技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于棉花的锌指蛋 白 （Czf5 ) 及其编码基因， 以及其在培育抗旱性提高的转基因植物中的应 用。 背景技术 非生物胁迫,如干旱、盐渍、 极端温度、 化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发 育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失 。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自 然逆境中占首位,其危害相当于其它灾害之和� �是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干旱地区约占国土面积的 52%,年受旱面积达 200— 270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米,因缺水而少 收粮食 350— 400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、 东北和西北,是我国缺水最 严重的地区,春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状,现有� �利用的种质资源匮乏，采用常规育 种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大,培育� �真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来, 随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分 子生物学技术的迅猛发展， 抗逆研究已 经从生理水平深入到分子水平,促进了植物抗� �基因工程的发展。当植物在受到胁迫时 会产生相应的应答反应， 来降低或消除给植株带来的危害。 植物的这种应答反应是一 个涉及多基因、 多信号途径、 多基因产物的复杂过程。 这些基因及其表达产物可以分 为 3 类： （1 ) 参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产 物； （2) 直接对保护生 物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物； （3 )与水和离子的摄入和转运相关的蛋白 质。 近年来， 通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研 究， 以及对胁迫具有耐受 能力的农作物、 旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成 果， 对胁迫相关基因和 信号转导系统也有了更进一步的了解 （Liu Q. 1998. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391-1406； KANG JY. 2002. Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling. Plant Cell, 14: 343-357； ABE H. 2003. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as l transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78. )。

但就目前的研究状况而言,由于其机制十分复� �，许多植物对逆境下的生物化学和 生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆 应答基因的功能及表达调控方面的研究 将对植物抗逆相关的信号传递途径及信号传递 网络系统的研究提供重要的基础。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE ( cDNA末端快速扩增） 相结合的 方法克隆出了棉花的一个锌指蛋白（本文命名 为 Czf5 )的编码基因， 并测定了其 DNA 序列。 并且发现通过转基因将其导入植株后， 可明显改善转基因植株的抗旱性， 而且 这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个锌指蛋白 Czf5 的编码基因 （本文命名为

GhCzf5 )， 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因并且 所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达 控制序列可操作地连接； 优选地， 所述 载体为附图 2所示的 rd29A-Gh Czf5-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本发 明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物抗旱性的方 法， 包括： 将本发明第一方面所述 基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体 导入植物或植物组织并使所述基因表 达； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法， 包括： 在有效产生植物的条件 下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发 明第二方面所述的重组表达载体的植 物或植物组织； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、本发明第二方面所述的重组表 达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用 于改善植物抗旱性以及用于植物育种 的用途； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基 因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0: 1所示。 附图说明 图 1是 GhCzf5的植物表达载体 (rd29A-GhCzf5-2300;)的构建流程。 图 2是 GhCzf5的植物表达载体 Crd29A-GhCzf5-2300)的质粒图。

图 3是对照烟草和转基因烟草的抗旱性生长情况� � CK (左)：对照烟草； T1D1 (中） 和 T1D8 (右）： 转基因烟草株系。

图 4是耐干旱和不耐干旱 T1代转基因烟草植株在转录水平上的验证结果� �� M为 Marker, 1-8为耐干旱的 T1代转基因烟草植株， 9一 12为不耐干旱的 T1代转基因烟 草植株。

具体实施方式 提供以下实施例， 以方便本领域技术人员更好地理解本发明。 所述实施例仅出于 示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。 实施例 1 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit 所示的方法通过抑制差 减杂交方法构建差减文库。 在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片中 提取的 mRNA 作为样本 （tester), 以未处理的棉花幼苗的叶片中提取的 mRNA 作为对照 ( driver)。 具体步骤简述如下：

