UTILISATION COSMETIQUE D'UN EXTRAIT D'AVOINE EN TANT QU'AGENT ACTIVATEUR DE LA CASPASE-14 La présente invention se situe dans le domaine de la cosmétique. Elle se rapporte à une méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'un extrait d'avoine (Avena sativa L), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, qui active l'expression de la caspase-14 au niveau cutané, et plus particulièrement pour prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, en particulier liés au photovieillissement.

Les signes visibles du vieillissement sont en partie attribués à la prédisposition génétique et en partie aux facteurs environnementaux de l'individu et autres facteurs de stress associés au mode de vie.

La principale fonction de la peau, qui est l'organe le plus grand du corps humain, est de protéger l'organisme contre un grand nombre de ces facteurs, notamment extérieurs. A titre d'exemple, on peut citer des facteurs tels que la pollution, la surexposition au soleil, ou encore l'utilisation de produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs ou les parfums, ou des facteurs mécaniques, telles que les abrasions, le rasage ou l'épilation. Par pollution, on entend aussi bien la pollution « extérieure » due par exemple aux particules de diesel, à l'ozone ou aux métaux lourds, que la pollution « intérieure » qui peut être due notamment aux émissions de solvants de peintures, de colles, ou de papier-peints (tels que toluène, styrène, xylène ou benzaldéhyde), ou bien encore le tabagisme ou l'exposition à la fumée de cigarette. La sécheresse de l'atmosphère est également une cause importante d'agression cutanée.

Ces facteurs aboutissent à une altération de la fonction barrière de la peau, qui se traduit par un inconfort cutané, des phénomènes sensoriels désagréables, tels que des tiraillements ou des démangeaisons, voire des fragilités excessives et des rougeurs.

Par ailleurs, ces facteurs participent à l'accélération du vieillissement dit « extrinsèque » de la peau. En effet, le vieillissement extrinsèque est dû à des facteurs environnementaux auxquels est soumis l'organisme tout au long de sa vie, facteurs l'on regroupe sous le terme d'agressions extérieures. Les personnes ayant la peau claire sont plus particulièrement sensibles aux effets nocifs des agressions extérieures, en particulier aux rayonnements ultraviolets du soleil. Cette barrière que représente la peau, est constituée par plusieurs couches composées de cellules de natures diverses qui permettent d'assurer à la peau son renouvellement continuel. Ce processus de renouvellement passe avant tout par un phénomène de desquamation des cellules qui se trouvent à la surface de la peau, phénomène qui doit être compensé par le renouvellement de Pépiderme assuré par les kératinocytes de la couche basale qui se divisent activement et se différencient en cellules de la couche cornée ou cornéocytes. Ces activités de renouvellement, mais aussi de réparation de la peau dans le cas de dommages tels que les rayonnements UV, sont extrêmement contrôlées par un ensemble de voies de signalisation. Parmi ces voies de signalisation, l'une d'entre elles fait intervenir une protéase, la caspase-14. La caspase-14 est un membre unique au sein de la famille des caspases. En effet, contrairement aux autres membres de la famille des caspases qui sont exprimés de façon ubiquitaire, la caspase-14 est uniquement exprimée et active dans l'épiderme et est absente de la plupart des autres tissus adultes (Eckart et al., J. Invest. Dermatol., 2000, 44 :425-432). Il a notamment été prouvé le rôle crucial de la caspase-14 dans la formation de la barrière que forme l'épiderme (Denecker et al, Nat. Cell. Biol. 2007, 9 : 666-674). En effet, celle-ci est exprimée et exerce son activité protéolytique seulement dans les couches de l'épiderme où ont Heu la différenciation et la « cornification », ainsi que dans le follicule pileux (Lippens et al., Cell Death Differ., 2000, 10 :257-259). De plus, il a été prouvé que la caspase-14 joue un grand rôle en particulier dans les processus de maintien de l'hydratation, de formation des cornéocytes, et de protection contre l'apoptose, notamment lors d'agressions extérieures comme celles dues aux rayonnements UV (Denecker et al., J. Cell Biology, 2008, 451-458).

L'ensemble de ces conclusions ont, entre autre, conduit à l'élaboration de compositions pharmaceutiques comprenant la caspase-14 en tant qu'agent actif, utilisables plus particulièrement en tant qu'écran solaire (WO2008025830).

