Die Erfindung betrifft kosmetische und dermatologische Zubereitungen, die eine Kombination aus Lävulinsäure und Anissäure umfassen. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen eignen sich insbesondere zur Anwendung auf der Haut. Die Zubereitungen zeigen eine selektive antibakterielle Wirkung auf der Haut, indem sie gezielt anaerobe Bakterien der Hautflora be kämpfen, während sie nur geringe oder keine bakterizide Wirkung gegen aerobe Bakterien aufweisen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich demgemäß zur kosmetischen Hautpflege sowie auch zur dermatologischen Behandlung bestimmter Hauterkrankungen, wie z.B. Akne.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Mikrobiom der menschlichen Haut ist eine komplexe Mischung verschiedener Gruppen von Mikroorganismen: anaerobe Bakterien, wie Cutibacterium acnes (C. acnes), besiedeln die Haut in unmittelbarer Nachbarschaft zu aeroben Bakterien, wie Staphylococcus epidermidis ( S . epidermidis) und Staphylococcus hominis ( S . hominis) sowie Pilzen.

Es ist bekannt, dass die Wechselwirkungen zwischen S. epidermidis und C. acnes für die Hautgesundheit von besonderer Bedeutung ist. S. epidermidis ist ein aerob wachsendes, kugelförmiges, grampositives Bakterium, das Katalase-positiv und Koagulase-negativ ist. Bei C. acnes handelt es sich um ein anaerob wachsendes, grampositives Bakterium. Es wird vermutet, dass beide Mikroorganismen auf gesunder Haut in einem verhältnismäßig stabilen Gleichgewicht Vorkommen und eine Störung dieses Gleichgewichts, eine sogenannte Dysbiose, sich negativ auf den Zustand der Haut auswirken kann, indem Hautunreinheiten oder sogar Hauterkrankungen ausgelöst oder deren Entwicklung zumindest begünstigt wer den. Es ist daher für die Behandlung oder Vorbeugung gegen solche Hautunreinheiten oder Hauterkrankungen von besonderer Bedeutung, Mittel bereitzustellen, mithilfe derer das Ver hältnis von anaeroben zu anaeroben Mikroorganismen der Hautflora, und insbesondere das Verhältnis von S. epidermidis und C. acnes, gezielt verändert werden können. Da insbeson dere das verstärkte Wachstum von anaeroben Bakterien, wie beispielsweise P. acnes, mit der Entwicklung von Hauterkrankungen einhergehen kann, werden insbesondere Zuberei tungen benötigt, die selektiv gegen anaerobe Bakterien wirksam sind.

Die Anissäure ist eine methoxylierte Benzoesäure (4-Methoxybenzoesäure), die bakteriosta tisch und der darüber hinaus eine anti-inflammatorische sowie auch fungizide Wrkung bei- gemessen wird. Anissäure wird u.a. in kosmetischen Produkten als Konservierungsmittel verwendet, um die Kontamination der Produkte durch Bakterien oder Pilze zu vermeiden. Zu diesem Zweck wird Anissäure diesen Produkten in einer Menge von 0,05-0,3 % zugesetzt.

Die Lävulinsäure, auch 4-Oxopentansäure oder 4-Oxovaleriansäure genannt, ist eine chemi sche Verbindung, die zu den g-Ketosäuren gehört. International deklariert als "Levulinic Acid" ist die Säure und ihre Salze auf dem Gebiet der Hautpflege zum einen als Duftstoffzusatz gefragt, da ihr typischer Geruch angenehm an Karamell oder Vanille erinnert. Bekannt ist darüber hinaus eine antibakterielle und fungizide Wirkung von Lävulinsäure. Dies macht die sen Stoff auch als Hautpflegemittel bei unreiner Haut interessant. Da Lävulinsäure nicht als Konservierungsmittel deklariert ist, kann sie ideal zur Konservierung von natürlichen Kosme tika verwendet werden. Eine Verwendung der Lävulinsäure als Konservierungsmittel in kos metischen Produkten ist hinreichend beschrieben worden, wobei die Substanz den zu kon servierenden Produkten in einer Menge von 0, 3-1,0% zugesetzt wird.

