技术领域 本发明涉及离子通道类蛋白及其编码基因与应 用，特别是涉及一个来源于棉花的 离子通道类蛋白 NHX1-1及其编码基因， 以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的 应用。 背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危 害之一， 盐渍土壤通常以钠盐、钙 盐或镁盐为主， 成为影响植物生长、 导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上 盐 碱土的面积约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1/3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面 积约 0. 4亿公顷。 随着我国人口增加， 耕地减少， 盐碱地资源的开发利用有着极其重 要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的 提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高 经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是 利用盐碱地经济、 有效的措施。 对绝大 多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的 耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3% 以下的土壤上， 土壤中过量的 Na ⁺ 会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作 用。 因此 如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界 农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其 耐盐机制涉及从植株到器官、组织、 生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家 也为此做了大量的工作， 并取得了很多 新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研 究植物的耐盐分子机理方面，使该领域 的研究有了突破性的进展 （Zhu JK. 2002. Sal t and drought stress s ingal transduct ion in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53： 1247-1273； Zhang ZL. 2011. Arabidops i s Floral Init iator SKBl Confers High Salt Tolerance by Regulat ing Transcript ion and Pre-mRNA Spl icing through Altering Hi stone H4R3 and Smal l Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylat ion. Plant Cel l, 23 : 396 - 411 )。 高 等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化 参数的变化，从而将胞外的信号变为胞 内信号， 通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细 胞核内， 激活转录因子， 而激 活转录因子再作用于功能基因， 启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆 性。尽 管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由 于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多 重要问题仍有待探索。例如， 植物抗盐的关键因子仍未找到； 植物耐盐的分子机制并 不十分清楚。 发明内容 本发明人利用 SSH与 RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个离子通� �类蛋白

(本文命名为 NHX1-1 ) 的编码基因的 DNA序列。 并发现将其导入转基因植株后， 可明显改善转基因植株的抗盐性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个离子通道类蛋 白 NHX1-1的编码基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含 有本发明第一方面所述的基因并且 所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达 控制序列可操作地连接； 优选地，所述 载体为附图 2所示的 rd29A-GhNHXl-l-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本 发明第一方面所述的基因或者本发 明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方 法，包括： 将本发明第一方面所述 基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体 导入植物或植物组织并使所述基因表 达； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法，包括： 在有效产生植物的条件 下培养含有本发明第一方面所述基因、本发明 第二方面所述的重组表达载体的植物或 植物组织； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、本发明第二方面所述的重组表 达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用 于改善植物耐盐性以及用于植物育种 的用途； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第七方面提供发明第一方面所述的基因 编码的氨基酸序列， 如 SEQ ID ΝΟ:1所示。 附图说明 图 1是 GhNHXl-1的植物表达载体 (rd29A-GhNHXl-l-2300)的构建流程。

图 2是 GhNHXl-1的植物表达载体 (rd29A-GhNHXl-l-2300)的质粒图。

图 3是 GhNHXl-1转基因烟草种子和非转基因烟草种子 （对照） 在常规 MS培养基 上的生长结果。 培养皿左侧 （GM)为转烟草基因种子的生长结果； 右侧 （CK) 为非 转基因烟草种子 （对照） 的生长结果。

图 4是 GhNHXl-1转基因烟草种子和非转基因烟草种子 （对照） 在添加有 100 mM NaCl的 MS培养基上的生长结果。 培养皿左侧 （GM) 为转烟草基因种子 （T _Q H2) 的 生长结果； 右侧 （CK) 为非转基因烟草种子 （对照） 的生长结果。

图 5是转基因 T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平� ��的蛋白表达验证结 果。 M为 Marker, 1_5为对照烟草， 6_15为耐盐转基因烟草 T1代植株， 16_21为不耐盐 转基因烟草 T1代植株。 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步 说明。 实施例 1 盐胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法通 过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过 程中以经 NaCl处理 6h的棉花幼苗的根 的 mRNA作为样品 （tester), 以未处理的棉花幼苗的根的 mRNA作为对照 （driver)。

