[0001] 本发明涉及分子生物学与生物技术领域， 具体地说， 涉及肌酸激酶突变体、 基 因及突变体的应用。

背景技术

[0002] 磷酸肌酸 （phosphocreatine ) ， 是在肌肉或其他可兴奋组织 （如脑和神经） 中的一种高能磷酸化合物， 是高能磷酸基的暂时贮存形式。 磷酸肌酸的作用非 常多， 其主要作用有以下七点： （1 ) 心肌保护剂： 磷酸肌酸广泛地分布于身体 各组织， 90%在肌肉组织中， 磷酸肌酸是用来维持 ATP水平的， 磷酸肌酸通过开 放合成通路和减少分解作用， 保护肌纤维膜免受缺血损害并维持细胞的核酸 储 备。 临床用于心麻痹症的心脏保护及心肌代谢窘迫 的其他状况。 适用于心肌缺 血、 肥厚、 心梗及心衰的治疗 （辅助治疗） ， 亦可用作各种心脏手术； （2 ) 缓 冲肌肉中酸性物质突然增高； （3 ) 磷酸肌酸 (CP)还参与能量运输， 即把能量从 线粒体运载到肌肉的其它部位； （4) 运动员首选的运补剂： 磷酸肌酸对于增加 运动员的体能， 提高运动成绩有明显的效果、 安全有效， 无副作用。 在比赛中 ， 磷酸肌酸 (CP)水平的增加能提高训练和比赛成绩； （5 ) ATP的贮存形式： 磷 酸肌酸可以把高能磷酸转移给 ADP生成 ATP，因此磷酸肌酸是 ATP的贮存形式； （6 ) 与40？作用而产生 ATP: 当体内肌酸磷酸激酶降低至零之前，脑组织缺 氧时， 磷 酸肌酸均能与 ADP作用而产生 ATP; ( 7 ) 缓冲剂的作用： 磷酸肌酸除提供能量外 ， 在大强度练习中还可以对控制肌肉中的酸性物 质起缓冲剂的作用。 这是因为 磷酸肌酸在合成 ATP过程中需要消耗大强度练习中堆积在肌肉中 乳酸释放出来的 氢离子， 而肌肉中氢离子过多会阻碍肌肉收缩， 所以磷酸肌酸能起缓冲作用并 推迟疲劳的出现。

[0003] 当前市场上的原料药磷酸肌酸是化学合成的， 由于合成过程中需要用到有毒且 易燃原料， 政府不再颁发生产环保批文， 严重引影响磷酸肌酸的应用。

[0004] 随着生物科技的飞速发展， 人类比以往任何时候更加关注自身的健康长寿 和环 境问题， 2015年初， 新的 《环境保护法》 正式施行， 这部被誉为史上最严厉的 环境保护法的出台， 也反应了政府大力改进中国环保现状的决心。 2015年 3月中 央政治局会议首提 "绿色化" ： "四化"变 "五化" 。 "绿色化"是指 "科技 含量高、 资源消耗低、 环境污染少的产业结构和生产方式" 。 颠覆传统 "高污 染、 高耗能、 高碳排放"化学合成产业的绿色生物合成将成� �下一轮产业经济 新的增长点， 并将成为生物经济的发动机。

[0005] 尽管通过生物催化技术生产磷酸肌酸不仅高效 且具有低碳环保， 具有很强的竞 争力， 但用于生物催化技术生产磷酸肌酸的肌酸激酶 活力较低， 影响着该技术 的工业化应用。

[0006] 因此， 提高肌酸激酶催化活力是降低绿色生物合成磷 酸肌酸生产成本的关键因 素。

[0007] 因此， 现有技术还有待于改进和发展。

技术问题

[0008] 本发明的目的在于提供高催化活性的肌酸激酶 突变体。 本发明的另一目的还在 于提供含有编码本发明所述的肌酸激酶突变体 的基因。 本发明的再一目的在于 将将：本发明的突变体应用于以肌酸和三磷酸 腺苷 (ATP)为底物， 生产磷酸肌酸 _t 问题的解决方案

