préférence de 3 à 6 atomes de carbone ; ou d'un solvant mixte à base d'un mélange quelconque des solvants précités.

Encore de préférence, le solvant de première extraction est choisi parmi le groupe consistant de l'eau, le méthanol, l'éthanol, un mélange méthanol- eau ou un mélange éthanol-eau, le chloroforme, le dichlorométhane. Encore de préférence, il s'agit de l'eau, du méthanol, de l'éthanol ou de leurs mélanges.

Le rapport de l'écorce à l'agent d'extraction n'est pas critique et généralement sera compris entre 1 : 5 et 1 : 20 parties en poids.

L'extraction s'effectue généralement à des températures comprises entre la température ambiante et le point d'ébuUition du solvant utilisé pour l'extraction.

De préférence, cette première extraction est effectuée au reflux sous pression atmosphérique pendant une durée de 2 à 4 h. En outre, elle est avantageu¬ sement précédée d'une macération à froid pendant 2 à 4 h dans le solvant d'extraction.

En fin d'extraction, la phase du solvant contenant l'extrait est filtrée puis concentrée et/ou évaporée à sec sous pression réduite. On obtient ainsi un premier extrait brut de Smelophyllum capense selon l'invention. Cet extrait brut peut être purifié selon divers procédés bien connus à l'homme de l'art. Selon un second aspect, la présente invention concerne aussi une composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre d'ingrédient actif, une quantité cosmétiquement efficace d'un extrait de Smelophyllum capense de préférence dispersé dans un excipient cosmétiquement acceptable.

Selon une variante de réalisation particulière, cette composition cosmétique stimule la synthèse du collagène, en particulier celle du collagène I, et est destinée notamment à lutter contre les effets du vieillissement cutané, ou à

obtenir un raffermissement cutané. Une telle composition, par exemple, peut avantageusement être utilisée comme composition pour prévenir l'apparition des rides ou en atténuer la profondeur.

Selon un troisième aspect, l'invention concerne encore une composi- tion pharmaceutique, notamment dermatologique, stimulant la synthèse du colla¬ gène, en particulier celle du collagène I, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre d'ingrédient actif, une quantité pharmaceutiquement efficace d'un extrait de Smelophyllum capense dispersé dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition est destinée à améliorer la cicatrisation cutanée ou à traiter les diverses pathologies accompagnées d'une déficience en collagène.

Selon un quatrième aspect, l'invention couvre encore un procédé de traitement cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, caractérisé en ce qu'il comprend l'application d'une quantité cosmétiquement ou pharmaceu¬ tiquement efficace pour un traitement cosmétique ou pharmaceutique d'un extrait de Smelophyllum capense, en particulier dispersé dans un excipient cosmétique¬ ment ou pharmaceutiquement acceptable. Les applications cosmétiques ou pharmaceutiques particulièrement avantageuses actuellement résultent de la description précédente ainsi que de la description suivante en relation avec les exemples, et des revendications. Il en est de même en ce qui concerne la concen¬ tration en extrait.

Dans l'un ou l'autre des aspects précédents, on utilisera de préférence l'extrait de Smelophyllum capense à une concentration comprise entre 0,0001 % et 1 % en poids par rapport au poids total de la composition finale. De préférence, cette concentration est comprise entre 0,01 % et 0,25 % en poids par rapport au poids total de la composition finale.

Egalement dans l'un quelconque des aspects précédents, la composi¬ tion selon l'invention contient de préférence en outre une substance active choisie parmi le groupe constitué par l'acide ascorbique, l'acide madécassique, l'acide asiatique, le madécassoside, l'asiaticoside, l'alpha- 1-protéinase inhibiteur, les inhibiteurs de collagénase, tels que l'acide rétinoïque, les inhibiteurs d'élastase, la lysine, la proline, le 2-oxoglutarate, et le ginsénoside Rrj-

Selon un cinquième aspect, la présente invention concerne également l'utilisation d'un extrait de Smelophyllum capense comme l'un des principes actifs ou l'un des adjuvants d'un milieu de culture de cellules ou de tissus, en particulier

pour la culture en masse de cellules de peau, en particulier de fibroblastes. Avanta¬ geusement, cette utilisation concerne la préparation de peau ou d'un derme artificiel.

