[0001] 本发明涉及一种外科整形用组织填充剂交联透 明质酸钠凝胶及其制备方法。

背景技术

[0002] 透明质酸（又名玻璃酸， 以下简称 HA)或者其钠盐是一种天然高分子粘多糖类物质 ， 广泛分布于哺乳动物的结缔组织、鸡冠和链球 菌的夹膜等处，由于不具有种属及脏器特异性 ， 由透明质酸制得的透明质酸凝胶作为填充物移 植或注入肌体都显示良好的肌体相容性，起到 抗皱、 丰乳、 充垫等作用， 而且对人体无副作用， 因此， 广泛用于医疗、 美容。 以 HA或者 其钠盐为原料制造的皮肤填充剂在美容外科整 形中最受欢迎。这些用于注射的组织填充剂与 胶原蛋白相似， 其疗效更长久， 过敏反应风险更低。 但是， HA或者其钠盐在生物体内易因 酶如透明质酸水解酶和自由基的作用而发生降 解， 因此在生物体内的滞留时间短。 为了提高 HA或者其钠盐在体内的滞留时间， 通常采用对 HA或者其钠盐进行交联， 使 HA或者其钠 盐高分子链中的羟基基团与交联剂形成化学键 合制得交联 HA或者其钠盐凝胶。为了不影响 凝胶的生物相容性， 交联剂的使用浓度不宜过高。 但当交联剂用量少时， 所得凝胶衍生物抵 抗体内酶解的能力低， 在体内停留的时间就比较短， 停留时间大约在 1〜6个月左右。 如果 交联剂用量过大时， 在体内的停留时间相应延长了， 但粘度较高， 凝胶硬度增加， 不容易通 过 30G乃至 27G的针头， 可注射性下降。 此外， 交联剂用量高， 会使过量交联剂残留于产 物中， 且很难纯化清洗。 这样， 使得交联 HA或者其钠盐凝胶的细胞毒性较大， 容易对人体 产生副作用。而现有 HA或者其钠盐的交联反应均是在均相的碱性水� ��液中只加入交联剂对 HA或者其钠盐进行交联， 而且均是通过提高交联度的方法来提高抗生物 降解能力， 延长皮 肤填充剂在体内停留时间。 这样， 一方面会破坏交联 HA或者其钠盐凝胶的生物相容性， 另 一方面又会使凝胶产品的粘弹性下降， 硬度增加， 可注射性下降。

发明内容

[0003] 本发明的第一个目的是：提供一种可以有效提 高抗酶解的能力， 同时也能维持透明质 酸钠本身优异的生物相容性的外科整形用组织 填充剂交联透明质酸钠凝胶。

[0004] 实现本发明第一个目的的技术方案是：一种外 科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝 胶， 其特征在于， 它是透明质酸钠碱性溶液与含环氧基的长链烷 烃及含环氧基的交联剂， 于 35 °C〜50°C反应 2〜5小时形成交联透明质酸钠， 再经洗涤、 凝胶化、 灭菌制得的， 其中， 透明质酸钠 ： 含环氧基的交联剂： 含环氧基的长链烷烃的摩尔比为 10 ： 4〜1： 1〜4 _; 所述含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 6〜18个；

所述含环氧基的交联剂为 1,4-丁二醇二缩水甘油醚、 分子量为 500〜6000的聚乙二醇二 缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷、 1,2,3,4-二环氧丁烷中的一种；

所述透明质酸钠碱性溶液是由透明质酸钠干粉 溶解于由 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液和 二甲亚砜组成的混合溶液后形成的， 其中， 透明质酸钠的浓度为 4wt%〜8wt%; 0.2-0.5M 的氢氧化钠水溶液与二甲亚砜的体积比为 10 ： 7〜1。

[0005] 上述交联透明质酸钠凝胶的化学结构中包含化 学键合的具有自黏附自聚集功能的疏 水基团， 该疏水基团的碳原子数目为 6〜18个。

[0006] 本发明的第二个目的是：提供一种制备可以有 效提高抗酶解的能力， 同时也能维持透 明质酸钠本身优异的生物相容性的外科整形用 组织填充剂交联透明质酸钠凝胶的方法，该方 法便于操作， 所得产品质量稳定。

