本发明涉及一种香豆素衍生物及其制备方法和 在检测弹性蛋白酶的活 性中的应用。 背景技术

现有技术测定弹性蛋白酶 （EC号： 3.4.21.37) 活性的方法主要有三种。 第一种是传统的高效液相色谱法 （HPLC ) , 该方法可以直接用于检测中性 粒细胞弹性蛋白酶介导的水解纤维蛋白原反应 。 但是， 高效液相色谱法实 验过程繁琐、 周期长、 并且很难做到弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的高 通量 筛选。 第二种是紫外吸收光谱法， 该方法操作简单、 反应快速， 目前已获 得广泛的使用， 但是这种方法存在以下两方面的缺陷： 首先， 紫外吸收光 谱法的背景干扰大， 导致分析的灵敏度低。 其次， 用于分析的底物均为多 肽衍生物或蛋白质， 底物的制备成本高。 目前普遍应用的第三种弹性蛋白 酶活性的检测方法是荧光发射光谱法， 该方法以多肽类为荧光探针， 检测 的灵敏度高、 操作方法简单、 并且可以用于高通量筛选。 该方法的缺陷在 于多肽类探针在常规条件下大都稳定性差， 储存和运输条件苛刻， 原子利 用率低。

目前国内外还没有非肽荧光探针用于检测弹性 蛋白酶活性及其抑制剂 或促进剂筛选的报道。 因此， 设计开发基于非肽荧光探针的灵敏、 性质稳 定、 操作简便、 成本低廉的检测方法是非常迫切和必要的。 发明内容

本发明的目的在于克服现有弹性蛋白酶活性检 测技术中存在的缺陷， 提供一种灵敏度高、 性质稳定、 操作简便、 易于储运并且成本低廉的非肽 弹性蛋白酶活性检测荧光探针和弹性蛋白酶活 性检测方法。

为达到 本发明提供一种香豆素衍生物， 该香豆素衍生物具 有式（1 )所示结构， 其中， 为五氟乙基和七氟丙基中的一种， 为三氟 甲基、 甲基、 氰基、 如式 （5 ) 所示的吡啶环基和如式 （6 ) 所示的苯并噻 唑环基中的一种；

式 （1 ) ;

式 ( 5 )；

式 （6)。

本发明提供了上述香豆素衍生物的制备方法， 该方法包括： 在亲核反 应条件和缚酸剂的存在下， 在有机溶剂中， 将式 （2 ) 所示结构化合物与酰 氯或酸酐接触；

式 （2 )

其中， 所述酰氯选自五氟丙酰氯和 /或七氟丁酰氯， 所述酸酐选自五氟 丙酸酐和 /或七氟丁酸酐。

本发明提供上述香豆素衍生物在检测弹性蛋白 酶的活性中的应用。 本发明提供了一种弹性蛋白酶的活性的检测方 法， 该方法包括： 将含 有弹性蛋白酶的待测样品与本发明所述的香豆 素衍生物接触， 以使所述香 豆素衍生物被弹性蛋白酶水解， 得到接触后的物料； 检测接触后的物料在 激发光下发出的荧光强度， 所述荧光强度在单位时间内的增加值指示了待 测样品中弹性蛋白酶的活性； 所述激发光的波长为 340-430 nm， 所述荧光 的发射波长为 450-520 nm。

本发明同时提供一种弹性蛋白酶的活性的检测 试剂盒， 该检测试剂盒 包括： 本发明所述的香豆素衍生物、 弹性蛋白酶标准品以及反应缓冲液。

本发明的香豆素衍生物在用于检测弹性蛋白酶 活性时， 与弹性蛋白酶 具有更高的亲和力， 检测的有效性更高。

本发明提供的香豆素衍生物荧光探针， 在用于筛选弹性蛋白酶抑制剂 时， 与采用多肽类荧光探针相比， 具有更高的灵敏度； 并且本发明的香豆 素衍生物荧光探针为有机小分子荧光探针， 不会与抑制剂发生相互作用， 避免了干扰检测准确性的副反应的发生， 有利于弹性蛋白酶抑制剂或促进 剂的发现。