Cependant, il n'existe aucun composé facile à mettre en œuvre, permettant d'activer la caspase-14, et présentant une activité cosmétique pour prévenir et/ou réparer les dommages au niveau de la peau, principalement liés au photo-vieillissement et, plus particulièrement, protéger la peau contre les rayonnements UV, alors que le besoin de soin innovant de ce type existe.

C'est ainsi que la Demanderesse a découvert et mis en évidence qu'un extrait d'avoine (Avena sativa L.), est un bon agent activateur de la caspase-14, et a une action significative sur la protection de la peau contre les agressions extérieures telles que les rayonnements UV, grâce notamment, à une fonction de protection et de réparation de l'ADN des cellules cutanées.

L'extrait d'avoine (Avena sativa L.) utilisé selon l'invention offre notamment les avantages suivants :

- il active la caspase-14 ;

- il permet de conserver l'hydratation de l'épiderme et optimise le rôle de barrière de l'épiderme ; et

- il prévient et répare les dommages de l'ADN des cellules de la peau soumises à des rayonnements UV, en particulier UVB.

La présente invention a pour objet une méthode de soin cosmétique pour prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'un extrait d'avoine {Avena sativa L.), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, qui active l'expression de la caspase-14 au niveau cutané.

L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description.

L'avoine est une plante annuelle appartenant au genre Avena cultivée comme céréale ou comme fourrage. Les protéines de l'avoine, riches en tryptophane, participent à la production de sérotonine et mélatonine chez l'Homme. Aussi, l'avoine contient de nombreux antioxydants comme les avénanthramides, les tocophérols et les tocotriénols (Bryngelsson et al, 2002). Pour réaliser l'extraction, on peut utiliser la plante entière ou une partie spécifique de l'avoine (feuilles, graines, etc.). Plus particulièrement selon l'invention, on utilise les graines de l'avoine.

L'extrait d'avoine (Avena sativa L.) utilisé selon l'invention est préférentiellement un extrait peptidique provenant de l'hydrolyse des protéines extraites des graines d'avoine.

Il est possible, pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier ensuite les composés peptidiques ainsi obtenus. Selon la présente invention, un composé peptidique désigne les fragments de protéines, les peptides et les acides aminés libres présents dans l'extrait issu de l'hydrolyse.

Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'extrait d'avoine selon l'invention. Préférentiellement, l'extrait d'avoine est obtenu par extraction des protéines, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des composés peptidiques. A titre d'exemple, dans une première étape, les graines d'avoine sont broyées à l'aide d'un broyeur à plantes. Avantageusement, la poudre ainsi obtenue est ultérieurement "délipidée" à l'aide d'un solvant organique classique, comme par exemple un alcool, l'hexane ou l'acétone.

On réalise ensuite l'extraction des protéines de l'avoine suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié ; le broyât de graines d'avoine est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0,01 - 20%) ; en effet, il a été observé que les opérations d'hydrolyses et de purifications ultérieures étaient facilitées par ce moyen. En particulier, la concentration en substances de type phénolique, interagissant avec les protéines, se trouve nettement réduite. Les protéines peuvent ensuite être précipitées en faisant varier la force ionique en acidifiant le milieu, ce qui permet d'éliminer les composants solubles et les acides nucléiques. Le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant organique tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant et constitue alors une forme plus purifiée de l'hydrolysat.

L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide toujours en présence de polyvinylpolypyrrolidone. Après une étape de filtration, l'étape de précipitation s'effectue alors à l'aide d'un agent classique de précipitation tel que les sels (chlorure de sodium, sulfate d'ammonium) ou un solvant organique (alcool, acétone). Le précipité obtenu peut être séparé des agents de précipitation par dialyse après remise en solution dans de l'eau ou un autre solvant.

La fraction soluble, contenant les protéines, des glucides et éventuellement des lipides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. Cette solution brute est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des composés peptidiques solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique.

Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.). Pour les mêmes raisons que précédemment, c'est-à-dire l'élimination des substances polyphénoliques, une quantité de polyvinylpolypyrrolidone est additionnée au milieu réactionnel lors de cette étape d'hydrolyse ménagée. Après fïltration, la solution obtenue constitue une première forme avantageuse d'extrait peptidique d'avoine selon l'invention.

