OBJETO DE LA INVENCION

La invención que se propone se refiere a un nuevo producto cosmético con propiedades reparadoras y rejuvenecedoras de la piel que incluye en su composición factores de crecimiento de origen vegetal, además de antioxidantes, péptidos antiarrugas y células madre y que tiene su aplicación en el sector de los centros de belleza, cosmética y dermatología.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Se conocen hasta la fecha muchas preparaciones cosméticas que tienen efectos de rejuvenecimiento y reparación de la piel pero no se conocen preparaciones que incluyan liposomas con ingredientes activos como factores de crecimiento de origen vegetal de gran pureza junto con antioxidantes liposomados, péptidos antiarrugas y células madre.

DESCRIPCION DE LA INVENCION El producto que la invención propone consiste en una preparación liposomada en la que los liposomas incorporan, como principios activos fundamentales, factores de crecimiento de origen vegetal de gran pureza y antioxidantes, además de incluir sin liposomar péptidos antiarrugas y células madre.

Los factores de crecimiento son proteínas naturales que estimulan el crecimiento, la proliferación y la diferenciación celular. Juegan un papel importante en el mantenimiento de una estructura de piel sana, al intervenir en la comunicación entre los células epidérmicas y dérmicas mediante la unión a receptores específicos en la superficie de la célula.

Es bien conocido que los factores de crecimiento juegan un papel importante para revertir los efectos del envejecimiento de la piel, la aplicación tópica en personas de factores de crecimiento se ha demostrado que actúa a nivel local y estimula la renovación celular, la reducción de las arrugas y el aumento de la síntesis de colágeno.

La principal ventaja del producto de la presente invención es que se trata de unos factores de crecimiento de origen vegetal de alta pureza, que al incorporarlos en liposomas, se mejora su penetración a través de la piel y su estabilidad al evitar su degradación como proteínas que son.

Entre los factores de crecimiento de origen vegetal incluidos en la composición encontramos los factores HGH (human growth hormone) Nicotiana benthamiana Sh- Polipéptido-7, GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor) Nicotiana benthamiana Sh-Polipéptido-45 y TGFb2 (Tumor growth factor beta 2) Nicotiana benthamiana Hexapéptido-40 Sh-Polipéptido-76.

Nicotiana benthamiana Sh-Polipéptido-7 es una única cadena de péptido humano recombinante, producida de forma transitoria en la expresión en plantas de Nicotiana benthamiana. El gen de partida es una copia sintetizada del gen humano que codifica para la hormona de crecimiento (GH) utilizados como tales o adaptado al huésped. Contiene un máximo de 197 aminoácidos. La proteína consiste en la secuencia apropiada de los 20 amino ácidos estándar.

Nicotiana benthamiana Sh-Polipéptido-45 es una única cadena de péptido humano recombinante, producida de forma transitoria en la expresión en plantas de Nicotiana benthamiana. El gen de partida es una copia sintética del gen humano que codifica para el factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrofagos utilizado como tal o adaptado para la producción del huésped. Contiene un máximo de 127 aminoácidos que puede contener enlaces disulfuro y / o glicosilación. La proteína consiste en la secuencia apropiada de los 20 amino ácidos estándar. Nicotiana benthamiana Hexapéptido-40 sh-Polipéptido-76 contiene dos cadenas polipeptídicas idénticas unidas por un enlace disulfuro simple. Son producidas de forma transitoria en la expresión en plantas de Nicotiana benthamiana. El gen de partida es una copia sintética del gen humano que codifica para el factor de crecimiento transformante beta 2 utilizado como tal o adaptado para la producción del huésped. Contiene un máximo de 237 aminoácidos que puede contener enlaces disulfuro y / o glicosilación. La proteína consiste en la secuencia apropiada de los 20 amino ácidos estándar.

Por otra parte entre los antioxidantes liposomados que se incluyen en la composición encontramos ergotioneina, quercetina y pterostilbeno y, entre los péptidos antiarrugas, también liposomados, podemos encontrar extracto de Centella asiática, palmitoil tripéptido-3 y caprooil tetrapéptido-3.

Finalmente el producto incorpora también como principio activo sin liposomar extracto de células madre de Malus doméstica.