因此， 本发明提供的香豆素衍生物荧光探针用于与弹 性蛋白酶活性检 测有关的应用时的灵敏度高、 与酶的亲和力高、 荧光强度的变化范围广， 易于探查， 原子利用率高， 并且本发明的香豆素衍生物为非肽类的荧光探 针， 非肽类荧光探针相比于肽类荧光探针， 稳定性更高、 使用更方便、 价 格更低廉。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施 方式部分予以详细说 明。 附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与下面的具体实施方式一起用于解释本发明， 但并不构成对本发明的限制。 在附图中：

图 h 弹性蛋白酶催化荧光探针水解反应的示意图， 其中 V表示光子 能量。

图 2: 乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、猪胰弹性蛋白 酶、人弹性蛋白酶、 胰蛋白酶、 糜蛋白酶、 羧肽酶和牛血清白蛋白催化 10 μΜ荧光探针水解的 相对速率。 具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所 描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明 ， 并不用于限制本发明。

本发明提供了一种香豆素衍生物， 该香豆素衍生物具有式 （1 )所示的 结构， 其中， 为五氟乙基和七氟丙基中的一种， R ₂ 为三氟甲基、 甲基、 氰基、 式 （5 ) 所示的吡啶环基和式 （6) 所示的苯并噻唑环基中的一种；

式 （1 );

： ί'、 式 (5 )； ^V

、、 、

式 （6)。

优选情况下， 为五氟乙基， R ₂ 为三氟甲基、 甲基和氰基中的一种； 最为优选地， 为五氟乙基， R ₂ 为三氟甲基。

其中， 如式 （4)所标示的香豆素环的命名方式， 所述三氟甲基、 所述 甲基和所述氰基可以在香豆素环的 4号位。 所述如式 （5 )所示的吡啶环基 可以在香豆素环的 3号位或者 4号位， 所述如式 （6)所示的苯并噻唑环基 可以在香豆素环的 3号位。 式 （4)

本发明所述的香豆素衍生物的制备方法包括： 在亲核反应条件和缚酸 剂的存在下， 在有机溶剂中， 将式（2)所示结构化合物与酰氯和 /或酸酐接 触；

式 (2)

其中， 所述酰氯选自五氟丙酰氯和 /或七氟丁酰氯， 优选情况下， 所述酰 氯为五氟丙酰氯； 所述酸酐选自五氟丙酸酐和 /或七氟丁酸酐，优选情况下， 所述酸酐为五氟丙酸酐。

在本发明所述的香豆素衍生物的制备方法中， 所述亲核反应为氨基与 各种取代的酰氯、 酸酐发生的反应， 所述亲核反应的条件包括： 温度为零 下 5至 30 °C， 时间为 10-120 min; 优选情况下， 所述亲核反应的条件为： 温度为 0-25°C， 时间为 15-60 min。

本发明所述的香豆素衍生物的制备方法中， 所述接触需要在缚酸剂存 在的条件下进行， 所述缚酸剂可以为本领域常用的任何能够吸收 反应中产 生的酸， 避免接触反应中生成的酸影响反应或反应平衡 的物质， 优选地， 所述缚酸剂选自三乙胺、 二乙胺、 二异丙基胺、 吡啶、 Ν,Ν-二甲氨基吡啶、 2,6-二甲基吡啶、 碳酸钾、 碳酸铯、 碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种， 最为 优选地， 所述缚酸剂为三乙胺和 /或二乙胺。

为了提高接触反应传质和传热的效果， 本发明所述接触反应需要在有 机溶剂的环境中进行， 所述有机溶剂可以为任何能够在本发明所述接 触条 件下不与本发明的反应物发生反应， 并能为反应提供适宜的溶液环境的有 机溶剂， 所述有机溶剂的沸点优选为 30-155°C， 更为优选地， 所述有机溶 剂为二氯甲垸、 四氢呋喃、 氯仿、 四氯化碳、 乙腈、 丙酮、 乙二醇二甲醚、 Ν,Ν-二甲基甲酰胺和 1,2-二氯乙垸中的至少一种，最为优选地，所� �有机溶 剂为二氯甲垸、 氯仿和四氢呋喃中的至少一种。

