一个棉花离子通道类蛋白及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及离子通道类蛋白及其编码基因与应 用，特别是涉及一个来源于棉 花的离子通道类蛋白 S0S1及其编码基因， 以及其在培育耐盐性提高的转基因植 物中的应用。 背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危 害之一， 盐渍土壤通常以钠 盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导 致粮食和经济作物减产的主要因素。 世界上盐碱土的面积约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1/3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面积约 0. 4亿公顷。 随着我国人口增加， 耕地减少， 盐碱地资源的开 发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐 碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐 碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物 种或品系的选育，则是利用盐碱地 经济、 有效的措施。 对绝大多数农作物来说， 大多数植物对盐碱、 干旱的耐受性 差， 只能生长在氯化钠含量为 0. 3%以下的土壤上， 土壤中过量的 Na ⁺ 会对植物体 的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在 盐渍环境下提高作物产量就成为全 世界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状， 其耐盐机制涉及从植株到器官、 组织、 生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家 也为此做了大量的工作， 并 取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物 拟南芥来研究植物的耐盐分子机理 方面， 使该领域的研究有了突破性的进展 （Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53： 1247-1273； Zhang ZL. 2011. Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre— mRNA Spl icing through Altering Histone H4R3 and Smal l Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cel l, 23 : 396 - 411 )。 高等植物细胞可有多种途径感受外 界环境中物化参数的变化， 从而将胞外的信号变为胞内信号， 通过系列的信号传 导最后将胁迫信号传递至细胞核内， 激活转录因子， 而激活转录因子再作用于功 能基因， 启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆 性。尽管研究者已从不同 侧面开展了大量研究， 但由于其机制十分复杂， 植物抗盐中的许多重要问题仍有 待探索。例如， 植物抗盐的关键因子仍未找到； 植物耐盐的分子机制并不十分清 楚。 发明内容 本发明人利用 SSH与 RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个离子通� �类蛋 白 （本文命名为 S0S1 ) 的编码基因的 DNA序列。 并发现将其导入转基因植株后， 可明显改善转基因植株的抗盐性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个离子通道类蛋 白 S0S1的编码基因， 其序列 为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含 有本发明第一方面所述的基因 并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的 表达控制序列可操作地连接；优选 地， 所述载体为附图 2所示的 35S-GhS0Sl-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本 发明第一方面所述的基因或者 本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地 ，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方 法， 包括： 将本发明第一方面 所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达 载体导入植物或植物组织并使所 述基因表达； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法， 包括： 在有效产生植物的 条件下培养含有本发明第一方面所述基因、本 发明第二方面所述的重组表达载体 的植物或植物组织； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、本发明第二方面所述的重 组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细 胞用于改善植物耐盐性以及用于 植物育种的用途； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第七方面提供发明第一方面所述的基因 编码的氨基酸序列，如 SEQ ID N0 : 1所示。 附图说明 图 1是 GhSOSl的植物表达载体（35S-GhS0Sl-2300)的构建流� �。

图 2是 GhSOSl的植物表达载体（35S-GhS0Sl-2300)的质粒图� �

图 3是 GhSOSl转基因 T1代烟草植株 （图右， T\W3 ) 和作为对照的非转基因烟 草植株 （图左） 的耐盐模拟实验结果。

图 4是 GhSOSl转基因 T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平� ��的蛋白 表达验证结果。 M为 Marker, 1_8为正常生长转基因植株， 9_12为对照植株， 13为 正对照 （GhSOSl )。 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步 说明。 实施例 1 盐胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方 法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实 验过程中以经 NaCl处理 6h的棉花 幼苗的根的 mRNA作为样品 （tester), 以未处理的棉花幼苗的根的 mRNA作为对 照 ( driver)。

( 1 ) 供试材料：

非洲棉（国家棉花中期库，获取单位中国棉花 研究所，统一编号： ZM-06838) 播种到灭过菌的蛭石上， 在 25°C、 光暗周期 16h/8h条件下培养， 每周浇 1/2MS 培养基 （9· 39 mM KN0 ₃ ， 0. 625 mM KH2P0 ₄ ， 10. 3 mM NH ₄ N0 ₃ ， 0. 75 mM MgS0 ₄ ， 1. 5 mM CaCl ₂ , 50 μ Μ ΚΙ , 100 μ Μ ¾Β0 ₃ ， 100 M MnS0 ₄ , 30 μ M ZnS0 ₄ ， 1 μ M N¾Mo0 ₄ , 0. 1 M CoCl ₂ , 100 μ M N¾EDTA, 100 μ M FeS0 ₄ ) 一次。 当苗株长高达 25-30 cm 时用于实验。

( 2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4株。 第一组为对照组， 在 25°C、 光照下培养， 放置到 1/2MS液体培养基中。 第二组为处理组， 25°C、 光照下培养， 放置到添加 有终浓度为 200 mM NaCl的 1/2MS液体培养基中， 处理 6小时， 处理完毕后及时 剪取两组幼苗的根， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。 (3) 总 RNA提取：

