La présente invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique, d'un activateur de l'autophagie des cellules de la peau comme principe actif cosmétique.

L'invention vise également des compositions cosmétiques comprenant au moins un activateur de l'autophagie des cellules de la peau comme principe actif cosmétique ainsi qu'un procédé cosmétique pour détoxifier la peau et/ou pour prévenir ou lutter contre le vieillissement cutané, comprenant l'application topique sur la peau de telles compositions. La peau, organe de contact avec l'environnement, est constamment soumise à des agressions, tant externes qu'internes, qui menacent son équilibre et modifient son aspect.

On sait par exemple que l'exposition excessive aux rayons ultraviolets (UV) se traduit par diverses manifestations cutanées, comme des érythèmes actiniques, de l'élastose solaire ou encore l'apparition prématurée des effets du vieillissement cutané : la peau devient lâche, profondément ridée, rugueuse, sèche, parsemée de taches hypopigmentées ou hyperpigmentées et de vaisseaux dilatés. Ces manifestations, qui reflètent de profonds changements structuraux dans le tissu cutané, sont inesthétiques et disgracieuses et beaucoup de gens ont tendance à vouloir les estomper. C'est pourquoi l'objectif de la présente invention est de proposer un moyen efficace pour protéger la peau contre les agressions susceptibles d'altérer son bon fonctionnement et son aspect, et pour lutter contre les manifestations qui en découlent. Pour y répondre, la présente invention propose d'utiliser comme principe actif cosmétique dans une composition cosmétique au moins un activateur de l'autophagie des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes et des fibroblastes. En effet, l'utilisation d'au moins un activateur de l'autophagie des cellules cutanées permet de lutter contre l'accumulation de molécules délétères dans les cellules cutanées produites en cas de stress et ainsi lutter contre les manifestations qui en découlent. En particulier, l'invention vise l'utilisation dans une composition cosmétique d'au moins un activateur de l'autophagie des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes et/ou des fibroblastes, comme principe actif, pour détoxif ier les cellules cutanées, lutter contre le vieillissement de la peau, restructurer la peau, hydrater et protéger la couche cornée, augmenter le renouvellement cellulaire, protéger les cellules des effets néfastes des radiations UVA et UVB et limiter les phénomènes d'inflammation.

Préférentiellement, l'invention vise l'utilisation dans une composition cosmétique d'au moins un activateur de l'autophagie des cellules de la peau, comme principe actif destiné à détoxifier les cellules de la peau et/ou lutter contre le vieillissement cutané. Avantageusement, en augmentant le mécanisme d'autophagie dans les cellules cutanées, l'utilisation selon l'invention permet d'augmenter l'élimination des molécules endommagées, de détoxifier la peau et de limiter le vieillissement cutané. En effet, dans certaines conditions, en particulier asec l'âge et la surexposition au soleil, les cellules de la peau ne sont plus en état d'évacuer les molécules endommagées par les radiations et les stress divers. Les cellules sont engorgées par ces molécules endommagées et par des radicaux libres. L'utilisation cosmétique d'activateurs de l'autophagie des cellules cutanées selon l'invention permet de limiter cet engorgement cellulaire et de débarrasser les cellules d'éléments délétères et inutiles qui entravent son fonctionnement optimal en s'accumulant.

L'invention vise également une composition cosmétique pour application topique sur la peau comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, une quantité efficace d'au moins un activateur de l'autophagie des cellules cutanées choisi parmi des principes actifs issus de Lithothamnium calcareum, Melilotus off icinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia, Yarrowia lipolytica et au moins un adjuvant cosmétique. Préférentiellement l'activateur de l'autophagie des cellules cutanées est présent en une quantité comprise entre 0,1 et 15% en poids par rapport au poids total de la composition.

Enfin l'invention a également pour objet un procédé cosmétique pour détoxif ier la peau et/ou pour prévenir ou lutter contre le vieillissement cutané, comprenant l'application topique sur la peau d'une composition comprenant au moins un activateur de l'autophagie des cellules de la peau. L'invention est maintenant décrite en détail.