L'extrait peptidique d'avoine peut être encore purifié afin de sélectionner les poids moléculaires et la nature des peptides générés. Le fractionnement peut s'effectuer avantageusement par ultrafiltration et/ ou par une méthode de type chromatographique.

L'utilisation d'extraits peptidiques, et en particulier d'extraits peptidiques de bas poids moléculaires, présente de nombreux avantages en cosmétique. Outre le fait de générer des composés peptidiques qui ne préexistaient pas dans le mélange protéique de départ extrait, l'hydrolyse et la purification permettent d'obtenir un mélange de composés peptidiques plus stables, plus facilement standardisables et ne provoquant pas de réactions allergiques en cosmétique.

L'extrait peptidique d'avoine préféré selon l'invention comprend essentiellement des composés peptidiques de bas poids moléculaires, c'est-à-dire ne comprend avantageusement que des peptides de bas poids moléculaire. Préférentiellement, il comprend essentiellement des composés peptidiques de poids moléculaire inférieur à 5 kDa, c'est-à-dire avantageusement l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention ne comprend que des peptides dont le poids moléculaire est inférieur à 5 kDa.

L'extrait d'avoine obtenu selon l'invention est analysé qualitativement et quantitativement pour ses caractéristiques physico-chimiques et sa teneur en composés peptidiques ; les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier.

Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine a un pH compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6, et comprend entre 0,5 et 8 g/1 de composés peptidiques en poids d'extrait sec et entre 0,5 et 5 g/1 de sucres en poids d'extrait sec, préférentiellement l'extrait d'avoine selon l'invention est dilué pour contenir entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés peptidiques en poids d'extrait sec et entre 2 et 5 g/1 de sucres en poids d'extrait sec.

L'extrait d'avoine selon l'invention, et plus particulièrement l'extrait peptidique d'avoine, active la caspase-14 après application au niveau cutané. Selon l'invention, l'extrait d'avoine augmente la quantité de caspase-14, soit par augmentation de la synthèse protéique de celle-ci (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique), soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation des transcrits d'ARN messager.

Ainsi, l'objet de l'invention se rapporte à une méthode de soin cosmétique pour prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'un extrait d'avoine selon l'invention, dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, qui active l'expression de la caspase-14 au niveau cutané. Les dommages subis par l'ADN cellulaire chez l'Homme se réparent tous les jours, mais pas tous. Les dégâts non réparés vont alors s'accumuler au fil des ans. Il est ainsi essentiel de prévenir ces dommages et de les réparer.

Par prévenir les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, on désigne le rôle protecteur de l'extrait d'avoine selon l'invention au niveau des cellules de la peau pour limiter l'apparition de dommages au niveau de l'ADN.

Par réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, on désigne le rôle réparateur de l'extrait d'avoine selon l'invention au niveau de l'endommagement préalablement subi par les cellules de la peau.

Les cellules cutanées selon l'invention désignent les cellules de l'épiderme et du derme, et en particulier les kératinocytes.

Les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées selon l'invention désignent les dommages dus à des réactions photochimiques entre les bases de l'ADN, comme par exemple la formation de dimères pyrimidiques de cyclobutane ou encore tout autre dommage subi par l'ADN lors d'agressions extérieures que peut produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer des agressions telles que la pollution, les rayonnements UV, en particulier UVB, liés par exemple à une surexposition au soleil, ou encore les produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs ou les parfums.

La méthode de soin cosmétique selon l'invention vise préférentiellement à prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées qui sont liés au photovieillissement et induits par des rayonnements UV, en particulier les UVB, et ainsi prévenir et/ou retarder l'apparition des signes cutanés du photo-vieillissement.

Les dommages non réparés ainsi subis par l'ADN des cellules cutanées liés au photovieillissement, entraînent un vieillissement prématuré de la peau, qui ne deviennent souvent visibles que lorsque la personne a déjà passé le cap des 20 ans mais qui s'accentuent avec le temps.

Ils prennent principalement la forme de rides, notamment de ridules autour de la bouche et des yeux, et d'hyperpigmentation, notamment sous forme de taches brunes bénignes qui peuvent être disséminées sur le corps et en particulier sur le front, le nez et les joues. Dans le cadre des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition comprenant l'extrait d'avoine et un milieu physiologiquement acceptable est appliquée topiquement sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps.