En los ensayos realizados, cuyos datos se exponen más adelante, se comprueba que estos factores de crecimiento en forma de liposomas mantienen la misma actividad que el factor en forma libre, pero se mejora su penetración a través de la piel y su estabilidad.

REALIZACION PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Como realización preferente se propone un producto cosmético liposomado, que presenta distintas formas cosméticas como crema nutritiva, solución, serum, emulsión, suspensión etc. en el que los diferentes componentes se pueden encontrar en el caso de la crema en las siguientes proporciones de ingrediente activo y de liposomas:

Otra realización preferente es en el caso del serum donde los diferentes ingredientes se encuentran en las siguientes proporciones:

ESTUDIOS CLÍNICOS Y DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DEL FACTOR LIBRE VERSUS EL FACTOR ENCAPSULADO EN FIBROBLASTOS DE PIEL Y QUERATINOCITOS HUMANOS

Factores analizados:

- Factores GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor), HGH (human growth hormone), TGFb2 (Tumor growth factor beta 2) y Follistatina.

- Factores GM-CSF, HGH, TGFb2 y Follistatina encapsulados en liposomas. GM-CSF y HGH 50 mg/ml lípidos, 400 ng/ml factor

TGFb2 y Follistatina 50 mg/ml lípidos, 200 ng/ml factor

Métodos utilizados:

- Proliferación Celular

- Síntesis de colágeno/elastina mediante PCR cuantitativa

- Migración

- Efecto anti-inflamatorio mediante PCR cuantitativa ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR (MTT) Este ensayo se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato- deshidrogenasa en un compuesto coloreado de color azul (formazan), permitiendo determinar la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas. Este método ha sido muy utilizado para medir supervivencia y proliferación celular.

La cantidad de células vivas es proporcional a la cantidad de formazán producido. Este método fue desarrollado por Mosmann en 1983 siendo modificado en 1986 por Francois Denizot y Rita Lang.

Metodología

1. Utilizando tripsina disociar las células y resuspenderlas en medio de cultivo suplementado (10 % de Suero fetal bovino y antibiótico).

2. Determinar el número de células requeridas por pocilio utilizando una cámara Neubauer (HaCaT: 5.000 cels/pocillo de 96, 30.000 cels/pocillo de 24; HSF:

4.000 cels/pocillo de 96, 30.000 cels/pocillo de 24)

3. Se incuban a 37 °C y 5 % de C02 durante 24 horas para permitir su adherencia.

4. Se preparan las mezclas de factor libre y liposomado a las concentraciones indicadas, se retira el medio y se añaden.

5. Se incuban a 37 °C y 5 % de C02 durante 72 horas.

6. Se añade MTT (1.9 mg/ml) en solución PBS (25 ul totales) sobre el medio

7. Se incuba por 3 horas a 37 °C para permitir la formación de cristales de formazán.

8. Luego se elimina el sobrenadante y se añaden 100 de DMSO.

9. Se incuba por 30 minutos a 37 °C para permitir que los cristales de formazan sean disueltos

10. La lectura de densidad óptica (DO) se realiza en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm.

El porcentaje de Viabilidad se obtiene de la siguiente forma:

% Viabilidad = DO células tratadas x 100/ DO células control

ENSAYO WOUND-HEALING (MIGRACIÓN CELULAR)

El ensayo de cierre de "herida" (wound healing assay) tiene como objetivo el estudio de la migración celular. Se basa en la observación del comportamiento de una monocapa confluente de células a la que previamente se le ha realizado una brecha o "herida". Las células en el borde de la brecha se moverán hacia la abertura hasta establecer nuevos contactos célula célula, cerrando así la "herida".

Los pasos básicos implican la creación de la "herida" o área libre de células en la monocapa celular, la captura de imágenes de manera periódica durante el experimento y la comparación de todas las imágenes para determinar la velocidad de migración de las células.

Metodología

1. Se cultivan las células hasta confluencia (100% aprox) en placas de 6 pocilios (HaCaT: 500.000 cels/pocillo de 6; HSF: 500.000 cels/pocillo de 6)

2. Se incuban a 37 °C y 5 % de C02 durante 24 horas.

3. Raspado de las heridas (2 "heridas" por pocilio de trayectoria horizontal, utilizando puntas estériles amarillas (P200). Se arrastrarán por la monocapa con un ángulo de inclinación de 30 grados (no perpendiculares a la placa) y guiándose con un trazo previamente marcado. Marcar tres puntos de toma de medidas.