La présente invention vise donc l'utilisation dans une composition cosmétique d'un activateur de l'autophagie, en tant que principe actif cosmétique. L'autophagie est un mécanisme de recyclage et de détoxification des constituants et des organites cellulaires. L'autophagie permet notamment de réguler, réparer et éliminer les protéines de longue durée de vie dans les cellules, assurant ainsi un contrôle au cours de la différenciation et du vieillissement de la peau humaine. Sur le plan cellulaire, le mécanisme d'autophagie, comprend quatre étapes : l'initiation, la formation d'une vacuole initiale, nommée autophagosome, qui séquestre le matériel cytoplasmique, la maturation de l'autophagosome en vacuole dégrαdαtive et la fusion avec le lysosome, jusqu'à la dégradation du matériel séquestré.

Selon un premier aspect, un activateur de l'autophagie des cellules cutanées utile selon l'invention peut être un principe actif présentant une activité stimulatrice de l'expression des MAP-LC3 (« microtubule-associated membrane protein » protéines membranaires associées aux microtubules) et/ou des ATG5-12 (« Autophagy-related gènes », gènes de l'autophagie) des cellules de la peau. En effet, la formation de l'autophagosome, étape essentielle dans le mécanisme de l'autophagie, implique deux systèmes de conjugaison : le complexe ATG5-12 et les MAP-LC3.

La première étape de l'autophagie est la formation d'une structure multimembranaire, appelée phagophore, dont l'origine reste inconnue. Cette structure s'étend pour former l'autophagosome qui séquestre du matériel cytoplasmique. L'autophagosome fusionne avec le lysosome et son contenu est ensuite dégradé par les enzymes lysosomales. Au cours de la formation de l'autophagosome, des protéines ATG sont recrutées à partir du cytoplasme et s'associent trans itoirement avec la membrane autophagosomale. Ce processus fait intervenir principalement trois complexes protéiques : la PI(3)K de classe III associée à la protéine Bécline 1 et deux systèmes de conjugaison. L'événement précoce dans l'induction de la formation de l'autophagosome est la production de phosphatidyl inositol 3-phosphate par le complexe Bécline 1-PI(3)K de classe III qui permet le recrutement du premier système de conjugaison ATG12-ATG5, noté aussi ATG5-12. Ce dernier, permet, à son tour, la conjugaison de la phosphatidyl éthanolamine (PE) à la protéine MAP-LC3 pour former le conjugué MAP-LC3 - PE, qui est alors recruté à la membrane autophagosomale. Les gènes ATG sont donc impliqués dans la formation de l'autophagosome et

YATG5-12 est précurseur de la conjugaison MAP-LC3 et phosphatidyl éthanolamine (PE).

Les Map-LC3 sont des protéines de 15kDa présentes chez les mammifères. Elles sont mises en jeu au moment de la formation des membranes des autophagosomes. Il en existe deux formes : une forme cystolique les LC3-I et une forme liée à la membrane LC3-II.

Les Map-LC3 sont dans un premier temps clivées, directement après leur synthèse, au niveau de leur partie C- terminale afin de donner la forme cystolique LC3-I. Au cours de l'autophagie, LC3-I est converti en LC3-II, et les protéines s'associent aux vacuoles autophagiques.

Ainsi, l'utilisation d'un principe actif présentant une activité stimulatrice de l'expression des MAP-LC3 et/ou des AT65-12 des cellules de la peau, permet de stimuler la formation de l'autophagosome et donc de stimuler l'autophagie des cellules de la peau.

Selon un deuxième aspect, un activateur de l'autophagie des cellules cutanées utile selon l'invention peut être un principe actif inhibant l'activation de mTOR phosphorylée.

Le complexe mTOR (« mammalian Target Of Rapamycine" ou cible de la rapamycine des mammif ières) est une molécule intervenant dans l'initiation de la formation de l'autophagosome. Il joue un rôle de senseur de l'ATP et des acides aminés régulant l'équilibre entre la disponibilité des nutriments et la croissance cellulaire.

Lorsque la quantité de nutriments est suffisante, mTOR est phosphorylée sur la senne 2448 et transmet un signal positif activant la croissance cellulaire et inhibant l'autophagie. Dans le cas contraire, c'est-à-dire en conditions de privation nutritionnelle ou starvation, cette phosphorylation disparaît au profit d'une phosphorylation de la thréonine 2446, ce qui permet la levée de l'inhibition de l'autophagie. Le mécanisme de l'autophagie est donc initié lorsqu'il y a déphosphorylation de mTOR sur la serine 2448.

