CANTU ORTIZ, Francisco Javier (Avenida Eugenio Garza Sada # 2501 Sur, Colonia TecnológicoC.P. Monterrey, Nuevo León, 64849, MX)
| REIVINDICACIONES 1. Un método para modificación covalente de proteínas para su visualización instantánea y posterior caracterización usando espectrometría de masas, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Teñir una muestra que contiene la proteína de interés en solución, con una solución colorante con un grupo funcional, para reaccionar en una adición nucleofilica con los grupos amino de la proteína, preferentemente en los aminoácidos lisina de la secuencia peptidíca; y opcionalmente tiene al menos otro grupo funcional ionizable para dar mayor solubilidad a la tinción en agua, posteriormente dar mayor solubilidad a los péptidos e influye su ionización por espectrometría de masas; b) Reducir los enlaces disulfuro de la proteína contenida en la solución muestra obtenida en la etapa a), particularmente intercambiando un grupo sulfidrilo (-SH) presente en el enlace disulfuro por ditiotreitol; llevando esto a cabo mediante la adición de una solución reductora, preferentemente en una relación de volúmenes 1:1 (solución muestra : solución reductora), y calentando por incubación a 100°C durante un tiempo de al menos 1 minuto, la solución obtenida es denominada solución muestra reducida; c) Alquilar los grupos sulfhidrilo (— SH) de la solución muestra reducida, presentes en los residuos de cisterna; esto se lleva a cabo agregando una solución de alquilación en una relación de volúmenes preferentemente 10:1 (solución muestra reducida : solución de alquilación) y mantener a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos; aunque el tiempo de incubación puede ser prolongado arriba de 5 minutos sin afectar la reacción; la solución obtenida es denominada solución de proteína alquilada; d) Separar las proteínas contenidas en la solución de proteína alquilada, en un gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), de acuerdo al protocolo estándar descrito por Sambrook, aplicando una corriente eléctrica preferentemente de 150 V por 45 minutos; es posible disminuir el voltaje e incrementar el tiempo de separación, así como incrementar el voltaje y disminuir el tiempo de separación; e) Cortar la bandas de interés del gel de SDS-PAGE, en fragmentos de lmm x lmm; f) Eliminar el exceso de agua presente en los fragmentos de gel además de fijar las proteínas, esto se lleva a cabo por la adición directa de acetonitrilo a los fragmentos de gel incuban por 5 minutos a temperatura ambiente, posteriormente el exceso de acetonitrilo es removido de las muestras, y posteriormente estas son secadas mediante centrifugación al vacio por 10 minutos; g) Digestión tríptica de las proteínas presentes en los fragmentos de gel fijados y deshidratados, esto se realiza cubriendo los fragmentos de gel, con una solución de tripsina (V511A Promega, 10 en NH4HCO3, 25 mM), e incubar a una temperatura de 60°C durante 30 minutos; h) Extraer los péptidos de los fragmentos de gel digeridos en g), esto se lleva a cabo adicionando una solución de acetonitrilo/ácido trifluoroacético 0.1% (v/v) en relación 1:1 a los fragmentos de gel digeridos, e incubar a 60 °C por 15 minutos; i) Secar los péptidos, eliminando el exceso de solución de acetonitrilo/ácido trifluoroacético por centrifugación a vacío hasta obtener los péptidos secos; j) Preparar los péptidos extraídos para análisis mediante espectrometría de masas; los péptidos secos, son recuperados por la adición de aproximadamente 20 uL de una solución de ácido fórmico 0.1% (v/v), la solución con los péptidos es transferida en viales de polipropileno (FAMOS) para nano LC-MS MS. 2. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa a), el colorante preferentemente es Uniblue A, a una concentración de 60 mM, disuelto en una solución de carbonato de sodio (100 mM) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 10% (p/v) en solución con agua bidestilada, a un pH en el rango de 8 a 9. 3. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque en la etapa a), la tinción se lleva a cabo preferentemente calentando a 100°C durante 1 minuto; aunque la temperatura de calentamiento puede ser menor a 100°C, con tiempos de reacción prolongados. 4. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa a), la muestra que contiene la proteína de interés, opcionalmente consiste en un: a) Una muestra con proteína seca (liofilizada); b) Una muestra de proteínas en solución en una concentración suficiente y una solución amortiguadora compatible; c) Una muestra de proteína en solución en una baja concentración y solución amortiguadora no compatible, (dígase de solución amortiguadora no compatible como aquella que contiene grupos amino, p.ej.: Tris). 5. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las muestras de proteína seca, se disuelve la muestra en una solución de carbonato de sodio (100 mM) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 10% (p/v) en solución con agua bidestilada, a un pH en el rango de 8 a 9. 6. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las muestras de proteínas en solución en una concentración suficiente y una solución amortiguadora compatible; son utilizadas tal cual, en el método propuesto. 7. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las muestra de proteína en solución en una baja concentración y solución amortiguadora no compatible; opcionalmente son: a) precipitadas usando TC A/acetona [lg TCA/mL acetona, previamente enfriada a 4 °C] y posteriormente resuspendidas en una solución amortiguadora [la solución amortiguadora, consiste en una solución carbonato de sodio (100 mM) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 10% (p/v) en solución con agua bidestilada con un pH en el rango entre 8 a 9]. b) Ultrafiltradas para eliminar la solución no compatible y al mismo tiempo concentrar las proteínas y recuperarlas con la adición de solución amortiguadora que consiste en una solución de carbonato de sodio (100 mM) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 10% (p/v) en solución con agua bidestilada, a un pH en el rango de 8 a 9. 8. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa a), en la solución colorante el grupo funcional para reaccionar en una adición nucleofilica es vinil. 9. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa a), en la solución colorante el grupo funcional ionizable para dar mayor solubilidad a la tinción en agua, posteriormente dar mayor solubilidad a los péptidos e influye su ionización por espectrometría de masas a los péptidos y solubilidad a la tinción en agua, preferentemente es sulfato. 10. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa g) la reacción de hidrólisis por tripsina cerca de residuos modificados con Uniblue A es inhibida, y debido a esto la reacción de hidrólisis se lleva a cabo en mayor parte en los residuos de arginina obteniendo fragmentos proteolíticos más grandes, logrando un mejoramiento en la cobertura de la secuenciación de péptidos. 11. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa j), los iones del grupo N-terminal precedidos por una lisina tienen una masa adicional correspondiente al Uniblue A (484.0 Da), lo que facilita su detección mediante espectrometría de masas. 12. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa j), cada modificación de lisina afecta la masa de los fragmentos de aminoácidos en dirección N- o C- terminal. 13. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa j), los iones del grupo N-terminal precedidos por al menos una lisina tienen una masa adicional acumulable correspondiente al Uniblue A (484.0 Da), respecto a la lisina. 14. El método para modificación covalente de proteínas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa j), los iones del grupo C-terminal precedidos por al menos una lisina tienen una masa adicional acumulable correspondiente al Uniblue A (484.0 Da), respecto a la lisina. 15. Un kit para visualizar instantáneamente proteínas para su posterior caracterización usando espectrometría de masas, caracterizado porque comprende los siguientes reactivos almacenados de manera independiente: a) Una solución amortiguadora A, que consiste en una solución de carbonato de sodio a una concentración 100 mM y una solución de dodecilsulfato sódico (SDS) a una concentración de 10% (p/v), con un rango de pH de 8 a 9; b) Solución de Colorante Uniblue A, en donde el Uniblue A es disuelto en la solución amortiguadora A, a una concentración de 60 mM; c) Solución reductora, consiste en una solución al 20% (v/v) de glicerol, Tris HCl 200 mM y 20 mM ditiotreitol (DTT), con un pH de 6.8; d) Solución de alquilación, consiste en una solución de iodoacetamida (IAA) a una concentración de 550 mM en solución amortiguadora A; e) Control positivo: consiste en 3 mg de albúmina de suero bovino (ASB) liofilizada, con la instrucción para reconstituir en 1 mL de solución amortiguadora A. 16. Un kit para visualizar instantáneamente proteínas para su posterior caracterización usando espectrometría de masas, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las instrucciones son: a) Adicionar 10 μL· de solución colorante a 90 μL· de solución muestra que contiene la proteína de interés, para obtener una solución muestra coloreada, b) Calentar la solución muestra coloreada a 100 °C por 1 minuto, c) Agregar 100 μΐ.. de la solución reductora, a la solución muestra coloreada caliente, manteniendo el calentamiento a 100 °C por 1 minuto, d) Agregar 20 \iL de la solución de alquilación a cada solución muestra coloreada caliente de c), e) Incubar la solución muestra coloreada de d) a temperatura ambiente por 5 minutos, f) Cargar la solución muestras coloreada en el gel de SDS-PAGE, g) Separar las proteínas de la muestra coloreada de f) mediante electroforesis, opcionalmente a 150 V por 45 minutos, Bio-Rad Protean3 Minigel 10% Acrilamida. |
La presente invención se refiere ampliamente a la modificación química de proteínas. De manera más específica, describe métodos para modificar químicamente un sitio específico en las cadenas peptídicas de las proteínas.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La invención es un método para llevar a cabo una modificación covalente de proteínas para una visualización instantánea y su posterior caracterización usando espectrometría de masas.