分别取对照和 NaCl处理的棉花根 0.5g，用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen) 提取棉花的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 0D260/0D280比值为 1.8-2· 0， 表明总 RNA纯度较高， 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒 (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

(4) 抑制消减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法 进行抑制差减杂交。 应用 Clontech 的 PCR-Select cDNA Subtraction Kits 差 减杂交试剂盒， 先将 Driver 和 Tester 的 mRNA分别反转录， 得到双链 cDNA, 再 以 2 Tester 和 2 g Driver cDNA 作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水 浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsal酶切 1.5 h， 然后将酶切后的 Tester cDNA 分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA不连接接头。 两 种连接有不同接头的 Tester cDNA 分别与过量的 Driver 混合， 进行第一次差减 杂交。 将两种第一次差减杂交的产物混合， 再与新鲜变性的 Driver cDNA进行 第二次差减杂交，通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

(5) cDNA消减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物（QIAquick PCR Purification Kit 纯化，购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒）载体连接，依照 pGEM-T Easy试剂盒的程序， 具体步骤如下： 用 200 μ 1 PCR管依次加入下列成分： 纯 化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1, Τ4连接酶缓冲液 5 μ 1， pGEM-T Easy载体 1 μ 1， T4 DNA连接酶 1 μ ΐ ， 于 4 °C连接过夜。 取 10 μ L 连接反应产物， 加入到 100 μ L感受态大肠杆菌 JMI09 (购自 TAKARA)中，冰浴 30 min、热休克 60 s、冰浴 2 min, 另加 250 μ L LB培养液（ 1% Tryptone购自 0X0ID, 0.5% Yeast Extract购自 0X0ID, 1% NaCl购自国药）置 37°C水浴中， 以 225 r/min 振荡培养 30 min， 取 200 μ L菌液种植于含 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB (同上） /X-gal/IPTG (X-gal/IPTG购自 TAKARA) 培养板上， 37 °C培育 18 h。 计数培养 板中直径>1 mm的清晰白色及蓝色菌落数， 随机挑取 300个白色菌落 (编号： Gh-S2-001至 Gh-S2-300)。 将所有白色克隆挑于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓 度 20%， 于 - 80°C保存备用。 以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R (Clontech 公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增， 得 到 231个阳性克隆， 对所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序 ( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将上述 231个差异克隆的 DNA测序，将 DNA测序结果去除载体和不明确序列 及冗余的 cDNA后， 共得到 203个有效 EST (uni gene)。 实施例 2 棉花离子通道类编码基因 GhSOSl的克隆

克隆子 Gh-S2-073去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明 该序列的编码的氨基酸序列属于离子通道类蛋 白 S0S1 ,本文将克隆子 Gh-S2-073 编码的全长基因命名为 GhSOSl,该基因对应的蛋白命名为 S0S1。

SEQ ID No: 3

1 ACATCTTTGT CCAAGTATCA CGTTGCATTG TTGTTGGAGT ATTATATCCA TTCTTACGAT

61 ATTTTGGATA TGGTTTGGAT TTAAAGGAGG CTGCCATCCT AATATGGTCG GGGCTCCGGG

121 GAGCTGTTGC ATTATCACTT TCTCTCTCTG TTAAGCGTTC CAGTGGCGGC TCATTTAATC

181 TCAGCTCTGA AACTGGAAGC CGGTTCATTT TCTTCACCGG TGGAATTGTA TTCCTGACAC

241 TTATTGTGAA TGGATCAACC ACACAGTTCA TTTTAAATTT TCTGGGTCTG GATAAACTAT

301 CAGCAGCCAA GAAGCGTATA CTAGACTACA CAAAGTATGA AATGTTGAAC AAAGCATTCG

361 AGGCTTTTGA AGACCTCGTA GATGATGAGG AACTTGGACC TGCTGATTGG CCTACAGTAA

421 AGAGATACAT TACAAGCTTA AACGATTTGG AGGGGGACCG TGTGCATCCT CATACTGAAT

481 CTGAAGCTGA TAATGACCTG GACCCTTCAA ACTTGAAAGA TATAAGAATA CGACTTTTAA

541 ATGGTGTCCA GGCAGCATAC TGGGGAATGC TTGATGAAGG TAGAATTGCA CAAAGCACAG

601 CAAATCTGTT GATGCAATCT GTAGATGAAG CTGTTGATGC GGCATCTCAT GAACCTTTAT

661 GTGATTGGAA GGGCTTAAAA TCTAATGTGC AGTTCCCGAA TTATTACAAG TTTCTTCAGA

721 GAAGCATGTT CCCACAAAAA CTGATTACAT TTTTCACTGT GGAAAGGCTG GAAAATGGGT

781 GTTGTATTTG TGCTGCATTT CTTCGAGCTC ATAGAATAGC ACGACGGCAA CTTCATGAAT

841 TTATAGGTGA CAGTGTAGTT GCTTCTACTG TAATTGCTGA AAGTGAAGCT GAAGGAGAAG

901 AGGCGAGGAA GTTTCTGGAA GATGTCCGTA TAACTTTTCC TCAGGTTTTA CGTGTTGTGA

961 AAACAAGACA AGTGACCTAC TCAGT

GhSOSl全长基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列， 设计两条特异性引物， 作为 3' RACE 的 5' 端特异性引物。