Konservierungsmittel in Kosmetika werden regelmäßig eingesetzt, um das Produkt vor Kon taminationen mit Bakterien und Pilzen zu schützen. Die mikrobiologische Stabilität von Kos metika ist ein entscheidender Faktor für die Haltbarkeit und den gesundheitlichen Schutz der Verbraucher. In der europäischen Kosmetikverordnung sind Konservierungsstoffe als Stoffe definiert, die ausschließlich oder überwiegend dafür eingesetzt werden, um die Entwicklung von Mikroorganismen in kosmetischen Mitteln zu hemmen. Die hierfür zugelassenen Stoffe sind in der entsprechenden Positivliste in Anhang V der EU KVO aufgeführt.

Die Verwendung von Anissäure und Lävulinsäure als Konservierungsmittel ist im Stand der Technik beschrieben worden. EP 1 541 124 A2 beschreibt eine synergistische Wirkung zwi schen zwei zur Konservierung verwendeten Wirkstoffen, nämlich Anissäure und C6-14- Fettsäuremonoglyceride. Die Mischung soll eine antimikrobielle Aktivität aufweisen, die sich zur Konservierung von kosmetischen Formulierungen nutzen lässt. In den Formulierungen entsteht somit ein breites antimikrobielles Mittel bei gleichzeitig guter Hautverträglichkeit. In der EP 2 735 301 A1 wird die Kombination von Lävulinsäure, dem Natriumsalz der Lävulin säure (Natriumlävulinat) und Anissäure zur Konservierung eines Kosmetikprodukts offenbart.

Während Anissäure und Lävulinsäure sich bei der Konservierung von Kosmetikprodukten umfänglich bewiesen haben, ist jedoch eine Verwendung dieser Substanzen zur gezielten Veränderung der Zusammensetzung der Hautflora bislang nicht bekannt. Wie oben erläutert besteht ein Bedürfnis nach kosmetischen und dermatologischen Zusammensetzungen, die zur Verbesserung des allgemeinen Zustands und der Gesundheit der Haut beitragen, indem sie gezielt in die Zusammensetzung der Hautflora eingreifen. Gleichzeitig sollen die Zusammensetzungen eine gute Hautverträglichkeit aufweisen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass Anissäure in Kombination mit Lävulinsäure verwendet werden kann, um selektiv die Konzentration von anaeroben Bakterien in der Hautflora, insbesondere C. acnes, zu verringern. Die Erfindung betrifft folglich die Verwendung einer Kombination aus Anissäure und Lävulinsäure zur Re duktion anaerober Bakterien und gleichzeitiger Bewahrung aerober Bakterien auf der Haut. Die erfindungsgemäße Kombination erlaubt so nach der Applikation auf die Haut die Entfal tung einer selektiven antibakteriellen Wirkung auf der Haut.

Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt eine Zusammensetzung für die gezielte Verän derung der Hautflora, wobei die Zusammensetzung folgendes umfasst:

(i) Anissäure oder ein antimikrobiell wirksames Salz davon, und

(ii) Lävulinsäure oder ein antimikrobiell wirksames Salz davon.

Genuss gemessen Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise Anissäure. Können jedoch auch Salze der Anissäure verwendet werden, sofern diese eine ausreichende antimikrobielle Wirksamkeit aufweisen. Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Salze der Anissäure weisen vorzugsweise eine antimikrobielle Aktivität auf, die zu mindes tens 50% der Aktivität der Anissäure in einem entsprechenden in vitro Assay entspricht. Dies bedeutet, dass bei Verwendung gleicher Mengen der Anissäure und des Salzes der Anissäu re zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität in einem in vitro Assay das Salz der Anis säure im Vergleich zur Anissäure mindestens die Hälfte der antimikrobiellen Aktivität aufwei sen muss. Geeignete Salze für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Natrium- und Kalium-Anisat.

Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Salze der Lävulinsäure weisen vorzugsweise eine antimikrobielle Aktivität auf, die zu mindestens 50% der Aktivität der Lävulinsäure in einem entsprechenden in vitro Assay entspricht. Dies bedeutet, dass bei Verwendung gleicher Mengen der Lävulinsäure und des Salzes der Lävulinsäure zur Be stimmung der antimikrobiellen Aktivität in einem in vitro Assay das Salz der Lävulinsäure im Vergleich zur Lävulinsäure mindestens die Hälfte der antimikrobiellen Aktivität aufweisen muss. Geeignete Salze für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Natrium- und Kalium-Lävulinat.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung für die gezielte Ver änderung der Hautflora, wobei die Zusammensetzung

(i) mehr als 0,3% (Gew./Gew.) Anissäure oder ein antimikrobiell wirksames Salz davon, und

(ii) mehr als 1,0% (Gew./Gew.) Lävulinsäure oder ein antimikrobiell wirksames Salz da von.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung mindes tens 0,5% (Gew./Gew.) Anissäure oder ein antimikrobiell wirksames Salz davon, und min destens 1,5% (Gew./Gew.) Lävulinsäure oder ein antimikrobiell wirksames Salz davon. So beträgt die Menge der Anissäure oder des Anissäuresalzes in der Zusammensetzung vor zugsweise mindestens 0,75%, mindestens 1,0%, mindestens 1,5%, mindestens 2,0%, min destens 2,5%, mindestens 3,0%, mindestens 3,5%, mindestens 4,5% oder mindestens 5,0% (Gew./Gew.). Die Menge der Lävulinsäure oder des Lävulinsäuresalzes in der Zusammen setzung beträgt vorzugsweise mindestens 2,0%, mindestens 2,5%, mindestens 3,0%, min destens 3,5%, mindestens 4,5% oder mindestens 5,0% (Gew./Gew.).

Anders ausgedrückt umfasst die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorzugswei se zwischen 0,5 und 5,0% (Gew./Gew.) Anissäure oder ein antimikrobiell wirksames Salz davon, und zwischen 1,5 und 5,0% (Gew./Gew.) Lävulinsäure oder ein antimikrobiell wirk sames Salz davon. Besonders bevorzugt ist eine Zusammensetzung, die zwischen 1,0 und 4,0% (Gew./Gew.) Anissäure oder Anissäuresalz und zwischen 2,0 und 4,0% (Gew./Gew.) Lävulinsäure oder Lävulinsäuresalz umfasst. Noch stärker bevorzugt ist eine Zusammenset zung, die zwischen 1,5 und 3,0% (Gew./Gew.) Anissäure oder Anissäuresalz und zwischen 2,0 und 3,0% (Gew./Gew.) Lävulinsäure oder Lävulinsäuresalz umfasst. Noch stärker bevor zugt ist eine Zusammensetzung, die zwischen 2,0 und 3,0% (Gew./Gew.) Anissäure oder Anissäuresalz und zwischen 2,5 und 3,0% (Gew./Gew.) Lävulinsäure oder Lävulinsäuresalz umfasst.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können als einheitliche Formulierung vorlie gen oder aber als Komponenten, die unmittelbar vor der Anwendung auf der Haut miteinan der kombiniert werden. Im letztgenannten Fall sind die obigen Mengenangaben auf die Zu sammensetzung anzuwenden, die sich aus der Kombination der Komponenten unmittelbar vor der Applikation ergibt. Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst sind Zusam- mensetzungen bei den die beiden antimikrobiell wirksamen Komponenten, nämlich die Anis säure oder das Salz davon und die Lävulinsäure oder das Salz davon als getrennte Formu lierungen vorliegen, die nacheinander auf die Haut aufgetragen werden. So können die bei den antimikrobiell wirksamen Komponenten zeitlich versetzt im Abstand von etwa 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 20 Minuten, 24 Minuten oder 30 Minuten auf die Haut aufgetragen werden.