Un milieu physiologiquement acceptable selon l'invention désigne en particulier des milieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères humains, sans risque par exemple de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, ou encore de réponse allergique.

A cet effet, l'une quelconque des formes plus ou moins purifiées de l'extrait d'avoine selon l'invention est alors solubilisée dans de l'eau ou dans tout mélange contenant de l'eau, puis stérilisée par ultrafiltration.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants physiologiquement acceptables, classiquement utilisés par l'homme du métier, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine selon l'invention est solubilisé dans un vecteur cosmétique comme les liposomes, ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement adapté.

De manière préférée, la composition selon l'invention destinée à être appliquée de façon topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps se présente sous forme de crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, microémulsion, gel aqueux ou anhydre, sérum, ou encore de dispersion de vésicules, de patch, de spray, d'onguent, de pommade, de lotion, de colloïde, de lait, de lotion, de stick ou de poudre.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine selon l'invention est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0001% à 20% environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05% et 5% environ, encore plus préférentiellement à une concentration comprise entre 1% et 3% environ par rapport au poids total de la composition finale.

Encore plus préférentiellement, la composition selon l'invention contient en outre, au moins un autre agent actif, préférentiellement un agent favorisant l'action de l'extrait d'avoine selon l'invention. On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : d'autres agents actifs peptidiques, des extraits de végétaux, des agents cicatrisants, anti-âge, antirides, apaisants, anti-radicalaires, anti-UV, des agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique, des agents hydratants, antibactériens, antifongiques, anti-inflammatoires, anesthésiques, des agents modulants la différenciation, la pigmentation ou la dépigmentation cutanée, des agents stimulants la pousse des ongles ou des cheveux etc. Préférentiellement, on utilisera un agent présentant une activité dans le domaine des antirides, tel qu'un agent anti- radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique. Plus particulièrement, l'agent actif est choisi parmi les vitamines, les phytostérols, les flavonoïdes, la DHEA et/ou un de ses précurseurs ou un de ses dérivés chimiques ou biologiques, un inhibiteur de métalloprotéinase, ou un rétinoïde.

En outre, des additifs tels que des solvants, des diluants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des absorbeurs d'odeurs, des agents épaississants, émulsifiants, humectants, émollients, des parfums, des antioxydants, des agents filmogènes, chélatants, séquestrants, conditionnants, peuvent être ajoutés à la composition selon l'invention.

Dans tous les cas, l'homme du métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition comprenant l'extrait d'avoine selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, être compris entre 0,01% et 20% du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5% à 80% en poids et de préférence de 5% à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés dans une proportion allant de 0,3% à 30% en poids par rapport au poids total de la composition.

Enfin, dans un mode préférentiel de réalisation des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition est appliquée le matin en tant que soin anti-âge de jour et/ou le soir au coucher en tant que soin réparateur de nuit. En cas d'application en soin de jour, la composition permet en particulier une protection de la peau vis-à-vis des agressions de l'environnement, notamment les rayonnements UV, en particulier UVB, en limitant l'apparition de dommages au niveau de l'ADN des cellules cutanées. En tant que soin de nuit, la composition joue plus particulièrement un rôle de réparation des éventuels dommages que la peau aura subie lors de la journée.

Dans un autre mode de réalisation avantageux des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition est appliquée avant une exposition de la peau au soleil, et constitue donc un excellent soin avant-soleil permettant en particulier de prévenir les dommages au niveau de l'ADN des cellules cutanées, et/ou après une exposition au soleil, en tant que soin après-soleil afin de réparer plus particulièrement les éventuels dommages subis par la peau au niveau de l'ADN.

Les exemples suivants décrivent et démontrent l'efficacité d'un extrait d'avoine tel que décrit selon l'invention mais ne doivent pas être interprétés comme une limitation de la présente invention.

Exemple 1 : préparation d'un extrait peptidique d'avoine (Avena sativa LA

Les graines d'avoine (Avena sativa L.) sont mises en solution dans 10 volumes d'eau en présence de 2% de POLYCLAR® 10 (polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble). Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 8 avec une solution aqueuse de soude 1 M. Une précipitation en milieu acide est ensuite réalisée. Le culot est remis en solution et après ajustement du pH, de la bromélaïne à 2% est ajoutée dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 50°C. On procède ensuite à l'inactivation de l'enzyme par chauffage de la solution à 80°C pendant 2 heures. Après centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à un hydrolysat brut d'avoine est récupérée.