技术解决方案

[0009] 本发明的技术方案如下：

[0010] 一种肌酸激酶突变体， 其中， 以序列表的序列 2为参考序列， 其具有选自第 100 位、 第 121位和第 33位的至少一个突变， 并且以三磷酸腺苷和肌酸为底物时其具 有比亲本高出至少 50%的肌酸激酶催化活性。

[0011] 所述的肌酸激酶突变体， 其中， 其中第 100位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。

[0012] 所述的肌酸激酶突变体， 其中， 其中第 121位的亮氨酸突变为天冬氨酸。

[0013] 所述的肌酸激酶突变体， 其中， 其中第 33位的缬氨酸突变为丙氨酸。

[0014] 所述的肌酸激酶突变体， 其中， 其具有所附序列表中 SEQ ID NO. : 3至 SEQ ID

NO. : 5之一所示的氨基酸序列。

[0015] 一种基因， 其中， 其含有编码上述的肌酸激酶突变体的核苷酸序 列。 [0016] 一种如上述的肌酸激酶突变体的应用， 其中， 将其应用于以三磷酸腺苷和肌酸 为底物制备磷酸肌酸的过程中。

发明的有益效果

有益效果

[0017] 本发明通过对 Oryctolagus cuniculus 肌酸激酶基因进行定点突变， PCR扩增 后插入适当的载体， 随后在 LB培养基上筛选， 从而获得了一系列具高催化活性 的肌酸激酶突变体， 该突变体能以肌酸和三磷酸腺苷 (ATP)为底物， 可高效率催 化生成磷酸肌酸。

对附图的简要说明

附图说明

[0018] 图 1为 肌酸激酶亲本与突变体 F100Y之聚丙烯酰胺凝胶电泳图， 图中从左至右 的三条泳道依次为蛋白分子量标准、 亲本肌酸激酶粗提蛋白（A)、 肌酸激酶突变 体 F100Y粗提蛋白（B) ， 箭头指示目的酶位置。

发明实施例

本发明的实施方式

[0019] 本发明提供肌酸激酶突变体、 基因及突变体的应用， 为使本发明的目的、 技术 方案及效果更加清楚、 明确， 以下对本发明进一步详细说明。 应当理解， 此处 所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。

[0020] 本发明一种肌酸激酶突变体， 其以所附的序列 2为参考序列， 其具有选自第 100 位、 第 121位和第 33位的至少一个突变， 并且以三磷酸腺苷 (ATP)和肌酸为底物 其具有比亲本高出至少 50%的肌酸激酶催化活性。

[0021] 优选的是， 所述亲本序列中的第 100位的苯丙氨酸 (Phe)突变为酪氨酸 (Tyr)； 所述亲本序列中的第 121位的亮氨酸 (Leu)突变成天冬氨酸 (Asp) ; 和 /或所述亲 本序列中的第 33位的缬氨酸 (Val)突变成丙氨酸 (Ala)。

[0022] 这些突变体可以通过常规 Histag纯化， 并具有高的催化活性。 例如， 在本发明 获得的一系列突变体中， 一个具有单点突变的突变体 F100Y的比活性较亲本高出

111%。 [0023] 另一方面， 本发明还提供了一种基因， 其含有编码本发明的肌酸激酶突变体的 核苷酸序列。

[0024] 又一方面， 本发明还涉及肌酸激酶突变体的应用， 其应用于以三磷酸腺苷 (ATP )和肌酸为底物制备磷酸肌酸。

[0025] 所述的肌酸激酶突变体可以未经纯化以粗酶形 式使用， 也可以是经部分纯化的 或完全纯化的酶。 如果需要， 还可利用本领域已知的固化技术将本发明肌酸 激 酶突变体制成固相酶或固相细胞形式的固化酶 。

[0026] 为了获得本发明的突变体， 先构建含有亲本肌酸激酶基因的载体质粒， 然后设 定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类， 再合成适当的引物， 以所述的含 亲本肌酸激酶基因的载体质粒为模板， PCR扩增 DNA片段、 装配所扩增的 DNA片段 以及 PCR扩增全长突变基因。 也可合成全长突变基因， 然后将该全长突变基因克 隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞， 经培养筛选出具有肌酸激酶活性的 阳性克隆。 最后从阳性克隆中提取质粒 DNA， 进行 DNA序列测定分析， 以确定引 入的突变。 在本发明肌酸激酶突变体的制备方法中， 可采用任何适当的载体。 例如， 适用的载体包括但不限于原核表达载体， 如 pRSET和 pES21等； 包括但不 限于克隆载体， 如 PUC18/19 和 pBluscript-SK。