(1) 供试材料：

非洲棉 （国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一编号： ZM-06838)播 种到灭过菌的蛭石上， 在 25°C、 光周期 16h/8h (光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养， 每周浇 1/2MS培养基 （含有 9.39 mMKN0 ₃ ， 0.625 mM KH ₂ P0 ₄ ， 10.3 mMNH ₄ N0 ₃ , 0.75 mMMgSO ₄ ， 1.5 mMCaCl ₂ ， 50 μΜΚΙ, 100 μΜΗ ₃ ΒΟ ₃ ， 100 MMnSO ₄ ， 30 μΜ ZnS0 ₄ ， 1 μΜΝα ₂ Μο0 ₄ , 0.1 μΜ CoCl ₂ , 100 μΜ Na ₂ EDTA, 100 MFeSO ₄ ) —次。 当 苗株高达 25— 30cm时用于实验。

(2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25°C、 光周期 16h/8h (光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养， 正常浇灌。 第二组为干旱处理组， 25°C、 光周期 16h/8h (光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养， 停止浇灌， 处理 10天， 处理完毕 后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。

(3) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片 0.5 g， 用植物 RNA提取试剂盒 （购自 invitrogen) 提取棉花叶片的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测 定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD _26Q /OD _28Q 比值为 1.8— 2.0，表明总 RNA 纯度较高，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S 条带的 2倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂 盒 (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制 差减杂交。应用 Clontech 的 PCR-Select cDNA Subtraction Kits 差减杂交试剂盒， 先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录， 得到双链 cDNA, 再以 2 Tester cDNA和 2 ig Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1.5 h， 然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上 不同的接头， 而 Driver cDNA不连接头。 两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过 量的 Driver混合， 进行第一次正向差减杂交。 将两种第一次差减杂交的产物混合， 再 与新鲜变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交,通过两次抑制性 PCR扩增差异 表达的片段,使其得到富集。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒的程序，将所述正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR 产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒)载体连接， 其具体步骤如下： 用 200 μΐ PCR管依次加入下列成分： 纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ1， 2><Τ4连接酶缓冲液 5 μ1， pGEM-T Easy载体 1 μ1， T4 DNA连接酶 1 μ1， 于 4°C连接过夜。取 10 μΐ连接反应产 物，加入到 100 μΐ感受态大肠杆菌 JM109(购自 TAKARA)中,冰浴 30 min、 热休克 60 秒、 冰浴 2 min,另力口 250 μΐ LB培养液（含有 1% Tryptone (购自 OXOID ) , 0.5% Yeast Extract (购自 OXOID ) , 1% NaCl (购自国药）） 置 37°C水浴中， 以 225 rpm振荡培养 30 min,取 200 μΐ 菌液接种于含 50 g/ml 氨苄青霉素的 LB (同上） /X-gal/IPTG ( X-gal/IPTG购自 TAKARA)培养板上, 37°C培育 18 h。 计数培养板中直径 > 1 mm的 清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 540个白色菌落 (编号： Gh-D2-001至 Gh-D2-540)。 将所有白色克隆接种于含有 50 μ _§ /ιη1氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96孔细胞培养 板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 -80°C保存备用。 以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit 试剂盒自带） 进行菌液 PCR 扩增， 得到 452个阳性克隆,然后将所有阳性克隆送英潍 捷基 （上海） 贸易有限公司测序。 (6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 405个有效 EST(unigene)。

' :施例 2 棉花锌指蛋白基因 GhCzf5的克隆

克隆子 Gh-D2-196去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQIDNo: 3， 序列分析表明该序 列编码的蛋白属于锌指蛋白， 本文将 SEQ ID No: 3 对应的全长编码基因命名为 GhCzfS, 其对应的蛋白命名为 Czf5。

SEQ ID Xo: 3

_ :GAT'J I A CA^CG^: AGTCAACC G AGCATGA TG TCAGTTIGC CT'H G二 ί_ r ^Ai^OA ^ A CA A3A C AACC :: ; ! CT^C GTCA T TGTTTCA: AASSTATSC —

_8_ C :J :G TC !GCCTAC TC H AG G A A TT T ii TT TTCCAT

GhCzf5全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3， 设计如下两条特异性引物， 作为 3'RACE的 5， 端特异性引物。