Ainsi, l'utilisation cosmétique d'un actif inhibiteur de l'activité de mTOR dans les cellules de la peau permet de favoriser l'initiation de l'autophagie, de mobiliser la formation des autophagosomes et donc de stimuler l'autophagie des cellules de la peau. Selon un dernier aspect, un stimulateur de l'activité autophagique des cellules cutanées utile selon l'invention peut être un principe actif présentant une activité stimulatrice de l'expression de la protéine p53, de l'AMPK et/ou de DRAM. La protéine p53 est une protéine majeure du stress, capable notamment : - d'activer la protéine DRAM (« Damage Regulated Autophagy Modulator » modulateur des dommages régulés par autophagie), une protéine directement impliquée dans l'initiation du mécanisme de l'autophagie, et

- d'inhiber mTOR par le biais de l'activation d'un protéine kinase, l'AMPK. L'activation de DRAM et/ou de l'AMPK, soit directement, soit par le biais de la p53 permet donc de stimuler l'autophagie.

Ainsi, l'utilisation cosmétique d'un principe actif présentant une activité stimulatrice de l'expression de la protéine p53 phosphorylée, de DRAM et/ou de l'AMPK des cellules de la peau, permet de favoriser l'initiation de l'autophagie, de mobiliser la formation des autophagosomes et donc de stimuler l'autophagie des cellules de la peau.

La conséquence cellulaire d'une activation du mécanisme de l'autophagie par un principe actif présentant une activité stimulatrice de l'expression des MAP-LC3, des ATG5-12, de la protéine p53 phosphorylée, de DRAM et/ou de l'AMPK et/ou présentant une activité inhibitrice de mTOR phosphorylée, est une meilleure détoxification des cellules, c'est-à-dire une diminution des espèces oxygénées réactives et des macromolécules dégénérées bloquées dans les cellules cutanées. Préférentiellement le stimulateur de l'activité autophagique des cellules cutanées utile selon l'invention est un principe actif issu d'au moins une plante, une algue ou une levure.

De façon préférée, l'activateur de l'autophagie est un principe actif issu d'au moins une algue du genre Lithothamnium calcareum, ou d'une plante choisie parmi Melilotus officinalis, Citrus limonum, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia ou d'une levure choisie parmi Candida saitoana et Yarrowia lipolytica.

Selon un aspect de l'invention, l'activateur de l'autophagie des cellules cutanées est susceptible d'être sélectionné par un test réalisé sur des cultures de cellules cutanées comprenant les étapes suivantes : - culture de cellules cutanées, kératinocytes ou fibroblastes, dans un milieu de culture adapté,

- retrait du milieu de culture et remplacement par un milieu de culture comprenant un agent stressant induisant un stress nutritif et/ou oxydât if, - ajout d'un principe actif issu de plante, d'algue ou de levure à tester dans le milieu de culture,

- retrait de l'agent oxydant et remplacement du milieu de culture par un milieu de culture comprenant le principe actif, et

- analyse de l'expression de MAP-LC3, d'ATG5-12, de mTOR phosphorylée, de la protéine p53 phosphorylée, de l'expression de la protéine

DRAM et/ou de l'AMPK par lesdites cellules, et comparaison des résultats avec ceux obtenus sur des cultures de cellules cutanées non traitées avec l'extrait à tester. Si on constate une augmentation de l'expression de MAP-LC3, d'ATG5-l2, de la protéine p53 phosphorylée, de la protéine DRAM et/ou de I ¹ AMPK, et/ou une diminution de mTOR phosphorylée, alors le principe actif testé peut être utilisé dans une composition cosmétique en tant qu'activateur de l'autophagie des cellules de la peau.

Pour illustrer l'invention, plusieurs principe actifs ont été testés pour étudier leur capacité à augmenter l'autophagie des cellules cutanées. Tout d'abord il a été vérifié que l'induction d'un stress au niveau des cellules de la peau entraînait bien une augmentation de l'autophagie. II a ensuite été comparé le niveau d'autophagie de cellules jeunes et âgées soumises aux mêmes stress oxydatifs et nutritifs.

Enfin des principes actifs ont été sélectionnés par la mise en oeuvre du procédé test selon l'invention.