ANTECEDENTES
El primer paso de un análisis de proteínas, es generalmente, la separación de las proteínas en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) seguido de la tinción de las proteínas. Las bandas correspondientes a la proteína de interés pueden ser cortadas directamente del gel y analizadas por espectrometría de masas. La tinción con azul de Coomassie, es una de las técnicas más frecuentemente utilizadas para la tinción de proteínas en geles de SDS-PAGE, debido a su alta compatibilidad con el análisis de espectrometría de masas. Sin embargo, esta técnica requiere de varias horas. Además de que, el colorante debe ser removido antes de preparar las proteínas para el análisis de espectrometría de masas, este procedimiento necesita al menos una hora [1]. En la literatura se han descrito diversas tinciones para la modificación covalente de proteínas [2],[3] pero la subsecuente aplicación de estas tinciones en la caracterización de proteínas por espectrometría de masas no es descrita. BREVE DESCRD7CIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Representación esquemática de la reacción de adición de Uniblue A a un grupo amino de la proteína.
Figura 2-a. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con Uniblue A. Muestra de Albúmina de suero bovino (ASB).
Carril 1: Marcador molecular. Carril 2: Muestra de ASB teñido con Uniblue A
Figura 2-b. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. Muestra de ASB.
Carril 1 : Marcador molecular.
Carril 2: Muestra de ASB teñida con azul de Coomassie.
Figura 3-a. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con Uniblue A. Muestra de Rituximab, un anticuerpo recombinante.
Carril 1: Marcador molecular.
Carril 2: Rituximab teñido con Uniblue A.
Figura 3-b. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. Muestra Rituximab, un anticuerpo recombinante.
Carril 1: Marcador molecular.
Carril 2: Rituximab teñido con azul de Coomassie.
Figura 4. Análisis de muestras de células de Escherichia coli TOP10 con y sin expresión de una proteína recombinante. Esta proteína, es una proteína de fusión, malE-lacZa, proveniente del vector pMAL-c4x (New England Biolabs Inc., NEB). El peso molecular teórico de esta proteína es de 50871.3 Da, que corresponde a la línea azul del marcador molecular.
Figura 4-a. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con Uniblue A para la identificación de la expresión de una proteína recombinante de Escherichia coli.
Carril 1 : Marcador molecular.
Carril 2: Perfil de proteínas de Escherichia coli recombinante teñidas con Uniblue A.
Carril 3: Perfil de proteína de Escherichia coli recombinante sin teñir.
Figura 4-b. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie para la identificación de la expresión de una proteína recombinante de Escherichia coli.
Carril 1 : Marcador molecular
Carril 2: Perfil de proteínas de Escherichia coli recombinante teñidas con Uniblue A y azul de Coomassie.
Carril 3: Perfil de proteínas de Escherichia coli recombinante teñidas con azul de Coomassie.
Figura 4-c. Comparación directa entre las cepas de Escherichia coli sin y con expresión de una proteína de fusión de 50871.3 Da. Tinción rápida de 1 minuto solamente con Uniblue A.
Carril 1: Marcador molecular Carril 2: Perfil de proteínas de Escherichia coli TOP10/pMAL-c4x que produce una proteína fusión MalE-lacza, tinción con Uniblue A
Carril 3: Perfil de proteínas de Escherichia coli TOP10 sin expresión, tinción con Uniblue A
Figura 5-a. Espectro de masas. Péptidos de ASB analizados por MS MS sin modificación. Figura 5-b. Espectro de masas. Péptidos de ASB analizados por MS/MS con modificación en Usina K (1).
Figura 5-c. Espectro de masas. Comparación directa entre los péptidos con Uniblue A, modificación (arriba) y sin modificación (abajo). Los iones del grupo N-terminal (b iones) son más fáciles de detectar debido a la adición de la masa correspondiente al Uniblue A (484.0 Da).
Figura 6. Representación esquemática del método motivo de esta invención y las etapas preparativas de muestras.
Figura 7. Representación esquemática de los fragmentos "a", "b" y "c" (N-terminal) y "x", "y" y "z" (C-terminal) de un péptido.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención refiere un método para modificar químicamente una proteína, particularmente mediante la adición nucleofílica de un colorante con al menos un grupo funcional, para reaccionar en una adición nucleofílica con los grupos amino de la proteína, preferentemente en los aminoácidos Usina de la secuencia peptídica; (por ejemplo un grupo vinil), y opcionalmente tiene al menos otro grupo funcional ionizable para dar mayor solubilidad a la tinción en agua, posteriormente dar mayor solubilidad a los péptidos e influye en su ionización por espectrometría de masas (por ejemplo un grupo sulfato); preferentemente el colorante es Uniblue A (ver figura 1). La modificación química de sitios específicos en la secuencia de una proteína con el colorante, demuestra ciertas ventajas para su visualización en un gel de SDS-PAGE. Las ventajas están directamente relacionadas con la visualización de las proteínas en un corto período de tiempo, sin modificación notable de su masa aparente en el SDS-PAGE, para posteriormente permitir su caracterización mediante espectrometría de masas, disminuyendo considerablemente el tiempo de análisis. Adicionalmente, la modificación de los péptidos puede ayudar para obtener resultados más significantes en el análisis de los péptidos por cambios de las propiedades del péptido.
Para llevar a cabo el método propuesto se requieren las siguientes soluciones:
a) Solución amortiguadora A. El rango de pH de esta solución es de 8-9.