[0007] 实现本发明第二个目的的技术方案是：一种上 述外科整形用组织填充剂交联透明质酸 钠凝胶的制备方法， 其特征在于， 具体制备步骤如下：

①将透明质酸钠干粉溶解于由 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液和二甲亚砜组成的� �合溶液 后获得透明质酸钠碱性溶液，然后向透明质酸 钠碱性溶液中加入含环氧基的长链烷烃及含环 氧基的交联剂， 搅拌状态下加热至 35 °C〜50°C并保温 2〜5小时后， 冷却至室温， 在搅拌下 滴加丙酮生成白色粉末形成固一液混合物料， 加入盐酸将固一液混合物料的 pH 值调节至 6.5〜7.4， 滤除液体后， 所得固体物料用异丙醇和丙酮分别洗涤 3〜5次， 再真空干燥至挥发 物质含量低于 2ppm， 所得白色干粉即为交联透明质酸钠粉末；

其中， 透明质酸钠： 含环氧基的交联剂： 含环氧基的长链烷烃的摩尔比为 10 ： 4〜1 ： 1〜4 _; 含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 6〜18个； 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液与二甲 亚砜的体积比为 10 ： 7〜1 _; 透明质酸钠碱性溶液中， 透明质酸钠的浓度为 4wt%〜8wt%; 氢氧化钠水溶液与滴加的丙酮的体积比为 1 : 4〜2： 3； 透明质酸钠的平均分子量为 50万〜 200万； 所述含环氧基的交联剂为 1,4-丁二醇二缩水甘油醚、 分子量为 500〜6000的聚乙二 醇二缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷、 1,2,3,4-二环氧丁烷中的一种；

②在步骤①得到的交联透明质酸钠粉末中，加 入注射用水溶胀形成交联透明质酸钠凝胶， 收集的凝胶颗粒中加入注射用水， 在 15 °C〜35 °C下搅拌洗涤 2〜5小时后， 滤除注射用水， 收集凝胶颗粒， 再用注射用水洗涤， 按上述过程反复洗涤共 4〜5次后， 收集的凝胶颗粒即 为交联透明质酸钠凝胶；

③向步骤②收集的凝胶颗粒中加入等渗生理盐 水， 在 15 °C〜35 °C下搅拌洗涤 2〜5小时 后，滤除等渗生理盐水，收集凝胶颗粒，再用 等渗生理盐水洗涤，按上述过程反复洗涤共 4〜 5次后， 经筛网分筛收集平均粒径为 150 μ m〜350 μ m的凝胶；

④将步骤③收集的凝胶颗粒灌装于事先灭菌的 一次性注射器中，在 121 °C〜125 °C蒸汽中 灭菌 15〜25分钟， 即可得到外科整形用组织填充剂交联透明质酸 钠凝胶。

[0008] 上述交联透明质酸钠凝胶的制备方法中，制得 的交联透明质酸钠凝胶的化学结构中包 含化学键合的具有自黏附自聚集功能的疏水基 团， 该疏水基团的碳原子数目为 6〜18个。

[0009] 本发明的技术效果是： 本发明技术方案采用含环氧基的交联剂， 例如 1,4-丁二醇二缩 水甘油醚对透明质酸钠进行交联时， 同时引入适量含环氧基的长链烷烃（长链烷烃 的碳原子 数目在 6〜18)， 由于该长链烷烃为疏水基，它成为交联透明质 酸钠凝胶网状分子结构中的一 部分， 调整了交联透明质酸钠凝胶的亲水性， 避免酶的进入而导致交联透明质酸钠降解， 延 长了其在体内留存时间， 也即填充剂能维持组织容积填充更长时间的效 果， 另外， 引入的长 链烷烃通过强大的疏水缔合产生自黏附自聚集 功能，在交联透明质酸钠凝胶中会形成很多物 理团簇， 因而可以达到增加抗酶解的效果， 并且不影响凝胶的生物相容性和其他物理性能 ， 达到了高交联度情况下相同的抗酶解稳定性， 甚至稳定性更高； 与相同交联度的凝胶相比， 由于本发明透明质酸钠凝胶具有上述自黏附自 聚集功能，使得本发明透明质酸钠凝胶在体外 抗酶解的能力可以增加 2〜3倍， 在体内的停留时间会大大延长， 因此， 凝胶的长效稳定性 提高。 本发明同时发现， 由于本发明凝胶的溶胀度不会由于疏水链的引 入而降低， 因此， 能 保持凝胶的柔软性， 不需要额外添加润滑剂， 就可以通过 30G的注射针头 (见表 2)。