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Formen vor liegen. So sind z.B. eine Lösung, eine Suspension, eine Emulsion vom Typ Wasser-in-ÖI (W/O) oder vom Typ Öl-in-Wasser (O/W), oder eine multiple Emulsionen, beispielsweise vom Typ Wasser-in-ÖI-in-Wasser (W/O/W) oder Öl-in-Wasser-in-ÖI (O/W/O), eine Hydrodis- persion oder Lipodispersion, oder auch ein Aerosol bevorzugte Zubereitungsformen. Vor zugsweise liegt die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Emulsionen vor, die neben den antimikrobiell wirksamen Komponenten weitere Substanzen enthält, wie z.B. Fette, Öle, Wachse und/oder andere Fettkörper, sowie Wasser und einen oder mehrere Emulgatoren, wie sie üblicherweise für einen solchen Typ der Formulierung verwendet werden. Solche Emulsionen können in vorteilhafter Weise als Creme oder Lotion formuliert sein. Es ist darü ber hinaus auch möglich und vorteilhaft, die erfindungsgemäßen Kombinationen aus Anis säure und Lävulinsäure in wässrige Systeme bzw. Tensidzubereitungen zur Reinigung der Haut und/oder der Haare einzubringen.

Es ist dem Fachmanne natürlich bekannt, dass kosmetische und therapeutische Zusammen setzungen zumeist nicht ohne die üblichen Hilfs- und Zusatzstoffe denkbar sind. Dazu zählen beispielsweise Konsistenzgeber, Füllstoffe, Duftstoffe, Farbstoffe, Emulgatoren, zusätzliche Wirkstoffe wie Vitamine oder Proteine, Lichtschutzmittel, Stabilisatoren, Insektenrepellentien, Alkohol, Wasser, Salze, sowie auch antimikrobiell, proteolytisch oder keratolytisch wirksame Substanzen usw., sofern deren Einsatz die antimikrobielle Aktivität der erfindungsmäßen Kombination nicht signifikant inhibiert oder anderweitig zu Wider läuft.

Die erfindungsgemäßen Kombinationen aus Anissäure und Lävulinsäure können in vorteil hafter Weise in übliche kosmetische und dermatologische Zubereitungen eingearbeitet, wel che wiederum in verschiedenen Formen vorliegen können. Die Zusammensetzungen können beispielsweise als Creme, Lotion, Gel, Salbe, Paste oder fester Stift vorliegen.

Die oben beschrieben Zusammensetzungen eignen sich in besonderer Weise für die nicht therapeutische, kosmetische und/oder für die therapeutische Behandlung der Haut, insbe sondere der Gesichtshaut eines Menschen. In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine wie oben beschriebene Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfah- ren zur Behandlung einer Hauterkrankung. Bei der Hauterkrankung handelt es sich vorzugs weise um eine Dermatitis. Die Behandlung von Akne ( Acne vulgaris) mit den oben vorliegend Zusammensetzungen ist besonders bevorzugt. Die therapeutische Wirkung der erfindungs gemäßen Zusammensetzungen ergibt sich in vorteilhafter Weise aus der gezielten Verände rung der Konzentration von anaeroben Bakterien auf der Haut. Die Konzentration dieser an aeroben Bakterien wird verringert, wobei die Konzentration von anaeroben Bakterien im glei chen Habitat nicht oder nicht wesentlich verringert wird. Dadurch ergibt sich eine Verschie bung des Verhältnisses von anaeroben zu aeroben Bakterien auf der Haut, und insbesonde re eine Verschiebung des Verhältnisses von C. acnes zu S. epidermidis.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich ferner auch für eine nicht therapeutische, kosmetische Verwendung. Eine solche nicht-therapeutische, kosmetische Verwendung kann der selektiven Verringerung der Anzahl der anaeroben Bakterien auf der Haut dienen, und insbesondere der selektiven Verringerung der Anzahl C. acnes. Auf diese Wiese können Hautunreinheiten beseitigt oder vermieden werden. Insbesondere können Verstopfungen von Talgdrüsen, wie sie z.B. bei Komedonen Vorkommen, vermieden werden. Die nicht-therapeutische, kosmetische Verwendung kann damit das optische Erscheinungs bild der Haut erheblich verbessern. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ferner auch die nicht-therapeutische Verwendung einer wie oben definierten erfindungsge mäßen Zusammensetzung der Zubereitung zur Hautpflegehaut bei Akne.