GhCzfo GSP1: SEQ ID NO: I：

GhCzfo GSP2: SEQ ID NO: .5：

实验歩骤按试剂盒说明书操作 （ 3， RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

ffl SEQ ID NO: 4与 3'端引物 AUAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA 为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体歩骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ mRNA反 转^的 cDNA、 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP 各 2.0 μ1、 以及 35 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94 °C 变 性 30 s, 58。C退火 30 s, 72 °C 延伸 lmin)， 72 °C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 5与 3' 替换页 （细则第 26条) 端引物 AUAP进行第 轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 μΐ PCR反;、 V：体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer ^ 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ稀释的第一 轮 PCR产物、 1.0 l Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5和 AUAP各 2.0 μ1、 以及 35 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 （ 94'C 变性 30 s， 58°C退 火 30 s， 72°C 延伸 l min)， 72°C 延伸 10 min。回收第二次 PCR产物中片段约为 500bp 的条带 （Gel Extraction Kit购 β OMEGA), 并将其连接于 pGEM-T Easy Vector, 然后 转化到大肠杆脔 JM109(具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落接种于含有 50 g/mL 氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加 th油至终浓度 20%， -80°C保存备 用。 用 SEQ ID NO: 5与 3'端引物 AUAP进行脔液 PCR 扩增， 得到 9个阳性克隆， 将 其屮 4个阳性克降送至英潍捷基（上海） 贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA 的 3'端。

根据己经获得的 GhCzf5基因片段，设计如下三条特异性引物，作 为 5'RACE的 3' 端特异性引物。

GhCzfS GSP3: SEQ ID NO : 6：

GAftAAT TCC GCA CTCAC AA

GhCzfS GSP I : SEQ ID NO : 7：

TT GCAGC AGAG GTT C TG

GhCzfS GSP5: SEQ ID NO: 8：

GCA GT ACA TT AATAGT TC 实验步骤按试剂 说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与 5'通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6 ) 为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ 10><Ex Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ mRNA反转 录的 cDNA、 1.0 μΙ Εχ Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ1、 以及 35 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环 （ 94'C 变 性 30 s， 55 'C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin)， 72 "C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 8与 3' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如 卜'：

50 μΐ PCR反应休系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ稀释的第一

6

替换页 （细则第 26条） 轮 PCR产物、 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 8和 AUAP各 2.0 μ1、 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5min， 33个循环 （ 94°C 变性 30 s， 58°C 退火 30s， 72 °C 延伸 1 min)， 72 °C 延伸 10 min。 回收第二次 PCR产物中片段约为

H H

500bp的条 H带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA), 并将其连接于 pGEM-T Easy Vector,

： '

转化到 JM109(具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落接种于含有 50 μ /ηι1氨苄青霉

H

i」 ■

素的 LB 液体培养基-V '中，37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%，-80'C保存备用。用 SEQ IDNO _: 8与 3'端引物AUAP进行菌液PCR 扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到

H H

9个阳性克隆,选取其中 4个； (：!克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司� ��序测序，获得该 基闘 cDNA的 5'端。

F

所得的 5'RACE产物克隆测序后，将其与 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID No: 3序列迸行拼接。 获得 GhCzf5全长 cDNA序列 SEQ ID No: 9：

SEQ ID NO: 9：

了 T AA'STCT^ AG C ATC AG AGGASCG _ TCTTGGTAAA T CATAT^TA T3 TTAAA53 CAIiJiTT GA

- A ATTATC G -::: C^ CCT CGTl'C ^ C ：: C:.:'TCCT::C

- - ATCAT. T S C ACC CGG A CATTGA AATC CTG

_ ¾ _ ^「 " ¹ c■? GA AGT ACA T A AGA TT "C GA'^CAS ： A^ G^ T AAC G A^CA. T ACTGTT A ； GITTGC T A GAGATTAAC GCT GTC TG CGGT^A C G

AA CATTGGA ATGTCACA G ： C T TTT C ：：'― G-:C A.:'TT7T QGT AG GT CSGA A TT?