附图说明

[0010] 图 1为本发明交联透明质酸钠凝胶的化学结构示� �图；

图 2为 FT-IR图谱

其中： 1为用作本发明原料的透明质酸钠的 FT-IR图谱； 2为本发明交联透明质酸钠凝胶 的 FT-IR图谱；

图 3为用作本发明原料的透明质酸钠的标准 1H-NMR图谱；

图 4为本发明方法单独用含环氧基的长链烷烃处� �后的透明质酸钠的 ^-NMR图谱； 图 5为本发明方法单独用 1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联后的透明质酸钠� � 1H-NMR图谱； 图 6为本发明方法用含环氧基的长链烷烃及交联� � 1,4-丁二醇二缩水甘油醚处理后得到 的交联透明质酸钠凝胶的 iH-NMR图谱。

具体实施方式

[0011] 以下结合实施例及附图对本发明做进一步描述 ， 但不局限于此。

[0012] 实施例所用原材料除另有说明外均为市售医药 级用品， 可通过商业渠道购得。

[0013] 实施例 1制备外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠� �胶

具体步骤如下：

①将 10g透明质酸钠干粉（平均分子量为 200万）溶解于由 200ml 0.5M的氢氧化钠水溶 液和 50ml二甲亚砜组成的混合溶液后获得透明质酸� �碱性溶液， 然后向透明质酸钠碱性溶 液中加入 0.5ml含环氧基的长链烷烃 1,2-环氧十二烷 （分子量 184.32， 纯度 98%， Sigma公 司产品）及 1ml含环氧基的交联剂 1,4-丁二醇二缩水甘油醚（分子量 202.25，纯度 98%， Sigma 公司产品）， 搅拌状态下加热至 40°C并保温 5小时后， 冷却至室温（15°C〜30°C )， 在搅拌下 滴加丙酮直至出现白色粉末， 形成固一液混合物料（丙酮的滴加量为 800ml)， 加入 5M盐酸 调节固一液混合物料的 pH值至 7， 滤除液体后， 所得固体粉末用异丙醇洗涤 3次， 然后丙 酮洗涤 5次 （异丙醇和丙酮每次用量均为 100ml)， 再真空干燥至挥发物质含量低于 2ppm， 所得白色干粉即为交联透明质酸钠粉末， 其化学结构式见附图 1 ;

其中， 透明质酸钠 ： 1,4-丁二醇二缩水甘油醚 ： 1,2-环氧十二烷的摩尔比为 10 ： 2 ： 1； 含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 12个； 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液与二甲亚砜的体积 比为 4 ： 1， 透明质酸钠碱性溶液中， 透明质酸钠的浓度为 4.0wt% _; 氢氧化钠水溶液与滴加 的丙酮的体积比为 1 ： 4;

②在步骤①得到的交联透明质酸钠粉末中加入 1L注射用水， 25°C溶胀 8小时形成交联 透明质酸钠凝胶， 收集的凝胶颗粒中加入注射用水 1L， 在 25°C下搅拌洗涤 2小时后， 滤除 注射用水， 收集凝胶颗粒， 再用注射用水洗涤， 按上述过程反复洗涤共 4次后， 收集的凝胶 颗粒即为交联透明质酸钠凝胶；

③向步骤②收集的凝胶颗粒中加入 500ml等渗生理盐水， 在 25°C下搅拌洗涤 2小时后， 滤除等渗生理盐水，收集凝胶颗粒，再用等渗 生理盐水洗涤，按上述过程反复洗涤共 4次后， 经筛网分筛收集平均粒径为 250 μ m的凝胶颗粒；