在本发明的香豆素衍生物的制备方法中， 相对于 1毫摩尔的式 （2) 所 示结构化合物， 所述酰氯和 /或酸酐的用量为 1-3毫摩尔； 所述缚酸剂的用 量没有特别的限制， 为了达到好的对反应生成的酸的吸收效果， 所述缚酸 剂的用量可以为 1-3毫摩尔，优选情况下，所述缚酸剂的用量为 2-3毫摩尔； 用于本发明的有机溶剂的用量也没有特别的限 制， 优选情况下， 所述有机 溶剂的用量为 10-20毫升。

在本发明所述的香豆素衍生物的制备方法中， 可以用薄层色谱 （TLC) 对反应的进行情况进行监测， 当检测结果显示原料点消失时， 表明反应结 束。 其中， 在本发明中， 术语 "原料点"指所述酯化或酰胺化的香豆素衍 本发明的制备方法还包括对接触反应的产物进 行提纯， 提纯的过程可 以包括：在 0-25 °C的温度下依次用 20-60ml水和 20-60ml饱和柠檬酸溶液对 反应体系进行洗涤， 静置分层分离油相， 并用无水硫酸钠对油相进行干燥， 通过减压方法去除溶剂获得粗产物， 最后用硅胶柱对粗产物进行层析获得 口

广叩 本发明提供了本发明所述的香豆素衍生物在检 测弹性蛋白酶的活性中 的应用。

所述应用可以为本领域任何涉及弹性蛋白酶活 性检测的应用， 例如， 所述应用可以包括： 弹性蛋白酶活性的检测、 弹性蛋白酶抑制剂筛选、 弹 性蛋白酶促进剂筛选， 弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的动力学表征等， 同时 本发明所述的应用也可用于与弹性蛋白酶活性 有关的疾病的诊断和治疗， 但本发明并不仅限于此。 其中， 所述与弹性蛋白酶活性有关的疾病可以为本领 域公知的任何与 弹性蛋白酶活性有关的疾病， 所述疾病可以为但并不限于， 慢性阻塞性肺 病 ( chronic obstructive pulmonary disease, COPD) , 囊月中性纤维化 ( cystic fibrosis, CF)， 急性肺损伤 （acute lung injury, ALI)， 急性呼吸窘迫综合症 ( acute respiratory distress syndrome， ARDS )，身性炎症反应综合征 ( systemic inflammatory response syndrome， SIRS )， 月巿癌 ( lung cancer )。

本发明还提供了一种弹性蛋白酶活性的检测方 法， 该方法包括： 将含有弹性蛋白酶的待测样品与本发明所述的 香豆素衍生物接触， 以 使所述香豆素衍生物被弹性蛋白酶水解， 得到接触后的物料；

检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度 ， 所述荧光强度在单位 时间内的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶 的活性； 所述激发光的波长 为 340-430nm， 所述荧光的发射波长为 450-520 nm。

本领域技术人员能够理解的是， 所述接触后的物料在激发光下发出的 荧光强度是指实际测得的所述接触后的物料的 荧光强度减去在相同条件下 测得的背景荧光强度， 也即， 不含有弹性蛋白酶的空白对照的荧光强度后 得到的荧光强度。

具体的， 对于 为三氟甲基的香豆素衍生物， 激发光波长为 360-380 nm， 荧光发射波长为 490-520 nm; 对于 R ₂ 为甲基的香豆素衍生物， 激发光 波长为 360-380 nm， 荧光发射波长为 450-470 nm; 对于 R ₂ 为氰基的香豆素 衍生物， 激发光波长为 410-450 nm， 荧光发射波长为 450-490 nm; 对于 R ₂ 为吡啶环的香豆素衍生物， 激发光波长为 350-380 nm, 荧光发射波长为 460-500 nm,对于 R ₂ 为苯并噻唑环的香豆素衍生物，激发光波 长为 355-395 nm, 荧光发射波长为 490-520 nm。