L'invention concerne également sous cet aspect un procédé de traitement de fibroblastes en culture par une concentration efficace d'un extrait de Smelophyllum capense pour obtenir une stimulation de la synthèse de collagène, en particulier de collagène I.

Ainsi, dans le cadre de cette culture par exemple pour la préparation de peau artificiel, en particulier de derme artificiel, par culture de cellules, selon les techniques bien connues de l'homme de l'art, on obtient grâce au procédé de l'invention, une peau ou un derme artificiel de très bonne qualité, particulièrement en ce qui concerne les propriétés biomécaniques.

Suivant une variante préférée de mise en oeuvre de l'utilisation ou du procédé de culture, les fibroblastes sont traités par un extrait de Smelophyllum capense à une concentration au moment de la culture comprise entre 0,3 / g/ml et 30 /g/ml de milieu de culture.

Selon une autre variante avantageuse, on peut ajouter au milieu de culture de l'acide ascorbique ou l'un de ses dérivés à une concentration non- cytotoxique, en particulier comprise entre 0,001 mM et 0,5 mM. Selon encore une autre variante avantageuse, on peut ajouter au milieu de culture une ou plusieurs parmi les substances suivantes : L-glutamine, L- lysine, 5-hydroxy-L-lysine, L-proline et 4-hydroxy-L-proline, lesdites substances pouvant être chacune présentes à une concentration comprise entre 2 et 10 mM. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art à partir de la description suivante faite en référence à plusieurs modes de réalisation actuellement préférés de l'invention, ainsi qu'aux exemples qui suivent. Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire.

Exemple 1

Préparation d'un extrait méthanolique d'écorce de racine de Smelophyllum capense

On prépare de la poudre d'écorce de racine de Smelophyllum capense par broyage d'écorces séchées de racine de cette plante provenant de l'Afrique du Sud. On fait ensuite macérer 200 g de cette poudre pendant 2 h dans 2 1 de méthanol. On porte le tout à reflux pendant 3 h, puis on laisse refroidir et on filtre

sur verre fritte. Le filtrat est évaporé à sec. Le résidu, pesant 44,6 g, est repris par 350 ml de méthanol. On effectue une précipitation par ajout dans cette solution de 1,75 1 d'éther éthylique, puis on filtre. Le précipité est ensuite séché sur un agent déshydratant solide tel que P2O5. Une quantité d'environ 27 g de ce précipité est ensuite dialysée pendant 4 jours contre 270 ml d'eau déminéralisée, puis on lyophilise. On obtient ainsi 13,6 g d'extrait selon l'invention dit extrait l .

Exemple 2

Mise en évidence de l'activité d'un extrait méthanolique d'écorce de racine de Smelophyllum capense préparé selon l'exemple 1. extrait Ii . sur la synthèse de collagène par des fibroblastes humains en culture

Culture de fibroblastes

Des cultures de fibroblastes de derme adulte sain sont réalisées en utilisant la méthode par explants à l'aide d'un prélèvement de peau faciale obtenu sur une femme âgée de 60 ans au cours d'un lifting.