GhSOSl GSP1 : SEQ ID NO: 4：

TCAGCTCTGAAACTGGAAGCCG GhSOSl GSP2: SEQ ID NO: 5：

CAGCAGCCAAGAAGCGTATACT

实验步骤按试剂盒说明书操作 （3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与 3' 端引物 AUAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA 为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下： Ex Taq购自 TAKARA, 50 μ 1 PCR 反应体系： 5 μ 1 ΙΟΧΕχ Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 mRNA反转 录的 cDNA, 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μ 1， 以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58 °C 退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双熘水稀释 50倍后取 2.0 μ 1作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 3' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下： 50 μ 1 PCR反应体 系： 5 μ ΐ ΙΟΧΕχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR 产物， 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5和 AUAP各 2.0 μ 1， 以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退 火 30 s， 72V 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 第二次 PCR产物 回收片段约为 2400bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA)连接于 pGEM_T Easy Vector, 转化到大肠杆菌 JM109(具体方法同上）， 随机挑取 10个白色菌落于含 有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终 浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID N0: 5与 3' 端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增， 得到 3个阳性克隆， 送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3' 端。

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列， 设计三条特异性引物， 作为 5' RACE 的 3' 端特异性引物。

GhSOSl GSP3: SEQ ID NO: 6：

TCTTCCAGAAACTTCCTCGCCT

GhSOSl GSP4: SEQ ID NO: 7：

GCAACTACACTGTCACCTATAA

GhSOSl GSP5: SEQ ID NO: 8： ACAGATTGCATCAACAGATTTG

实验步骤按试剂盒说明书操作 （5 ' RACE System for Rapid Ampl ification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与 5'通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO : 6 )为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下： Ex Taq 购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μΐ mRNA反转录的 cDNA, 1. 0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO : 7和 AAP 各 2. 0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变 性 30 s, 55°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2. 0 μΐ作为模板， 用 SEQ ID NO : 8与 3'端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下： 50 μ1 ΡΟ?反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1. 0 μΐ Ex Taq, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO : 8和 AUAP各 2. 0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72°C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 第二次 PCR回收片段约为 1700bp条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到 JM109 (具体 方法同上）， 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ _§ ΐ氨苄青霉素的 LB 液体培 养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID N0 : 8与 3'端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳 性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测 序测序，获得该基因的 cDNA的 5，端。

所得的 5 ' RACE产物克隆测序后，与 3 ' RACE产物测序结果拼接。获得 GhSOSl 的 cDNA序列 SEQ ID NO : 9。

SEQ ID NO : 9：

1 GTGATCAGAG TTGTAATAAC ATGGAGGAAG TGAAAGAGTA TCTATACGTC TTACCGTCAA

61 GAATGCTAGA GGAAATTAGC TCCAGTGAAT CGGAGCCAGT GGATGCGGTC ATCTTTGTTG

121 GGATTTCTTT GGTATTAGGA ATCGCTTCCA GGCATCTTCT TCGCGGCACC AGAGTTCCTT

181 ACACTGTCGC TTTGCTCATC ATTGGCCTTG GTCTCGGCTC TCTCGAATAT GGTACAAGTC

241 ATAAATTAGG AAGGATTGGT GATGGCATTC GACTTTGGAA CAACATTGAT CCTGACCTTC

301 TATTAGCTGT TTTTCTACCC GCATTACTTT TTGAGAGTGC ATTTTCTATG GAAGTGCACC

361 AGATAAAGAG GTGTATGGCA CAAATGGTTC TGCTTGCTGG TCCTGGAGTT ATTATTTCAA

421 CCTTCTGTCT TGGATTTGCT CTGAAGATCA CTTTTCCATA TGAGTGGAAC TGGAAAACAT

481 CACTGTTGCT TGGGGGACTT CTGAGTGCTA CTGATCCTGT TGCTGTTGTG GCTTTGTTGA

541 AGGAGCTTGG TGCTAGCAAA AAACTGAGCA CCATAATTGA AGGAGAATCC TTAATGAATG 601 ATGGGACAGC AATTGTGGTC TATCAGTTAT TCTTTAAAAT GGTAAATGGA GAGAGCTTTA