( 1 ) 供试材料：

冀棉 14 (国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一编号： ZM-30270) 播种到灭过菌的蛭石上， 在 25°C、 光暗周期 16h/8h条件下培养， 每周浇 1/2MS培养 ¾ ( 9. 39 mM KN0 ₃ , 0. 625 mM KH2P0 ₄ , 10. 3 mM NH^Oa, 0. 75 mM MgS0 ₄ , 1. 5 mM CaCl ₂ , 50 μ Μ ΚΙ , 100 μ Μ Η ₃ Β0 ₃ ， 100 μ M MnS0 ₄ ， 30 μ M ZnS0 ₄ , 1 μ M N¾Mo0 ₄ , 0. 1 μ M CoCl ₂ ， 100 μ Μ N¾EDTA, 100 μ Μ FeS0 ₄ ) 一次。 当苗株长高达 25-30 cm时用于实 验。

( 2 ) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4株。 第一组为对照组， 在 25°C、 光照下培养， 放 置到 1/2MS液体培养基中。 第二组为处理组， 25°C、 光照下培养， 放置到添加有终浓 度为 200 mM NaCl的 1/2MS液体培养基中， 处理 6小时， 处理完毕后及时剪取两组幼 苗的根， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照和 NaCl处理的棉花根 0. 5g， 用植物 RNA提取试剂盒 （ invitrogen) 提取棉花的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm 和 280 nm的吸光度值， 0D260/0D280比值为 1. 8-2· 0， 表明总 RNA纯度较高， 用 1. 0% 的琼脂糖凝胶电泳检测总 A的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍， 表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒（purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

(4) 抑制消减杂交：

为了增加获得表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST) (unigene)的有效 性， 避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区 。 本实验室用 Rsal， Haelll分别 对双链 cDNA (按照消减试剂盒中记载的方案， 由 mRNA逆转录获得）进行消化， 做两 组抑制差减，其他步骤及方法按 Clontech公司的 PCR_select ^TM cDNA Subtraction Kit 试剂盒所示的方法进行抑制消减杂交， 最后合并两组正向消减杂交 cDNA片段的第二 次 PCR产物。

( 5) cDNA消减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 (QIAquick PCR Purification Kit 纯化，购自 Qiagen)与 pGEM_T Easy (购自 Promega试剂盒）载体连接，依照 pGEM_T Easy 试剂盒的程序， 具体步骤如下： 用 200 l PCR管依次加入下列成分： 纯化的正向差 减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1， Τ4连接酶缓冲液 5 μ 1， pGEM-T Easy 载体 1 μ 1， T4 DNA连接酶 1 μ ΐ ， 于 4°C连接过夜。 取 10 μ L连接反应产物， 加 入到 100 μ L感受态大肠杆菌 JMI09 (购自 TAKARA)中，冰浴 30 min、 热休克 60 s、 冰 浴 2 min, 另加 250 L LB培养液 （1% Tryptone购自 0X0ID, 0. 5% Yeast Extract 购自 0X0ID, 1% NaCl购自国药） 置 37°C水浴中， 以 225 r/min振荡培养 30 min, 取 200 μ L菌液种植于含 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB (同上） /X-gal/IPTG (X-gal/IPTG 购自 TAKARA) 培养板上， 37°C培育 18 h。 计数培养板中直径〉 1 mm的清晰白色及蓝 色菌落数， 随机挑取 300个白色菌落 (编号： Gh-S001至 Gh-S300)。 将所有白色克隆 挑于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， 于 - 80°C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer l 和 Primer 2R (Clontech公司的 PCR- select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒自带） 进行菌液 PCR扩增， 得到 211个阳性克隆， 对所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序 (6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将上述 211个差异克隆的 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 153个 EST (unigene)。 经 BlastN发现其中 87条在 GenBank 中有同源序列， 29条功能未知或者为假定蛋白， 另有 37条未获得同源匹配， 推测可能是处于 3' 、 5' 末端非翻译区的较短序列。 实施例 2 棉花离子通道类编码基因 GhNHXl-1的克隆

克隆子 Gh-S037序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列的编码的氨基酸序 列属于离子通道类蛋白 NHX1，本文将克隆子 Gh-S037编码的全长基因命名为 GhNHXl-1, 该基因对应的蛋白命名为 NHX1-1。