④将步骤③收集的凝胶颗粒灌装于事先灭菌的 一次性注射器中， 在 121 °C蒸汽中灭菌 25 分钟， 即可得到外科整形用组织填充剂交联透明质酸 钠凝胶。 [0014] 实施例 2〜实施例 7制备外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠� �胶

具体步骤与实施例 1基本相同，不同之处在于：实施例 1的步骤①中，透明质酸钠 ： 1,4- 丁二醇二缩水甘油醚 ： 1,2-环氧十二烷的投料量及三者的摩尔比分别� �表 1所示添加， 获得 交联剂 1,4-丁二醇二缩水甘油醚和 1,2-环氧十二烷用量不同的交联透明质酸钠凝� �。

[0015] 表 1

检测实施例 1至实施例 7制得的凝胶的颗粒大小、 可注射性、 细胞毒性、 酶降解率及溶 胀度， 同时， 检测单独用 BDDE交联的透明质酸钠凝胶商业化产品， 检测结果见表 2。

[0016] 表 2

用 BDDE 实施例 实施例 实施例 实施例 实施例 实施例 实施例 交联的 凝胶

1 2 3 4 5 6 7 商业化

-iz:口 广口口 颗粒大小 团状凝

250 300 280 300 180 200 350 (微米） 胶

可注射性

容易（含

( 30G 针 容易 容易 容易 容易 容易 容易 困难

润滑剂） 头）

细 胞 毒 1级 1级 1级 1级 1级 1级 2级 1级 性， 级 ( 90. 0 ) ( 83. 84 ( 95. 0 ) ( 82. 2 ) (85. 4) (76. 2) (65. 0) ( 85. 2 )

( RCR %) )

酶降解率

20. 0 53. 0 80. 0 40. 3 15. 0 10. 0 35. 0 86. 0 (%)

溶胀度

3500 2500 7450 2100 2600 2400 1500 2200 (%) 由表 2可以看出， 通过单独增加 BDDE交联剂的用量（如实施例 2、 4、 7)， 溶胀度会降 低， 抗酶解性也会提高， 但在一定的比例下（实施例 7)， 凝胶硬度增加， 可注射性下降， 必 须通过利用润滑剂提高其可注射性， 另外细胞毒性也增加。而本发明通过引进含环 氧基长链 烷烃（如实施例 1、 5和 6)不会影响原来透明质酸的亲水能力， 凝胶的溶胀度没有下降， 但 抗酶解性却得到提高， 同时细胞毒性能通过生物相容性的检验标准。

[0017] 表 2注 1 ： 体外细胞毒性测试 根据 EN ISO 10993-5: 2009《医疗器械的生物学评价

--第 5部分： 体外细胞毒性试验》 标准， 检测细胞增值率， 交联透明质酸钠作为三类医疗器 械进行体外细胞毒性测试。

[0018] 具体检测方法如下：

①先将待测交联透明质酸钠凝胶与 RPMI1640培养液按 0.2g/ml混合， 置于 37°C， 5%二 氧化碳孵箱中浸提 72小时， 用 0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌， 得到浸提液；

②将 l X 10 ⁵ /mL的 L929细胞悬浮液接种于 96孔细胞培养板， 置于 37°C二氧化碳培 养箱中培养 24小时， 待细胞贴壁生长后， 去除上清液， 分成对照组和实验组两组；

③对照组加入 RPMI1640培养液； 实验组加入含 50%上述浸提液的 RPMI1640培养液； 将对照组和实验组分别置于 37°C二氧化碳培养箱中继续培养，于 2天后取出，培养板每孔加 入 MTT溶液 （5mg/ml) 20 L, 于 37 °C继续培养 4小时， 终止培养；

④小心吸弃孔内培养上清液， 每孔加入 200 L DMSO， 振荡 10分钟混勾后， 用酶联免 疫检测仪在 630nm下分别测定其吸光度值；

⑤根据下面的公式计算细胞相对增值率 （RCR)， RCR ( %) = (实验组平均吸光度值 / 对照组平均吸光度值） X 100%;