1/ Visualisation de l'autophaqiβ des cellules cutanées après un stress nutritif

Le protocole réalisé consiste à soumettre des cultures de kératinocytes type HaCaT ou kératinocytes humains normaux à un stress nutritif, c'est-à-dire à une absence de facteurs de croissance, pendant un certain temps et à évaluer l'expression de plusieurs marqueurs de l'autophagie au cours de la récupération cellulaire.

Le protocole est le suivant :

- cultures de cellules de la peau pendant 24 heures en milieu de culture complet (avec facteurs de croissance)

- retrait du milieu de culture complet et remplacement par un milieu de culture non nutritif (sans facteur de croissance). Les cellules sont cultivées pendant plusieurs temps (de 0,5h à 24h) en état de stress nutritif, après ces temps de cultures en état de stress nutritif, retrait du milieu de culture non nutritif et remplacement par du milieu de culture complet, et enfin évaluation de l'état d'autophagie des cellules cutanées par évaluation de l'expression de MAP-LC3, du complexe AT65-12, de mTOR phosphorylée, de p53 phosphorylée, de DRAM et de AMPK phosphorylée après récupération cellulaire.

1.1/ Evaluation de l'expression de MAP-LC3 après un stress nutritif II est possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées en visualisant l'expression de la protéine MAP-LC3 par marquage immunof luorescent. L'expression de MAP-LC3 a été évaluée sur des cultures de cellules cutanées de lignées HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux après différents temps de contact du stress nutritif. Les résultats d'immunomarquage étant qualitatif, il a été défini plusieurs niveaux d'expression des MAP-LC3 :

- très faible détection d'immunoréactivité

- faible détection d'immunoréactivité ±

- moyenne détection d'immunoréactivité +

- forte détection d'immunoréactivité ++ Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant

Lors de la culture des kératinocytes HaCaT en état de stress nutritif, on observe l'apparition nette d'un marquage ponctiforme MAP-LC3 au niveau du cytoplasme des cellules. Ce marquage traduit la formation d'autophagosomes dans les kératinocytes soumis au stress nutritif. Ce marquage est observable dès 2 heures de starvation et atteint un maximum après 4 heures de starvation.

Ces conditions de stress nutritif permettent donc d'induire la formation d'autophagosomes et par conséquent une autophagie, visualisée par l'expression de MAP-LC3.

1.2/ Evaluation de l'expression du complexe ATG5-12 après un stress nutritif

II est aussi possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées en visualisant l'expression du complexe ATG5-12 par marquage immunofluorescence. L'évaluation de l'expression du complexe AT65-12 a été réalisée sur des cultures de cellules cutanées de lignées HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux après différents temps de culture en état de stress nutritif. Les résultats d'immunomarquage étant qualitatif, il a été défini plusieurs niveaux d'expression desATG5-12 : - très faible détection d'immunoréactivité

- faible détection d'immunoréactivité ±

- moyenne détection d'immunoréactivité +

- forte détection d'immunoréactivité ++

- très forte détection d'immunoréactivité +++ Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Lors de la culture des kératinocytes HaCaT en état de stress nutritif, on observe l'apparition nette d'un marquage ponctiforme AT65-12 au niveau du cytoplasme des cellules. Ce marquage traduit la formation d'autophagosomes dans les kératinocytes soumis à un stress nutritif.

Ce marquage est observable dès 1 heure et jusqu'à 3 heures de starvation.

Les conditions de stress nutritif permettent donc d'induire un phénomène de type autophagique, visualisé par l'expression ATG5-12.

1.3/ Evaluation de l'expression de mTOR phosphorylée après un stress nutritif

II est aussi possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées en visualisant l'expression de mTOR phosphorylée par Western Blott.

L'évaluation de l'expression de mTOR phosphorylée a été évaluée sur des cultures de cellules cutanées de lignées HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux après différents temps de culture en état de stress nutritif. L'expression de mTOR phosphorylée est présentée dans le tableau ci-après en pourcentage par rapport au témoin (sans stress nutritif).

Cette expérience a montré une nette diminution de la protéine mTOR phosphorylée visible dès 8 heures de privation, dans des cultures de cellules cutanées soumises à une starvation.

Lorsque la protéine mTOR phosphorylée diminue, il y a levée de l'inhibition de l'autophagie.