661 GTTGGGATGC CATTATTGGA TTTCTGGCCA AAGTCGCTCT TGGAGCTGTC GGCCTTGGAA

721 TTGCTTTTGG GATAGCATCT GTTTTGTGGC TTGGATTTAT TTTCAATGAT ACAGTGATTG

781 AGATTACATT GACAGTTGCT GTGAGCTATG TTGTTTACTT CACTGGTCAA GAAGGTATTG

841 AAGTTTCTGG TGTTTTGGCA GTGATGACTT TAGGAATGTT TTATGCTGCT GTTGCGAAGA

901 CAGCCTTTAA GGGTGATGGT CAGCAGAGTT TGCATCACTT TTGGGAAATG GTTGCTTATA

961 TTGCAAATAC ATTAATTTTC ATCTTGAGTG GAGTTGTTAT AGCTGAAGGC ATTCTTGGCA

1021 ATGATAAGAT ATTTCAGAAC AATGGAAATT CATGGGGTTA TCTGATTCTT CTGTACATCT

1081 TTGTCCAAGT ATCACGTTGC ATTGTTGTTG GAGTATTATA TCCATTCTTA CGATATTTTG

1141 GATATGGTTT GGATTTAAAG GAGGCTGCCA TCCTAATATG GTCGGGGCTC CGGGGAGCTG

1201 TTGCATTATC ACTTTCTCTC TCTGTTAAGC GTTCCAGTGG CGGCTCATTT AATCTCAGCT

1261 CTGAAACTGG AAGCCGGTTC ATTTTCTTCA CCGGTGGAAT TGTATTCCTG ACACTTATTG

1321 TGAATGGATC AACCACACAG TTCATTTTAA ATTTTCTGGG TCTGGATAAA CTATCAGCAG

1381 CCAAGAAGCG TATACTAGAC TACACAAAGT ATGAAATGTT GAACAAAGCA TTCGAGGCTT

1441 TTGAAGACCT CGTAGATGAT GAGGAACTTG GACCTGCTGA TTGGCCTACA GTAAAGAGAT

1501 ACATTACAAG CTTAAACGAT TTGGAGGGGG ACCGTGTGCA TCCTCATACT GAATCTGAAG

1561 CTGATAATGA CCTGGACCCT TCAAACTTGA AAGATATAAG AATACGACTT TTAAATGGTG

1621 TCCAGGCAGC ATACTGGGGA ATGCTTGATG AAGGTAGAAT TGCACAAAGC ACAGCAAATC

1681 TGTTGATGCA ATCTGTAGAT GAAGCTGTTG ATGCGGCATC TCATGAACCT TTATGTGATT

1741 GGAAGGGCTT AAAATCTAAT GTGCAGTTCC CGAATTATTA CAAGTTTCTT CAGAGAAGCA

1801 TGTTCCCACA AAAACTGATT ACATTTTTCA CTGTGGAAAG GCTGGAAAAT GGGTGTTGTA

1861 TTTGTGCTGC ATTTCTTCGA GCTCATAGAA TAGCACGACG GCAACTTCAT GAATTTATAG

1921 GTGACAGTGT AGTTGCTTCT ACTGTAATTG CTGAAAGTGA AGCTGAAGGA GAAGAGGCGA

1981 GGAAGTTTCT GGAAGATGTC CGTATAACTT TTCCTCAGGT TTTACGTGTT GTGAAAACAA

2041 GACAAGTGAC CTACTCAGTA CTGAACCATC TGATTGATTA TTTACATAAC CTCGAGAAGG

2101 CGGGGTTACT GGAAGAAAAA GAGATGCTTC ATCTTCATGA TGCTGTCCAG ACTGACTTGA

2161 AGAGGCTCTT AAGGAATCCT CCATTAGTAA AGATTCCAAA AATAAATGAT ATTATAAGTG

2221 CTCATCCTTT TCTAGGTGCC CTTCCTTCTA GTGTCCGCGA ATCACTAGAA TGTTCTACAA

2281 AAGAAAAAAT GAAAACACGT GGTATGACAC TTTACAAAGA GGGCTCTAGA CCAAATGGTA

2341 TTTGGCTTAT TTCAAATGGT GTTGTCAAGT GGAAGAGTAA GAGCATACGA AACAAGCACT

2401 CAATGCATCC AACTTTTACT CATGGGAGTA CGTTGGGCTT GTATGAAGTA TTGGTTGGAA

2461 AACCATACAT CTGCGACATG GTCTCAGATT CCATGGTTCT CTGTTTTTTT ATTGAAAGTG

2521 ACAGAATTCT TTCAATGCTA AGGTCGGATC CTGCACTAGA AGATTTTCTG TGGCAGGAAA

2581 GTGCTATTGT ACTTGCCAAA CTCTTGTTTC CTCAAATATT TGAGAAAATA GCGCTGCATG

2641 ATTTGAGAGC TCTTGTGGCA GAAAGGTCAT CAATGAAAAC ATACATTACA GGGGAATCAA

2701 TAGAAGTGTG TCACCAATCT GTCGGCTTCA TGTTGGAAGG GTTCATCAAG CCCTCACATG

2761 CTGAAGGCGA ACTCATCAAA TCACCAGCAG TTCTTTTGCC TTCACAAGGG AATCAAAGTT

2821 TCTTTCATGC AGATAAGTCA GGTTCTACAA CAGCCAGTTT TTCTCATCAG CGATCCGGGT

2881 ATCTACTTGA GACAAGAGGA AGCGTAATAT ACCAAGTTGA GACCAGAGCA AGAGTAATTA