Le procédé de purification de Phydrolysat brut commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0,2 μπι) afin d'obtenir une solution beige brillante et limpide, qualifié d'hydrolysat.

A cette étape, l'hydrolysat d'avoine ainsi obtenu est caractérisé par un extrait sec titrant de 10 à 15 g/kg, un taux de protéines de 8 à 12 g/1 et un taux de sucres de 2 à 4 g/1.

La nature protéique de cet hydrolysat est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). L'hydrolysat protéique d'avoine est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE® LDS. Une solution de NuPAGE® Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites ne se réoxydent durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE® MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie® R-250. Dans ces conditions, on observe que les protéines obtenues ont un poids moléculaire inférieur à 40 kDa.

Cet hydrolysat est ensuite purifié afin d'éliminer les protéines de poids moléculaire supérieur à 10 kDa, à l'aide de filtrations à flux tangentiel. Pour cela, l'hydrolysat est pompé sous pression à travers un support Pellicon® équipée de cassette Pellicon® 2 Biomax 10 kDa. Le filtrat récupéré est encore élué à travers une cassette Pellicon® 2 Biomax 5 kDa. En fin de purification, on obtient un hydrolysat peptidique brillant et limpide comprenant uniquement des composés peptidiques de poids moléculaire inférieur à 5 kDa. On procède ensuite à une phase de dilution afin d'obtenir un hydrolysat peptidique caractérisé par une teneur en composés peptidiques de 1,5 à 3,5 g/1. Cet hydrolysat peptidique correspond à l'extrait d'avoine actif préféré selon l'invention. Exemple 2 : étude de l'expression de la caspase-14 dans des kératinocvtes humains normaux, en présence de l'extrait peptidique d'avoine selon l'exemple 1

Le but de cette étude est de déterminer l'expression de la caspase-14 dans des kératinocytes humains normaux traités ou non à l'aide d'un extrait peptidique d'avoine selon l'invention.

Protocole :

Des kératinocytes humains normaux, KHN, en culture sont traités avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1 à 1 % ou à 3 % pendant 24 h. Les cellules sont ensuite lavées, fixées au paraformaldéhyde 3,7% avec triton 0,1% en présence de BSA (dilué au l/100ième). Les cellules sont incubées en présence d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de la caspase-14 (BD Biosciences), puis d'un anticorps secondaire, couplé à un marqueur fluorescent. Les cellules sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope).

Résultats :

On observe une augmentation de l'intensité lumineuse dans les cellules KHN traitées avec l'extrait peptidique par rapport à la condition contrôle. Cette augmentation de fluorescence est dose-dépendante puisqu'elle est plus importante lorsque l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est dosé à 3 % qu'à 1 %. Par conséquent, l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention active l'expression de la caspase-14 dans les KHN. Exemple 3 : étude de l'expression de la caspase-14 par siRNA dans des KHN traités avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1

Afin de quantifier l'efficacité d'un extrait peptidique d'avoine selon l'invention sur la surexpression de la caspase-14 dans une population de KHN, le gène codant pour la caspase-14 a été « éteint » par utilisation de la technique du siRNA.

Protocole :

Des cellules KHN sont mises en culture en plaque 6 puits jusqu'à une confluence de 60 % puis traitées avec 20 ΐ. d'extrait peptidique selon l'exemple 1 à 1 %. Ensuite, 100 μΐ, d'un mélange préalablement réalisé contenant le siRNA de la caspase-14 et l'agent transfectant sont rajoutés délicatement au goutte à goutte, puits par puits. La plaque de culture cellulaire est incubée à 37°C et à 5 % en C02 pendant 72 h. Le milieu de culture est renouvelé tous les 2 jours. Quatre conditions sont mises en place :

- condition 1 : contrôle sans siRNA et sans extrait peptidique ;

- condition 2 : cellules transfectées avec le siRNA, sans extrait peptidique ;

- condition 3 : cellules non transfectées mais traitées avec l'extrait peptidique ;

- condition 4 : cellules transfectées avec le siRNA et traitées avec l'extrait peptidique.