A TACAG ^: TA T ^: QT A A GT TTT AAA AAAC GAT'S CGC^C 一 ·"_； -ACCCI GA'S ATGTGGT:¾ G?TT ? TT^

'': '：― CTGAAGTTGT ATG. ?CATC CACTTA GTT

■■'― - AT '■_」；_- TTTTCGA-TA GTGSAAT AA AATCTGCT A

―:；- AG TGTTG T GT^ AAT T ATAATGT A

n

:：4. T A.TTTTTT AT -iC-TATTI：： TT CAATTTA TTTAAAAA AAAAAAAAAA

:■ _ 根据 SEQ ID NO:9序列设计一对引物如下： GhCzfo: 3EQ ID NO: 10：

AT^ GT.:CC TCAASCCT C A

GhCzfS: SEQ ID XO: U:

一 -—— ' —一

7

替换页 （细则第 26条) 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 GhCzf5全长编码基因。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 l PCR反应体系： 10 ^ 5xPS Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ1、 以及 30 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 （94°C 变性 30 s， 58°C退 火 30 s， 72 °C 延伸 lmin), 72 °C 延伸 10min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分 钟，离心，去上清，晾干，然后用 21 μΐ双蒸水溶解。然后向其中加入 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 0.5 μΐ 5 mM的 dATP、 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Taq。 反应条件： 70'C反应 30分钟。 将得到的约 500bp的 DNA片段回收 （Omega回收试剂盒）， 并将其连接至 pGEM T-easy载体上, 然后转化 JM109(方法同上)， 随机挑取 10个白色菌落接种于含有 50 g/mL氨苄青霉 素的 LB 液体培养基中，37'C培养过夜后加甘油至终浓� � 20%，-80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR 扩增 （反应休系及反应条件同上），得到 Ί 个阳性克隆，选取其中 4个阳性克隆送至英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序,序列为 SEQ ID NO: 2, 其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

Czf5蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

G1SSLPAPS EGVLCVLLVK

TALSISMVK

"HLSSSSSSS SSSSSS3SSS

SSSPSS LIZ IPAVSFDISI

GNA SYIKEF RS MPST YD

AVCS SQFEH DCSVCLTRFH:

PESEIKRLS GHLFHKVCLS

ir" ϊ^. i* >― >

GhCzf5编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

8 替换页 （细则第 26条) 丄 TATG GIACT CT GGTAAAC . ^ A^ TTT CCAIAT TAT G -"IAAAGG ATAATT SAT CAAT C TCA CATTAT GT 丄：：丄 AT:: AT TCT CC TCCTC： JTC T CC TC rCCT CT CCTCGTCA C A-OATCAT A i-Si ZZKICh ZQC CAT CCG A T T AT7GAA ATCCCI-S»:5S AT ATTCGA： A CAGCATC 二 4_ G:iTAATG:TG iTA'JTCACAC TAAAGAGTT CG G AGGA TGCCAT GAC C GGTACGAT

30 _ ί.3ΰ ΑΙ3¾ G GS AGT A A CGiAGCAT GA T T CAG TT CCTGAC TAGGTTCGAG 3€1 C A AAT A^ A^AITAA ： TT T:C G: GGTCAT^ T CACAAG T A7 CTTG:SAA 2^ AA TGGTTGA AC ATTG JAA TGTCACATGC CCTCTTTGCA GGAACG TCT :5CTSCCC5AA

46_ ： CTA TTTG ^ GA

实施例 3 GhCzf5基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 NPTII蛋白在植物中的表达。 选择诱导型的 M29A启动子及终止子 Tnos分别 作为 GhCzf5基因的启动子和终止子。

用引物 SEQIDNO:12和 SEQ ID NO: 13以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏 远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50μ1ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μΐ ρΒΙ12Κ 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ1、 以及 31 μ1双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5min， 33个循环（ 94°C 变性 30s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72'C 延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll酶切将所得的 PCR产物 连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID XO: 12 ：