GhNHXl-1全长基因的克隆

根据已经获得的 Gh-S037基因片段， 设计两条特异性引物， 作为 3' RACE的 5' 端特异性引物。

GhNHXl GSP1: SEQ ID NO: 4：

TGGATTGCTT AGTGCTTACA TTA

GhNHXl GSP2: SEQ ID NO: 5：

CAACGGATCG CGAGGTTGCT CTC

实验步骤按试剂盒说明书操作 （3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与 3' 端引物 AUAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA为模 板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下： ExTaq 购自 TAKARA, 50 lPCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA， 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 4和 AUAP各 2. 0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min e

所得的 PCR产物用双馏水稀释 50倍后取 2. 0 μ 1作为模板， 用 SEQ ID NO : 5 与 3' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下： 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物， 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 5和 AUAP各 2. 0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 第二次 PCR产物回收片段约为 1200bp条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA)连接于 pGEM_T Easy Vector, 转化到大肠杆菌 JM109 (具 体方法同上）， 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养 基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO : 5与 3' 端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增， 得到 5个阳性克隆， 送英潍捷基 （上海） 贸易 有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3' 端。

根据已经获得的 GhNHXl-1基因片段，设计三条特异性引物，作为 5' RACE的 3' 端特异性引物。

GhNHXl-1 GSP3: SEQ ID NO : 6：

CCCTCGCAAC TGAGTATGGC CC

GhNHXl-1 GSP4: SEQ ID NO : 7：

TGCACCACGC ATAAGACCGG CC

GhNHXl-1 GSP5: SEQ ID NO : 8：

ACATGGAGCT TTCTTAGTCA AG

实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与 5'通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6)为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下： Ex Taq购 自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 55°C退火 30 s, 72°C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 所得的 PCR产物用双蒸水 稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 8与 3'端引物 AUAP进行第二轮 PCR 扩增， 具体步骤如下： 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ lOxEx Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ1稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 l Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 8和 AUAP 各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 第二次 PCR回 收片段约为 1200bp条带 (Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 GEM-T Easy Vector, 转化到 JM109(具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄 青霉素的 LB 液体培养基中培养, 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备 用。 SEQ ID NO: 8与 3'端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上）, 得到 4个阳性克隆,送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序,获得该基因的 cDNA 的 5'端。