Les conditions de stress nutritif permettent donc d'induire I' autophagie sur des cultures de cellules cutanées, visualisée par la diminution de l'expression de mTOR phosphorylée.

1.4/ Evaluation de l'expression de p53 phosphorylée après un stress nutritif II est aussi possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées en visualisant l'expression de la protéine p53 phosphorylée par Western Blott.

L'évaluation de l'expression de la protéine p53 phosphorylée a été évaluée sur des cultures de cellules cutanées de lignées HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux après différents temps de culture en état de stress nutritif. L'expression de p53 phosphorylée est présentée dans le tableau ci-après en pourcentage par rapport au témoin (sans stress nutritif).

Cette expérience a montré une nette augmentation de l'expression de la protéine p53 phosphorylée visible dès 1 heure, dans des cultures de cellules soumises à une starvation.

Les conditions de stress nutritif permettent donc d'induire un phénomène de type autophagique sur des cultures de cellules cutanées, visualisé par l'augmentation de l'expression de la protéine p53 phosphorylée.

1.5/ Evaluation de l'expression de la protéine DRAM après un stress nutritif

II est aussi possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées en visualisant l'expression de la protéine DRAM, par Western Blott, sur des cultures de cellules cutanées de lignées HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux après différents temps de culture en état de stress nutritif. L'expression de DRAM est présentée dans le tableau ci-après en pourcentage par rapport au témoin (sans stress nutritif).

Cette expérience α montré une nette augmentation de l'expression de la protéine DRAM après 0,5 heure de culture en état de stress nutritif. L'expression de la protéine DRAM devient maximale après 1,5 heure de culture en état de stress nutritif. Ceci coïncide osec la cinétique d'expression de la protéine p53 qui atteint son maximum après une heure de stress nutritif.

Les conditions de stress nutritif permettent donc d'induire un phénomène de type autophagique sur des cultures de cellules cutanées, visualisé par l'augmentation de l'expression de la protéine DRAM.

1.6/ Evaluation de l'expression de la protéine AMPK phosphorylée après un stress nutritif

II est aussi possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées en visualisant l'expression de la protéine AMPK phosphorylée, par Western Blott, sur des cultures de cellules cutanées de lignées HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux après différents temps de culture en état de stress nutritif. L'expression de DRAM est présentée dans le tableau ci-après en pourcentage par rapport au témoin (sans stress nutritif).

Cette expérience a montré que l'expression de AMPK phosphorylée est augmentée dès 0,5 heure de culture en état de stress nutritif et est maximale à 1,5 heure. Ceci coïncide asec la cinétique d'expression de la protéine p53 qui atteint son maximum après une heure de stress nutritif. Les conditions de stress nutritif permettent donc d'induire un phénomène de type αutophαgique sur des cultures de cellules cutanées, visualisé par l'augmentation de l'expression de la protéine AMPK phosphorylée. Ces études ont donc permis de montrer que le mécanisme d'autophagie peut être indifféremment visualisé sur des cultures de cellules cutanées stressées par l'évaluation de l'expression de différentes protéines comme MAP-LC3, le complexe AT65-12, de mTOR phosphorylée, la protéine p53 phosphorylée, la protéine DRAM ou la protéine AMPK phosphorylée.

2/ Visualisation de l'autophaqiβ des cellules cutanées après un stress nutritif et oxydatif

La visualisation de l'autophagie est possible, comme dans le cas du stress nutritif, par l'évaluation de différentes protéines telles que MAP-LC3, le complexe ATG5-12, la protéine mTOR phosphorylée, la protéine p53 phosphorylée, la protéine DRAM ou la protéine AMPK phosphorylée. Dans cette expérience, l'expression de l'autophagie des cellules cutanées a été étudiée en analysant l'expression de MAP-LC3, de la protéine p53 phosphorylée et de la protéine DRAM dans les cultures de cellules cutanées stressées. Le protocole opératoire est le suivant : - cultures de cellules pendant 24 heures en milieu de culture complet

- retrait du milieu de culture et remplacement avec du milieu de culture non nutritif contenant l'agent oxydant H ₂ O ₂ pendant 3 h (différentes doses de H ₂ O ₂ - 125μM et/ou 250μM - ont été testées).