Les fibroblastes sont cultivés jusqu'à confluence dans un milieu E 199 (Gibco) supplémenté avec 2 mM de L-glutamine (Gibco) et 10 % en v/v de sérum de veau foetal (Gibco) à 37 ^* C dans une atmosphère à 5 % de CO2 humidifiée. Pour évaluer la teneur en collagène, les cultures primaires en confluence sont récoltées avec une solution à 0,1 % de trypsine et 0,02 % d'EDTA dans une solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à pH 7,2 et les cellules sont alors ensemencées à la densité de 10^ fibroblastes par puits, dans des plaques de microculture (Falcon) à 96 puits, en présence du même milieu de culture que celui décrit ci-dessus. 24 h après l'ensemencement, le milieu est enlevé et remplacé par un milieu de même composition que le milieu décrit précédemment, si ce n'est qu'il ne contient pas de sérum et que l'on a ajouté 25 μM d'acide L-ascorbique sous forme de sel de sodium. En outre, ce nouveau milieu contient ou non le produit à tester (extrait 1^) selon qu'il s'agit d'une culture traitée ou d'une culture témoin. On laisse ensuite incuber pendant une période supplémentaire de 48 h à 37 ^* C. Le produit à tester (extrait I _j ) a été dissous dans le DMSO avant l'incorporation dans le milieu de culture (la concentration finale en DMSO dans le milieu est de 0,1 % en v/v).

Viabilité des cellules A la fin de la période d'incubation, le milieu est enlevé et un test de viabilité de cellules MTT a été réalisé conformément à la publication de Denizot F.

et al. J. Immunol. Methods, (1986) 89, 271-277. Les cellules sont incubées avec lOOμl d'une solution en sel tétrazolium à 0,5 mg/ml (bromure de 3-[4,5- diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium ou MTT) dans le milieu E 199 sans rouge de phénol (Gibco) pendant 3 h à 37 ^* C. Ensuite, 100 μl d'isopropanol sont ajoutés à chaque puits pour solubiliser le dérivé bleu de Formazan sombre formé par les cellules vivantes. On mesure le taux d'absorbance à 540 nm.

Mesure du collagène

La quantité de collagène de type I sécrété par les cellules dans le milieu dépourvu de sérum après 48 h d'incubation avec le mélange ou le composant individuel, est déterminée par un test ELISA comme précédemment décrit dans la publication de Dumas M. et al., Mech. Ageing Dev. (1994) 73, 179-187, et celle de Grimaud J.P. et al., dans : Methods of Enzymatic Analysis (Bermeyer, H.U., éd.), VCH Publishers, einheim, (1986), 186-201. Les milieux d'incubation dépourvus de sérum et les cellules restantes homogénéisées par sonication dans de la glace sont recueillis et transférés dans des puits d'une immunoplaque en plastique (NUNC) pour une incubation de 24 h à +4 ^* C pour permettre l'adhérence du collagène sécrété. Des inhibiteurs de protéase (éthylmaléimide, fluorure de phénylméthylsulfonyle, éthylènediaminetétraacétate, chacun en concentration finale de 1 mM) sont ajoutés pendant cette période. Les plaques sont ensuite réinsérées avec le PBS. Une étape de lavage similaire est réalisée après chaque traitement de plaque.

Après 24 h d'incubation à 4 ^* C avec de la sérum albumine pour éviter une liaison non spécifique, des anticorps de lapin anti-collagène de type I humain (Institut Pasteur, Lyon, France) sont ajoutés pendant 1,5 h à 22 ^* C et les anticorps liés sont mis à réagir avec de l'IgG de chèvre anti-lapin conjugué à de la phosphatase alcaline (Interchim, Montluçon, France). L'absorbance du para- nitrophénol formé à partir de para-nitrophénylphosphate (Sigma) par la phosphatase alcaline est mesuré à 405 nm. Les densités optiques sont converties en nanogramme de collagène en utilisant une courbe étalon établie avec du collagène de type I humain purifié (Institut Jacques Boy, France).

Statistiques

Les taux de collagène (moyenne + SD, déviation standard, n = 6) sont comparés à ceux déterminés sur des cellules non traitées (milieu + L-ascorbate + DMSO) par le test t de Student's avec p < 0,05 comme niveau de significativité.

Résultats

On calcule le pourcentage de stimulation A de la synthèse de colla¬ gène I en comparant les quantités de collagène I sécrétées dans les cultures témoins (ne recevant aucun produit à tester) C ₀ et dans les cultures traitées , à partir de la formule suivante :

Ct - C _r

A = x lOO

-o

L'ensemble des résultats figure au tableau I ci-dessous.