所得的 5' RACE产物克隆测序后，与 3' RACE产物测序结果拼接。获得 GhNHXl_l 全长 cDNA序列 SEQ ID NO : 19。

SEQ ID NO : 19：

1 CTCTTAGCAA AGACTTCAAA ATCATTAAAG TTTTGTTCGT TAACACAATG GCAATCGGGA

61 TATTAAGCAC TCTTTTAGCA AAATCAGAGA CGATTTTAGG GTCTGGTCAC AGCTCAGTAG

121 TTTCAATGAA TTTATTCGTT GCTCTTCTTT GCGGGTGTAT CGTGATCGGT CATTTGCTAG

181 AGGAAAGCCG ATGGATGAAT GAATCCATTA CTGCCCTTGC CATTGGGCTG TGCACTGGAA

241 TTGTAATTTT GCTTACAACA GGAGGAAAAA GCTCTCATCT TTTAGTTTTC AGTGAAGATT

301 TGTTCTTTAA TTATTTGCTT CCACCTATTA TTTTCAATGC AGGATTCCAG GTGAAAAAGA

361 AGCAATTTTT CCGCAACTTT ATGACCATAA TGCTGTTTGG TGCAGTTGGC ACTTTAATAT

421 CCTTTGCCAT CATATCTCTA GGTGCCATAC ATTTTTTCAA GAAAATGAGT ATTGGTAATC

481 TCAAGATAGG GGATTATCTT GCCATTGGGG CAATATTTTC AGCAACAGAC TCTGTTTGCA

541 CTTTGCAAGT GCTTAATCAG GACGATACGC CTTTATTGTA TAGTCTGGTT TTCGGGGAGG

601 GAGTTGTGAA TGATGCCACA GCTGTTGTTC TTTTCAAAGC AATCCAAAGC TTTGACCTTC

661 CTCACATCAA CACCACCATT GCTTTGCAAT TTGTTGGGAA CTTTTTATAT TTATTCATCT

721 CGAGTACATT GCTTGGGGTT TTGGCTGGAT TGCTTAGTGC TTACATTATT AAAAAGCTCT

781 ATTTCGGAAG GCACTCAACG GATCGCGAGG TTGCTCTCAT GATACTCATG GCTTACCTTT

841 CATATATGCT GGCTGAATTT TTCTATTTAA GTGCGATCCT CACTGTGTTC TTTTGTGGGA

901 TTGTTATGTC TCATTATACA TGGCATAATG TTACCGAAAG TTCAAGAGTG ACAACCAAGC

961 ATGCTTTTGC CACACTATCA TTTGTTGCTG AGATTTTCAT CTTCCTCTAT GTTGGTATGG

1021 ATGCTTTGGA CAT T GAG AAA TGGAGAGTAG T TAG T GAT AG CCCTGGGAAA TCAGTTGGGG

1081 TGAGCGCAAT TCTATTAGGC TTGATTCTTG TTGGGAGAGC AGCCTTTGTT TTCCCTTTAT 1141 CTTCCATTTC CAACTTGACT AAGAAAGCTC CATGTGACAA AATTGATTTC AAACAGCAAG

1201 TTACCATTTG GTGGGCCGGT CTTATGCGTG GTGCAGTTTC AATGGCACTT GCTTATAATC

1261 AGTTTACCAG CTTGGGCCAT ACTCAGTTGC GAGGGAATGC AATGATGATA ACCAGCACAA

1321 TCACAGTTGT ACTTTTCAGC ACTGTGGTTT TTGGCTTGAT GACTAAACCA TTGATTAGAA

1381 TCTTGCTTCC TTCACCGAAA AATCGAATGC TCTCTTCCGA ACCGTCTACA CCTAAGTCAC

1441 TCACCGTGCC GCTTCTCACC AATGGCCACG ACTTAGAGGC TTACGAAAGC GACCGAAATC

1501 TAATAACCCG GCCAACAAGC TTAAGGATGT TCTTGAGCAC TCCTTCCAAC ACCGTGCACT

1561 ACTATTGGAG AAAATTCGAC AACGCGTTCA TGCGACCTGT ATTCGGAGGA AGGGGTTTCG

1621 TACCCTTCGT TCCGGGATCG CCCATCGAAC AAAATGATCA ACAATGGCAG TGAATAATGA

1681 AG AG AT C AC A GATACCAGGT ACTAAAATAC TACACTAATT TTTATAAACT TGTAGGATAG

1741 TGGAATGAAA ACCGGCTTTT CAGTGTGAAG TTTGCTAATA TATACGTGAG AGTTATGTTA

1801 CTTGGACTCG GGTTTGGGTT TTAAATATGG GTATATGTCT GACTTGGATA TATTCATAAA

1861 AAAAATTAAA ACAAAATAGA AGGACACAAA AGTGAGAGTT TGGCCGGTTG ATTTGATTTT

1921 AACAATTTTT TTCCAGCGTT TGCTGTTTAA TGTTTGATTG TATCTTACAT TGAATGCTGC

1981 TTTGGAGTTT TTTTTTCTTT TTTCTTTTTT TTTGTGAGGG TTTTTTTTGT AAAAGGTTTA

2041 ATTTTATTGA TTGTATATCT TTTTATTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 根据 GhNHXl-1全长 cDNA序列设计一对引物如下：

GhNHXl-lF: SEQ ID NO : 9：

ATGGCAATCG GGATATTAAG CACT

GhNHXl-lR: SEQ ID NO : 10：

TCACTGCCAT TGTTGATCAT TTTG

通过 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10来克隆 GhMHl-1全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10各 2· 0 μ 1， 以 及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2. 5倍的无水乙醇， _20°C放置 10分钟， 离心， 去上清， 晾干， 用 21 μ ΐ双蒸水溶解。 加入 2. 5 μ 1 lO X Ex Buffer, 0. 5 μ 1 5 mM 的 dATP ， 2. 5 μ 1 lO X Ex Taq。 反应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到约 1600 bp 的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒）， 连接至 pGEM T-easy载体上，转化 JM109 (方法 同上）， 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培 养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 9与 SEQ ID NO: 10进行菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上）， 得到 4个阳性克隆，送至英 潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2。

NHX1- -1蛋白的氨基酸序列： SEQ]