- retrait de l'agent oxydant et du milieu de culture non nutritif, remplacement par du milieu de culture complet sans oxydant.

- Evaluation de l'expression de MAP-LC3, de la protéine p53 phosphorylée ou de la protéine DRAM après récupération cellulaire. Plusieurs temps de récupération ont été choisis (0,5 heure, 1 heure, 1,5 heure ou 2 heures de récupération).

2.1/ Evaluation de l'expression MAP-LC3 après un stress nutritif et oxydât if

II est possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées stressées en visualisant l'expression de la protéine MAP-LC3, par marquage immunofluorescent.

L'évaluation de l'expression MAP-LC3 a été analysée dans ces conditions de stress modéré (125μM et 250μM de peroxyde d'hydrogène HzOz) sur des cultures de kératinocytes HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux. Les résultats d'immunomarquage étant qualitatifs, il a été défini plusieurs niveaux d'expression des AT65-12 :

- très faible détection d'immunoréactivité

- faible détection d'immunoréactivité ±

- moyenne détection d'immunoréactivité +

- forte détection d'immunoréactivité ++

- très forte détection d'immunoréactivité +++

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Pour la dose 125μM de stress oxydatif , on observe le marquage ponctiforme de

MAP-LC3 au niveau du cytoplasme des cellules dès 0,5 heure de récupération qui devient maximum après 1,5 heure, puis s'atténue à partir de 2 heures de récupération.

Pour la dose de 250μM, on constate que ce marquage apparaît dès 0,5 heure, atteint un maximum à 1 heure et s'affaiblit dès 1,5 heure de récupération.

Les conditions de stress nutritif et oxydatif permettent donc d'induire un phénomène de type autophagique, visualisé par l'augmentation de l'expression de MAP-LC3 dans les cellules cutanées.

2.3/ Evaluation de l'expression de la protéine p53 phosphorylée après stress nutritif et oxydatif

II est aussi possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées stressées en visualisant l'expression de la protéine p53 phosphorylée par Western Blott. L'évaluation de l'expression de la protéine p53 phosphorylée a donc été analysée dans ces conditions de stress modéré asec 125 μM de WzOz, sur des cultures de kératinocytes HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux. L'expression de p53 phosphorylée est présentée dans le tableau suivant en pourcentage par rapport au témoin (sans stress).

Pour la dose 125μM de stress nutritif et oxydatif, on observe que le marquage de la protéine p53 phosphorylée est à son maximum après 0,5 heure de récupération, puis s'atténue progressivement. Les conditions de stress oxydαtif permettent donc d'induire un phénomène de type αutophαgique, visualisé par l'augmentation de l'expression de la protéine p53 phosphorylée.

2.4/ Evaluation de l'expression de la protéine DRAM après stress nutritif et oxydât if

II est aussi possible d'évaluer l'autophagie des cellules cutanées stressées en visualisant l'expression de la protéine DRAM par Western Blott. L'évaluation de l'expression de DRAM a donc été analysée dans ces conditions de stress modéré asec 125 μM de HzO ₂ , sur des cultures de kératinocytes HaCaT et sur des kératinocytes humains normaux. L'expression de DRAM est présentée dans le tableau suivant en pourcentage par rapport au témoin (sans stress).

On constate qu'un stress nutritif et oxydatif sur les cultures de cellules cutanées augmentent l'expression de la protéine DRAM.

Pour la dose 125μM de stress oxydatif, on observe que le marquage de la protéine DRAM est à son maximum après 1,5 heure de récupération, puis s'atténue à partir de 2 heures. Les conditions de stress nutritif et oxydatif permettent donc d'induire un phénomène de type autophagique.

Ces études ont donc permis de montrer que le mécanisme d'autophagie peut être visualisé sur des cultures de cellules cutanées stressées par l'évaluation de l'expression de différentes protéines comme MAP-LC3, la protéine p53 phosphorylée ou la protéine DRAM.

3/ Comparaison de l'autophaqiβ dans des cellules jeunes ou âgées Cette étude a pour objectif de comparer le niveau d'autophagie de cellules jeunes (de donneurs d'âge moyen 26 ans) et âgées (de donneurs d'âge moyen 70 ans) soumises aux mêmes stress oxydatifs et nutritifs.