在本发明所述的弹性蛋白酶活性的检测方法中 ， 香豆素衍生物的用量 范围与待测弹性蛋白酶样品及香豆素衍生物的 种类有关， 通常情况下， 香 豆素衍生物的用量能够达到表征弹性蛋白酶待 测样品的活性即可， 优选情 况下， 相对于待测样品中每 Ι μΜ的弹性蛋白酶， 所述香豆素衍生物的用量 可以为 1-100 μΜ， 为了达到最佳的检测效果， 所述香豆素衍生物的用量优 选为 1-10 μΜ。

在本发明提供的弹性蛋白酶活性的检测方法中 ， 所述含有弹性蛋白酶 待测样品与香豆素衍生物接触的条件包括： 温度为 25-37 °C， pH值为 6-8， 时间为 5-30 min。优选情况下， 所述接触的条件包括： 温度为 28-34 °C， pH 值为 6.5-8.0， 时间为 10-25 min。

本发明所述的检测方法中， 所述接触优选在避光条件下进行， 并对接 触的容器进行预热， 以保持待测样品的生物活性。 优选地， 所述接触的反 应容器为黑色平底孔板、 比色杯或酶标板， 并且在接触前将参加接触的各 组分及反应容器预热至适宜的反应温度， 预热所要达到的温度优选为 28-37 V。

根据本发明一种优选的实施方式， 所述接触还优选在 50-100 mM 的 Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH=7.0) 缓冲液中进行。优选地， 可以在接触 前将 1-100 nM的含弹性蛋白酶样品、 1-10 μΜ的香豆素衍生物分别与 50-150 μΐ所述 Tris-HCl缓冲液混合， 体系的总体积可以为 150-250 L。

对所述含有弹性蛋白酶待测样品与香豆素衍生 物接触后的物料的荧光 强度的检测可以在酶标仪或荧光分光光度计中 进行， 可以采用时间依赖性 检测的方法获得弹性蛋白酶在接触过程中催化 香豆素衍生物水解的荧光强 度随时间变化的情况， 获得荧光强度随时间变化的增加值， 即相对反应速 率。 此外， 可以采用多次重复试验和设置若干对照组的方 式保证检测的可 靠性。

当本发明所述的弹性蛋白酶活性的检测方法用 于弹性蛋白酶抑制剂或 促进剂的筛选时， 可以按以下方法进行， 分别将 15-25 的弹性蛋白酶、 15-25 μ∑的抑制剂或促进剂溶解于 50-150 μ∑ 50-100 mM的 Tris-HCl (含有 8-12 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0 ) 缓冲液中， 并分别置于不同的恒温水槽中预热 至 30-37°C ; 同时将反应容器置于孵育箱中预热至 30-37°C。 随后， 在反应 容器中先后将上述的已经预热的含有弹性蛋白 酶抑制剂或促进剂的缓冲溶 液与香豆素衍生物混合，体系的总体积为 150-250 。避光条件下加入 1-100 nM的弹性蛋白酶启动反应，并用酶标仪或者荧� ��分光光度计对样品荧光强 度的变化情况进行监测。

本发明还提供一种弹性蛋白酶的活性的检测试 剂盒， 该检测试剂盒包 括： 本发明所述的香豆素衍生物、 弹性蛋白酶标准品以及反应缓冲液， 所 述弹性蛋白酶标准品在检测时可以用作为对照 组或绘制标准曲线。

本发明所提供的试剂盒可以应用于检测待测样 品中弹性蛋白酶的活 性， 筛选弹性蛋白酶抑制剂或促进剂以及其它与弹 性蛋白酶活性检测或弹 性蛋白酶抑制剂或促进剂功能相关的领域， 另外， 本试剂盒也可用于与弹 性蛋白酶活性检测有关的医学检测和治疗领域 ， 但本发明并不仅限于此。