1 MAIGILSTLL AKSETILGSG

21 HSSWSMNLF VALLCGCIVI

41 GHLLEESRWM NESITALAIG

61 LCTGIV工: LLT TGGKSSHLLV

81 FSEDLFFNYL LPP工工 FNAGF

101 QVKKKQFFRN FMTIMLFGAV

121 GTLISFAIIS LGAIH TKKM

141 SIGNLKIGDY LAIGAIFSAT

161 DSVCTLQVLN QDDTPLLYSL

181 VFGEGWNDA

201 SFDLPHINTT 工 ALQFVGNFL

221 YLFISSTLLG VLAGLLSAYI

241 工 KKLYFGRHS TDREVALMIL

261 MAYLSYMLAE TYLSAILTV

281 TCGIVMSHY TWHNVTESSR

301 VTTKHAFATL SFVAEIFIFL

321 YVGMDALDIE KWRWSDSPG

341 KSVGVSAILL GLILVGRAAF

361 VFPLSSISNL TKKAPCDKID

381 FKQQVT工丽 A GLMRGAVSMA

401 LAYNQFTSLG HTQLRGNAMM

421 ITSTITWLF STWFGLMTK

441 PLIRILLPSP KNRMLSSEPS

461 TPKSLTVPLL TNGHDLEAYE

481 SDRNLITRPT SLRMFLSTPS

501 NTVHYYWRKF DNAFMRPVFG

521 GRGFVPFVPG SPIEQNDQQW 541

GhNHXl-1 编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGCAATCG GGATATTAAG CACTCTTTTA GCAAAATCAG AGACGATTTT AGGGTCTGGT

61 CACAGCTCAG TAGTTTCAAT GAATTTATTC GTTGCTCTTC TTTGCGGGTG TATCGTGATC 121 GGTCATTTGC TAGAGGAAAG CCGATGGATG AATGAATCCA TTACTGCCCT TGCCATTGGG 181 CTGTGCACTG GAATTGTAAT TTTGCTTACA ACAGGAGGAA AAAGCTCTCA TCTTTTAGTT 241 TTCAGTGAAG ATTTGTTCTT TAATTATTTG CTTCCACCTA TTATTTTCAA TGCAGGATTC 301 CAGGTGAAAA AGAAGCAATT TTTCCGCAAC TTTATGACCA TAATGCTGTT TGGTGCAGTT 361 GGCACTTTAA TATCCTTTGC CATCATATCT CTAGGTGCCA TACATTTTTT CAAGAAAATG 421 AGTATTGGTA ATCTCAAGAT AGGGGATTAT CTTGCCATTG GGGCAATATT TTCAGCAACA 481 GACTCTGTTT GCACTTTGCA AGTGCTTAAT CAGGACGATA CGCCTTTATT GTATAGTCTG 541 GTTTTCGGGG AGGGAGTTGT GAATGATGCC ACAGCTGTTG TTCTTTTCAA AGCAATCCAA 601 AGCTTTGACC TTCCTCACAT CAACACCACC ATTGCTTTGC AATTTGTTGG GAACTTTTTA 661 TATTTATTCA TCTCGAGTAC ATTGCTTGGG GTTTTGGCTG GATTGCTTAG TGCTTACATT 721 ATTAAAAAGC TCTATTTCGG AAGGCACTCA ACGGATCGCG AGGTTGCTCT CATGATACTC 781 ATGGCTTACC TTTCATATAT GCTGGCTGAA TTTTTCTATT TAAGTGCGAT CCTCACTGTG 841 TTCTTTTGTG GGATTGTTAT GTCTCATTAT ACATGGCATA ATGTTACCGA AAGTTCAAGA 901 GTGACAACCA AGCATGCTTT TGCCACACTA TCATTTGTTG CTGAGATTTT CATCTTCCTC 961 TATGTTGGTA TGGATGCTTT GGACATTGAG AAATGGAGAG TAGTTAGTGA TAGCCCTGGG 1021 AAATCAGTTG GGGTGAGCGC AATTCTATTA GGCTTGATTC TTGTTGGGAG AGCAGCCTTT 1081 GTTTTCCCTT TATCTTCCAT TTCCAACTTG ACTAAGAAAG CTCCATGTGA CAAAATTGAT 1141 TTCAAACAGC AAGTTACCAT TTGGTGGGCC GGTCTTATGC GTGGTGCAGT TTCAATGGCA 1201 CTTGCTTATA ATCAGTTTAC CAGCTTGGGC CATACTCAGT TGCGAGGGAA TGCAATGATG 1261 ATAACCAGCA CAATCACAGT TGTACTTTTC AGCACTGTGG TTTTTGGCTT GATGACTAAA 1321 CCATTGATTA GAATCTTGCT TCCTTCACCG AAAAATCGAA TGCTCTCTTC CGAACCGTCT 1381 ACACCTAAGT CACTCACCGT GCCGCTTCTC ACCAATGGCC ACGACTTAGA GGCTTACGAA 1441 AGCGACCGAA ATCTAATAAC CCGGCCAACA AGCTTAAGGA TGTTCTTGAG CACTCCTTCC 1501 AACACCGTGC ACTACTATTG GAGAAAATTC GACAACGCGT TCATGCGACC TGTATTCGGA 1561 GGAAGGGGTT TCGTACCCTT CGTTCCGGGA TCGCCCATCG AACAAAATGA TCAACAATGG 1621 CAGTGA