Die Zusammensetzungen können im Rahmen der therapeutischen oder der nicht-therapeu tischen, kosmetischen Behandlung ein- oder mehrfach auf die Haut aufgetragen werden. In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für die tägliche Applikation auf die Haut formuliert. In einer alternativen Ausführungsform sind die erfin dungsgemäßen Zusammensetzungen für die einmalige Applikation auf die Haut formuliert. Überraschend wirkt die Kombination aus Anissäure und Lävulinsäure in den erfindungsge mäßen Zusammensetzungen selektiv, d.h. die anaeroben Bakterien wie C. acnes werden auf der Haut reduziert und die aeroben Bakterien, wie S. epidermidis, werden nicht oder nicht wesentlich angegriffen.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen liegt in der hohen antimikrobiellen Selektivität. Die Zusammensetzungen führen gezielt zu einem signifikanten Rückgang der Zellzahl von anaeroben Bakterien, welche die Haut besiedeln, insbesondere C. acnes. Gleichzeitig wirken die Zusammensetzungen nicht oder nur geringfügig hemmend auf A aeroben Bakterien, insbesondere S. epidermidis, deren Anzahl auf der Haut nicht in signifi kantem Umfang verringert wird. Wie in den nachstehend beschriebenen Beispielen erläutert und in den Abbildungen 1-2 gezeigt wird, führt die Verwendung der erfindungsgemäßen Zu- sammensetzungen zu einem Rückgang von 90% der anaeroben Bakterien, während die aeroben Bakterien sich im untersuchten Zeitraum sogar weiter vermehrten.

Es wird vorliegend bevorzugt, dass die Anzahl von anaeroben Bakterien in einem bestimm ten Hautareal nach Aufträgen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung um mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, oder mindes tens 95% im Vergleich zur Zellzahl im betreffenden Hautareal vor Aufträgen der Zusammen setzung zurückgeht. Es ist darüber hinaus bevorzugt das die Anzahl von aeroben Bakterien in diesem Hautareal geleichzeitig um höchstens 25%, höchstens 20%, höchstens 15%, höchstens 10%, höchstens 5%, oder weniger im Vergleich zur Zellzahl im betreffenden Hautareal vor Aufträgen der Zusammensetzung zurückgeht.

Es wird vorliegend besonders bevorzugt, dass die Anzahl von C. acnes in einem bestimmten Hautareal nach Aufträgen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung um mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, oder mindestens 95% im Vergleich zur Zellzahl im betreffenden Hautareal vor Aufträgen der Zusammen setzung zurückgeht. Es ist darüber hinaus bevorzugt das die Anzahl von S. epidermidis in diesem Hautareal geleichzeitig um höchstens 25%, höchstens 20%, höchstens 15%, höchs tens 10%, höchstens 5%, oder weniger im Vergleich zur Zellzahl im betreffenden Hautareal vor Aufträgen der Zusammensetzung zurückgeht.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wurde in verschiedenen Untersuchungen gezeigt, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden. In einem Test wurden dazu Bakterien von der Wange mittels Abstrichtechnik gewonnen und aerob und anaerob (d.h. bei reduziertem Sauerstoffgehalt) inkubiert. Nach 14 Tagen Anwendung wurden erneut Bakterien von den Probanden entnommen. Nach der Auswertung aller Probandendaten zeigte sich ein überaschendes Bild. Bei den aerob kultivierten Bakterien zeigten sich keine Auffäligkeiten, während es bei den anaerob kultivierten Bakterien schon nach einer Woche zu einer eine signifikanten Reduktion von mehr als 90% der Bakterienzellzahl kam. In weiteren in vitro Untersuchungen konnte dieses selektive Verhalten bestätigt werden.