在本发明所提供的试剂盒中， 优选情况下， 弹性蛋白酶标准品纯度不 低于 70%, 反应缓冲液为 50-100 mM的 Tris-HCl (含有 8-12 mM CaCl ₂ ， pH = 6.5-7.5 )， 本试剂盒的保存条件为在零下 20°C至 4°C避光保存。 所述试剂 盒的具体使用方法可以按照以下所列举的方法 进行：

( 1 )配置 10 mM香豆素衍生物的 DMSO溶液，并且在零下 20 或4°〇 下避光保存。

(2)将弹性蛋白酶标准品用 0.1 M的 Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲液溶解， 配制成 100 U/ml的弹性蛋白酶标准品溶液， 并以 10倍 的稀释度进行梯度稀释。

(3 )将 10 μΐ含有弹性蛋白酶的待测样品用 100 μΐ的 100m M Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲液溶解。

(4)分别将 0.2 ml的 Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲液， 香豆素衍生物、 待测的弹性蛋白酶样品和弹性蛋白酶标准品加 入于黑色酶 标板中。 (5 ) 以检测到的梯度稀释的弹性蛋白酶标准品的荧 光强度变化值绘制 标准曲线， 通过比对确定被检测的样品中弹性蛋白酶的活 性。

当本发明的试剂盒用于弹性蛋白酶抑制剂或促 进剂的筛选时， 可以将 所述抑制剂在检测前以适当比例或粘度添加于 反应混合液中。 随后加入适 量的弹性蛋白酶标准品启动反应，反应的条件 为 25-35°C，时间为 5-30 min。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。 以下实施例中所使用多肽 类底物 Suc-Ala-Ala-Ala-pNA为购自 Sigma-alderich试剂公司、 产品编号为 70967-97-4的市售品。 硅胶层析柱为欣维尔公司产品。 酶标仪为 Molecular Devices公司 （型号 SpectraMax M5 )。 以下实施例中所使用的酶或蛋白的来源及参数 如下：

乙酰胆碱酯酶购自 a-Aldrich (C1682 ) 比活力≥l,500units/mg

丁酰胆碱酯酶购自 Sigma-Aldrich (C1057) 比活力≥900units/mg 牛血清白蛋白购自百灵威科技公司 （109636) 纯度为 98%

猪胰弹性蛋白酶购自玛雅公司 （10095 ) 比活力≥30 U/mg

人弹性蛋白酶购自 Sigma-Aldrich (E8140-1U ) 比活力≥50 U/mg 胰蛋白酶购自玛雅公司 （10020) 比活力≥250 U/mg

糜蛋白酶购自玛雅公司 （10001 ) 比活力≥1500 U/mg

羧肽酶购自 Worthington (CLS005304 ) 比活力 >170 U/mg

以下实施例中荧光强度变化率 （AF/Δί) 按照以下公式计算：

_ F ₂ - F _x

At t ₂ - t _x 其中， F ₂ 表示 ¾时刻样品的荧光强度， 表示 ^时刻样品的荧光强度。 紫外可见吸收值的变化率 （ΔΑ/Δί) 按照以下公式计算：

ΑΑ _ Α ₂ - Α _ι

At - 1、 其中， A ₂ 表示 t ₂ 时刻样品在 405 nm处的紫外可见吸收值， 表示 ^ 时刻样品在 405 nm处的紫外可见吸收值。

其中， At的单位为分钟。 实施例 1

本实施例用于说明本发明所述的香豆素衍生物 的制备方法。

在有机溶剂 （二氯甲垸， 20 ml) 中， 在缚酸剂 （吡啶， 2.5 mmol) 存 在下， 将式 （2)所示的化合物 （7-氨基 -4-三氟甲基香豆素， l mmol) 与酸 酐 （五氟丙酸酐， 2 mmol) 在 5°C下， 维持 30分钟的接触， 得到接触后的 物料。 然后依次用水 （50 ml) 和饱和柠檬酸溶液 （50 ml)洗涤接触后的物 料， 得到洗涤后的物料。 分离洗涤后的物料中的油相并用无水硫酸钠进 行 干燥， 减压去除溶剂获得粗产品， 将粗产品经硅胶柱纯化获得白色固体产 品 （1 ) 0.15 g o