Preferentemente consiste de una solución de carbonato de sodio (100 mM) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 10% (p/v) en solución con agua bidestilada. El SDS es un detergente aniónico, el cual es capaz de disolver moléculas hidrófobas. La función del SDS es desnaturalizar las proteínas originando un cambio en la estructura (primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria) dando lugar a una estructura lineal. Otra de las funciones del SDS es cargar negativamente las proteínas. Estas dos funciones son importantes para llevar a cabo una adecuada separación de las proteínas en un gel de SDS-PAGE.
b) Solución colorante. Se refiere a un colorante en solución, donde el colorante tiene un grupo funcional para reaccionar en una adición nucleofilica con los grupos amino de la proteína, preferentemente en los aminoácidos lisina de la secuencia peptídica; y opcionalmente tiene al menos otro grupo funcional ionizable como el sulfato, para dar mayor solubilidad a la tinción en agua, posteriormente dar mayor solubilidad a los péptidos e influye en su ionización por espectrometría de masas. Preferentemente, es Uniblue A, a una concentración de 60 mM, disuelto en la solución amortiguadora A.
c) Solución reductora. Esta solución tiene un pH de 6.8, y consiste de una solución de glicerol (20% v/v), Tris HC1 pH 6.8 (200 mM) y ditiotreitol (DTT) 20 mM. La reducción de un enlace disulfuro por DTT, se lleva a cabo por dos reacciones secuenciales, en las cuales se intercambia un grupo sulfidrilo (— SH) presente en el enlace disulfüro (unión covalente entre dos grupos— SH presentes en residuos de cisterna).
d) Solución de alquilacíón. Consiste en una solución de iodoacetamida (IAA) a una concentración de 550 mM en solución amortiguadora A. La alquiliación se da por la unión covalente entre la iodoacetamida y los grupos— SH presentes en los residuos de cisterna.
e) Control positivo. 3 mg de albúmina de suero bovino (ASB) liofilizada son reconstituidos en 1 mL de solución amortiguadora A. Una de las razones por la cual se eligió la ASB, es porque es una proteína muy bien caracterizada y estudiada, lo que permite utilizarla como modelo para llevar a cabo diversos experimentos, además de su disponibilidad en el mercado a un bajo costo.
Las muestras proteicas a analizar deben cumplir con las siguientes características.
a) Estar en solución con al menos 50% de solución amortiguadora A.
b) Tener una concentración de proteína en al menos 100 mg mL de solución. c) Carecer de compuestos aminos que puedan obstruir o reaccionar con el colorante Uniblue A.
Las muestras proteicas a caracterizar por el método propuesto en esta solicitud, se han clasificado como a continuación se describe.
a) Muestra de proteína seca (liofilizada).
b) Muestra de proteínas en solución en una concentración suficiente y una solución amortiguadora compatible.
c) Muestra de proteína en solución en una baja concentración y solución amortiguadora no compatible, (dígase de solución amortiguadora no compatible como aquella que contiene grupos amino, p.ej.: Tris).
Dependiendo del origen de la muestra que contiene la proteína, se presenta un protocolo (ver figura 6) para la preparación de la muestra, de tal modo que:
- En muestras de proteína seca (1), se disuelve (2) la muestra en una solución amortiguadora A.
-En muestras de proteínas en solución en una concentración suficiente y una solución amortiguadora compatible (3), ingresan a la etapa a) del método propuesto. -En muestras en solución en las cuales existe una baja concentración de proteínas y a demás presentan una solución amortiguadora no compatible (5), opcionalmente: -Las proteínas pueden ser precipitadas usando TCA/acetona y posteriormente resuspendidas en solución amortiguadora A (6); esto se lleva a cabo mezclando el TCA/acetona (lg TCA/mL acetona, previamente enfriada a 4 °C) y la muestra líquida de proteína en relación 1:9. La mezcla se coloca en un baño con hielo a 4 °C por 1-2 horas. Después, las muestras son centrifugadas a 14,000 rpm a 4 °C por 15 minutos. El sobrenadante es removido y el precipitado es lavado con acetona al menos tres veces, después es centrifugado a 14,000 rpm por 5 min y el sobrenadante es eliminado. Una vez lavado, el precipitado es resuspendido en la solución amortiguadora A.
-La solución no compatible puede ser eliminada mediante ultrafiltración y al mismo tiempo las proteínas son concentradas y posteriormente las proteínas son recuperadas con la adición de solución amortiguadora A.