2941 TATTTGATAT TGCAACACTT GAAGGCAATA GGGTTTTGCG GAACAATTCA TCTTCATTTA

3001 ACCTTTCACA TAGATCTTTA ACTAGAGAAC ATGGAGGTCT TATGAGTTGG CCCGAACATT

3061 TCTTTAGGGG AAGACAACAT ACACAAAATC ATGACGCAAC TGATCAACAA GTAAACAGAT

3121 TGTCAGCAAG AGCCATGCAG TTAAGCATAT TTGGCAGTAA GGTAAATTTG CCACAGCGTA

3181 GCTGGAGTTT ATCAAGGATG AATCAGTGTC AGCCAATAAA CAACCCGTCA TATAATAGAT 3241 TTCTTTCATT CCCTGGCCAT CTACTGGTCT CTGCCGGATC AGAAGGAGCT TCCACTATGA

3301 GGAAGAATAA CAAAGAAGCT GGAAAGATAA CAAGGCGAGT ACCCTCAGCA CAAGCGAAGA

3361 AGATGGACAC GAAAGAGGGT CACGTAAATG ATGATTCAAG TGATGAATCT GGCGGTGAGG

3421 ATGAGATCCT GGTAAGAATC GATTCGCCTA GTGTACTATC ATTCCACCAG GCTTCTTAAA

3481 GGTTTGTCTA CATCCTACCT ATTCATGGCT GTGATTTCTT GTCCCACTGT TGTATCACTA

3541 TAGGATTGCT TATGGTGTCT TTTTATGTGT AGCATAATAT CTGTAGTTTG GTTATGAATA

3601 AAAGCTTGGT TTAATTCATG CACCAAAGAA AGAAAAAAGA GAAGCTTGGT TTAATTCGAC

3661 TCATCTCGTT TTTCCATTCA ACTTTTATTA GTTAACAAGT CTTTGTTTTA GAAAAGAGGG

3721 AGCTCAATTT CTGTATCAAT CCTGAAACTA TGGATTTTTC ATTAATTATT GAATTAAATG

3781 TTTGGATTTG TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 根据 GhSOSl全长 cDNA序列设计 对引物如下：

GhSOSIF: SEQ ID NO : 10：

ATGGAGGAAGTGAAAGAGTATCTAT

GhSOSIR: SEQ ID NO : 11：

TTAAGAAGCCTGGTGGAATGATAG

通过 SEQ ID NO : 10和 SEQ ID NO : 11来克隆 GhSOSl全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 10和 SEQ ID NO : 11各 2. 0 μ 1， 以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2. 5倍的无水乙醇， _20°C放置 10分钟， 离心， 去上清， 晾干， 用 21 μ ΐ双蒸水溶解。 加入 2. 5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Buffer, 0. 5 μ 1 5 mM的 dATP ， 2. 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Taq。 反应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到约 3300 bp的 DNA片段回收 （Omega回收试剂盒）， 连接至 pGEM T-easy 载体上 （得到 GhSOSl-pGEM质粒） ，转化 JM109 (方法同上）， 随机挑取 10个白色 菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加 甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO : 10与 SEQ ID NO : 11进行菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 4个阳性克隆，送至英潍捷基 （上 海） 贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID N0 : 2， 其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

S0S1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MEEVKEYLYV LPSRMLEEIS sbHDAaisao 丄 I人丄) IWSS 3 T88

I ΙδΑΓΠ T98 wiAivsabi lf8 iwsiinasai TS8

Λ3λΈΠ丄 S3H T08 Of 丄 d丄 d欄 SH™ T8Z

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921 SPAVLLPSQG NQSFFHADKS

941 GSTTASFSHQ RSGYLLETRG

961 SVIYQVETRA RVIIFDIATL

981 EGNRVLRNNS SSFNLSHRSL

1001 TREHGGLMSW PEHFFRGRQH

1021 TQNHDATDQQ VNRLSARAMQ

1041 LSIFGSKVNL PQRSWSLSRM

1061 NQCQPINNPS YNRFLSFPGH

1081 LLVSAGSEGA STMRKNNKEA

1101 GKITRRVPSA QAKKMDTKEG

1121 HVNDDSSDES GGEDEILVRI

1141 DSPSVLSFHQ AS*

GhSOSl 编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGAGGAAG TGAAAGAGTA TCTATACGTC TTACCGTCAA GAATGCTAGA GGAAATTAGC