4. Dejar reposar unos 15 minutos antes de añadir el tratamiento.

5. Se preparan las mezclas de factor libre y liposomado a concentración 1 ng/ml, retira el medio y se añaden.

6. Se incuban a 37 °C y 5 % de C02 durante 72 horas.

7. Se toman medidas a tiempos 0, 24, 48 y 72 horas.

El porcentaje de migración se obtiene de la siguiente forma:

Migración =( Medida tiempo 0-Medida tiempo X / Medida tiempo 0) * 100

ANALISIS DE EXPRESION GENICA MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL. ENSAYO EXPRESION DE ESLASTINA Y CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS

La PCR a tiempo real o PCR cuantitativa es una variación de la PCR estándar utilizada para la cuantificación de DNA o de RNA mensajero (mRNA) de una muestra. Utilizando primers específicos de secuencia, es posible determinar el número de copias o la cantidad relativa de una determinada secuencia de DNA o RNA. Cuando la PCR a tiempo real se combina con una reacción de retro-transcripción o RT (RTPCR), puede determinarse la cantidad de mRNA de una muestra mediante una cuantificación relativa. Dicha cuantificación se denomina relativa si se compara entre diferentes muestras la cantidad relativa o relación del mRNA de un gen específico respecto a la cantidad de mRNA de un gen constitutivo (control endógeno, GAPDH en nuestro caso). Es lo que se denomina como normalización de la expresión del gen específico, o normalizar respecto a la diferente concentración de RNA total de las muestras, ya que si la cantidad de control endógeno varía es debido a cambios en la cantidad de RNA total empleada en la síntesis de cDNA, no a cambios en su expresión. Para la cuantificación, se mide en cada ciclo de PCR la cantidad de amplicón producido. La cuantificación del producto se produce mediante la adición de fluoróforos que se unen al amplicón de forma cuantitativa, de forma que a mayor producto mayor fluorescencia se emitirá.

El método de cuantificación que hemos utilizado es el AACt, en el que se comparan directamente los Cts del gen testado y gen de referencia (ACt) en cada muestra, y posteriormente se comparan los ACt de la muestras experimental con respecto a la muestra control, para aplicar dicho método es necesario que las eficiencias de ambos genes sean similares. Metodología

1. Utilizando tripsina disociar las células y resuspenderlas en medio de cultivo suplementado (10 % de Suero fetal bovino y antibiótico).

2. Determinar el número de células requeridas por pocilio utilizando una cámara Neubauer (HaCaT: 9.000 cels/pocillo de 96; HSF: 9.000 cels/pocillo de 96) 3. Se incuban a 37 °C y 5 % de C02 durante 24 horas para permitir su adherencia.

4. Se preparan las mezclas de factor libre y liposomado a las concentraciones indicadas, se retira el medio y se añaden.

5. Se incuban a 37 °C y 5 % de C02 durante 72 horas.

6. Extracción de ARN utilizando el kit: E.Z.N.A.® Total RNA (Omega Bio-Tek, Inc., United States) siguiendo las indicaciones del fabricante. El ARN aislado se guardó a - 80 °C hasta su uso. Un microgramo de RNA, estimado por el espectrofotómetro NanoDrop 200 c (Thermo FisherScientific Inc.) se usó para obtener ADNc usando la transcriptasa reversa M-MLV (Invitrogen) según los procedimientos tradicionales.

7. Los ensayos de PCRq se hicieron usando el sistema ABI PRISM 7300 (Applied

Biosystems, NJ, USA) y SYBR green. Las reacciones fueron llevadas a cabo en un volumen de 20 μΙ, en el que había 2 μΙ de ADNc, 900 nM de cada primer, 200 nM de sonda, y 10 μΙ de la master mix universal TaqMan (Applied Biosystems) o SYBR green. Las condiciones de los ciclos fueron de 50 °C por 2 min y 95 °C for 10 min, seguidos de 40 ciclos a 95 °C por 15 s y 60 °C por 1 min. La expresión se analizó por el método de 2-DCt donde ACt es determinado sustrayendo el valor del Ct del gen GAPDH, usado como control endógeno, al valor del Ct objetivo.