El método para la modificación covalente de proteínas para su visualización instantánea y posterior caracterización usando espectrometría de masas comprende las siguientes etapas: a) Teñir una muestra que contiene la proteína de interés en solución, con una solución colorante con 1 grupo funcional, para reaccionar en una adición nucleofilica con los grupos amino de la proteína, preferentemente en los aminoácidos Usina de la secuencia peptídica; y opcionalmente tiene al menos otro grupo funcional ionizable para dar mayor solubilidad a la tinción en agua, posteriormente dar mayor solubilidad a los péptidos e influye su ionización por espectrometría de masas, la solución colorante es Uniblue A disuelto en la solución amortiguadora A en una concentración de 60 mM. La solución muestra resultante es calentada a 100°C durante 1 minuto, evitando prolongar la exposición de la muestra a esta temperatura debido a que se corre el riesgo de degradar la proteína. La reacción química también funciona con temperaturas más bajas, pero con un tiempo de incubación más prolongado. b) Reducción de la proteína (8). Esto se realiza mediante la adición de la solución reductora a la solución muestra obtenida en la Etapa a, en una relación de volúmenes 1: 1 (solución muestra : solución reductora) preferentemente y la posterior incubación en un rango comprendido entre 90°C a 100°C durante un tiempo de al menos 1 minuto; la solución obtenida se le denomina solución muestra reducida. c) Alquilación de los grupos sulfhidrilo (— SH) reducidos (9), presentes en los residuos de cisterna. Esta etapa se lleva a cabo agregando la solución de alquilación en una relación de volúmenes 10:1 (solución muestra reducida: solución de alquilación). El tiempo para la alquilación es preferentemente de 5 minutos a una temperatura ambiente. d) Separación de las proteínas en un gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) (10). La separación se llevó a cabo de acuerdo al protocolo estándar descrito por Sambrook 2001, aplicando una corriente eléctrica de 150 V por 45 minutos. Para este caso la separación de las proteínas se llevó a cabo en geles de poliacrilamida al 10 y 12.5% (aunque la concentración de poliacrilamida usada en los geles depende del peso molecular de las proteínas de interés a separar). e) Cortar las bandas de proteína del gel de SDS-PAGE (11). Esto se realiza cortando la región donde se localiza la banda que corresponde a la proteína de interés en el gel. Posteriormente las bandas con la proteína de interés se cortan en fragmentos más pequeños (lmm x lmm). f) Eliminar el exceso de agua presente en los fragmentos de gel además de fijar las proteínas (12), esto se lleva a cabo Fijando y deshidrando los fragmentos de gel. Esto se realiza por la adición directa de acetonitrilo a los fragmentos de gel hasta cubrirlos e incubando por 5 minutos a temperatura ambiente, posteriormente el exceso de acetonitrilo es removido de las muestras, y estas son secadas mediante centrifugación al vacio por 10 minutos. Este etapa es recomendable para disminuir los efectos del acetonitrilo sobre la tripsina cuando se realiza la digestión. g) Digestión tríptica de las proteínas presentes en los fragmentos de gel fijados y deshidratados (13). Esto se realiza mediante la adición de una solución de tripsina (V511A Promega, 10 en NH 4 HCO 3 , 25 mM) suficiente para cubrir los fragmentos de gel previamente fijados y deshidratados. Posteriormente, los fragmentos de gel son incubadas a una temperatura de 60°C durante 30 minutos, en esta etapa la reacción de hidrólisis por tripsina cerca de residuos modificados con Uniblue A es inhibida, por lo tanto la reacción de hidrólisis se realiza en mayor parte en los residuos de arginina obteniendo fragmentos proteolíticos más grandes, logrando un mejoramiento en la cobertura de la secuenciación de péptidos, cabe señalar que en esta etapa los iones del grupo N-terminal precedidos por una Usina tienen una masa adicional correspondiente al Uniblue A (484.0 Da), lo que facilita su detección mediante espectrometría de masas, y cada modificación de lisina afecta la masa de los fragmentos de aminoácidos en dirección N o C terminal. h) Extracción de los péptidos de los fragmentos de gel (14). Esto se lleva a cabo por la adición de una solución de acetonitrilo/ácido trifluoroacético 0.1% (v/v) en relación 1:1 a los fragmentos de gel seguido de la incubación a 60 °C por 15 minutos. Para la obtención de una mayor cobertura de la secuencia de péptidos se recomienda usar tiempos de extracción prolongados. Después de la extracción es importante transferir la solución de extracción a un tubo nuevo. i) Secar los péptidos (15), esto se lleva a cabo eliminando el exceso de solución de acetonitrilo/ácido trifluoroacético por centrifugación a vacío hasta obtener los péptidos secos. Preparación y análisis de los péptidos extraídos mediante espectrometría de masas (16). Los péptidos extraídos son recuperados por la adición de aproximadamente 20 μΐ,. de una solución de ácido fórmico 0.1% (v/v), la solución con los péptidos es transferida en viales de polipropileno (FAMOS) para nano LC-MS MS. El análisis de los péptidos puede ser realizado, p. ej. en un nano LC-ESI- trampa de iones. El espectro resultante puede ser evaluado usando algoritmos de investigación automática como el X!Tandem o OMSSA. Para cuantificar el número de modificaciones covalentes, se toman en cuenta los cambios de masa de + 484.03989 Da (monoisotópico) para Uniblue A.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un Kit para visualizar instantáneamente proteínas para su posterior caracterización usando espectrometría de masas. El pregonado Kit comprende los siguientes reactivos, almacenados de manera independiente:
a) Una solución amortiguadora A. Esta solución tiene un pH en el rango de 8 a 9, preferentemente consiste en una solución de carbonato de sodio a una concentración 100 mM y una solución de dodecilsulfato sódico (SDS) a una concentración de 10% (p/v).