61 TCCAGTGAAT CGGAGCCAGT GGATGCGGTC ATCTTTGTTG GGATTTCTTT GGTATTAGGA

121 ATCGCTTCCA GGCATCTTCT TCGCGGCACC AGAGTTCCTT ACACTGTCGC TTTGCTCATC

181 ATTGGCCTTG GTCTCGGCTC TCTCGAATAT GGTACAAGTC ATAAATTAGG AAGGATTGGT

241 GATGGCATTC GACTTTGGAA CAACATTGAT CCTGACCTTC TATTAGCTGT TTTTCTACCC

301 GCATTACTTT TTGAGAGTGC ATTTTCTATG GAAGTGCACC AGATAAAGAG GTGTATGGCA

361 CAAATGGTTC TGCTTGCTGG TCCTGGAGTT ATTATTTCAA CCTTCTGTCT TGGATTTGCT

421 CTGAAGATCA CTTTTCCATA TGAGTGGAAC TGGAAAACAT CACTGTTGCT TGGGGGACTT

481 CTGAGTGCTA CTGATCCTGT TGCTGTTGTG GCTTTGTTGA AGGAGCTTGG TGCTAGCAAA

541 AAACTGAGCA CCATAATTGA AGGAGAATCC TTAATGAATG ATGGGACAGC AATTGTGGTC

601 TATCAGTTAT TCTTTAAAAT GGTAAATGGA GAGAGCTTTA GTTGGGATGC CATTATTGGA

661 TTTCTGGCCA AAGTCGCTCT TGGAGCTGTC GGCCTTGGAA TTGCTTTTGG GATAGCATCT

721 GTTTTGTGGC TTGGATTTAT TTTCAATGAT ACAGTGATTG AGATTACATT GACAGTTGCT

781 GTGAGCTATG TTGTTTACTT CACTGGTCAA GAAGGTATTG AAGTTTCTGG TGTTTTGGCA

841 GTGATGACTT TAGGAATGTT TTATGCTGCT GTTGCGAAGA CAGCCTTTAA GGGTGATGGT

901 CAGCAGAGTT TGCATCACTT TTGGGAAATG GTTGCTTATA TTGCAAATAC ATTAATTTTC

961 ATCTTGAGTG GAGTTGTTAT AGCTGAAGGC ATTCTTGGCA ATGATAAGAT ATTTCAGAAC

1021 AATGGAAATT CATGGGGTTA TCTGATTCTT CTGTACATCT TTGTCCAAGT ATCACGTTGC

1081 ATTGTTGTTG GAGTATTATA TCCATTCTTA CGATATTTTG GATATGGTTT GGATTTAAAG

1141 GAGGCTGCCA TCCTAATATG GTCGGGGCTC CGGGGAGCTG TTGCATTATC ACTTTCTCTC

1201 TCTGTTAAGC GTTCCAGTGG CGGCTCATTT AATCTCAGCT CTGAAACTGG AAGCCGGTTC

1261 ATTTTCTTCA CCGGTGGAAT TGTATTCCTG ACACTTATTG TGAATGGATC AACCACACAG

1321 TTCATTTTAA ATTTTCTGGG TCTGGATAAA CTATCAGCAG CCAAGAAGCG TATACTAGAC

1381 TACACAAAGT ATGAAATGTT GAACAAAGCA TTCGAGGCTT TTGAAGACCT CGTAGATGAT

1441 GAGGAACTTG GACCTGCTGA TTGGCCTACA GTAAAGAGAT ACATTACAAG CTTAAACGAT

1501 TTGGAGGGGG ACCGTGTGCA TCCTCATACT GAATCTGAAG CTGATAATGA CCTGGACCCT

1561 TCAAACTTGA AAGATATAAG AATACGACTT TTAAATGGTG TCCAGGCAGC ATACTGGGGA

1621 ATGCTTGATG AAGGTAGAAT TGCACAAAGC ACAGCAAATC TGTTGATGCA ATCTGTAGAT 1681 GAAGCTGTTG ATGCGGCATC TCATGAACCT TTATGTGATT GGAAGGGCTT AAAATCTAAT