⑥细胞相对增值率 RCR与细胞毒性分级关系如下：

C 不小于 100%， 细胞毒性分级为 0级； C 为 75〜99%， 细胞毒性分级为 1级；

C 为 50〜74%, 细胞毒性分级为 2级；

C 为 25〜49%， 细胞毒性分级为 3级；

C 为 1〜24%， 细胞毒性分级为 4级；

RC 为 0%， 细胞毒性分级为 5级；

用按上述上方法测得的细胞相对增值率判断交 联透明质酸钠凝胶的生物相容性。 C 越 高， 表明待测交联透明质酸钠凝胶的生物相容性越 好；

表 2注 2酶降解率

具体检测方法如下：

①取待测交联透明质酸钠凝胶样品，用 PBS稀释至样品的交联透明质酸钠浓度为 4mg/ml 作为供试品；

② 取 l .Og供试品， 力 B 50U lml透明质酸酶液震荡 lmin， 于 37°C水浴中 24小时， 然 后在 100°C煮沸 lOmin灭活；

③滤液经 0.45 μ m微孔滤膜抽滤， 然后用 PBS定容至 10ml;

④采用改良咔脞显色法 （参考文献： Bitter .T， Muir H.M, (1962) A modified uronic acid carbarbazole reation .Anal.Biochem.4,330-333. ) 测定糖醛酸含量， 乘以 2.07后折算为加入酶 液的样品中交联透明质酸钠的含量 C _{1 ;} 未加酶液样品中的交联透明质酸钠含量为 C ₂ ， 计算 酶降解率 = d/ C ₂ X 100% ；

用按上述方法测得的酶降解率判断交联透明质 酸钠凝胶的抗酶解性。 酶降解率越低， 表 明待测交联透明质酸钠凝胶的抗酶解性越好， 交联透明质酸钠凝胶在体内的停留时间越长， 凝胶的长效稳定性好。

[0019] 表 2注 3溶胀度

具体检测方法如下：

将凝胶成膜后真空烘干得凝胶膜， 将所得干凝胶膜精确称量， 其重量为 Wd， 然后加到 PBS中， 常温下放置 24小时， 把充分膨胀的凝胶膜取出， 用吸水纸去除凝胶膜表面的游离 水后， 称量凝胶膜重量为 Wg, 计算溶胀度 （％) =(Wg/Wd ) X 100% _;

用按上述方法测得的溶胀度可以间接判断交联 透明质酸钠凝胶的可注射性。 溶胀度越高 表明待测交联透明质酸钠凝胶亲水性越好， 凝胶越柔软， 可注射性提高。

[0020] 表 2注 4凝胶颗粒大小 具体检测方法是利用英国 Malvern 公司的 Mastersizer 2000 型粒度测定仪检测颗粒大小 D[4,3]。

[0021] 表 2注 5可注射性

具体检测方法如下：

在一次性使用的 lml无菌注射针管内， 先装入已经消毒灭菌的凝胶， 再装上 30G注射针 头， 然后按照正常注射挤压的办法挤出凝胶， 用手感判断可注射难易程度。

[0022] 实施例 8〜9

本实施例的制备交联透明质酸钠凝胶的方法与 实施例 1基本相同， 不同之处在于透明质 酸钠的分子量为 150万， 透明质酸钠 ： BDDE ： 1,2-环氧十二烷的摩尔比分别是 10 ： 3： 1 和 10 ： 3 ： 2。

[0023] 按照上述方法检测实施例 8〜9制备的凝胶的酶降解率分别为 30.20% 和 32.5%， 表 明透明质酸钠的分子量为 150万，透明质酸钠 ： BDDE ： 1,2-环氧十二烷的摩尔比在 10: 3：

1 就可以满足耐酶解性的要求。

[0024] 对本发明交联透明质酸钠凝胶进行红外光谱检 测

①采用传统 FT-IR傅立叶变换红外光谱仪

②检测方法如下：

采用传统方法将用作原料的透明质酸钠和实施 例 1制得的交联透明质酸钠凝胶冷冻干燥 样品和溴化钾压片在 FT-IR上扫描检测红外结构， 得到的图谱见附图 2， 其中： 1为用作本 发明原料的透明质酸钠的 FT-IR图谱； 2为本发明交联透明质酸钠凝胶的 FT-IR图谱；