实施例 3 GhNHXl-1基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动� �� rd29A及 Tnos作为 GhNHXl_l 基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12以植物表达载体 PBI121 (购自北京华 夏远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 15XPS Buffer, 3 μ 12· 5 mM的 dNTP, 1.0 μ 1 PBI121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ 1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 56°C退 火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll酶 切连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300_l。

SEQ ID NO: 11 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 12：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14以 PBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的

PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 15XPS Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP, 1.0 μ 1 PBI121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14各 2.0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 mine 通过 Sacl、 EcoRI酶切连接到 pCAMBIA2300-l (promega T4 连接酶盒）获得 PCAMBIA2300-2

SEQ ID NO: 13：

AAG dOTAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 14：

TCA GAA M AGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 以拟南芥 （哥伦比亚型 ， 购自 www. arabidopsis. org)DNA为模板扩增拟南芥 rd29A启动子（参考 Zeng J. , et L. 2002, Preparation of total DNA from "recalcit rant plant taxa" , Acta Bot. Sin. , 44(6)： 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA)。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合 酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μΐ 5XPS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μ 1 拟南芥 DNA， 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16 各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s，58°C退火 30 s，72°C 延伸 30 s， 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Pstl酶切连接到 （连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO : 15：

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA SEQ ID NO : 16：

TGAO^ CTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

SEQ ID NO : 17和 SEQ ID NO : 18扩增 GhNHXl_l(模板是实施例 2所获得 GhNHXl_l )， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 GhNHXl- 1- pGEM， 1. 0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ Μ的引 物 SEQ ID NO : 17和 SEQ ID NO : 18各 2. 0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条 件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个 循环后， 72 °C 延伸 10 min。 通过 Pstl、 Sad 酶切连接到 （连接方法同上） PCAMBIA2300-3, 获得植物表达载体 rd29A_ GhNHXl-l_2300。

SEQ ID NO : 17：

TGAC 7¾ i7ATGGCAATCGGGATATTAAGCACT

SEQ ID NO : 18：

AAGGUCTCACTGCCATTGTTGATCATTTTG 实施例 4 rd29A-GhNHXl-l-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态制备： 提前 1-2天 将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划 单斑接种， 28 °C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml 链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16 h)至 0D600值为 0. 4， 形 成种子菌液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 : 20的比例） 接种于 100 ml同样浓度抗生素 的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2. 5 h至 0D ₆ 。。=0. 8。冰浴菌液 10 min,每隔 3 min 摇匀一次， 令细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液； 加 入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀； 用 10%甘 油重复洗 3-4次； 加入适量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μ 1/管将 其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μ 1的感受态细胞中加入 1 μ 1的 质粒， 混匀后冰浴约 10 min o 将感受态和 DNA的混合物用枪转移到预冷的电击杯中， 轻敲使悬浮液到达底部， 注意不要有气泡。 将电击杯 （购自 bio-rad)放到电击室的 滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。 使用 0. lcm 的电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr" ， 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用枪将细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml 的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。 取 100〜200 μ 1的菌液涂布与相应的抗性筛 选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ g/ml利福平、 50 μ g/ml链霉素、 50 μ g/ml 卡那霉素）， 28°C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子 （国家烟草中期库， 获取单位： 中国农科院烟草所， 库 编号 I5A00660) 30 s， 用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0. 1%升汞浸泡 8 min, 用灭菌双 蒸水洗两次， 完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于 MS (18.78 mMKN0 ₃ , 1.25 mM KH ₂ P0 ₄ , 20.6 mM NH4NO3, 1.5 mM MgS0 ₄ , 3.0 mM CaCl ₂ , 50 μ M KI, 100 μΜ H ₃ B0 ₃ ， 100 μ M MnS0 ₄ , 30 μ M ZnS0 ₄ ， 1 μ M Na ₂ Mo0 ₄ , 0. 1 μΜ CoCl ₂ , 100 μ M Na ₂ EDTA, 100 μΜ FeS0 ₄ ， 7.4 g/L琼脂， 蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件下发芽， 制备无菌苗。 取无菌苗叶片剪成 5 mmX5 mm 大小的叶盘， 用处于对数生长期的含表达载体 rd29A-GhNHXl-l-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min, 吸干菌液， 在黑暗条件下共培养 2 天 （MS 培养基）。 将叶片转到分化培养基 （MS+1 mg/L 细胞分裂素 （BA) +0. 1 mg/L 萘乙酸 (麵 +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素） 上， 光照条件下培养 45天左 右， 待芽长大后切下转移到生根培养基 （MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素） 中培养 30天左右， 待根系发达后将小苗转入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基 上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片， 提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法）， 用 SEQ ID NO: 9： 和 SEQ ID NO: 10 (50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟΧΕχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 DNA, 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72V 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min), PCR鉴定， 保存阳性植株进行编号 T。H1_T。H20。 实施例 6 过表达 GhNHXl-1转基因烟草 T1的耐盐模拟实验及功能鉴定