用 NMR和 MS检测该白色固体产品， 数据为 ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ ): δ ppm: 7.03(s, 1H), 7.79(s, 2H), 7.88(s, 1H), 11.82(s, 1H). ¹⁹ F NMR(376 MHz, CD ₃ OD): δ -122.63, -83.31, -65.09 ppm. GC-MS calcd for [C ₁₃ ¾F ₈ N0 ₃ ] 375.17, found 374.94. HRMS[M - H]", calc.374.0069, found. 374.0079。

该数据与式 （1 ) 所示的化合物的理论值完全相符， 证明该产品为如式 (3 ) 所示的化合物。

式 （3 ) 本测试例用于说明本发明提供的弹性蛋白酶活 性的检测方法。

将 1 mg弹性蛋白酶样品溶解于 100 mM Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0 )缓冲液中并进行梯度稀释， 按表 1中给出的浓度配制不同浓度的 弹性蛋白酶标准品溶液， 将配置获得的弹性蛋白酶标准品溶液置于 30 °〇恒 温水槽中预热； 同时将黑色平底 96孔板置于 30 孵育箱中预热。 随后， 各取 40 μΐ已预热的弹性蛋白酶标准品溶液于预热的� �色平底 96孔板中， 加入 120 μΐ 100 mM Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲液于已预 热的黑色平底 96孔板中， 并设置阴性对照组 （只加 160 μΐ的缓冲液）， 在 避光条件下， 将 40 μΐ实施例 1中制得的产品 （1 ) 分别与弹性蛋白酶标准 品及对照组缓冲液接触， 用酶标仪对各弹性蛋白酶标准品溶液及对照组 溶 液在 370 nm处的激发光下的接触后荧光强度进行动力学� ��描， 获得 5-10 分钟内的荧光强度的变化率， 结果列于表 1。酶反应动力学的米氏常数以及 经济成本如表 2所示， 其中， 米氏常数越低表示底物与酶的亲和力越强。 对比例 1

该对比例用于说明现有技术中弹性蛋白酶活性 的检测方法。

采用与测试例 1 相同的方法检测弹性蛋白酶标准品催化系列浓 度梯度 的底物水解的情况， 不同的是， 所用的底物探针为 Sigma-alderich试剂公司 的多肽类底物 Suc-Ala-Ala-Ala-ρΝΑ,在波长为 405 nm处对接触后的紫外可 见吸收值进行动力学扫描， 获得 5-10分钟内的紫外可见吸收值的变化率， 结果列于表 1。 酶反应动力学的米氏常数以及经济成本如表 2所示。 表 1

j试例 1 20·45 ± 1.852 低于 10

对比例 1 145 士 12 1755 测试例 2 本测试例用于说明本发明提供的弹性蛋白酶活 性检测方法的专一性。 将 l mg各种酶和蛋白 （乙酰胆碱酯酶、 丁酰胆碱酯酶、 猪胰弹性蛋白 酶、 人弹性蛋白酶、 胰蛋白酶、 糜蛋白酶、 羧肽酶和牛血清白蛋白） 样品 溶解于 100 mM Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0)缓冲液中配置酶样品 的溶液并置于 30 °C恒温水槽中预热； 同时将黑色平底 96孔板置于 30 V 孵育箱中预热。 随后， 各取 40 μΐ已预热的酶溶液于预热的黑色平底 96孔 板中， 加入 120 μΐ 100 mM Tris-HCl (含有 10 mM CaC12， pH = 7.0) 缓冲液 于已预热的黑色平底 96孔板中，在避光条件下，将 ΙΟμΙ实施例 1中制得的 产品 （1 ) 分别与各个酶样品接触， 用酶标仪在 370 nm的激发光下检测各 种酶和蛋白催化 10 μΐ实施例 1中制得的产品 （1 ) 水解的相对速率， 即荧 光强度的变化率， 结果如图 2所示。 测试例 3