La quantification de l'expression de la caspase-14 est observée par la technique classique d'immunotransfert (Western Blot) réalisée à l'aide d'un anticorps anti-caspase- 14 et selon un protocole classique. Afin d'analyser la compensation apportée par le peptide dans les KHN ayant été transfectés avec le siRNA, la comparaison sera faite par rapport à des KHN non traités et dont le gène n'a pas été éteint par siRNA.

Résultats :

Entre les conditions 1 et 3, on constate que l'ajout de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 a entraîné une augmentation d'environ 1/5 de l'expression de la protéine caspase-14 par rapport au contrôle. Entre les conditions 1 et 2, on constate bien l'effet du siRNA sur l'expression de la protéine caspase-14 : en effet, celle-ci est en baisse d'environ 1/3. Par contre, l'ajout de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 aux cellules transfectées avec le siRNA permet de restaurer l'expression de la caspase-14, et la baisse due à la présence de siRNA n'est plus que d'environ 1/6 par rapport à la condition contrôle.

En conclusion, l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention a permis d'augmenter l'expression de la caspase-14 dans les KHN. Exemple 4 : test comètes sur des cellules KHN

Le test comètes est un test qui permet de quantifier les dommages causés à l'ADN au niveau cellulaire.

Protocole :

Dans ce but, des cellules KHN sont :

- condition a : mises en culture pendant 24 h avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1 à une concentration de 1 % et de 3 %, puis irradiées avec des rayonnements UVB à raison de 20 mJ/ cm ² , afin de constater un effet protecteur de l'actif peptidique selon l'invention sur les cellules ;

- condition b : irradiées dans un premier temps avec des rayonnements UVB à raison de 20 mJ/ cm ² , puis traitées pendant 24 h avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1 à une concentration de 1 % et de 3 %, afin de constater un effet réparateur de l'actif sur les cellules.

Une condition contrôle est réalisée dans chaque cas sans actif peptidique.

Les cellules sont ensuite trypsinées de leur support, puis centrifugées à 900 tour/min pendant 5 minutes afin de les concentrer et les dénombrer.

Un nombre défini de cellules (25 000 cellules) est ensuite inclus dans un gel d'agarose Low Melting à 0,75 %, puis déposé sur une lame de verre préalablement recouverte d'agarose à 1 %. Les lames sont ensuite immergées dans une solution de lyse pendant lh30 à 4 °C, puis dans une solution alcaline pendant 20 minutes à 4 °C. Les cellules sont ainsi lysées et l'ADN dénaturé. Les lames sont plongées dans une solution d'électrophorèse avant d'appliquer un champ électrique (20 V - 250 mA). L'ADN ainsi dénaturé est soumis à une migration au sein du gel d'agarose à 4 °C. L'application d'un colorant fluorescent de l'ADN sur les lames (l'iodure de propidium à 2 μg/ ml) permet d'observer au microscope l'ADN apparaissant sous forme de comètes dans le cas où il a été endommagé.

Un logiciel de quantification permet de déterminer le Tail Moment moyen appliqué à chaque condition testée. Ce paramètre renseigne sur le niveau d'endommagement de l'ADN : plus il est élevé, plus les dommages sur l'ADN sont importants.

Résultats :

Dans la condition a, le Tail Moment diminue sensiblement lorsque l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliqué en prétraitement (à une concentration de 1 % ou de 3 %), c'est-à-dire que les cellules ont subies moins de dommages que dans la condition contrôle, lorsqu'elles sont soumises à des rayonnements UVB ultérieurs. Ces résultats confirment bien l'effet protecteur de l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention sur les cellules KHN, plus particulièrement au niveau de leur ADN. Par ailleurs, lorsque l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliqué après irradiation, sans prétraitement (condition b), le Tail Moment diminue de façon dose dépendante. Ce test en condition b a permis de mettre en évidence le rôle réparateur de l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention sur l'ADN des cellules cutanées testées soumises à des irradiations UVB préalables.