b) Solución de colorante Uniblue A. El colorante Umblue A es disuelto en solución amortiguadora A, a una concentración de 60 mM.
c) Solución reductora. Esta solución tiene un pH 6.8, y consiste en una solución al 20% (v/v) de glicerol, Tris HC1 200 mM y 20 mM ditiotreitol (DTT).
d) Solución de alquilación: Consiste en una solución de iodoacetamida (IAA) a una concentración de 550 mM en solución amortiguadora A.
e) Control positivo: 3 mg de albúmina de suero bovino (ASB) liofilizada, para reconstituir en 1 mL de solución amortiguadora A.
Las instrucciones para usar el Kit se describen a continuación:
a) Adicionar 10 de solución colorante a 90 μL· de solución muestra que contiene la proteína de interés, para obtener una solución muestra coloreada,
b) Calentar la solución muestra coloreada a 100 °C por 1 minuto,
c) Agregar 100 de la solución reductora, a la solución muestra coloreada caliente, manteniendo el calentamiento a 100°C por 1 minuto,
d) Agregar 20 iL de la solución de alquilación a cada solución muestra coloreada caliente de c),
e) Incubar la solución muestra coloreada de d) a temperatura ambiente por 5 minutos. f) Cargar la solución muestras coloreada en el gel de SDS-PAGE,
g) Separar las proteínas de la muestra coloreada de f) mediante electroforesis (por ejemplo 150 V por 45 minutos, Bio-Rad Protean3 Minigel 10% Acrilamida). Cada uno de los ejemplos posteriores hacen referencia a la visualización de las bandas de proteínas en un gel de SDS-PAGE, comparando la tinciones de Uniblue A y azul de Coomassie, esto para mostrar la visualización instantánea de las proteínas para su posterior caracterización mediante espectrometría de MS MS. Ejemplo 1. Modificación covalente de proteínas para su visualización instantánea empleando el Kit motivo de esta invención en una muestra de albúmina de suero bovino (ASB) y posterior caracterización mediante espectrometría de masas.
I. Preparación de la muestra.
Reconstituir 3.0 mg de ASB liofilizada en 1 mL de solución amortiguadora A en un tubo Eppendorf.
Π. Método de empleo del Kit.
Agregar 10 ÍL de solución colorante (Uniblue A) a 90 iL * de la solución de ASB (relación de volúmenes 1:9). Posteriormente las muestras fueron incubadas a 100 °C por 1 minuto. Enseguida se agregaron 100 μΐ, de la solución reductora (relación de volúmenes 1:1) a la mezcla mencionada anteriormente y se incubaron a 100 °C por 1 minuto. Finalmente, se adicionaron 20 μΐ, de la solución de alquilación e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente.
ΙΠ. Separación de las proteínas en un gel de SDS-PAGE.
Para la separación de las muestras se emplearon geles de una concentración de acrilamida de 12.5% (0.75 mm de espesor). Una vez listas las muestras, se cargaron volúmenes de 2 μΐ de la muestra de ASB en cada uno de los carriles del gel. Adicionalmente se empleó un marcador molecular Kaleidoscope™ de Bio-Rad (en este caso se empleó un volumen de 5 μί). La separación de las proteínas se llevó a cabo a un voltaje de 150 V por 45 minutos (ver figura 2-a y 2-b).
IV. Preparación de la muestra para caracterización. Primero se llevó a cabo el corte de las bandas correspondientes a las proteínas de interés del gel de SDS-PAGE. Posteriormente las bandas con la proteína de interés se cortaron en fragmentos más pequeños (aproximadamente lmm x lmm). Después, se adicionó acetonitrilo a los fragmentos de gel con la finalidad de fijar y deshidratar las proteínas presentes en los fragmentos de gel. Finalmente el exceso de acetonitrilo fue removido de las muestras, y posteriormente estas fueron secadas mediante centrifugación al vacio por 10 minutos. Posteriormente, se realizó la digestión tríptica de las proteínas presentes en los fragmentos de gel. Esto se realizó mediante la adición de una solución de tripsina (V511A Promega, 10 ng/μL en NH 4 HCO 3 , 25 mM), suficiente para cubrir los fragmentos de gel previamente fijados y deshidratados. Posteriormente, los fragmentos de gel fueron incubados a una temperatura de 60°C durante 30 minutos. Después de la digestión, el siguiente paso fue la extracción de los péptídos de los fragmentos de gel. Esto se realizó por la adición de una solución de acetonitrilo/ácido trifluoroacético 0.1% (v/v) en relación 1: 1 a los fragmentos de gel seguido de la incubación a 60 °C por 15 minutos. Después de la extracción, la solución fue transferida a un tubo nuevo.