1741 GTGCAGTTCC CGAATTATTA CAAGTTTCTT CAGAGAAGCA TGTTCCCACA AAAACTGATT

1801 ACATTTTTCA CTGTGGAAAG GCTGGAAAAT GGGTGTTGTA TTTGTGCTGC ATTTCTTCGA

1861 GCTCATAGAA TAGCACGACG GCAACTTCAT GAATTTATAG GTGACAGTGT AGTTGCTTCT

1921 ACTGTAATTG CTGAAAGTGA AGCTGAAGGA GAAGAGGCGA GGAAGTTTCT GGAAGATGTC

1981 CGTATAACTT TTCCTCAGGT TTTACGTGTT GTGAAAACAA GACAAGTGAC CTACTCAGTA

2041 CTGAACCATC TGATTGATTA TTTACATAAC CTCGAGAAGG CGGGGTTACT GGAAGAAAAA

2101 GAGATGCTTC ATCTTCATGA TGCTGTCCAG ACTGACTTGA AGAGGCTCTT AAGGAATCCT

2161 CCATTAGTAA AGATTCCAAA AATAAATGAT ATTATAAGTG CTCATCCTTT TCTAGGTGCC

2221 CTTCCTTCTA GTGTCCGCGA ATCACTAGAA TGTTCTACAA AAGAAAAAAT GAAAACACGT

2281 GGTATGACAC TTTACAAAGA GGGCTCTAGA CCAAATGGTA TTTGGCTTAT TTCAAATGGT

2341 GTTGTCAAGT GGAAGAGTAA GAGCATACGA AACAAGCACT CAATGCATCC AACTTTTACT

2401 CATGGGAGTA CGTTGGGCTT GTATGAAGTA TTGGTTGGAA AACCATACAT CTGCGACATG

2461 GTCTCAGATT CCATGGTTCT CTGTTTTTTT ATTGAAAGTG ACAGAATTCT TTCAATGCTA

2521 AGGTCGGATC CTGCACTAGA AGATTTTCTG TGGCAGGAAA GTGCTATTGT ACTTGCCAAA

2581 CTCTTGTTTC CTCAAATATT TGAGAAAATA GCGCTGCATG ATTTGAGAGC TCTTGTGGCA

2641 GAAAGGTCAT CAATGAAAAC ATACATTACA GGGGAATCAA TAGAAGTGTG TCACCAATCT

2701 GTCGGCTTCA TGTTGGAAGG GTTCATCAAG CCCTCACATG CTGAAGGCGA ACTCATCAAA

2761 TCACCAGCAG TTCTTTTGCC TTCACAAGGG AATCAAAGTT TCTTTCATGC AGATAAGTCA

2821 GGTTCTACAA CAGCCAGTTT TTCTCATCAG CGATCCGGGT ATCTACTTGA GACAAGAGGA

2881 AGCGTAATAT ACCAAGTTGA GACCAGAGCA AGAGTAATTA TATTTGATAT TGCAACACTT

2941 GAAGGCAATA GGGTTTTGCG GAACAATTCA TCTTCATTTA ACCTTTCACA TAGATCTTTA

3001 ACTAGAGAAC ATGGAGGTCT TATGAGTTGG CCCGAACATT TCTTTAGGGG AAGACAACAT

3061 ACACAAAATC ATGACGCAAC TGATCAACAA GTAAACAGAT TGTCAGCAAG AGCCATGCAG

3121 TTAAGCATAT TTGGCAGTAA GGTAAATTTG CCACAGCGTA GCTGGAGTTT ATCAAGGATG

3181 AATCAGTGTC AGCCAATAAA CAACCCGTCA TATAATAGAT TTCTTTCATT CCCTGGCCAT

3241 CTACTGGTCT CTGCCGGATC AGAAGGAGCT TCCACTATGA GGAAGAATAA CAAAGAAGCT

3301 GGAAAGATAA CAAGGCGAGT ACCCTCAGCA CAAGCGAAGA AGATGGACAC GAAAGAGGGT

3361 CACGTAAATG ATGATTCAAG TGATGAATCT GGCGGTGAGG ATGAGATCCT GGTAAGAATC

3421 GATTCGCCTA GTGTACTATC ATTCCACCAG GCTTCTTAA 实施例 3 GhSOSl基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任 公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启 动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择 35S及 Tnos作为 GhSOSl基因的 启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13以植物表达载体 PBI 121 (购自北 京华夏远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 PBI 121 , 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ 1, 以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll酶切连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒）获 得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 12 ：

GCACGAATTCGGCGGGAAACGACAATCTGA

SEQ ID NO: 13：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 14禾 P SEQ ID NO: 15以 PBI121为模板扩增 Tnos， 采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5XPS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 PBI121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个 循环后，72°C 延伸 10 min。通过 KpnI、EcoRI酶切连接到 pCAMBIA2300_l (promega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2

SEQ ID NO: 14：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300为模板扩增 35S启动子， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5XPS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 pCambia2300质粒， 1· 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ 1， 以及 31 μ 1的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 HindIII、 Sail酶切连接到 (连接方法同上） PCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300_3

SEQ ID NO: 16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17： TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT

SEQ ID NO : 18和 SEQ ID NO : 19扩增 GhSOSl (模板是实施例 2所获得的

GhSOSl-pGEM质粒）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反 应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 GhSOSl-pGEM, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 18和 SEQ ID NO : 19各 2. 0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58 °C 退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min。 通过 Kpnl、 Sai l 酶切连接到 （连接方法同上） PCAMBIA2300-3， 获得植物表达载体 35S-