GCACG TTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 13：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15以 pBI121为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5^PS Buffer. 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μΐ pBI12 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID 1^0: 15各2.(^1、 以及 31 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94°C 变性 30s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。 通过 Sacl、 EcoRl酶切将所得的 PCR产物连接（promega T4 连接酶盒 )到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2

替换页 （细则第 26条) SEQ ID -、 Ό: 11：

AAG (H AATTTCCCCGATCGI TCAAA

SEQ ID NO: 15：

TCA^ f CAGTGAATTCCCGATCTAGTA

用引物 SEQ ID NO: 16 禾 H SEQ ID NO: 17 以拟南芥 （哥伦比亚型 ， 购自 www.arabidopsis.org ) DNA为校板扩增拟南芥 rd29A启动了- (参考 Zeng J., et al. 2002, Preparation of total DNA from "recalcitrant plant taxa", Acta Bot. Sin., 44(6): 694-697中 的方法提取拟南芥 DNA)。 ¾用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反 v:体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μΐ 拟南芥 DNA、 1 .0 μΐ PrimeSTAR > 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16禾卩 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1、 以及 31 μΐ双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环 （94°C 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 V 延伸 10 min。 通过 HindIII、 Pstl酶切将所得的 PCR产物连 接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。

SEQ ID NO: 16：

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTC TTTTA SEQ ID NO: 17：

丁 GAr7( UCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 GhCzf5编码基因的全长序列 （模 板. ¾施例 2所获得 GhCzf5全长编码基因）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚

^嗨。 50 μΐ PCR 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer , 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP、 1 .0 μΐ GhCzf5-pGEM 1 .0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19

^ 2 0 μΙ、 以及 3 1 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94°C 变 性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min)， 72 "C 延伸〗 0 min。 通过 Pstl、 Sacl酶切 将所得的 PCR 产物连接 （连接方法问上） 到 pCAMBIA2300-3， 获得植物表达载休 rd29A- GhCzf5-2300。

SEQ ID NO: 18： 丁 GAr/¾t^i(i ATGGGT C T AAGTCT C CA

SEQ ID NO: 19：

kAGGAGCTC T A CAAAAG TAGSCCGGAT C STC

实施例 4 rd29A-GhCzf5-2300表达载体转化农杆菌

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替换页 （细则第 26条) 农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc) 感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划 线接种， 28 °C培养 1至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ _§ /ιη1利福平和 50 μ _§ /ιη1 链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C下摇动培养过夜 (约 12-16 h)至 OD ₆ 。。值为 0.4， 形成 种子菌液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 :20的比例） 接种于 100 ml含 50 μ _§ /ιη1利福平和 50 μ _§ /ιη1链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5 h至 OD _6QQ =0.8。 冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次， 令所述细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液； 加入一定量冰预冷的 10%甘油重悬浮菌体, 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀； 用并预冷的 10%甘油重复洗 3-4次； 然后加入适量冰浴预冷的 10% 甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化所述的感受态细胞， 往 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ 的质粒， 混匀后冰浴约 10 min。 将感受态细胞和 DNA的混合物用移液枪转移到冰预 冷的电击杯 （购自 bio-md) 中， 轻敲使悬浮液到达电击杯底部， 注意不要有气泡。 将 所述电击杯放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。 使用 0.1cm规格的电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr"， 电击一 次。 立即取出电击杯， 加入 28 °C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用移液枪将细胞打 匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 在 28 °C， 225 rpm摇动培养 1 h。 取 100— 200 μΐ 的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含 50 μ _§ /ιη1利福平、 50 g/ml链霉素、 50 g/ml卡那霉素）， 28 °C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子 （国家烟草中期库， 获取单位： 中国农科院烟草所， 库 编号 I5A00660 ) 30 s, 然后用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0.1%升汞浸泡 8 min， 然后用 灭菌双蒸水洗两次， 完成表面灭菌。 将表面灭菌的烟草种子置于 MS固体培养基 （含 有 18.78 mM KN0 ₃ 1.25 mM KH ₂ P0 ₄ 、 20.6 mM H ₄ N0 ₃ 1.5 mM MgS0 ₄ 、 3.0 mM CaCl ₂ 、 50 μΜ ΚΙ、 100 μΜ Η ₃ ΒΟ ₃ 、 100 M MnSO ₄ 、 30 M ZnSO ₄ 、 1 μΜ Να ₂ Μο0 ₄ 0.1 μΜ CoCl ₂ 100 μΜ Na ₂ EDTA 100 μΜ FeS0 ₄ 、 7.4 g/1琼月旨、 30 g/l蔗糖） 上于无 菌条件下发芽， 制备无菌苗。 取无菌苗叶片剪成 5 mmx5 mm大小的叶盘， 用处于对 数生长期的含表达载体 rd29A-GhCzf5-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min， 吸干菌液， 在 黑暗条件下共培养 2天 （MS固体培养基）。 将叶片转到分化固体培养基 （MS+1 mg/1 细胞分裂素 （BA) +0.1 mg/1萘乙酸 （NAA) +50 mg/1卡那霉素 +500 mg/1头孢霉素） 上， 每天用 2000 Lx的光照 16h， 培养 45天左右， 待芽长大后切下转移到生根培养基 (MS+50 mg/l卡那霉素 +500 mg/l头孢霉素）中培养 30天左右， 待根系发达后将小苗 转入仅加有 500 mg/1头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