BEISPIELE

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen, ohne sie einzu schränken. Alle Mengenangaben, Anteile und Prozentanteile sind, soweit nicht anders an gegeben, auf das Gewicht und die Gesamtmenge bzw. auf das Gesamtgewicht der jeweili gen Zubereitungen und Zusammensetzungen bezogen. Beispiel 1: Herstellung von Bakteriensuspensionen und Wachstumsversuche

S. epidermidis (DSM 1798) wurde aus einem Kryoröhrchen (EN 12353) entnommen, auf einer CASO-Agarplatte ausgestrichen und bei 37°C 24 h inkubiert. Anschließend wurde eine zweite Passage angelegt. Mit der zweiten Passage wurden 10 ml BHI-Medium und 5 g Glas perlen (4 mm Durchmesser) angeimpft und 3 min geschüttelt. Danach wurde dieser Ansatz auf eine OD600 von 0,1 eingestellt und anschließend 1:10 mit Verdünnungsmittel verdünnt. Diese Bakteriensuspension wurde anschließend für den Growth-Assay eingesetzt.

Test- Wachstumsversuch mit S. epidermidis

In jedes Well einer 24-Well-Platte wurden 10mI_ Bakteriensuspension gegeben und komplett trocknen lassen (mind. 45 min unter der Sterilwerkbank). Nach der Trocknung wurden 10mg der zu untersuchenden Formulierung (siehe Tabelle 1) aufpipettiert und mittels T-Spatel im Well verteilt. Die Kontrolle blieb unbehandelt. Die Platte wurde für die Inkubationsdauer (6h / 24h) im Feuchtebrutschrank bei 37°C und 90% Luftfeuchtigkeit ohne Deckel gelagert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde in jedes Well 500pL Abspülpuffer gegeben und 1min im Ultraschallbad abgespült. 100pL des erhaltenen Überstandes wurden zu 900pL Neutralisati onsmittel gegeben und anschließend auf CASO-Agar mittels Spiralplater ausplattiert. Die Agarplatten wurden bei 37°C für 24h inkubiert, und die Kolonien wurden anschließend mit dem l+L Countermat ausgezählt.

C. acnes (DSM 1897) wurde aus einem Kryoröhrchen (EN 12353) auf einer Agarplatte (COST-Agar) ausgestrichen und bei 37°C 5 Tage in der anaeroben Box inkubiert. Mit dieser Kultur wurden 10 ml anaeroben Medium im CELLSTAR CELLreactor - Röhrchen angeimpft und 18h in der anaeroben Box inkubiert. Danach wurde dieser Ansatz auf eine OD600 von 0,5 eingestellt und anschließend 1:10 mit anaerobem Medium verdünnt. Diese Bakterien suspension wurde anschließend für den Growth-Assay eingesetzt.

Test - Wachstumsversuch mit C. acnes

In jedes Well einer 24-Well-Platte wurden 10pL Bakteriensuspension gegeben und komplett trocknen lassen (mind. 45min unter der Sterilwerkbank). Nach der Trocknung wurden 10mg der zu untersuchenden Formulierung (siehe Tabelle 1) aufpipettiert und mittels T-Spatel im Well verteilt. Die Kontrolle blieb unbehandelt. Die Platte wurde für die Inkubationsdauer (6h / 24h) ohne Deckel in einer anaeroben Box (mit Zellstoff ausgelegt + 50m L Wasser) im Brut- schrank bei 37°C gelagert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde in jedes Well 500mI_ Ab spülpuffer gegeben und 1min im Ultraschallbad abgespült. 100mI_ des erhaltenen Überstan des wurden zu 900mI_ Neutralisationsmittel gegeben und anschließend auf COST-Agar mit tels Spiralplater ausplattiert. Die Agarplatten wurden bei 37°C für 5 Tage inkubiert, und die Kolonien wurden anschließend mit dem l+L Countermat ausgezählt.