Finalmente, el exceso de líquido fue eliminado por centrifugación a vacío hasta obtener los péptídos secos.
Caracterización de la muestra mediante espectrometría de masas.
Los péptídos extraídos fueron recuperados por la adición de aproximadamente 20 μΐ, de una solución de ácido fórmico 0.1% (v/v), la solución con los péptídos fue transferida en viales de polipropileno (FAMOS) para nano LC-MS/MS. El análisis de los péptídos se llevó a cabo usando un nano LC-ESI- trampa de iones. El espectro resultante fue evaluado por el uso de algoritmos de investigación automática X!Tandem y OMSSA. Para cuantificar el número de modificaciones covalentes, se tomó en cuenta el cambio en masa de + 484.03989 Da (monoisotópico) en los aminoácidos modificados por Uniblue A, (ver figura 5-a, 5-b y 5-c).
Ejemplo 2. Modificación covalente de proteínas para su visualización instantánea empleando el Kit motivo de esta invención en una muestra de un anticuerpo recombinante (Rituximab).
I. Preparación de la muestra.
Para este procedimiento se llevó a cabo un intercambio de una solución amortiguadora no compatible por solución amortiguadora A. Primero, 250 iL de una solución de Rituximab recombinante (500mg 50mL) fueron colocados en un tubo para ultrafiltración Amicon® Ultra (Millipore™) con capacidad de 0.5 mL y una membrana de 3000 MWCO (Molecular Weight Cut Off, [Da]). Posteriormente, se agregaron 250 μΐ- de solución amortiguadora A.
Después la muestra fue centrifugada a 14,000 x g por 30 minutos en una centrifuga para tubos Eppendorf. Enseguida se adicionó un volumen suficiente de solución amortiguadora A para tener un alcanzar un volumen de 0.5 mL (máxima capacidad del tubo Eppendorf). Repetir este procedimiento al menos cinco veces. Después de repetir el procedimiento anterior por última vez, el Rituximab fue resuspendido en 125 )ÍL de solución amortiguadora A, la concentración final de esta solución fue de 20 mg/mL.
Π. Método de empleo del Kit.
Se agregaron 10 γΛ-, de solución colorante (Uniblue A) a 90 de la solución de Rituximab (relación de volúmenes 1:9). Posteriormente las muestras fueron incubadas a 100 °C por 1 minuto. Enseguida se agregaron 100 de la solución reductora (relación de volúmenes 1: 1) a la mezcla mencionada anteriormente y se incubaron a 100 °C por 1 minuto. Finalmente, se adicionaron 20 iL de la solución de alquilación e incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
III. Separación de las proteínas en un gel de SDS-PAGE.
Para la separación de las muestras se emplearon geles de una concentración de acrilamida de 12.5% (0.75 mm de espesor). Una vez listas las muestras, se cargaron volúmenes de 2 μΐ- de la muestra de Rituximab en cada uno de los carriles del gel. Se empleó un marcador molecular Kaleidoscope™ de BioRad (en este caso se empleó un volumen de 5 μΐ . La separación de las proteínas se llevó a cabo a un voltaje de 150 V por 45 minutos (ver figura 3-a y 3-b).
Ejemplo 3. Modificación covalente de proteínas para su visualización instantánea empleando el Kit, este caso, en una muestra de Escherichia coli, cepa TOP10, con y sin expresión de una proteína recombinante con el plásmido pMAL-c4x, que codifica para una proteína de fusión.
La fusión es dada por una proteína de unión a la maltosa y el gen lacZa. En este ejemplo se realizó un control de expresión de una proteína.
I. Preparación de la muestra. La propagación de las cepas de E. coli fue llevada a cabo en 50 mL del medio TB Overnight Express (Novagen Inc.). Adicionalmente, para la cepa recombinante se agregaron 150 uL del antibiótico carbencilina al medio TB para evitar el crecimiento de otros microorganismos. Después el medio de cultivo se inoculó con 100 uL de una solución de E. coli. El cultivo de E. coli fue llevado a cabo por 16 horas a 37°C y una agitación de 250 rpm. Después de la incubación, el medio de cultivo con células fue separado en volúmenes de 7mL en tubos cónicos de 15 mL y centrifugado a 5,000 x g a una temperatura de 4°C por 15 minutos. Enseguida el sobrenadante fue removido y las células de E. coli precipitadas, en el fondo del tubo, fueron resuspendidas con la adición de 4.5 mL de solución amortiguadora A. Posteriormente, se llevó a cabo el rompimiento de la pared celular de E. coli para obtener las proteínas presentes en el interior de las células, esto fue realizado por ultrasonicación durante 15 minutos. Después, la muestra fue centrifugada a 10,000 x g por 15 minutos a 4°C, y el sobrenadante fue recuperado.