Exemple 5 : mise en évidence de l'action réparatrice de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 sur des biopsies de peau humaine soumises à des rayonnements UVB Le but de cette expérience est de mesurer les capacités de réparation de l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention après irradiation par rayonnements UVB de biopsies de peau humaine. Le rayonnement UV, et particulièrement UVB, entraine des réactions de dimérisation qui ont lieu au niveau des sites comprenant deux pyrimidines adjacentes (thymidine, cytosine). Plusieurs types de photoproduits sont alors formés, dont les dimères de cyclobutane-pyrimidine ou DCPs. Or, il est connu que lorsqu'une cellule est exposée à un stress génotoxique, son cycle de division est temporairement arrêté pour permettre la réparation de l'ADN et éviter ainsi l'apparition de mutations dans les générations suivantes de cellules. La prolifération cellulaire ne reprend qu'ensuite. Si la fréquence ou la quantité des dommages est trop élevée, ou encore la réparation inefficace, les cellules enclenchent un processus de mort programmée, l'apoptose. Par conséquent, en mesurant par immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-DCPs, la quantité de photoproduits formés, il est possible d'évaluer l'efficacité d'un composé ayant une action réparatrice sur l'ADN.

Protocole d' immunomarquage des DCPs sur des biopsies de peau soumises à des UVB

Des biopsies de peau humaine sont mises en culture à l'interface air/liquide. Ces biopsies sont soumises à des irradiations par rayonnements UVB à raison de 200 mJ/ cm ² . Après irradiation, dans une première condition, une solution à 1 % de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliquée topiquement sur les biopsies durant 24 h. Dans une seconde condition, une solution à 3 % de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliquée topiquement durant 24 h. Une condition contrôle est réalisée par application topique d'une solution de PBS après irradiation.

Pour le marquage des dimères cyclobutane-pyrimidine, les biopsies de peau sont incluses dans de la paraffine et des coupes histologiques de 3 um d'épaisseur sont effectuées. Les lames sont déparaffinées, hydratées puis soumises à un immunomarquage par un anticorps dirigé contre les dimères cyclobutane-pyrimidine (MBL D 194-1, mouse monoclonal) puis par un anticorps secondaire adapté (Invitrogen A21202), couplé à un marqueur fluorescent. Les coupes de peau sont alors examinées au microscope à Epi- fluorescence (Nikon Eclipse E 80i microscope).

Résultats :

En condition contrôle, la fluorescence observée est plus intense lorsque les biopsies ont été soumises aux rayonnements LTVB. Dans les deux conditions testées avec posttraitement avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1, on observe une fluorescence beaucoup moins intense que dans la condition contrôle avec UVB.

Conclusions :

L'extrait peptidique d'avoine selon l'invention a permis une meilleure et une plus importante réparation des dommages subis par l'ADN des cellules cutanées tetsées, ceci grâce notamment à l'activation de la caspase-14. On observe aussi que cette action de réparation est dose-dépendante puisque celle-ci est plus importante lorsqu'une plus grande quantité d'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliquée.

Exemple 6 : composition d'une crème solaire

Noms %

Ingrédient (Noms INCI)

commerciaux massique

PHASE A

Aqua (Eau déminéralisée) qsp

Glycerin 3,00

Versene NA2 Disodium EDTA 0,10

Triethanolamine 0,50

UltraThix® P100 Acrylic acid/VP Crosspolymer 0,70

PHASE B j

Dimethicone (lOOcs) 0,50

Glucamate SSE20 PEG-20 Methyl Glucose Sesquistearate 2,50

Glucamate S S Methyl Glucose Sesquistearate 0,50 Noms %

Ingrédient (Noms INCI)

commerciaux massique

Lanette® 16 Cetyl Alcohol 1,50

Ceraphyl® SLK Isodecyl Neopentanoate 3,00

Ceraphyl® 230 Diisopropyl Adipate 2,00

Escalol® 517 Avobenzone 3,00

Escalol® 587 Octisalate 5,00

Escalol® 597 Octocrylene 2,00

Bis-Ethylhexyloxyphenol

Escalol® S 3,00

Methoxyphenyl Triazine

PHASE C

Cyclopentasiloxane 5,00

Cyclopentasiloxane,

Si-Tec™ RE- 100 Dimethicone/Vinyltrimethylsiloxysilicate 1,00

Crosspolymer

PHASE D

Ethanol 5,00

Phenoxyethanol, Benzoic acid,

Optiphen™ ND 1,20

Dehydroacetic acid

PHASE E

Extrait d'avoine selon l'exemple 1 3,00

Parfum (Fragrance) qsp

Colorant qsp