RESULTADOS 1. PROLIFERACIÓN CELULAR

1.1. PROLIFERACIÓN CELULAR CON HGH

En la figural , se puede observar que, en queratinocitos humanos, tanto el factor libre como el liposomado generan una proliferación celular del 20-40 % por encima de las células sin tratar (que indican el 100% de proliferación), a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml). Sin embargo a concentraciones superiores a 1 ng/ml se observa una alta disminución de la viabilidad celular con el factor liposomado, pero no con el factor libre, que mantiene la proliferación celular alrededor del 20% por encima de las células sin tratar. Por otro lado, los liposomas no inducen proliferación a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml), aunque si una alta disminución de la viabilidad celular a concentraciones superiores o iguales a 1 ng/ml.

Por otro lado en la figura2, se puede observar que, en fibroblastos humanos, el factor libre no genera proliferación, manteniéndose alrededor del 100%. Sin embargo a concentraciones superiores a 1 ng/ml se observa una alta disminución de la viabilidad celular con el factor liposomado, pero no con el factor libre, que se mantiene alrededor del 100%. Por otro lado, los liposomas inducen una disminución de la viabilidad celular (20%) a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml), y una alta disminución de la viabilidad celular a concentraciones superiores o iguales a 1 ng/ml.

1.2. PROLIFERACIÓN CELULAR CON GM-CSF

En la figura 3, se puede observar que, en queratinocitos humanos, tanto el factor libre como el liposomado generan una proliferación celular del 20% por encima de las células sin tratar (que indican el 100% de proliferación), a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml). Sin embargo a concentraciones superiores a 1 ng/ml se observa una alta disminución de la viabilidad celular con el factor liposomado, pero no con el factor libre, que mantiene la proliferación celular alrededor del 20% por encima de las células sin tratar. Por otro lado, los liposomas no inducen proliferación a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml), aunque si una alta disminución de la viabilidad celular a concentraciones superiores o iguales a 1 ng/ml.

Por otro lado en la figura 4, se puede observar que, en fibroblastos humanos, el factor libre y el factor liposomado generan una proliferación celular del 100% por encima de las células sin tratar (que indican el 100% de proliferación), a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml). Sin embargo a concentraciones superiores a 1 ng/ml se observa una disminución de la viabilidad celular del 50- 60% con el factor liposomado, pero no con el factor libre, que mantiene la proliferación celular alrededor del 60% por encima de las células sin tratar. Por otro lado, los liposomas no inducen proliferación a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml), aunque si una disminución de la viabilidad celular del 50-60% a concentraciones superiores o iguales a 1 ng/ml.

1.3. PROLIFERACIÓN CELULAR CON FOLLISTATIN

En la figura 5, se puede observar que, en fibroblastos humanos, tanto el factor libre como el liposomado generan una proliferación celular del 60-70% por encima de las células sin tratar (que indican el 100% de proliferación), a concentraciones bajas (0,01 ng/ml). Sin a la concentración de 0,5 ng/ml, el factor libre genera una proliferación del 40%, mientras que el factor liposomado no genera proliferación. Por otro lado, a concentraciones superiores a 1 ng/ml se observa una disminución de la viabilidad celular con el factor liposomado del 50%, pero no con el factor libre, que mantiene la proliferación celular alrededor del control. Por otro lado, los liposomas no inducen proliferación a concentraciones bajas (0,01 ng/ml - 0,5 ng/ml), aunque si una disminución de la viabilidad celular a concentraciones superiores a 0.5 ng/ml.

MIGRACIÓN CELULAR (WOUND HEALING)

2.1. MIGRACIÓN CELULAR CON HGH

En la figura 6 se observa una rápida velocidad de reparación de la herida con el factor libre en queratinocitos humanos, ya que a las 24h del tratamiento la herida se había cerrado en un 40% más rápido que en las células control, y a las 48h ya estaba completamente cerrada. Sin embargo se observa que el factor liposomado dificulta el cierre de la herida, cerrándose más lentamente que en las células control. Sin embargo, en la figura 7 se observa que en fibroblastos humanos apenas se aprecia diferencia en la velocidad de reparación de la herida entre las células tratadas con factor libre y las células control.