分析附图 2 中的图谱 1 和 2 可以看出二者的红外结构谱图一致， 均存在以下波 峰： 3395cm— ¹ 【 v (NH) , ν (OH) OH禾 Π NHCO], 2916cm— ¹ 【 v (CH) C— CH2— C】， 1615cm— ¹ 【 δ (NH)酰胺 （ I I ) 和羧酸基团】， 1411cm— ¹ 【 v (CN) 和 δ (ΝΗ)酰胺 I I I】， 1377cm— ¹ 【 v (C=0) -C00H], 1044cm— ¹ 【 v (C- 0) C- 0- C】， 945cm— ¹ 【 δ (0- H) 和 v (C- C) C_0- C (环) 和 0H】， 612cm— ¹ 【ω (N-H)酰胺 I】。 证明本发明对透明质酸钠进行交联改性并未改 变透明质 酸钠的基本化学结构， 这样就确保交联透明质酸钠凝胶的生物相容性 不受影响。

[0025] 对本发明交联透明质酸钠凝胶进行 ^-NMR分析

检测检测方法

①用 NMR仪器 （300HZ， Bruker, Switzerland )； ②检测方法如下：

1 ) 原料透明质酸钠溶解在 D ₂ 0中， 进行 NMR检测， 其检测图谱见附图 3 ; 2) 本发明交联透明质酸钠凝胶 （实施例 1制得） 用 NaOH调整到 pH=8， 高压 121 °C灭 菌 30分钟， 形成液体， 然后冷冻干燥得粉末， 溶解于 D ₂ 0/DMSO中进行 NMR检测， 其检 测图谱见附图 6;

3 ) 采用本发明方法分别制得单独用含环氧基的长 链烷烃处理后的透明质酸钠及单独用 1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联后的透明质酸钠� � NaOH调整到 pH=8， 高压 121 °C灭菌 30分 钟， 形成液体， 然后冷冻干燥得粉末， 溶解于 D ₂ 0/DMSO中进行 NMR检测， 其检测图谱见 附图 4和 5;

在附图 3的 1H-NMR图谱中， 透明质酸钠的乙酰胺基团 N-Acetyl (NHCOCH ₃ ) 的位置 在 1.9〜2.2ppm, 葡萄糖醛酸 （10H) 的位置在 3.0〜4.0ppm, 葡萄糖单元异头碳氢 （2H) 的 位置在 4.35〜4.45ppm;

在附图 4的 ¹ H-NMR图谱中， 除附图 3的上述峰值外， 还在位置 1.2〜1.4ppm和 0.65〜 0.85ppm出现了峰， 它们分别代表亚甲基 CH ₂ 峰和长链碳端基 C¾， 证明用本发明方法可以 将含环氧基的长链烷烃与透明质酸钠化学键合 ；

在附图 5的 iH-NMR图谱中， 除附图 3的上述峰值外， 还在位置 1.5〜1.7ppm出现了 0- CH ₂ CH ₂ 的峰， 它代表交联剂 BDDE与透明质酸钠的交联键， 证明用本发明方法含环氧基的 交联剂 BDDE可以将透明质酸钠交联；

在附图 6的 1H-NMR图谱中， 除附图 3的上述峰值外， 还同时出现三个峰， 即： 位置在 0.65〜0.85ppm 出现的代表含环氧基的长链烷烃的长链碳端基 CH ₃ ， 1.2〜1.4ppm代表环氧 烷烃的亚甲基 CH ₂ 以及 1.5〜1.7ppm 代表交联剂 BDDE 与透明质酸钠的的交联键 0- CH ₂ CH ₂ ， 证明制备本发明交联透明质酸钠凝胶的方法可 以确保含环氧基的交联剂 1,4-丁二 醇二缩水甘油醚 （BDDE) 与透明质酸钠进行交联而且可以确保 1,2-环氧十二烷与透明质酸 钠化学键合。

[0026] 采用分子量为 500〜6000 的聚乙二醇二缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷或 1,2,3,4- 二环氧丁烷作为含环氧基的交联剂与含环氧基 的长链烷烃 （长链烷烃的碳原子数 6〜18个） 配合， 可以获得性能相同的交联透明质酸钠凝胶， 故不再赘述。