GhSOSl- 2300。

SEQ ID NO : 18：

TGACTGCAGATGGAGGAAGTGAAAGAGTATCTAT SEQ ID NO : 19：

AAGGAGCTCTTAAGAAGCCTGGTGGAATGATAG

实施例 4 35S-GhS0Sl-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc ) 感受态制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养 基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利 福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16 h) 至 0D600值为 0. 4， 形成种子菌液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 : 20的比例） 接种 于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2. 5 h至 0D ₆ 。。=0. 8。 冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次， 令细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液； 加入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀； 用 10%甘油重复洗 3_4次； 加入适量冰浴预冷的 10% 甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μ ΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μ 1的感受态细胞中加入 1 μ 1 的质粒， 混匀后冰浴约 10 min。 将感受态和 DNA的混合物用枪转移到预冷的电 击杯中， 轻敲使悬浮液到达底部， 注意不要有气泡。 将电击杯 （购自 bio-rad) 放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使 用 0. lcm的 电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad)的程序设置为 "Agr" ， 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用枪将细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。 取 100〜200 μ 1的 菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含 50 g/ml利福 平、 50 y g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素）， 28°C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库， 获取单位： 中国农科院烟草所， 库编号 I5A00660) 30 s， 用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0.1%升汞浸泡 8 min， 用 灭菌双蒸水洗两次， 完成表面灭菌。 将表面灭菌的烟草种子置于 MS (18.78 mM KN0 ₃ ， 1.25 mM KH ₂ P0 ₄ ， 20.6 mM NH ₄ N0 ₃ ， 1.5 mM MgS0 ₄ ， 3.0 mM CaCl ₂ ， 50 μ M KI， 100 μΜ Η ₃ Β0 ₃ ， 100 μ M MnS0 ₄ , 30 μ M ZnS0 ₄ ， 1 μ M N¾Mo0 ₄ ， 0.1 μΜ CoCl ₂ , 100 μ M N¾EDTA， 100 μ M FeS0 ₄ ， 7.4 g/L琼脂， 蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件 下发芽， 制备无菌苗。 取无菌苗叶片剪成 5 mmX5 mm大小的叶盘， 用处于对数 生长期的含表达载体 35S-GhS0Sl-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min, 吸干菌液， 在黑暗条件下共培养 2天 （MS培养基）。 将叶片转到分化培养基 （MS+1 mg/L细 胞分裂素 （BA) +0.1 mg/L萘乙酸 （NAA) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉 素）上， 光照条件下培养 45天左右， 待芽长大后切下转移到生根培养基（MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素） 中培养 30天左右， 待根系发达后将小苗转 入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法）， 用 SEQ IDN0: 9: 禾 P SEQ IDN0: 10 (50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 DNA, 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预 变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72V 延伸 10 min)， PCR鉴定， 保存阳性植株进行编号 T。W1_T。W20。 实施例 6 过表达 GhSOSl转基因烟草 T1的耐盐模拟实验及功能鉴定 将灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T。W1-T。W20及对照烟草种子分别播种 在蛭石上， 每盆播种 15颗种子， 25°C、 14小时光培养 /10小时暗培养循环， 每 5天浇一次 1/2MS, 培养 25天之后， SEQ ID NO : 10禾 P SEQ ID NO: 11做 PCR检 测， 去除阴性植株。选取大小一致的转基因烟草及 对照烟草做耐盐实验， 每盆保 留大小较一致的 4-5颗苗。 转基因烟草、 对照烟草浇还 200mM NaCl的 1/2MS, 25°C、 14小时光培养 /10小时暗培养循环。 14天后观察结果， T1代转基因植株 (TO 代转基因植株的种子长成的植株） 的耐盐性鉴定表明， 对照植株不能正常 生长， 而 T\W3、 T\W5、 T\W8、 T\W12、 T\W16、 T\W19六个株系的烟草中能够正常生 长， 表现出明显的耐盐性 （参见图 2， 以 T\W3为例， T\W5、 T\W8、 T\W12、 T\W16、 T\W19的结果与 T\W3类似， 在此未示出）。 实施例 7 在转录水平上验证 S0S1蛋白表达

实施 6中 T\W3、 T\W5、 T\W8、 T\W12、 T\W16、 T\W19正常生长 Tl代植株随机选取 8棵， 实施 6中对照植株随机选取 4棵， 用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen)提取 的总 RNA。 紫外分光光度测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 计算各个 RNA 浓度。 依照 invitrogen反转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase 所示方法进行反转录 （l g总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID NO: 11 )。 通过 SEQ ID NO: 20和 SEQ ID NO: 21检测 GhSOSl , 检测 S0S1蛋白相对表达情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ M的引物 SEQ ID N0: 20和 SEQ ID NO: 21各 2. 0 μ 1， 以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin， 28个循环后， 72°C 延伸 10 min。 产物电泳结果如图 4所 示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000,购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1-8为 转基因植株植株， 9-12为对照植株， 13为正对照 （GhSOSl , SEQ ID NO: 2)。 图中 所示条带大小与正对照的大小一致。结果表明 正常生长转基因植株对 GhSOSl转录 较强， 对照植株没有转录。

SEQ ID NO: 20： TCTGATTCTTCTGTACATCTTTG

SEQ ID NO: 21 : TTGAGTGCTTGTTTCGTATGCTC