L'évaluation du niveau d'autophagie a été envisagée par l'analyse de l'expression de la protéine MAP-LC3 par Western Blott. Le protocole mis en place est le suivant :

- cultures de cellules dites jeunes ou âgées pendant 24 heures en milieu de culture complet.

- retrait du milieu de culture complet, remplacement asec du milieu de culture non nutritif contenant l'agent oxydant H2O2 pendant 3h à différentes doses

- retrait de l'agent oxydant, remplacement par du milieu de culture complet sans oxydant,

- Evaluation de l'expression de MAP-LC3 après récupération cellulaire.

Les résultats sont décrits dans le tableau ci-dessous en pourcentage par rapport au témoin (sans stress).

Dans les conditions de cette étude, les cellules cutanées dites jeunes montrent une augmentation de l'expression MAP-LC3 lorsqu'elles sont soumises à un stress oxydatif modéré (125, 250, voir 400μM). Lorsqu'elles sont soumis à un stress oxydatif important (600 et lOOOμM), elles se placent en apoptose. Les cellules cutanées dites âgées ne présentent pas la même augmentation de l'expression MAP-LC3 lorsqu'elles sont soumises au même stress oxydatif modéré.

Cette différence de mise en autophagie des cellules âgées par rapport aux cellules jeunes est significative. Cette étude montre donc que des cellules âgées ne sont plus capables de se protéger et de se détoxif ier lors d'un stress nutritif et oxydatif modéré.

4/ Criblage de principes actifs augmentant l'autophaqiβ des cellules cutanées

Le criblage est réalisé selon le protocole de stress nutritif et oxydatif présenté en point 2.1, à partir de principes actifs issus de végétaux, d'algues ou de levures. L'évaluation de l'effet de principes actifs sur l'autophagie des cellules cutanées a été effectuée en analysant l'expression de la protéine MAP-LC3 dans des cultures de cellules cutanées soumises à un stress nutritif et oxydatif. Le protocole de test est le suivant : - cultures de cellules pendant 24 heures en milieu de culture complet,

- retrait du milieu de culture complet, remplacement avec du milieu de culture non nutritif contenant l'agent oxydant H2O2 pendant 3h en présence ou non des principes actifs,

- retrait de l'agent oxydant et du milieu de culture non nutritif, remplacement par du milieu de culture complet en présence ou non des principes actifs, - Evaluation de l'expression de MAP-LC3 après récupération cellulaire par marquage immunof luorescent. Les principes actifs testés on été produits selon le protocole suivant :

- solubilisation de poudre de plante, algue ou levures dans l'eau à raison de 50g/l (m/v),

- hydrolyse enzymatique,

- séparation des phases soluble et insoluble,

- f iltration et f iltration stérilisante. Les principaux principes actifs sont :

Les résultats des principes actifs les plus efficaces sélectionnés et testés en triplicate sont décrits dans le tableau suivant :

Ces principes actifs permettent donc d'augmenter l'autophagie des cellules cutanées soumises à un stress nutritif et oxydatif modéré, et ainsi détoxif ier la peau et prévenir ou lutter contre le vieillissement cutané. Ces principes actifs peuvent être incorporés dans des compositions cosmétiques.

5. Exemples de compositions cosmétiques contenant un principe actif agissant sur l'autophaqie des cellules cutanées

L'invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant au moins un principe actif agissant sur l'autophagie des cellules cutanés dans différentes formes galéniques, adaptées à l'administration par voie topique cutanée.

Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme de crèmes, émulsions huile-dans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples, solutions, suspensions ou poudres. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse, ou sous forme solide.

Ces compositions contiennent entre 0,01 et 15% en poids de principe(s) actif(s) agissant sur l'autophagie des cellules cutanés selon la présente invention, préférentiellement entre 1% et 4%. 5.1. Crème experte

Un exemple de crème comprenant un principe actif extrait de citron tel que présenté au point 4., peut avoir la composition suivante :

A. Eau QSP 100% <9lycerol (Univar) 3.33 %

EDTA 0.13 7

Satialgine (Degussa) 0.66 7 /o Talc (Luzenac) 1%

B. Miglyol 812 (Condea Chemie) 3.33 7 /o Ritaphyl ICS (Rita) 1.33 7

Ritachol SS (Rita) 1.33 7 /o Ipm (Univar) 3.33 7 Ritalan C (Rita) 1.33 7 /o Montanov 14(Seppic) 1.33 7 Lanol 14M (Seppic) 1.33 7 /o