[0027] 在本发明制备肌酸激酶突变体的方法中， 所获得的肌酸激酶突变体基因可以在 原核细胞或真核细胞胞内表达， 也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现 在原核细胞或真核细胞胞外表达。

[0028] 在本发明制备肌酸激酶突变体的方法中， 所述载体的宿主细胞为原核细胞或真 核细胞。 所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌。 所述真核细胞包括但不限于酿 酒酵母和毕赤巴斯德酵母。

[0029] 本发明中所用的术语 "亲本"系指来自 Oryctolagus cuniculus

的肌酸激酶（CKM)， 其核苷酸序列如序列 1所示（参考 GenBank NM_001082239)， 氨基酸序列如序列 2所示（参考 GenBank NP_001075708)。

[0030] 本发明中所用的术语 "参考序列" ， 当其为核苷酸序列时， 系指序列表中的序 列 1， 当其为氨基酸序列时， 是指序列表中的序列 2。 在将参考序列和突变的肌 酸激酶序列进行排序比较时， 可以手工进行， 也可以用计算机进行 （目前有许 多可供利用的计算机软件， 例如 CLUSTALW程序等） 。

[0031] 本发明中所用的术语 "肌酸激酶突变体"是指这样一种以序列表中序� �� 2所示 氨基酸序列为参考序列， 存在选自第 100位、 第 121位和第 33位的至少一个突变， 并且以肌酸和三磷酸腺苷 (ATP)为底物生产磷酸肌酸时其具有比亲本高出� ��少 50 %的肌酸激酶催化活性的酶。 因此， 在本发明中， 所述肌酸激酶突变体的变体， 包括对序列 2所示氨基酸序列中除第 100位、 第 121位和第 33位外的其它位点的保 守取代形式、 增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、 氨基端截断的形式、 羧基 端截断的形式、 以及序列 2的部分或全部串联重复形式， 也包括在本发明的范围 内。

[0032] 在发明中所用的氨基酸三字母或单字母表达方 式， 采用 IUPAC规定的氨基酸代 码（Eur. J. Biochem. , 138 : 9-37， 1984)。

[0033] 以下用具体的实施例对本发明制备的突变体及 其性能进行说明。 下列实施例仅 用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围 。 实施例中未注明具体条件者， 按常规条件或制造商建议的条件进行。

[0034] 实施例 1 : 肌酸激酶编码基因的扩增与克隆

[0035] 根据基因库（GenBank匪_001082239)基因序列设计引 物 ckm_F禾 Pckm-R (见表 1) 。 用弓 I物对 ckm- F禾口 ckm- R从 Oryctolagus cuniculus cDNA文库中扩增肌酸激酶 编码基因。

[0036] 扩增条件为： 20 mM Tris-HCl (pH 8. 8) , 10 mM KC1 , 10 mM (NH4) 2S04， 2 mM MgS04， 0. 1% Triton X-100, 50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP， 400 nM弓 |物 ckm- F， 400 nM弓 |物 ckm_R， lOOng cDNA, 1. 0 U Pfu DNA 聚合酶 (Promega, USA)， 再用无菌水调反应体积至 50 ml。

[0037] PCR扩增反应程序为： 95 °C 3分钟， 35圈循环： 95 °C 50秒、 50 °C 30秒和 72 °C 1分钟， 最后 72°C 10分钟。 扩增的产物经限制性内切酶 Ndel和 BamHI酶切后与经 同样限制性内切酶 Ndel和 BamHI酶切的载体 pRSET-A (源自 Invitrogen, USA)连接 ， 得质粒 pRSET-ckm。 经 DNA测序， 确定该被克隆的肌酸激酶的核苷酸序列， 具 体示于序列表中序列 1， 相应的氨基酸序列为序列表中的序列 2。