剪取获得的转基因烟草植株的叶片， 提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取 方法），用 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11进行 PCR扩增鉴定（50 μΙ ΡΟ 反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ DNA、 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ1、 以及 35 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C 预变性 5 min， 33个循环 （94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min)， 72 °C 延伸 10 min)， 将 PCR鉴定为阳性植株编号为 T0D1-T0D20并保存。 实施例 6 过表达 GhCzf5转基因烟草 T1代植株的抗旱模拟实验

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T0D1-T0D20转基因烟草及对照烟草种子分 别播种在蛭石上， 每盆播种 15颗种子， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 每 5天浇一次 1/2MS, 培养 25天之后， 每盆保留大小较一致的 4-5棵苗用于干旱实验， 转基因烟草、对照烟草干旱 14天 (不浇水)， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植株 （T0代转基因植株的种子长成的植株） 的抗旱性鉴定表明， 对照植 株都萎蔫严重， 而 T1D1、 T1D8、 T1D10、 T1D13、 T1D17 五个株系共 23棵烟草中 有 18棵能够正常生长， 表现出明显的耐旱性（见图 3， 以 T1D1、 T1D8为例， T1D10、 T1D13、 T1D17的结果与 T1D1、 T1D8类似， 在此未示出）。 实施例 7 在转录水平上验证 Czf5蛋白表达 实施例 6中 18棵能够在干旱条件下正常生长的 1\代转基因植株中随机选取 8棵， 实施例 6中 5棵不能在干旱条件下正常生长的 1\代转基因植株中随机选取 4棵， 各 剪取干旱 14天的叶片 0.05 g， 用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen)提取总 RNA。 紫 外分光光度测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 计算各个 RNA浓度。 依照 invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 ( 1 总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO: 11 )。通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11扩增 GhCzf5， 检测 Czf5蛋白相对表达情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶， 以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ1， 以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变 性 5 min， 29个循环 （94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin)， 72 °C 延 伸 10 min。产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000,购自深圳瑞 真生物技术有限公司）， 1-8为正常生长植株， 9-12为不能正常生长植株。 图中所示条 带大小与 GhCzf5的大小一致。结果表明正常生长植株中 GhCzf5的转录较强， 不能正 常生长植株中没有 GhCzf5转录或转录很弱。 本领域技术人员可以理解的是本发明也适用于 特定描述之外的变化和调整， 并且 本发明包括所有的这种变化和调整。发明人要 求落入下文权利要求范围和精神内的修 改和改变的权利。