Las proteínas presentes en el sobrenadante fueron precipitadas por la adición de 0.5 mL de una solución de TCA/acetona (lg TCA/mL de acetona) en relación de volúmenes 9:1 (Sobrenadante: solución TCA/acetona). Este procedimiento se realizó a una temperatura de 4°C por 1-2 horas. Después de la precipitación, las muestras fueron centrifugadas a 10,000 x g por 15 minutos a 4°C. El sobrenadante fue desechado y las proteínas precipitadas fueron lavadas con acetona (90%) al menos tres veces (centrifugar a 10,000 x g por 15 minutos entre cada lavada). Finalmente el exceso de acetona fue eliminado y las proteínas fueron reconstituidas en 100 uL de solución amortiguadora A.
Método de empleo del Kit.
Se agregaron 10 de la solución colorante (Uniblue A) a 90 μL de la solución de E. coli (relación de volúmenes 1:9). Las muestras fueron incubadas a 100 °C por 1 minuto. Se adicionaron 100 de la solución reductora (relación de volúmenes 1:1) a las muestras y después fueron incubadas a 100 °C por 1 minuto. Finalmente, se adicionaron 20 μί de la solución de alquilación a las muestras y se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente.
III. Separación de las proteínas en un gel de SDS-PAGE. Para la separación de las muestras se emplearon geles de una concentración de acnlamida de 12.5% (0.75 mm de espesor). Una vez listas las muestras, se cargaron en volúmenes de 5 iL de la muestra de ASB en cada uno de los carriles del gel. Se empleó un marcador molecular Kaleidoscope™ de BioRad (en este caso se empleó un volumen de 5 μί). La separación de las proteínas se llevó a cabo a un voltaje de 150 V por 45 minutos (4-a, 4-b y 4-c).
Tabla 1: Análisis de péptído de ASB (carga 2+) identificado mediante OMSSA (tolerancia 2 Da, 0.8 Da para fragmentos)
Secuencia del péptido de ASB
Sec ID No.1
K V P Q V S T P T L V E V S R
Lys Val Pro Glm Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg
Tabla 2: Fragmentos N-terminales del péptido sin y con modificación con Uniblue A.
Sec. Código Frag. sin modificación con Uniblue A
AA AA N-term Teórico Medido teórico Medido
K(l) i Lys bl 129.10 - 613.14 613.19
V Val b2 228.17 228.07 712.21 712.37
P Pro b3 325.22 325.15 809.26 -
Q Glm 453.28 453.32 937.32 937.49
V Val b5 552.35 552.43 1036.39 1036.53
s Ser b6 639.38 639.52 1123.42 1123.59
T Tin- b7 740.43 740.68 1224.47 1224.71
P Pro b8 837.48 - 1321.52 -
T Tin- b9 938.53 - 1422.57 -
L Leu blO 1051.62 1051.88 1535.66 1535.66
V Val bll 1150.68 (1150.7)* 1634.72 1634.81
E Glu bl2 1279.73 1279.94 1763.77 1763.89
V Val bl3 1378.79 1378.89 1862.83 1862.93
s Ser bl4 1465.83 1465.73 1949.87 1950.63**
R Arg bl5 - - - -
* Identificado solamente mediante OMSSA para la tolerancia más alta
** Análisis manual mediante mmass, error 0.76 Da
Letra Estilo normal: análisis manual con mmass (tolerancia 0.5 Da),
Letra Estilo negrita análisis automática con OMSSA (tolerancia 0.8 Da para fragmentos, modificación opcional con Uniblue A con 484.0 Da).
Tabla 3: Fragmentos C-terminales del péptido sin y con modifícación con Uniblue A
Sec. Código Frag. sin modifícación con Uniblue A
AA C-
AA term Teórico medido teórico medido
K(l) Lys yl5 - - - -
V Val yl4 1511.84 1512.32 1511.84 -
P Pro yl3 1412.77 1412.98 1412.77 1413.04
Q Glm yl2 1315.72 1316.04 1315.72 1315.78
V Val yl l 1187.66 1187.89 1187.66 1187.94 6 s Ser ylO 1088.60 1088.79 1088.60 1088.79
T Tin- y9 1001.56 1001.80 1001.56 1001.85
P Pro y8 900.52 900.74 900.52 900.71
T Tin- y7 803.46 803.54 803.46 803.71
L Leu y6 702.42 702.42 702.42 702.35
V Val y5 589.33 589.55 589.33 589.53
E Glu y4 490.26 490.30 490.26 490.44
V Val y3 361.22 361.27 361.22 361.23
S Ser y2 262.15 262.06 262.15 -
R Arg yi 175.12 - 175.12 - Estos resultados indican, que una modificación de peso molecular de 484.0 Da está presente en la posición 1 del péptido, Usina (lys, K).