Im Rahmen der Auswertung wurde der Reduktionsfaktor bestimmt. Der Reduktionsfaktor ist der Faktor, um den die Zellzahl (CFU) der unterschiedlichen Zeitpunkte im Vergleich zur T0- Kontrolle oder untereinander reduziert wird.

CFU (Kontrolle)

= Reduktionsfaktor CFU (Testsubstanz)

Das Studiendesign ist so ausgelegt, dass eine antibakterielle Wirksamkeit der Testformulie rungen durch Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nachgewiesen wird.

Tabelle 1: getestete Formulierungen und Ergebnisse der Wachstumsversuche

Die Auszählung zeigte, dass die Anzahl der aeroben S. epidermidis Bakterien durch die Formulierung, welche Anissäure und Lävulinsäure enthielten, nicht oder nicht wesentlich beeinträchtigt wurde. In den Ansätzen von S. epidermidis wurden nur geringe Reduktionsfak- toren gemessen. Hingegen wurde die Anzahl der anaeroben C. acnes Bakterien durch die Formulierungen signifikant reduziert

Beispiel 2: ATA-Test

Der ATA Test dient der Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit von kosmetischen Formulierungen nach 2x täglicher Anwendung. Die Testdauer beträgt i.d.R. 1 Woche. Die Anwendung der Testformulierung und die Messung der Wrksamkeit erfolgen in dem ver braucherrelevanten Areal, der Wange. Zielgröße ist die Keimzahl der aeroben und anaero ben Bakterien.

Alle Probanden haben eine Vorkonditionierung von 3 Tagen mit einem vorgegebenen Waschgel durchlaufen. Nach Abspülen der Wangen wird die in Tabelle 1 beschriebene "Testformulierung 5" nach Vorschrift aufgetragen. Anschließend erfolgt ein Abstrich mittels eines Floq Swabs. Es werden 3 x 10 Striche auf einer 5 cm x 5 cm großen Fläche der Wan ge in einem definierten Muster abgestrichen. Das Muster des Abstrichs ist in Abbildung 3 dargestellt. Während der Probenabnahmezyklen wird der Floq-Swab in einem Abspülpuffer getränkt, und nach der dritten Probennahme verbleibt der Swab im Abspülpuffer. Die Lösung wird direkt verdünnt und jede Probe wird mittels Spiralplater auf 2 Agar-Platten ausplattiert. Der Abstrich wird dann zu den entsprechend vorgegebenen Zeitpunkten, meistens nach 1 Woche, wiederholt. Zum Schluss wurde die eine Hälfte der Agar-Platten bei 37°C 5 Tage unter Ausschluss von Sauerstoff bebrütet und die andere Hälfte der Agar-Platten bei 37°C über 24h bebrütet. Anschließend wurden die Agar-Platten mit Hilfe des Countermats ausge wertet.

Die Ergebnisse des ATA-Tests sind in den Abbildungen 1 und 2 gezeigt. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der anaeroben Kultivierung. Es ist zu erkennen, dass die Zellzahl der anae roben Bakterien durch Behandlung mit der Testformulierung, die eine Kombination aus Anis säure und Lävulinsäure enthält, deutlich zurückgegangen ist. Eine solche Verringerung der Zellzahl ist in Abbildung 2, welche die Ergebnisse der aeroben Kultivierung zeigt, nicht zu erkennen. Vielmehr konnte hier sogar eine Zunahme der Zellzahl verzeichnet werden. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen somit eindrucksvoll die selektive Wrksamkeit der erfindungs gemäßen Kombination aus Anissäure und Lävulinsäure.