Brij 72 (Uniquema) 1 % Brij 721 (Uniquema) 0.33 7 /o

C. Phénoxyéthanol (Sigma) 0,9°/c _> Ethylhexylglycérine (Seppic) 0,1% D . Principe actif issu de Citron selon l'invention 4%

La crème est obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- chauffer A et B à 80 ⁰ C, sous agitation mécanique,

- émulsionner B dans A sous agitation,

- à 30 ⁰ C additionner C dans l'ordre, et - continuer l'homogénéisation jusqu'à ce que la crème soit uniforme. 5.2. Crème αnti-rides

Un exemple de crème comprenant un principe actif extrait de Lithothamnium tel que présenté au point 4., peut avoir la composition suivante :

A. Eau QSP 100% Butylène glycol (Univar) 3%

B. Isohexadecane (Laserson) 5% Rita IPP (Rita) 2% Montanov 202 (Seppic) 3% Arlacel 161 (Uniquema) 1% Ritox 59 (Rita) 1%

Lanette O (Cognis) 1%

C. Phénoxyéthanol (Sigma) 0,9% Ethylhexylglycérine (Seppic) 0,1% DC 200 (Dow Corning) 0.5% Principe actif issu de Lithothamnium selon l'invention 4%

D. Sepigel 305 (Seppic) 4% La crème est obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- mélanger A ₁ mélanger B et chauffer A et B à 80 ⁰ C, sous agitation mécanique, - émulsionner B dans A sous agitation,

- à 30 ⁰ C additionner C dans l'ordre, et

- continuer l'homogénéisation jusqu'à ce que la crème soit uniforme.

5.3. Crème de Nuit Un exemple de crème comprenant un principe actif extrait de Melilothus tel que présenté au point 4., peut avoir la composition suivante : A. Eau QSP 100% Carbopol ETD 2020 (Noveon) 0.4%

B. alcool cethylique (Stéarinerie Dubois) 3% Alcool stearylique (Stéarinerie Dubois) 3% DUB MCT 5545 (Stéarinerie Dubois) 4.5%

DC 345 (Dow Corning) 7.5%

Monomuls 900 18 (Henkel) 3%

C. Phénoxyéthanol (Sigma) 0,9% Ethylhexylglycérine (Seppic) 0,1% Principe actif issu Melilotus selon l'invention 4%

D. NaOH qsp pH 4.5 La crème est obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- mélanger A, bien disperser le gel et mélanger B,

- chauffer A et B à 80 ⁰ C, - émulsionner B dans A sous agitation,

- à 40 ⁰ C additionner C dans l'ordre,

- continuer l'homogénéisation jusqu'à ce que la crème soit uniforme,

- ajuster le pH avec D, et

- laisser refroidir sous agitation jusqu'à 30 ⁰ C. 5.4. Crème peaux matures

Un exemple de crème comprenant un principe actif extrait de Candida saitoana tel que présenté au point 4., peut avoir la composition suivante : A. Eau QSP 100%

Glycerol (Univar) 1.75% Propylene glycol (Univar) 6.5%

Aculyne 33A (ISP) 2.5%

Carbopol EDT 2020 (Goodrich) 0.5 % B. Cetiol SN (Cognis) 3%

Eumulgine Bl (Cognis) 1.75%

Ritαphyl ICS (Ritα) 3%

Pαtlαc IL (Ritα) 3% Isopropyl myristαte (Univαr) 3%

Montαne 80 (Seppic)) 1.5%

Montαnox 60 (Seppic) 1.5%

DC 345 (Dow Corning) 3%

C. Phénoxyéthαnol (Sigma) 0,9% Ethylhexylglycérine (Seppic) 0,1%

D. Principe actif issu de Candida saitoana 4% NaOH QSP pH 5.5

La crème est obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- mélanger A ₁ mélanger B, et chauffer A et B à 80 ⁰ C, - émulsionner B dans A sous agitation,

- à 30 ⁰ C additionner C et D,

- ajuster à pH 5.5 avec NaOH, et

- continuer l'homogénéisation jusqu'à ce que la crème soit uniforme.