[0038] 表 1

[0039] 实施例 2: 肌酸激酶位点 100的定点突变

[0040] 具体过程如下：

[0041] 为了将亲本氨基酸序列中第 100位点的 Phe (F)突变为 Tyr (Υ)获得突变体 F100Y, 以质粒 pRSET-ckm (见实施例 1)为模板， 设计引物对 100YF和 100YR (见表 1)。

[0042] 用引物对 ckm-F和 100YR, 扩增 F-YR片段， 用引物对 100YF和 ckm_R， 扩增 YF-R片 段。 扩增反应条件为： 20 mM Tris-HCl (pH 8. 8)， 10 mM KC1， 10 mM

(NH4) 2S04, 2 mM MgS04， 0. 1% Triton X- 100， 50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP， 1. 5 U Pfu DNA聚合酶 （Promega, USA)， 20 ng pRSET-ckm, 以及 400 nM引物 ckm_F和 400 nM引物 100YR (或者， 400

nM引物 100YF和 400 nM引物 ckm-R) ， 用无菌水调反应体积至 50微升。 PCR扩增反 应程序为： 95 °C 3分钟， 35圈循环： 95 °C 50秒、 52 °C 30秒和 72 °C 3分钟， 最 后 72°C 5分钟。 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收， 分别得到 F-YR 片段和 YF-R片段。 然后扩增全长基因。 扩增反应条件为： 20 mM Tris-HCl (pH 8. 8)， 10 mM KC1， 10 mM (NH4) 2S04， 2 mM MgS04， 0. 1% Triton X- 100， 50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP, 400 nM引物 ckm_F和 400 nM ckm-R, 1. 5 U Pfu DNA聚合酶， 20 ng F-YR片段与 20 ng YF-R片段， 用无菌水 调反应体积至 50微升。 PCR扩增反应程序为： 95°C 3分钟， 35圈循环： 95°C 50 秒、 52°C 30秒和 72°C 3分钟， 最后 72°C 5分钟。 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用 商业试剂盒回收， 得到全长突变基因 F100Y。 将 F100Y片段回收并经酶切再回收 后与载体 pRSET-A连接（参考实施例 1)， 得质粒 pRSET-F100Y。 将质粒 pRSET-FlOO Y转入感受态细菌细胞 E. col i BL21 o 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 F100Y 的氨基酸序列见序列表中的序列 3。 [0043] 实施例 3: 对肌酸激酶突变体位点 121的定点突变

[0044] 为了将亲本氨基酸序列中第 121位点的 Leu (L)突变为 Asp (D)获得突变体 L121D, 以质粒 pRSET-ckm (见实施例 1)为模板， 设计引物对 121DF和 121DR (见表 1)。

[0045] 用引物对 ckm-F和 121DR, 扩增 F-DR片段， 引物对 121DF和 ckm_R， 扩增 DF-R片段 。 引物 ckm-F和 ckm-R的具体序列， 见表 1。 扩增反应条件为： 20 mM Tris-HCl (pH 8. 8)， 10 mM KC1， 10 mM (NH4) 2S04， 2 mM MgS04， 0. 1% Triton

X-100, 50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP， 400

nM弓 I物 ckm-F禾卩 400 nM引物 121DR，或 400 nM引物 121DF禾口 400 nM引物

ckm-R, 1. 5 U Pfu DNA聚合酶 （Promega, USA)， 20 ng pRSET-ckm, 用无菌水 调反应体积至 50微升。 PCR扩增反应程序为： 95°C 3分钟， 35圈循环： 95°C 50 秒、 52°C 30秒和 72°C 3分钟， 最后 72°C 5分钟。 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用 商业试剂盒回收， 分别得到 F-DR片段和 DF-R片段。 然后扩增全长基因。 扩增反 应条件为： 20 mM Tris-HCl (pH 8. 8)， 10 mM KC1， 10 mM (NH4) 2S04， 2 mM MgS04， 0. 1% Triton X-100, 50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP, 400 nM引物 ckm_F和 400 nM ckm-R, 1. 5 U Pfu DNA聚合酶， 20 ng F-DR片段与 20 ng DF-R片段， 用无菌水调反应体积至 50微升。 PCR扩增反应程 序为： 95 °C 3分钟， 35圈循环： 95 °C 50秒、 52 °C 30秒和 72 °C 3分钟， 最后 72 V 5分钟。 经 1%

琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收， 得到全长突变基因 L121D。 将 L121D与 载体 pRSET-A连接（参考实施例 1)， 得质粒 pRSET-L121D。 将质粒 pRSET_L121D转 入感受态细菌细胞 E. coli BL21 o 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 L121D的 氨基酸序列见序列表中的序列 4。

[0046] 实施例 4: 肌酸激酶位点 33的定点突变

[0047] 为了将亲本氨基酸序列中第 33位点的 Val (V)突变为 Ala (A)获得突变体 V33A, 以 质粒 pRSET-ckm (见实施例 1)为模板， 设计引物对 33AF和 33AR (见表 1)。

[0048] 用引物对 ckm-F和 33AR, 扩增 F-AR片段， 引物对 33AF禾 Pckm-R， 扩增 AF-R片段。

引物 ckm-F和 ckm-R的具体序列， 见表 1。 扩增反应条件为： 20 mM Tris-HCl (pH 8. 8)， 10 mM KC1， 10 mM (NH4) 2S04， 2 mM MgS04， 0. 1% Triton X- 100， 50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP， 400 nM弓 |物 ckm— F禾卩 400 nM 引物 33AR， 或 400 nM引物 33AF和 400 nM引物 ckm_R， 1. 5 U Pfu DNA聚合酶 (Promega, USA)， 20 ng pRSET-ckm, 用无菌水调反应体积至 50微升。 PCR扩增 反应程序为： 95 °C 3分钟， 35圈循环： 95 °C 50秒、 52 °C 30秒和 72 °C 3分钟， 最后 72°C 5分钟。 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收， 分别得到

F-AR片段和 AF-R片段。 然后扩增全长基因。 扩增反应条件为： 20 mM

Tris-HCl (pH 8. 8)， 10 mM KC1， 10 mM (NH4) 2S04， 2 mM MgS04， 0. 1%

Triton X-100, 50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP, 400 nM 引物 ckm-F和 400 nM ckm- R， 1. 5 U Pfu DNA聚合酶， 20 ng F-AR片段与 20 ng AF-R片段， 用无菌水调反应体积至 50微升。 PCR扩增反应程序为： 95°C 3分钟 ， 35圈循环： 95°C 50秒、 52°C 30秒和 72°C 3分钟， 最后 72°C 5分钟。 经 1% 琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收， 得到全长突变基因 V33A。 将 V33A与载 体 pRSET-A连接， 得质粒 pRSET-V33A。 将质粒 pRSET_V33A转入感受态细菌细胞 E. col i BL21 o 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 所得突变体的氨基酸序列见序 列表中的序列 5。

[0049] 实施例 5: 亲本肌酸激酶的提取与纯化

[0050] 具体过程如下：

[0051] 将含肌酸激酶基因的质粒 pRSET-ckm转化感受态细菌细胞 E. col i

BL21 , 在 Luria broth (LB)平板（含 50 mg/L卡那霉素）上 37°C培养 24 小时。 接种 单个克隆于 5 毫升 LB液体培养基（含 50 mg/L卡那霉素）中于 30°C培养 20-24小时 。 离心收集菌体， 并悬浮于 1毫升 lOOmM Tris盐酸缓冲液 (pH 7. 5)中。 然后用超 声波裂解细菌细胞。 离心（10°C， 17, 800 g， 10分钟）并收集上清液， 即为粗提 蛋白（或称粗提物）。

[0052] 图 1中 A显示了重组的亲本肌酸激酶粗提蛋白之聚丙� �酰胺凝胶电泳的结果， 表 明肌酸激酶（目标带大小约为 42kD)在大肠杆菌 BL21中有表达。