Beispiel 3: Suspensions-Tests Die Wirkung der erfindungsgemäßen Formulierungen wurde in Suspensionstests mit S. epidermidis und C. acnes weiter untersucht. Glycerin-Stammkulturen von S. epidermidis (DSM 1798) und C. acnes (DSM 1897), die nach der europäischen Norm 12353 angelegt worden waren, wurden im Kühlschrank bei 5°C gelagert. Aus diesen flüssigen Stammkultu ren wurde eine erste Passage hergestellt. Hierbei wurde mittels steriler Einmalimpföse die entsprechende Kultur auf einer Agarplatte (C. acnes : COST-Agar, S. epidermidis·. COAST- Agar) ausgestrichen und anschließend bebrütet. Die Kulturen von C. acnes wurden für 5 Tage bei 37°C bebrütet, während die Kulturen von S. epidermidis für 24 h bei 37°C bebrütet wurden. Aus dieser ersten Passage wurde anschließend eine zweite Passage hergestellt, in dem man einige Kolonien mit einer sterilen Einmalimpföse aufnimmt und diese anschließend auf eine neue Agarplatte ausstreicht. Diese zweite Passage wurde anschließend für 5 Tage bzw. 24h bei der entsprechenden Temperatur bebrütet. Die erhaltene zweite Passage wurde anschließend für den Suspensionstest eingesetzt.

Zur Herstellung der Suspensionen wurden einige Kolonien der zweiten Passage mit einer sterilen Impföse abgenommen und zu 10ml_ Medium in ein Schikanekolben mit 5g Glasper len (0 4mm) gegeben und 3min leicht geschüttelt. Anschließend wurde mittels optischer Dichte (OD) die ungefähre Zellzahl pro ml_ eingestellt. Die optische Dichte wurde mit dem Eppendorf Photometer bei 600 nm bestimmt. Die erhaltene OD wurde auf einen Wert um 0,8 (±0,01) eingestellt werden und anschließend nochmals 1:50 verdünnt. Mit dieser Verdün nungsstrategie erhielt man eine Zellzahl von etwa 1x10 ⁶ .

Jeweils 50mI_ der antimikrobiellen Rohstofflösung und 450mI_ Medium wurden für die Test formulierungen in sterilisierten Eppendorf Reaktionsgefäßen vorgelegt (C. acnes: Anaero- ben-Medium, S. epidermidis·. BHI-Medium). Für die Positivkontrolle wurden 500mI_ Medium vorgelegt. Nach Zugabe von 500mI_ der hergestellten Kultursuspension wurden zu verschie denen Zeitpunkten 1:10-Verdünnungen aller Proben hergestellt (nach 1h, 3h, und 6h). Für die Positivkontrolle wurde zusätzlich direkt nach der Kulturzugabe (0min) eine Verdünnung hergestellt und mittels Spiralplatter ausplattiert. Über die gesamte Testdauer wurden die Proben in einem Eppendorf-Schüttler bei 1000rpm und 30°C bzw. 37°C gelagert. Für die 1:10-Verdünnungen wurden 900mI_ Neutralisationsmedium in Eppendorf Reaktionsgefäßen vorgelegt und zu den Abnahmezeitpunkten wurden 100mI_ der Kultur-Rohstoff-Suspension dazu gegeben. Nachdem der Test abgeschlossen war, wurden alle Agarplatten zum Bebrü ten in den Brutschrank eingelagert und nach der Inkubation am Countermat ausgewertet.

Die Ergebnisse werden in den Abbildungen 4 und 5 gezeigt. Es ist zu erkennen, dass die Verwendung von Anissäure, Lävulinsäure oder einer Kombination beiden Substanzen das Wachstum des aeroben Bakteriums S. epidermidis nicht signifikant beeinträchtigt. Bei dem anaaeroben Bakterium C. acnes hingegen führt zwar die alleinige Verwendung von Anissäu re oder Lävulinsäure nicht zu einer Verringerung der Zellzahl. Allerdings führt die kombinierte Verwendung zu einer signifikanten selektiven antimikrobiellen Wirkung.