2.2. MIGRACIÓN CELULAR CON GM-CSF

En la figura 8 se observa un ligero incremento en la velocidad de reparación de la herida en queratinocitos humanos con respecto a las células control, ya que a las 24h del tratamiento la herida se había cerrado un 13% más rápido que el control, y a las 48h ya estaba completamente cerrada. Sin embargo se observa que el factor liposomado dificulta el cierre de la herida, cerrándose más lentamente que en las células control. Por otro lado, en la figura 9 se observa que en fibroblastos humanos las células tratadas con factor libre muestran una mayor velocidad de reparación de la herida, un 20% más rápido, con respecto al control. Sin embargo, al igual que en los demás casos, el factor liposomado dificulta el cierre de la herida, cerrándose más lentamente que en las células control.

Cabe destacar que los resultados obtenidos con los ensayos de migración son similares a los obtenidos en los ensayos de proliferación celular y por lo tanto los corroboran.

INDUCCIÓN DE SÍNTESIS DE ELASTINA, MEDIANTE LA MEDICIÓN DE TRANSCRITOS DEL GEN DE LA ELASTINA POR PCR CUANTITATIVA

3.1. INDUCCIÓN DE SÍNTESIS DE ELASTINA POR HGH

En las figuras 10 y 11 se observa un aumento en la síntesis de elastina en las células tratadas tanto con el factor libre como con el factor liposomado con respecto a las células control (indicado por la línea horizontal = valor 1), tanto en fibroblastos como en queratinocitos. Este aumento es dosis-dependiente, incrementándose según se aumenta la concentración del factor.

3.2. INDUCCIÓN DE SÍNTESIS DE ELASTINA POR GM-CSF

En las figuras 12 y 13 se observa un aumento en la síntesis de elastina en las células tratadas tanto con el factor libre como con el factor liposomado con respecto a las células control (indicado por la línea horizontal = valor 1), tanto en fibroblastos como en queratinocitos. Este aumento es dosis-dependiente, incrementándose según se aumenta la concentración del factor. 4. ANÁLISIS DEL EFECTO ANTI-INFLAMATORIO, MEDIANTE LA MEDICIÓN DE TRANSCRITOS DE LOS GENES ANTI-INFLAMATORIOS IL6 Y TNFa, POR PCR CUANTITATIVA

En este ensayo a las células se les indujo una inflamación leve con LPS antes del tratamiento. Para ello se les añadió medio con LPS a 200ng/ml, durante tres horas, se retiró y se añadió el medio con los factores.

4.1. ANÁLISIS DEL EFECTO ANTI-INFLAMATORIO INDUCIDO POR HGH En las figuras 14 y 15 se observa una disminución de la inflamación, es decir de los niveles de tránscritos de TNFa e IL6, en las células tratadas con el factor libre o con el factor liposomado después de habérsele inducido una inflamación previa con LPS (barras c LPS). Estos resultados nos indican el efecto anti-inflamatorio del factor HGH, tanto libre como liposomado. Esta disminución es dosis- dependiente, incrementándose según se aumenta la concentración del factor.

4.2. ANÁLISIS DEL EFECTO ANTI-INFLAMATORIO INDUCIDO POR GM- CSF

En las figuras 16 y 17 se observa una disminución de la inflamación, es decir de los niveles de tránscritos de TNFa e IL6, en las células tratadas con el factor libre o con el factor liposomado después de habérsele inducido una inflamación previa con LPS (barras c LPS). Estos resultados nos indican el efecto anti-inflamatorio del factor GM-CSF, tanto libre como liposomado. Esta disminución es dosis- dependiente, incrementándose según se aumenta la concentración del factor.

Una vez descrita suficientemente la naturaleza de la presente invención, solamente queda por añadir que dicha invención puede sufrir ciertas variaciones en los componentes y porcentajes, siempre y cuando dichas alteraciones no varíen sustancialmente las características que se reivindican a continuación: