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Title:
COTTON ISOPENTENYL-TRANSFERASE, GENE ENCODING SAME AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/026312
Kind Code:
A1
Abstract:
An isopentenyl-transferase IPT1-1 from cotton, the gene encoding the same and uses thereof in culturing transgenic plants with improved drought-tolerance.

Inventors:
HE, Yunwei (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian Distric, Shenzhen City Guangdong 8, 518048, CN)
CHEN, Miao (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian Distric, Shenzhen City Guangdong 8, 518048, CN)
CUI, Hongzhi (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian Distric, Shenzhen City Guangdong 8, 518048, CN)
WANG, Jiansheng (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian District,Shenzhen Cit, Guangdong 8, 518048, CN)
Application Number:
CN2012/080001
Publication Date:
February 20, 2014
Filing Date:
August 13, 2012
Export Citation:
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Assignee:
BIOCENTURY TRANSGENE (CHINA) CO., LTD (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian Distric, Shenzhen City Guangdong 8, 518048, CN)
HE, Yunwei (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian Distric, Shenzhen City Guangdong 8, 518048, CN)
CHEN, Miao (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian Distric, Shenzhen City Guangdong 8, 518048, CN)
CUI, Hongzhi (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian Distric, Shenzhen City Guangdong 8, 518048, CN)
WANG, Jiansheng (4th Floor, Oriental Pearl Technology BuildingBlock 308 Shawei Industrial Zone, Futian District,Shenzhen Cit, Guangdong 8, 518048, CN)
International Classes:
C12N15/29; A01H5/00; A01H5/10; C07K14/415; C12N5/14; C12N9/10; C12N15/11; C12N15/54; C12N15/64; C12N15/82
Domestic Patent References:
WO2004000015A2
Foreign References:
CN1404723A
US7705201B2
Other References:
DATABASE EMBL 28 March 2011 Database accession no. HQ326777
DATABASE NCBI 04 December 2009 Database accession no. XP 002312745.1
HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY: 'Genetic Transformation of Cotton with Isopentenyl Transferase Gene and Regeneration of Transgenic Plants' MASTER'S THESES 2004, ISSN 1674-0246 pages D047 - 139
Attorney, Agent or Firm:
PEKSUNG INTELLECTUAL PROPERTY LTD. (908 Shining Tower, 35 Xueyuan Road Haidian District, Beijing 1, 100191, CN)
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Claims:
权 利 要 求 书

1. 棉花的一个异戊烯基转移酶编码基因, 其序列为 SEQ ID NO: 2。

2. 一种重组表达载体, 其含有权利要求 1所述的基因并且所述基因的核苷 酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。

3. 权利要求 2所述的载体,其为附图 2所示的 rd29A-GMPTl-l-2300载体。

4. 一种重组细胞, 其含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述 的重组表达载体; 优选地, 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

5. 一种改善植物耐旱性的方法, 包括: 将权利要求 1所述的基因或者权利 要求 2或 3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达; 优选 地, 所述植物是烟草。

6. 一种制备转基因植物的方法, 包括: 在有效产生植物的条件下培养含有 权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体的植物或植物 组织。

7. 权利要求 6所述的方法, 其中所述植物是烟草。

8. 权利要求 1所述的基因、权利要求 2或 3所述的重组表达载体或者权利 要求 4所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。

9. 权利要求 8所述的用途, 其中所述植物是烟草。

10. 权利要求 1所述的基因编码的蛋白, 其序列如 SEQ ID NO: 1所示。

Description:
一个棉花异戊烯基转移酶及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及异戊烯基转移酶及其编码基因与应 用,特别是涉及一个来源于棉 花的异戊烯基转移酶 IPT1-1及其编码基因,以及其在培育耐旱性提高 的转基因植 物中的应用。 技术背景 非生物胁迫, 如干旱、 盐渍、 极端温度、 化学污染和氧损伤等能够对植物的 生长发育造成严重的危害,对作物产量造成极 大损失, 其中干旱对作物产量的影 响,在诸多自然逆境中占首位, 其危害相当于其它灾害之和,是许多地区是农 业发 展的瓶颈。 据统计, 世界干早、 半干早地区占陆地面积的 34% ; 我国干早、 半干 旱地区约占国土面积的 52%, 年受早面积达 20〜270万公顷 , 全国灌溉区每年缺 水约 30亿立方米, 因缺水而少收粮食 350〜40亿公斤; 特别是我国主要产粮区如 华北、 东北和西北, 是我国缺水最严重的地区, 春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状, 现有可利用的种质资源匮乏, 采用 常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大 , 培育出真正的耐胁迫品种就尤 为困难。近年来, 随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分 子生物学技术的 迅猛发展, 抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平, 促进了植物抗逆基因工程 的发展。 当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应, 来降低或消除给植株带来 的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基 因、 多信号途径、 多基因产物的复 杂过程。 这些基因及其表达产物可以分为 3 类:(1)参与信号级联放大系统和转录 控制的基因及产物; (2) 直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其 表达产 物; (3 ) 与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。 近年来, 通过转基因技术提 高植物对胁迫耐受能力的研究, 以及对胁迫具有耐受能力的农作物、 旱生植物和 盐生植物的研究都取得了显著的成果, 对胁迫相关基因和信号转导系统也有了 更进一步的了角军 (Liu Q.1998.Two transcrip tion facto rs,DREBl and DREB2,w ith an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature -responsive gene exp ression, respectively, in A rabidopsis. Plant Cell, 10: 1391-1406; KAN GJY.2002. A rabid op sis basic leucine zipper p ro teins that mediate stress2responsive abscisic acid signaling。 Plant Cell, 14: 343- 357; ABE H.2003.A rabid op sis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2(MYB) function as transcrip tional activato rs in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78. ) 。

但就目前的研究状况而言, 由于其机制十分复杂,许多植物对逆境下的生 物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究 。 在抗逆应答基因的功能及表达 调控方面的研究占多数, 但抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整 个信号 传递网络系统的机理还有待进一步研究。

发明内容 本发明人利用 SSH与 RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个异戊烯 转 移酶 (本文命名为 IPT1-1 ) 的编码基因的 DNA序列。 并发现将其导入转基因 植株后, 可明显改善转基因植株的耐旱性, 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个异戊烯基转移 酶 IPT1-1的编码基因,其序 列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体, 其含有本发明第一方面所述的基 因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体 的表达控制序列可操作地连接; 优选地, 所述载体为附图 2所示的 rd29A-GMPTl- 1-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞, 其含有本发明第一方面所述的基因或 者本发明第二方面所述的重组表达载体; 优选地, 所述重组细胞为重组农杆菌 细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方 法, 包括: 将本发明第一方 面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组 表达载体导入植物或植物组织并 使所述基因表达; 优选地, 所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法, 包括: 在有效产生植物 的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因 、 本发明第二方面所述的重组表 达载体的植物或植物组织; 优选地, 所述植物是烟草。 本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、 本发明第二方面所述的 重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组 细胞用于改善植物耐旱性以及用 于植物育种的用途; 优选地, 所述植物是烟草。

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基 因编码的氨基酸序列, 如 SEQ ID NO: l所示。 附图说明 图 1是 GhIPTl-1的植物表达载体 (rd29A-GMPTl-l-2300)的构建流程。 图 2是 GhIPTl-1的植物表达载体 (rd29A-GMPTl-l-2300)的质粒图。

图 3是 GhIPTl-1 T1代转基因烟草植株(图中, T1A1 ; 右, T1A5)和作为对 照的非转基因烟草植株 (图左, CK) 的耐旱模拟实验结果。

图 4是转基因 T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平 的蛋白表达 验证结果。 M为 Marker, 1_5为对照烟草, 6_18为耐旱转基因烟草 Tl代植株, 19-24 为不耐旱转基因烟草 T1代植株。 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步 说明。 实施例 1、 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建:

具体方法为:

利用 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit所示的方法通 过抑制差减杂交方法构建差减文库。 在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶 子的 mRNA作为样本 (tester), 以未处理的棉花幼苗的叶子的 mRNA作为对照 ( driver )。 具体步骤简述如下:

( 1 ) 供试材料:

冀棉 14 (国家棉花中期库,获取单位中国棉花研究所 统一编号: ZM-30270) 播种到灭过菌的蛭石上, 在 25°C、 光周期 16h/8h条件下培养, 每周浇 1/2MS 培养基 (9. 39 mM KN03, 0. 625 mM KH2P04, 10. 3 mM NH4N03, 0. 75 mM MgS04, 1. 5 mM CaC12, 50 μ M KI , 100 μ Μ H3B03, 100 μ Μ MnS04, 30 μ M ZnS04, Ι μ Μ Na2Mo04, 0. 1 μ M CoC12, 100 μ M Na2EDTA, 100 μ Μ FeS04) 一次。 当苗株高达 25-30cm时用于实验。

( 2) 材料处理:

将供试幼苗分为 2组, 每组 4盆, 每盆 1株。 第一组为对照组, 在 25°C、 光照培养, 正常浇灌。 第二组为干旱处理组, 25°C、 光照培养, 停止浇灌, 处 理 10天, 处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片, 用液氮迅速冷冻后, 于 -70°C冰箱中保存。

( 3) 总 RNA提取:

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子 0. 5g, 用植物 匪 提取试剂盒

( invitrogen) 提取棉花的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001 测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值, 0D260/0D280比值为 1. 8-2· 0, 表 明总 RNA纯度较高, 用 1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性, 28S条带 的亮度约为 18S条带的 2倍, 表明 RNA 的完整性良好。 使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试齐 [J盒(purification of polyA+ RNA from total RNA) 分离 mRNA。

(4) 抑制消减杂交:

为了增力口获得表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST) (unigene) 的有效性, 避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区 。 本实验室用 Rsal, Haelll分别对双链 cDNA (按照消减试剂盒中记载的方案, 由 mRNA逆转录获得) 进行消化, 做两组抑制差减, 其他步骤及方法按 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制消减杂交, 最后合并两组两 组正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物。

( 5) cDNA消减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 (QIAquick PCR Purification

Kit纯化, 购自 Qiagen) 与 pGEM- T Easy (购自 Promega试剂盒)载体连接, 依 照 pGEM-T Easy试剂盒的程序, 具体步骤如下: 用 200 μ 1 PCR管依次加入下 列成分: 纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1, Τ4连接酶 缓冲液 5 μ 1 , pGEM-T Easy载体 1 μ 1, Τ4 DNA连接酶 1 μ ΐ , 于 4°C连接 过夜。 取 10 连接反应产物, 加入到 100 感受态大肠杆菌 JMI09 (购自 TAKARA)中, 冰浴 30 min、 热休克 60 s、 冰浴 2 min, 另加 250 L LB培养液

( 1% Tryptone购自 0X0ID , 0. 5% Yeast Extract购自 0X0ID , 1% NaCl购自国 药) 置 37 Ο°C水浴中, 以 225 r/min振荡培养 30 min, 取 200 μ L菌液种植于含

50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB (同上) /X-gal/IPTG ( X- gal/IPTG购自 TAKARA ) 培养板上, 37 °C培育 18 计数培养板中直径〉 1 mm 的清晰白色及蓝色菌落 数, 随机挑取 360个白色菌落 (编号: Gh-D001至 Gh-D360)。将所有白色克隆挑 于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING) 中, 37 °C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 - 80 °C保存备用。 以巢式 PCR 引 物 Primer 1禾口 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR- se l ectTM cDNA Subtract ion Ki t试剂盒自带) 进行菌液 PCR扩增, 得到 292个阳性克隆, 对所有阳性克隆 在送英潍捷基 (上海) 贸易有限公司测序

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析:

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后, 共得到 180个 EST (uni gene) 经 BlastN发现其中 102条 uni gene 在 GenBank 中有同源序列 (蛋白同源性 50%以上), 33条 EST功能未知或者为假定蛋白, 另有 45条未获 得同源匹配, 推测可能是处于 3 '、 5 ' 末端非翻译区的较短序列。 实施例 2 棉花异戊烯基转移酶编码基因 GhIPT l- 1的克隆

克隆子 Gh-D21 1去掉冗余 DNA后, 序列为 SEQ ID No : 3, 序列分析表明该 序列的编码的氨基酸序列属于异戊烯基转移酶 , 本文将克隆子 Gh-D21 1编码的 全长基因命名为 GhIPT l- l, 对应的蛋白命名为 IPT 1- 1。

SEQ

1 ACAACCCCGA GTGAATTTGG GGCTCAACCT GGAGACTATC TTCCGCAGAA AGGATAAGGT

61 GGTGTTTGTA ATGGGAGCAA CCGGCACCGG CAAGTCCCGT CTGGCAATCG ATCTGGCCAC

121 CCATTTTCCA GCTGAAATTG TAAATTCAGA CAAAATGCAA GTATATAAAG GCCTTGACAT

181 ATTAACTAAC AAAGTCACTG TAGAGGAGTG CCGTGGGGTT CCACACCATT TGCTAGGCAT

241 AGTAGACCCA ATCTCCAATT TCACATCCAT GGATTTCCAG CATCATGCTT CACTTGCTGT

301 TGAATCCATA CTTGCGGAAG GCCGGCTCCC AATCATCGCC GGTGGCTCCA ATTCATACAT

361 CGAGGCATTG GTGAATGATG ACCCTGAATT TCAATTAAGA TACGAATGCT GCTTCCTATG

421 GGTTGATGTG TCATTGCGCG TGTTACACTC CTTTGTGTCG GAACGGGTAG ATAAGATGGT

481 GAAAGCAGGC TTGGTAGATG AGGTGGAACA AATGTTTGAT CCAATGGCTG ATTATTCCCG

541 AGGGATTAGG CGTGCGATTG GGGTCCCCGA ATTGGACCAA TATTTCCGTG CTGGATCAAT

601 TCTTGATGCC AACATTCGAG CTAGGATGCT TGACACGGCC ATTTCAAAAA TCAAGGAAAA

661 TACATGCACT CTAGCTTCTC GCCAGTTCCA TAAAATCTGC CGCCTTTATA ACCAACGGAA 721 TTGGAGAATG CACCGGATTG ATGCCACCGA AGTTTTCCTA AAGCGTGGCG ATGAGGCCGA

781 TGAGACATGG GAGAGACTTG TTGCGGGACC AAGCACCATG ATAGTGGACA AATTCCTCTT

841 TGAAAAAAAT CGTGTGCCCA CCATTTTGCC GTCTACCGCC TCATCATCGG TCCCTATCGC

901 CGCCGTAGCA GCCGCATCCC GTTAAAGGTA GGACCCGTAG AATCTCACAC ATGCAAATGA

961 TGTCCCACGT GGCATCACGC CACATGGCAG GCTGGCATCC TATACCTCTC TCTCTCTACA

1021 TATTTTTTAT CTGAATTTGT TTTTCAATGA TTAGTCAATA GTCATAATGA AAAAAATAAA

1081 GAAAAATAGT TTATGGGTTG GAGATCGGAG AAGTTATAGT TGTAGACGTT GCTGCGAGCC

1141 CGGTCGTTAA ACTGTGT

GhIPTl-1全长基因的克隆

已经获得的 GhIPTl-1基因片段,已经有终止密码子 TAA,只需要做 5 ' RACE。 根据已经获得的 Gh-D211基因片段, 设计三条特异性引物, 作为反转录引 物及 5 ' RACE的 3 ' 端特异性引物。

GhIPTl-1 GSP1 : SEQ ID NO : 4:

CCCATGTCTC ATCGGCCTCA

GhIPTl-1 GSP2: SEQ ID NO : 5:

GGCGAGAAGC TAGAGTGCAT GTA

GhIPTl-1 GSP3: SEQ ID NO : 6:

GGCATCAAGA ATTGATCCAG CACG

实验步骤按试剂盒说明书操作(5, RACE System for Rapid Ampl ification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司)。

用 SEQ ID NO: 5与 5 ' 通用引物 AAP (试剂盒自带), 以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID N0 : 4)为模板进行第一轮 PCR扩增,具体步骤如下: Ex Taq 购自 TAKARA, 50 μ 1 PCR反应体系: 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP, 2. 0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA, 1. 0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 5和 AAP各 2. 0 μ 1, 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s , 55°C退火 30 s , 72°C 延伸 2min, 33个循环后, 72°C 延伸 10 min 0 所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2. 0 μ 1作为模板, 用 SEQ ID NO : 6与 3 ' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增, 具体步骤如下: 50 μ 1 PCR反 应体系: 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP, 2. 0 μ 1稀释的第一 轮 PCR产物, 1. 0 l Ex Taci、 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 6和 AUAP各 2. 0 μ 1, 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后, 72°C 延伸 10 min。 第二次 PCR产物回收片段约为 700bp条带 (Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到 JM109 (具体方法同上), 随机挑取 10个白色菌落 于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养, 37°C培养过夜后加甘 油至终浓度 20%, -80°C保存备用。 SEQ ID NO : 6与 3' 端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增(反应体系及反应条件同上), 得到 3个阳性克隆,送英潍捷基(上海) 贸易有限公司测序测序,获得该基因的 cDNA的 5' 端。 所得的 5' RACE产物克隆测序后, 与克隆子 Gh-D211测序结果拼接, 获得

SEQ ID NO : 17:

1 GAAGCAGATT TTGCAACTGG TTGTGTTCTT CCACTTTTGC AGGGTTTAAG ATGAAACTTT

61 CTATGTCTGC CAGCAAACTA GTACAACCCC GAGTGAATTT GGGGCTCAAC CTGGAGACTA

121 TCTTCCGCAG AAAGGATAAG GTGGTGTTTG TAATGGGAGC AACCGGCACC GGCAAGTCCC

181 GTCTGGCAAT CGATCTGGCC ACCCATTTTC CAGCTGAAAT TGTAAATTCA GACAAAATGC

241 AAGTATATAA AGGCCTTGAC ATATTAACTA ACAAAGTCAC TGTAGAGGAG TGCCGTGGGG

301 TTCCACACCA TTTGCTAGGC AT AG T AG AC C CAATCTCCAA TTTCACATCC ATGGATTTCC

361 AGCATCATGC TTCACTTGCT GTTGAATCCA TACTTGCGGA AGGCCGGCTC CCAATCATCG

421 CCGGTGGCTC CAATTCATAC ATCGAGGCAT TGGTGAATGA TGACCCTGAA TTTCAATTAA

481 GATACGAATG CTGCTTCCTA TGGGTTGATG TGTCATTGCG CGTGTTACAC TCCTTTGTGT

541 CGGAACGGGT AGATAAGATG GTGAAAGCAG GCTTGGTAGA TGAGGTGGAA CAAATGTTTG

601 ATCCAATGGC TGATTATTCC CGAGGGATTA GGCGTGCGAT TGGGGTCCCC GAATTGGACC

661 AATATTTCCG TGCTGGATCA ATTCTTGATG CCAACATTCG AGCTAGGATG CTTGACACGG

721 CCATTTCAAA AATCAAGGAA AATACATGCA CTCTAGCTTC TCGCCAGTTC CATAAAATCT

781 GCCGCCTTTA TAACCAACGG AATTGGAGAA TGCACCGGAT TGATGCCACC GAAGTTTTCC

841 TAAAGCGTGG CGATGAGGCC GAT GAG AC AT GGGAGAGACT TGTTGCGGGA CCAAGCACCA

901 TGATAGTGGA CAAATTCCTC TTTGAAAAAA ATCGTGTGCC CACCATTTTG CCGTCTACCG

961 CCTCATCATC GGTCCCTATC GCCGCCGTAG CAGCCGCATC CCGTTAAAGG TAGGACCCGT

1021 AGAATCTCAC ACATGCAAAT GATGTCCCAC GTGGCATCAC GCCACATGGC AGGCTGGCAT

1081 CCTATACCTC TCTCTCTCTA CATATTTTTT ATCTGAATTT GTTTTTCAAT GATTAGTCAA

1141 TAGTCATAAT GAAAAAAATA AAGAAAAATA GTTTATGGGT TGGAGATCGG AGAAGTTATA

1201 GTTGTAGACG TTGCTGCGAG CCCGGTCGTT AAACTGTGT 根据 SEQ ID NO : 17序列设计一对引物如下:

GhIPTl-lF: SEQ ID NO : 7:

ATGAAACTTTCTATGTCTGCCAGCA

GhIPTl-lR: SEQ ID NO : 8:

TTAACGGGATGCGGCTGCTACGG 通过 SEQ ID N0:7和 SEQ ID NO: 8来克隆 GhIPTl-1全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶, 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ 1 PCR反应体系: 10 μΐ 5XPS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 7禾口 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ 1, 以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min, 33个循环后, 72 °C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾: PCR产物加 2.5倍的无水乙醇, _20°C放置 10分钟, 离心, 去上清, 晾干, 用 21 μΐ双蒸水溶解。 加入 2.5 μ 1 10 X Ex Buffer, 0.5 μ 1 5 mM的 dATP , 2.5 μ 1 ΙΟΧΕχ Taq。 反应条件: 70°C反应 30分钟。 将得到约 900 bp的 DNA片段回收 (Omega回收试剂盒), 连接至 pGEM T-easy 载体上,转化 JM109(方法同上), 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ g/mL氨 苄青霉素的 LB 液体培养基中培养, 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, -80 °C保存备用。 SEQ ID NO: 7与 SEQ ID NO: 8进行菌液 PCR扩增 (反应体系及 反应条件同上), 得到 4个阳性克隆,送至英潍捷基(上海)贸易有 公司测序, 序列为 SEQ ID NO: 2。

IPTl-1蛋白的氨基酸序列: SEQ ID NO: 1

1 MKLSMSASKL VQPRVNLGLN

21 LETIFRRKDK WFVMGATGT

41 GKSRLAIDLA THFPAEIVNS

61 DKMQVYKGLD 工 LTNKVTVEE

81 CRGVPHHLLG IVDPISNFTS

101 MDFQHHASLA VESILAEGRL

121 PIIAGGSNSY 工 EALVNDDPE

141 FQLRYECCFL WVDVSLRVLH

161 SFVSERVDKM VKAGLVDEVE

181 QMFDPMADYS RGIRRAIGVP

201 ELDQYFRAGS 工: LDANIRARM

221 LDTAISKIKE NTCTLASRQF

241 HKICRLYNQR 隱 RMHRIDAT

261 EVFLKRGDEA DETWERLVAG

281 PSTMIVDKFL FEKNRVPT工: L

301 PSTASSSVPI AAVAAASR*

GhIPTl-1 编码基因的核苷酸序列: SEQ ID NO: 2

1 ATGAAACTTT CTATGTCTGC CAGCAAACTA GTACAACCCC GAGTGAATTT GGGGCTCAAC

61 CTGGAGACTA TCTTCCGCAG AAAGGATAAG GTGGTGTTTG TAATGGGAGC AACCGGCACC 121 GGCAAGTCCC GTCTGGCAAT CGATCTGGCC ACCCATTTTC CAGCTGAAAT TGTAAATTCA

181 GACAAAATGC AAGTATATAA AGGCCTTGAC ATATTAACTA ACAAAGTCAC TGTAGAGGAG

241 TGCCGTGGGG TTCCACACCA TTTGCTAGGC AT AG T AG AC C CAATCTCCAA TTTCACATCC

301 ATGGATTTCC AGCATCATGC TTCACTTGCT GTTGAATCCA TACTTGCGGA AGGCCGGCTC

361 CCAATCATCG CCGGTGGCTC CAATTCATAC ATCGAGGCAT TGGTGAATGA TGACCCTGAA

421 TTTCAATTAA GATACGAATG CTGCTTCCTA TGGGTTGATG TGTCATTGCG CGTGTTACAC

481 TCCTTTGTGT CGGAACGGGT AGATAAGATG GTGAAAGCAG GCTTGGTAGA TGAGGTGGAA

541 CAAATGTTTG ATCCAATGGC TGATTATTCC CGAGGGATTA GGCGTGCGAT TGGGGTCCCC

601 GAATTGGACC AATATTTCCG TGCTGGATCA ATTCTTGATG CCAACATTCG AGCTAGGATG

661 CTTGACACGG CCATTTCAAA AATCAAGGAA AATACATGCA CTCTAGCTTC TCGCCAGTTC

721 CATAAAATCT GCCGCCTTTA TAACCAACGG AATTGGAGAA TGCACCGGAT TGATGCCACC

781 GAAGTTTTCC TAAAGCGTGG CGATGAGGCC GAT GAG AC AT GGGAGAGACT TGTTGCGGGA

841 CCAAGCACCA TGATAGTGGA CAAATTCCTC TTTGAAAAAA ATCGTGTGCC CACCATTTTG

901 CCGTCTACCG CCTCATCATC GGTCCCTATC GCCGCCGTAG CAGCCGCATC CCGTTAA 实施例 3 GhIPTl-1基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责 任公司)作为植物表达载体, 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S 启动子, 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择诱导型启动子 rd29A及 Tnos 作为 GhIPTl-1基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10以植物表达载体 PBI 121 (购自北 京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系: 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP, 1. 0 μ 1 PBI 121 , 1. 0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10各 2. 0 μ 1, 以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 56°C退火 30 s, 72°C 延伸 30 s, 33个循环后, 72 °C 延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll 酶切连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒)获得 PCAMBIA2300- 1。