[0053] 实施例 6: 肌酸激酶突变体的提取与纯化

[0054] 具体过程如下：

[0055] 将含肌酸激酶基因的质粒 pRSET-FlOOY转化感受态细菌细胞 E. col i BL21， 在 Luria broth (LB)平板（含 50 mg/L卡那霉素）上 37 °C培养 24 小时。 接种 单个克隆于 5 毫升 LB液体培养基（含 50 mg/L卡那霉素）中于 30°C培养 20-24小时 。 离心收集菌体， 并悬浮于 1毫升 lOOmM Tris盐酸缓冲液 (pH 7. 5)中。 然后用超 声波裂解细菌细胞。 离心（10°C， 17, 800 g， 10分钟）并收集上清液， 即为粗提 蛋白（或称粗提物）。

[0056] 图 1中 B显示了重组的肌酸激酶突变体 F100Y粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝胶电泳的 结果， 表明肌酸激酶（目标带大小约为 42kD)在大肠杆菌 BL21中有较高的表达水 平。

[0057] 实施例 7: 亲本肌酸激酶活性的测定

[0058] 配制底物溶液： 含 lOOmM的肌酸（Creatine)、 5mM之 ATP、 20mM

之 MgC12、 40mM Poly (P)和 lOOmM Tris盐酸缓冲液， 调 pH至 7. 5。 取底物溶液 400 微升， 然后加入 100微升的亲本肌酸激酶，于 37°C进行 10分钟反应。 离心（10°C， 17, 800 g， 15分钟）并收集上清液。 通过高压液相色谱 (HPLC) 测定所得上清液 中磷酸肌酸的含量。 用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度， 测定结果如表 2所示。 一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转 化一微摩尔肌酸为磷酸肌 酸所需之酶量。 肌酸激酶特异性活力为 3. 5U/mg ₀

[0059] 实施例 8: 肌酸激酶突变体活性的测定

[0060] 配制底物溶液： 含 lOOmM的肌酸（Creatine)、 5mM之 ATP、 20mM

之 MgC12、 40mM Poly (P)和 lOOmM Tris盐酸缓冲液， 调 pH至 7. 5。 取底物溶液 400 微升， 然后加入 100微升肌酸激酶突变体 F100Y，于 37°C进行 10分钟反应。 离心（1 0°C， 17, 800 g， 15分钟）并收集上清液。 通过高压液相色谱 (HPLC) 测定所得上 清液中磷酸肌酸的含量。 用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度， 测定结果 如表 2所示。 一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转 化一微摩尔肌酸为磷 酸肌酸所需之酶量。 肌酸激酶特异性活力为 7. 4U/mg ₀

[0061] 表 2 肌酸激酶亲本与突变体酶比活性之差异

[] [表 1]

[0062] 实施例 9: 肌酸激酶固定化

[0063] 取肌酸激酶粗酶， 用洗酶缓冲液 （0. 02M Tris-HCl/O. OOlM EDTA， pH7. 0溶液 ) 稀释至蛋白含量 5-10mg/ml。 将酶稀释液与 PB溶液（2. Omol/L磷酸二氢钾， PH7. 5)等体积混合， 加入固定化酶载体 LX-3000 (10毫克酶 /克载体）， 于摇床（ 转速 lOOrpm)中 25° C反应 20小时。 反应完成后用滤袋过滤， 用洗酶缓冲液清洗 5 -6次， 得到固定化肌酸激酶。

[0064] 实施例 10: 用固定化肌酸激酶制备磷酸肌酸

[0065] 配制底物溶液： 含 lOOmM的肌酸（Creatine)、 5mM之 ATP、 20mM之 MgCl ₂

、 40mM Poly (P)和 lOOmM Tris盐酸缓冲液， 调 pH至 7. 5。 取底物溶液 1毫升， 然 后加入 0. 05克固定化肌酸激酶。 于 37°C进行反应 2-20小时。 离心（10°C， 17, 800 g， 15分钟）并收集上清液。 通过高压液相色谱 (HPLC) 测定所得上清液中磷酸肌 酸的含量。 结果， 肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超过 85%。

[0066] 应当理解的是， 本发明的应用不限于上述的举例， 对本领域普通技术人员来说 ， 可以根据上述说明加以改进或变换， 所有这些改进和变换都应属于本发明所 附权利要求的保护范围。