本测试例用于说明根据本发明的弹性蛋白酶抑 制剂的筛选方法。

将 lmg弹性蛋白酶样品溶解于 100 mM Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0)缓冲液中配置弹性蛋白酶浓度为 0.05 mg/mL的待测弹性蛋白酶 标准品溶液， 将西维塞斯钠 （sivelestat) 溶解于 1 ml 100 mM Tris-HCl (含 有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲液中配置成浓度梯度为 0.1、 1、 4、 7、 10、 20 μΜ的抑制剂溶液， 将 0.01 mmol实施例 1中制得的产品 （1 )溶解 于 10 ml 100 mM的 Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲液中配置 成浓度为 1 mM的荧光探针溶液， 分别将配置获得的弹性蛋白酶标准品溶 液、 抑制剂溶液和荧光探针溶液置于 30 °C恒温水槽中预热； 同时将黑色 平底 96孔板置于 30°C孵育箱中预热。随后， 分别将 40 μΐ各浓度梯度的抑 制剂溶液、 100 μΐ 100 mM Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲液 和 40 μΐ荧光探针 (终浓度为 5 μΜ)溶液加入到黑色平底 96孔板中混合为实 验组， 并设立 140 μΐ 100 mM Tris-HCl (含有 10 mM CaCl ₂ ， pH = 7.0) 缓冲 液和 40 μΐ荧光探针溶液混合的对照组， 在避光条件下， 分别在实验组和 对照组中用排枪迅速加入 20 μΐ弹性蛋白酶标准品溶液启动反应。 最后用 酶标仪在 370 nm的激发光下分别对实验组和对照组荧光强度� ��变化率进 行检测， 结果列于表 2。 对比例 2

本对比例用于说明现有技术弹性蛋白酶抑制剂 的筛选方法。

采用与测试例 3相同的方法进行弹性蛋白酶抑制剂的筛选， 不同的是， 将荧光探针溶液换为 Sigma-Aldrich 试剂公司 的多肽类底物 Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, 其终浓度为 200 mM。 紫外可见光的吸收波长为 405 nm。 结果列于表 3。

通过实施例 1的结果可以看出， 利用本发明的方法能够制得式 （1 )所 示结构的香豆素衍生物。

通过测试例 1和对比例 1 的结果可以看出， 与现有的多肽类底物荧光 探针相比， 本发明的非肽香豆素衍生物荧光探针与弹性蛋 白酶具有更高的 灵敏度和亲和力。

通过测试例 2 的结果可以看出， 弹性蛋白酶对本发明所提供的香豆素 衍生物荧光探针的水解能力明显的高于其他种 类的酶， 因此， 本发明所提 供的香豆素衍生物的专一性高。

通过测试例 3和对比例 2的结果可以看出本发明所提供的方法能够用 于弹性蛋白酶抑制剂的筛选， 并且本发明提供的弹性蛋白酶抑制剂的筛选 方法与采用多肽类底物荧光探针相比， 荧光信号的变化范围较大， 易于检 测的进行， 而多肽类底物探针的紫外可见吸收值的变化率 小 （需精确至小 数点后两位数字， 且产物不能进行荧光检测）， 不易于检测的进行， 同时， 本发明所提供的香豆素类衍生物具有更高的原 子经济性， 此外， 从获得原 料的容易程度方面考虑， 本发明所提供的香豆素类衍生物荧光探针易于 合 成， 而对比例 1 中所使用的 Sigma-Aldrich 试剂公司提供的多肽类底物 Suc-Ala-Ala-Ala-pNA则难于合成。 因此， 本发明所提供的香豆素衍生物相 较于现有技术所提供的荧光探针具有实施更加 容易， 成本更低的优势。 以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述 实施方式中的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技 术方案进行多种简单变型， 这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术 特 征， 在不矛盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不 必要的重复， 本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行 任意组合， 只要 其不违背本发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。