SEQ ID NO : 9 :

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO : 10:

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO : 11和 SEQ ID NO : 12以 PBI 121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系: 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μ 1 PBI121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ 1, 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反 应条件: 94°C预变性 5min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 30 s, 33 个循环后, 72 °C 延伸 10 min。 通过 Sacl、 EcoRI 酶切连接到 pCAMBIA2300-l (promega T4 连接酶盒)获得 pCAMBIA2300- 2

SEQ ID NO: 11:

AAG dOTAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 12:

TCA GAA mCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 以拟南芥 (哥伦比亚型 , 购自 www. arabidopsis. org) DNA为模板扩增拟南芥 rd29A启动子(参考 Zeng J. , et L. 2002, Preparation of total DNA from "recalcit rant plant taxa" , Acta Bot. Sin. , 44(6): 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA)。 采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系: 10 μ 15XPS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP, 1.0 μ 1 拟南芥 DNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14各 2.0 μ 1, 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条 件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 30 s, 33个循环后, 72°C 延伸 10 mine 通过 HindIII、 Pstl酶切连接到 (连接方法 同上) pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300_3

SEQ ID NO: 13:

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA SEQ ID NO: 14:

TGAO^ CTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16扩增 GhIPTl-1 (模板是实施例 2所获得 GhIPTl-1), 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系: 10 μ 15XPS Buffer, 3 μ 12· 5 mM的 dNTP, 1.0 μ 1 GhlPTl- 1- pGEM, 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16各 2· 0 μ 1, 以及 31 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58 °C 退火 30 s, 72 °C 延伸 2min, 33个循环后, 72°C 延伸 10min。通过 Pstl、 Sacl 酶切连接到 (连接方法同上) PCAMBIA2300-3, 获得植物表达载体 rd29A_ GhlPTl- 1-2300。

SEQ ID NO : 15:

TGAO^ TGAAACTTTCTATGTCTGCCAGCA

SEQ ID NO : 16:

AAG dOmAACGGGATGCGGCTGCTACGG 实施例 4 rd29A-GhIPTl-l-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态制备: 提前 1-2天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体 培养基上划单斑接种, 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml 利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中, 28°C下摇动培养过夜(约 12-16 h)至 0D600值为 0. 4, 形成种子菌液。 取 5 ml活化后的菌液 (1 : 20的比例)接 种于 100 ml 同样浓度抗生素的 LB液体培养基中, 28°C摇动培养 2-2. 5 h至 0D 6 。。=0. 8。 冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次, 令细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10 min,弃上清液;加入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体, 4 °〇下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀; 用 10%甘油重复洗 3_4次; 加入适量冰 浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀, 以 40 μ 1/管将其分装, 于 -70°C保存备 用。

转化农杆菌:在冰上融化感受态细胞,往 40 μ 1的感受态细胞中加入 1 μ 1 的质粒, 混匀后冰浴约 10 mino 将感受态和 DNA的混合物用枪转移到预冷的电 击杯中, 轻敲使悬浮液到达底部, 注意不要有气泡。 将电击杯 (购自 bio-rad) 放到电击室的滑道上, 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。 使用 0. 1cm 的电击杯的时候, MicroPulser (购自 bio_rad) 的程序设置为 "Agr" , 电击 一次 。 立即取出电击杯, 加入 28°C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用枪将细 胞打匀。 将悬浮液转入 1. 5 ml的离心管, 28°C, 225 rpm培养 1 h。 取 100〜 200 μ ΐ 的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上 (LB 固体培养基, 含 50 μ g/ml利福平、 50 μ g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素), 28°C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子 (国家烟草中期库, 获取单位: 中国农科院烟草 所, 库编号 I5A00660) 30 s , 用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0. 1%升汞浸泡 8 min, 用灭菌双蒸水洗两次,完成表面灭菌。将表面 灭菌的烟草种子置于 MS ( 18. 78 mM KN0 3 , 1. 25 mM KH 2 P0 4 , 20. 6 mM NH^Oa, 1. 5 mM MgS0 4 , 3. 0 mM CaCl 2 , 50 μ M KI , 100 μ M H3BO3, 100 M MnS0 4 , 30 μ M ZnS0 4 , 1 μ M Na 2 Mo0 4 , 0. 1 M CoCl 2 , 100 μ M N¾EDTA, 100 μ M FeS0 4 , 7. 4 g/L琼脂, 蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件 下发芽, 制备无菌苗。 取无菌苗叶片剪成 5 mmX 5 隱大小的叶盘, 用处于对数 生长期的含表达载体 rd29A-GhIPTl-l-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min, 吸干菌 液,在黑暗条件下共培养 2天(MS培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+ 1 mg/L 细胞分裂素 (BA) +0. 1 mg/L萘乙酸 (NAA) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢 霉素)上,光照条件下培养 45天左右,待芽长大后切下转移到生根培养基 (MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素) 中培养 30天左右, 待根系发达后将小苗转 入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片,提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法), 用 SEQ ID NO : 7和 SEQ ID NO : 8 ( 50 μ 1 PCR反应体系: 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP, 2. 0 μ 1 DNA, 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10各 2. 0 μ 1, 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2 min, 33 个循环后, 72 °C 延伸 10 min), PCR鉴定, 保存阳性植株进行编号 T。A1_T。A20。

实施例 6 过表达 GhIPTl-1转基因烟草 T1的耐旱模拟实验及功能鉴定 灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T。A1-T。A20及对照烟草种子分别播种在蛭石 上, 每盆播种 15颗种子, 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环, 每 5天浇一次 1/2MS, 培养 25天之后, 每盆保留大小较一致的 4_5棵苗, 做干旱实验, 转基因烟 草、 对照烟草干旱 14天(不浇水), 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1 代转基因植株(T0代转基因植株的种子长成的 株)的抗旱性鉴定表明, 对照植 株都萎蔫严重, 而 Ί Α1、 Ί\Α5、 Ί\Α8、 Ί\Α13、 Ί\Α15、 Ί\Α17、 Ί\Α19七个株系共 32 棵烟草中有 23棵能够正常生长, 显现出明显的耐旱性 (参见图 3, 以 Ί\Α1、 Ί\Α5 为例, Ί\Α8、 Ί\Α13、 Ί\Α15、 Ί\Α17、 Ί\Α19的结果与 Ί\Α1、 Ί\Α5类似, 在此未示出)。 实施例 7 在转录水平上验证 IPTl-1蛋白表达

分别取对照烟草、 不耐旱转基因烟草 T1代植株、 耐旱转基因烟草 T1代植 株(生长状况良好)干旱 14天叶子 0. 05g,用植物 RNA提取试剂盒(invitrogen) 提取的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm 和 280 nm的吸光度值, 计算各个 RNA浓度。 依照 invitrogen反转录试剂盒 Superscript I I I Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 ( 2 μ g总 RNA 作为模板, 反转录引物 SEQ ID NO : 8)。 通过 SEQ ID N0 : 7和 SEQ ID NO : 8扩 增 GhIPTl-l,检测 IPTl-1蛋白相对表达情况。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶, 以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系: 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP, 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 7和 SEQ ID NO : 8各 2. 0 μ 1, 以及 30 μ 1的双蒸 水。 PCR反应条件: 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 lmin, 29个循环后, 72°C 延伸 10 min。 产物电泳结果如图 4所示: M 为 DNA Ladder Marker (DL2000,购自深圳瑞真生物技术有限公司), 1-5为对照 烟草, 6-18为耐旱转基因烟草 T1代植株, 19-24为不耐旱转基因烟草 T1代植 株。 图中所示条带大小与 GhIPTl-1 的大小一致。 结果表明对照烟草没有转录 GhIPTl-1的 mRNA, 耐旱转基因烟草 T1代植株对 GhIPTl-1的转录较强,不耐旱 转基因烟草 T1代植株没有转录或转录很弱。