TABLEAU I

*S = significatif NS = non significatif

L'examen du tableau I montre d'abord que le taux de viabilité des cellules dans les cultures traitées n'a pas varié de manière significative par rapport à celui des cultures témoins. L'extrait 1^ ne présente donc pas de cytotoxicité.

Dans ce tableau, on a exprimé les quantités de collagène I sécrétées par les fibroblastes en ng/10000 cellules/48 h. On observera, à partir du tableau I, que l'extrait méthanolique de

Smelophyllum capense a produit une activité significative de stimulation de la synthèse de collagène I par les fibroblastes. Or, il est connu notamment par la

publication de Dumas M. et al., dans : Mech. Ageing Dev. (1994) 7_3_, 179-187, que la quantité de collagène I diminue au cours du vieillissement cutané.

Ainsi, l'extrait de Smelophyllum capense peut être utilisé pour des produits destinés à combattre le vieillissement cutané ou nécessitant une augmentation de synthèse locale de collagène comme cela est le cas lors d'un traitement des rides ou pour contribuer à l'amélioration de la cicatrisation cutanée.

Ainsi, les extraits de Smelophyllum capense peuvent avantageusement être utilisés, grâce à leur propriété de stimulation de la synthèse du collagène, comme agent actif, dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, telles que définies précédemment.

Diverses formulations de compositions cosmétiques sont données ci- après :

Exemple 3 Gel de massage raffermissant cutané

- Extrait d'écorce de racine de Smelophyllum capense 1^ de l'exemple 1 ....0,1 g

- Ethanol 25 g

- Glycérine 2 g

- Propylèneglycol 2 g - Carbopol 940® 1,25 g

- Excipient aqueux avec conservateur éventuellement parfumé .... q.s.p. 100,00 g

Une partie de l'excipient aqueux est utilisée avec le Carbopol pour préparer séparément un gel, l'autre partie de l'excipient aqueux est utilisée pour être mélangée avec les autres composants et le gel est ajouté dans la solution obtenue afin d'obtenir une composition gélifiée formant le gel de massage.

Cette composition de gel de massage peut être utilisée trois fois par semaine pendant deux mois au niveau du buste.

Exemple 4

Lotion de soins du corps pour le raffermissement cutané

- Extrait d'écorce de racine de Smelophyllum capense I _j de l'exemple 1 0,5 g

- Agent solubilisant (Cremophor RH40®) 2 g

- Acide hyaluronique 1 g - Excipient aqueux contenant un conservateur éventuellement parfumé q.s.p. 100,00 g

L'extrait est tout d'abord solubilisé dans l'agent solubilisant, puis est ajouté dans l'excipient aqueux auquel on ajoute l'acide hyaluronique.

La lotion obtenue peut être utilisée par cure de trois semaines sur les zones sensibles au relâchement, telles que le ventre, les cuisses.

Exemple 5 Emulsion antiride

- Extrait d'écorce de racine de Smelophyllum capense Ij de l'exemple 1 0,10 g

- Excipient émulsionné parfumé q.s.p. 100,00 g

Exemple 6 Composition cicatrisante

- Extrait d'écorce de racine de Smelophyllum capense l\ selon l'exemple 1 0,5 g

- Excipient émulsionné, type eau dans l'huile q.s.p. 100,00 g

Exemple 7

Crème raffermissante et embellissante

- Extrait d'écorce de racine de Smelophyllum capense Ij de l'exemple 1 ....0,05 g

- Asiaticoside 0,1 g - Phosphate d'ascorbyle (sel de magnésium) 0,05 g

- Glycocéramides végétaux 0,05 g

- Palmitate de vitamine A 0,01 g

- Conservateurs 0,05 g

- Excipients émulsionnés q.s.p. 100,00 g

Cette crème, appliquée deux fois par jour, restaure les qualités de fermeté, d'élasticité ainsi que les propriétés de barrière cutanée et l'éclat d'une peau jeune.