T。H1-T。H20烟草种子、非转基因对照烟草种子� ��灭菌双蒸水浸泡 30min，用 75%酒精 浸泡 30 s, 用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0. 1%升汞浸泡 8 min, 用灭菌双蒸水洗两次， 完成表面灭菌。 做两组实验： 第一组： 将表面灭菌的 T。H1-T。H20烟草种子、 对照烟草 种子置于 MS固体培养基上于无菌条件下发芽。 第二组： 将表面灭菌的 T。H1-T。H20烟草 种子、对照烟草种子置于添加有 lOOmMNaCl的 MS固体培养基上于无菌条件下发芽。 25 。C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 10天后观察结果。 第一组试验结果表明， 在 MS固体培养基中 TO代各株系的种子发芽率为 90%， 生长状态良好， 均与对照无明显差 异（图 3); 第二组试验结果发现， 在含 lOOmMNaCl的 MS培养基中， T。H1_T。H20烟草种子 和对照种子均能萌发， 但对照植株生长明显受到抑制。 T1代转基因植株（T0代转基因 植物的种子长成的植株）的耐盐性鉴定表明， Ί Η2、 Ί Η5、 Ί Η7、 Ί Η13、 Ί Η15、、 Ί Η16、 Ί\Η19、 Ί\Η20转基因植株生长整体高于对照植株， 显现出明显的耐盐性（参见图 4， 以 Ί Η2为例， Ί Η5、 Ί Η7、 Ί Η13、 Ί Η15、、 Ί Η16、 Ί Η19、 Ί Η20与 Ί Η2的结果类似， 在此 未示出）。 实施例 7 在转录水平上验证 NHX1-1蛋白表达

分别取对照烟草、不耐盐转基因烟草 T1代植株、 耐盐转基因烟草 T1代植株（生 长状况良好） lOOmMNaCl处理 14天叶子 0.05g,用植物 RNA提取试剂盒（ invitrogen) 提取的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA浓度。使用 invitrogen反转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase并依照说明书中方法进行反转录 （2 μ g总 R A作为模板，反 转录引物 SEQ ID NO: 10)。 通过 SEQ ID N0:9和 SEQ ID NO: 10扩增 GhNHXl_l， 检测 GhNHXl-1蛋白相对表达情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以反转录 的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ 1， 以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin， 29个循环后， 72°C 延伸 10 mine 产物电泳结果如图 5所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000,购自深圳瑞真 生物技术有限公司）， 1-5为对照烟草， 6-15为耐盐转基因烟草 T1代植株， 16_21为 不耐盐转基因烟草 T1代植株。 图中所示条带大小与 GhNHXl-1基因的大小一致。结果 表明对照烟草没有转录 GhNHXl-1的 mRNA, 耐盐转基因烟草 T1代植株对 GhNHXl-1的 转录较强， 不耐盐转基因烟草 T1代植株没有转录或者转录很弱。